Summary
在这里，我们提出了一个免疫造血测试协议，用于检测狂犬病病毒抗原，作为正式固定组织的替代诊断测试。
Abstract
狂犬病的主要诊断方式之一是在受感染的组织样本中检测病毒核糖核蛋白（RNP）复合物（抗原）。虽然直接荧光抗体 （DFA） 测试或直接快速免疫组织化学测试 （DRIT） 最常用于抗原检测，但两项测试都需要新鲜和/或冷冻组织，以便在使用抗原检测之前在幻灯片上留下印象。如果样品被收集并固定在正式素中，则两种测试都不是抗原检测的最佳方法，但是，在嵌入石蜡块和切片后，常规免疫造血术 （IHC） 可以进行测试。使用这种IHC方法，组织被抗狂犬病抗体染色，部分被去帕拉芬化，抗原通过部分蛋白解或其他方法检索，并孵育为一级和二级抗体。抗原使用马萝卜过氧化酶/氨基乙基卡巴佐尔染色，并用血氧素进行反污，以便使用光显微镜进行可视化。除了特定的抗原检测外，形式固定还具有其他优势，如确定组织学变化、放宽标本储存和运输条件（在环境温度下）、检测追溯性病例的能力以及通过灭活感染剂提高生物安全性。
Introduction
狂犬病是由属于利萨病毒1属的负感RNA病毒引起的急性渐进性脑炎。近99%的人类死亡是由狂犬病病毒（RABV）感染引起的，狂犬病病毒是该属的类型成员，由狗2传播。疑似动物的狂犬病诊断依赖于在脑组织3中与基因组RNA（核蛋白复合物，RNP）复合体中检测抗原（主要是病毒编码核蛋白，N蛋白）。直接荧光抗体（DFA）检测的抗原被认为是狂犬病诊断的黄金标准。该方法利用新鲜或新鲜的冷冻脑物质，在幻灯片上的触摸印象，固定在丙酮，染色使用商业上可用的荧光异氰酸酯（FITC）标记单克隆或多克隆抗体（mAbs/pAbs），并通过荧光显微镜5读取。DFA 测试对于新鲜脑组织中的狂犬病抗原检测是快速、敏感和特定的。最近，一种直接的快速免疫化学测试（DRIT），改良免疫造血（IHC）技术，被证明表现出类似的敏感性DFA，但提供了光显微镜的可视化6的优势。虽然 DRIT 中使用的检测方法与 IHC 类似，但初始步骤利用新鲜或冷冻组织生成样品的触摸印象，然后固定在形式素中。
IHC是一种广泛使用的技术，用于确定组织学变化和检测蛋白质使用特定抗体在正式固定组织嵌入石蜡块。IHC是组织7部分狂犬病抗原检测的既定替代测试。IHC已特别用于诊断出现神经系统疾病的回顾性病例，以确定狂犬病的负担8。石蜡嵌入的正式固定组织保存蛋白质进行检测，即使几年后储存在环境温度9。形式素处理通过交叉连接和改变氨基酸侧链来改变蛋白质，这可能使表位不再对抗体10产生反应。虽然狂犬病抗原检测的IHC测试涉及mAbs或pAbs，后者是有利的，因为多个表位和不同的利沙病毒可以检测11。
IHC 所涉及的标准步骤是组织正式固定、嵌入石蜡块、组织分割、去帕拉芬化和水化、表位恢复、对初级和二级抗体的反应，以及使用染色基板开发。这份手稿详细描述了狂犬病诊断方案。对于狂犬病抗原检测，使用美国疾病控制和预防中心 （CDC） 在佐治亚州亚特兰大产生的带有 RABV （pAbs） 的鼠血清，并结合生物镀金化抗鼠二级抗体进行免疫。生物素化腹肌通过添加链球菌素-马萝卜过氧化酶（HRP）复合物（HRP）来检测，然后通过氨基-乙基卡巴佐尔基质进行颜色开发来检测。
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Protocol
虽然在正式固定组织上执行了 IHC 协议，如果存在，这些组织会灭活 RABV，但应正确遵循适当的生物安全协议。所有生物安全程序均见微生物和生物医学实验室（BMBL）第5版（https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm）中的生物安全程序，包括佩戴适当的个人防护设备（PPE），以及如第12版所述的疫苗接种要求。此外，应适当遏制和处理危险化学品（如甲醛、AEC 和二甲苯）（例如烟气罩）。
1. 组织正式固定
- 将 3-5 mm 脑组织在坏死后收集13 放入 10% 磷酸盐缓冲正式素溶液（1：20 至 1：50 组织/甲醛比）中，24-72 小时。
警告： 正式素是一种有毒固定剂。 - 记录大约组织重量（大小）、组织类型（大脑区域）和形式素体积。实验室必须记录和维护固定时间的记录。
- 在正式固定后和加工之前，要延长组织储存时间，请将组织放入 70% 乙醇中。
2. 组织处理
- 标本固定后，解剖组织，包括重要的大脑区域，如脑系统横截面、小脑（3叶）或海马（海马）各切3至5毫米厚，并放入处理盒式磁带中。
- 处理石蜡渗透的组织盒，嵌入石蜡块，并在微切除器上分割（3 至 6 μm）。
3. 准备材料/染色菜肴
- 设置染色盘14（材料表），如图1所示。将每道菜装满 250 mL 的溶液。
- 准备 3-氨基-9-乙基碳化硅 （AEC） 基板库存解决方案
- 使用玻璃移液器将一片20毫克的3-氨基9乙基卡巴佐尔（AEC）溶解到5毫升的N、N、二甲基甲酰胺中。
注意：AEC是一种致癌物质。
- 使用玻璃移液器将一片20毫克的3-氨基9乙基卡巴佐尔（AEC）溶解到5毫升的N、N、二甲基甲酰胺中。
- 为抗原检索准备蛋白酶（例如 Pronase）库存溶液
- 溶解 7 毫克蛋白酶在 200 mL 的 PBS。
- 冲洗缓冲器 PBS-T 的准备
- 添加 10 mL 的 Tween 80 至 990 mL 的 PBS。将其混合好，形成同质溶液。
4. 脱脂和组织补液
- 使用微原子制作 5 μm 石蜡部分，在 38 °C 的水浴中漂浮，然后收集到玻璃滑梯上。用耐试剂笔/标记标记幻灯片。
- 将滑梯放在托盘上，在 55-60 °C 烤箱中熔化 1 小时。不要将温度升高到 60 °C 以上，因为它会破坏病毒抗原。
- 从烤箱中取出幻灯片，并在 1、2 和 3 的菜肴中连续 3 次脱氟乙烯冲洗 5 分钟。
- 通过连续浸泡将乙醇稀释到去离子水中，通过连续浸泡来补充滑梯上的部分水分：（4 至 11 是浸洗）菜 4：二甲苯/100% 乙醇（1：1）：菜5：100%乙醇：菜6：100%乙醇：菜7：95%乙醇：菜8：95%乙醇：菜9：乙醇80%：菜10：乙醇70%：菜11：去离子水（图1。菜设置）。
警告：二甲苯是一种危险的化学品，工作应在烟气罩中进行。
5. 蛋白解抗原检索
- 用蛋白酶（PBS的2.5微克/mL）治疗幻灯片30分钟，在菜12中进行蛋白解抗原检索。
- 然后在 PBS-T 中冲洗 10 分钟（第 13 道菜）。
- 用3%的过氧化氢治疗10分钟（第14道菜）。
- 再次，用PBS-T清洗10分钟（菜15）。
6. 染色程序
- 一次处理一个滑梯，将剩余的滑梯浸入缓冲区（不要取下整个滑动支架 - 保持滑梯湿润）。从组织部分周围取下一张滑梯并擦去多余的缓冲器（使用纸巾），小心不要打扰组织部分。在湿度室中孵化滑梯，通过放置湿纸巾，在室温下将湿纸巾放在实验室长椅上，用普通山羊血清（阻塞）在实验室的14 号台上放置15分钟。
- 在室温下与高于（步骤 6.1.）的负控制抗体一起孵育最佳预定稀释原发性抗狂犬病抗体（1：250 稀释小鼠抗狂犬病血清，未发布）和负控制抗体，在室温下与上述（步骤 6.1.）相同，60 分钟之间不清洗。
- 60 分钟后，用 PBS-T 清洗 10 分钟（第 16 道菜）。
- 在室温下在湿度室中用生物素化抗体（特定物种）孵育15分钟（处理与第6.1步相同）。
- 用 PBS-T 清洗 10 分钟（第 16 道菜）。
- 在室温下在湿度室中与斯特雷普塔维丁-HRP复合物一起孵育15分钟（处理方式与6.1相同）。
- 用 PBS-T 清洗 10 分钟（第 16 道菜）。
- 在室温下在湿室中用过氧化酶基板氨基乙酰卡巴佐尔（AEC）孵育10分钟。在使用前制作 AEC。为此，在 14 mL 的 0.1M 醋酸盐缓冲器（pH 5.2）中加入 1 mL 的 AEC 库存解决方案。添加 0.15 mL 的 3% H2O2。使用前过滤混合物（0.45μm 过滤器）。
注：AEC 的工作解决方案仅稳定 2-3 小时。AEC 库存溶液可在冰箱中存储更长时间。 - 在去离子水中清洗 10 分钟（菜 17）
- 与吉尔的血氧林反衬稀释 1：2 与去离子水 2 分钟 （菜 18） 。
- 用去离子水浸冲洗冲洗多余的血氧林（第19和20菜）。
- 在斯科特的自来水冲洗 30s （咆哮溶液） 菜 21 。
- 在去离子水中清洗 10 分钟（菜 22）
- 一次取出一个滑梯 - 安装水溶性安装介质。
- 在光显微镜上阅读幻灯片。
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Representative Results
图2 显示了不同脑组织检测中阳性和阴性对照样本的代表性IHC染色结果。 图2A、D、G 表示阳性样本为200倍， 图2B、E、H 对应放大400倍。 图2A-C 对应脑力： 图2D-F 对应小脑细胞和普金耶细胞： 图2G-I 对应海马。 图2C，F，我是 阴性对照样本。品红色染色表明，由于抗狂犬病抗原抗体的反应性，在蓝色背景（血氧林反污）中使用AEC基板进行颜色发育。AEC 是一种过氧化酶基板，在 HRP 催化的氧化反应后，在光显微镜下可观测到水溶性沉淀。
IHC 中的阳性结果对应于组织部分的品红色染色。细胞质内含物和不同尺寸的颗粒内含物的染色表明样本对RABV感染呈阳性反应。如果没有观察到特定的红色染色或仅观察到血氧素造成的蓝色背景，则样本被视为阴性。除了阳性染色外，内含物的分布还可以间接量化样本中狂犬病抗原的水平，这可能与组织样本的病毒载量相对应。无论分布水平如何，任何特定的污渍都会将样品分类为 RABV 抗原检测阳性。
图1：流程图，指示 IHC 测试的不同步骤。请单击此处查看此图的较大版本。
图2：正负狂犬病脑组织的免疫化学染色。 （A） 脑膜内病毒内含物和狂犬病病毒抗原检测在脑系统总放大200倍：（B） 正脑系统400倍：（C） 脑力系统负控制200倍：（D） 小脑内的狂犬病病毒内含物200倍：（E） 小脑和普金耶细胞400倍：（F） 小脑负控制：（G） 海马内的病毒内含物200倍：（H） 海马400倍：海马负控制 200 倍。红色污渍使用链球菌素-生物素复合染色方法（AEC基质）表示狂犬病病毒抗原的存在。血氧林计数器（蓝色）。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
由于症状发病后狂犬病死亡率高，对疑似动物的RABV感染诊断对于适当的暴露后预防治疗极为关键。狂犬病的诊断主要取决于使用新鲜或冷冻组织的DFA、DRIT和基于PCR的技术。对于正式固定组织的测试，IHC 测试为 RABV 抗原的敏感和特定检测提供了替代方法。虽然固定在甲醛中的组织由于侧链（如交叉链接）的改变而稳定了蛋白质，但样品需要在抗原检测之前进行处理。在本协议中，通过蛋白酶（例如 Pronase）的部分蛋白酶消化恢复表位，使初级抗体与 RNP 复合物结合。虽然对 N 蛋白有反应的 mAbs 主要依赖于 DFA 和 DRIT，但对 N 蛋白上的多个表位有反应的 pAb 更倾向于进行 IHC 测试。此外，与 mAbs 相比，不同 RABV 变种和非狂犬病利沙病毒的反应或 pAbs 可能更广泛。
IHC 测试的主要限制之一是该协议涉及几个顺序步骤，完成大约需要 6 个小时。如果组织需要固定在正式和嵌入石蜡块中，则需要额外 1 - 2 天才能弄脏组织。另一个限制是IHC测试中未提供商业原发性抗狂犬病抗体。但是，当只有 FF 组织可供测试时，IHC 确实提供了执行狂犬病诊断的选项。IHC 测试对于检测狂犬病病例尤其重要，如果一半的组织存储在正式组织（以及 DFA 测试的其他未修复组织中），并且有必要根据诊断要求测试脑系统和其他组织的完整横截面。通过IHC测试检测的狂犬病抗原可用于人类死后大脑样本，根据临床症状对疑似病例进行诊断和/或回顾性分析。虽然IHC没有被批准作为狂犬病诊断的主要或确认性测试，如DFA，该方法使用狂犬病特异性抗体检测抗原。使用新鲜/冷冻与FF组织的DFA比较提供了类似的灵敏度和特异性15。除非抗体直接与FITC（DFA测试的要求）结合，否则HRP标记的抗体可用于IHC染色狂犬病抗原。基于 HRP 的检测的优势在于能够使用光显微镜进行观察。目前市售的DFA试剂，FITC结合狂犬病特异性抗体（mAbs）不检测抗原后，正式固定由于表位的修改。然而，如果FITC结合狂犬病特异性pAb可用，它可以作为一种染色方法，如世界卫生组织16建议。除了抗原检测，FF组织还可以进行RNA分离，然后使用PCR和测序使用特定的引物来确认RABV基因组RNA的存在。
正式固定组织的其他优点包括通过血氧林和离子素染色方法确定组织学变化。虽然甲醛处理保留了蛋白质，但由于蛋白质的广泛交叉链接和核酸的降解或改性，它完全使样品中的大多数病原体失活。因此，与DFA相比，该方法提高了生物样品处理、运输和测试的安全性。DFA 中的丙酮固定步骤不会使 RABV 失活，应用适当的 PPE17处理。固定后的样品是稳定的，可以储存在环境温度下，这适用于低资源区，因为进入冷库的机会有限。同样，石蜡嵌入的正式固定组织可以考虑在环境温度下长期储存，而不会失去对蛋白质的抗体反应。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢实验室成员、流行病学家以及公共卫生部门的附属机构向疾病控制和预防中心提交样本。本报告的结论和结论是作者的，不一定代表疾病控制和预防中心的官方立场。使用商号和商业来源仅供识别，并不意味着得到疾病控制和预防中心的认可。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3% hydrogen peroxide | Pharamacy brands | Off the shelf 3% H2O2 | |
| 3-Amino-9-ethylcarbazole (AEC) | Millipore Sigma | A6926 | |
| Acetate Buffer pH 5.2 | Poly Scientific R&D Corp. | s140 | |
| Buffered Formalin 10% Phosphate Buffered | Fisher Scientific | SF100-4 | Certified |
| Cover slips Corning | Fisher Scientific | 12-553-471 | 24 X 50 mm |
| Ethanol 190 Proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol 200 Proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Gill's hematoxylin formulation #2 | Fisher Scientific | CS401-1D | |
| HistoMark Biotin-Streptavidin Peroxidase Kit | seracare | 71-00-18 | Mouse Primary Antibody |
| ImmunoHistoMount | Millipore Sigma | i1161 | Mounting media |
| N,N, Dimethyl formamide GR | Fisher Scientific | D119 | |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone | RR14440.01 | 01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6) |
| Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Objective | Multiple vendors | ||
| Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Objective | Multiple vendors | ||
| Pronase | Millipore Sigma | 53702 | Protease, Streptomyces griseus |
| Scott's Tap Water | Poly Scientific R&D Corp. | s1887 | |
| Tissue-Tek Slide stain set | Fisher Scientific | 50-294-72 | |
| TWEEN-80 | Millipore Sigma | P1754 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3S-4 | Histological Grade |
| Zeiss Axioplan 2 imaging - microscope | Multiple vendors |
References
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