Summary
Aqui, apresentamos um protocolo de teste de imunohistoquímica para a detecção de antígenos do vírus da raiva como um teste de diagnóstico alternativo para tecidos fixos de formalina.
Abstract
Uma das principais modalidades de diagnóstico para raiva é a detecção do complexo de ribonucleoproteína viral (RNP) nas amostras de tecido infectado. Embora o teste de anticorpos fluorescentes diretos (DFA) ou o teste imunohistoquímico rápido direto (DRIT) sejam mais comumente utilizados para a detecção de antígenos, ambos os testes requerem tecidos frescos e/ou congelados para impressões em lâminas antes da detecção de antígenos usando anticorpos. Se as amostras forem coletadas e fixadas em formalina, nenhum dos testes é ideal para a detecção de antígenos, no entanto, os testes podem ser realizados pela imunohistoquímica convencional (IHC) após a incorporação em blocos de parafina e secção. Com este método IHC, os tecidos são manchados com anticorpos antirraiva, seções são desparafinadas, antígenos recuperados por proteólise parcial ou outros métodos, e incubados com anticorpos primários e secundários. Os antígenos são manchados usando peroxidase de rabanete / amino etil carbazole e contra-manchados com hematoxilina para a visualização usando um microscópio leve. Além da detecção específica de antígenos, a fixação de formalina oferece outras vantagens como a determinação de alterações histológicas, condições relaxadas para armazenamento e transporte de amostras (sob temperaturas ambientes), capacidade de testar casos retrospectivos e maior segurança biológica através da inativação de agentes infecciosos.
Introduction
A raiva é uma encefalite progressiva aguda causada pelo sentido negativo vírus RNA pertencentes ao gênero lyssavirus1. Quase 99% de todas as mortes humanas causadas pela infecção pelo vírus da raiva (RABV), o tipo de membro do gênero, é transmitida por cães2. O diagnóstico de raiva de animais suspeitos baseia-se na detecção de antígeno (principalmente nucleoproteína codificada viral, n proteína) em complexo com RNA genômico (complexo de ribonucleoproteína, RNP) no tecido cerebral3. A detecção de antígeno pelo teste de anticorpo fluorescente direto (DFA) é considerada o padrão-ouro para o diagnóstico da raiva4. O método utiliza material cerebral congelado fresco ou fresco, uma impressão de toque em um slide, fixação em acetona, coloração usando isothionato fluorescente comercialmente disponível (FITC) rotulados anticorpos monoclonais ou policclonais (mAbs/pAbs) e lidos pela microscopia de fluorescência5. O teste de DFA é rápido, sensível e específico para detecção de antígeno de raiva em tecido cerebral fresco. Recentemente, foi demonstrado um teste imunohistoquímico rápido direto (DRIT), a técnica de imunohistoquímica modificada (IHC), que apresentou sensibilidade semelhante à DFA, mas oferece a vantagem da microscopia leve para visualização6. Embora o método de detecção utilizado no DRIT seja semelhante ao IHC, a etapa inicial utiliza tecidos frescos ou congelados para gerar impressões de toque da amostra seguidas de fixação em formalina.
IHC é uma técnica amplamente utilizada para determinar alterações histológicas e detecção de proteínas usando anticorpos específicos em tecidos fixos de formalina embutidos em blocos de parafina. IHC é um teste alternativo estabelecido para a detecção de antígenos da raiva nas seções teciduais7. A IHC tem sido particularmente utilizada para o diagnóstico de casos retrospectivos que apresentaram doenças neurológicas para determinar a carga da raiva8. Tecidos fixos de formalina embutidos em parafina preservam as proteínas para a detecção mesmo após vários anos quando armazenados à temperatura ambiente9. O tratamento formalin modifica as proteínas ao intercruzar e alterar as cadeias laterais de aminoácidos, o que pode tornar os epítoes não mais reativos contra anticorpos10. Embora o teste de IHC para detecção de antígenos da raiva envolva mAbs ou pAbs, este último é vantajoso, pois múltiplos epítopos e lyssavírus divergentes podem ser detectados11.
As etapas padrão envolvidas no IHC são a fixação formalina de tecidos, incorporação em blocos de parafina, secção de tecidos, desparafinação e hidratação, recuperação de epítopes, reatividade contra anticorpos primários e secundários e o desenvolvimento usando substratos cromogênicos. Este manuscrito descreve um relato detalhado do protocolo para diagnóstico de raiva. Para detecção de antígeno da raiva, o soro de camundongos imunizado com RABV (pAbs) gerado nos Centros de Controle e Prevenção de Doenças dos EUA (CDC) Atlanta, Geórgia, em combinação com anticorpos secundários anti-camundongos biotinilados são utilizados. O Abs biotinilado é detectado pela adição do complexo de peroxidase de rabanete streptavidin-horseradish (HRP), seguido pelo desenvolvimento de cores com substrato de amino-etilcarbazol.
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Protocol
Enquanto o protocolo IHC foi realizado em tecidos fixos de formalina, que inativam rabv se presente, protocolos de biossegurança apropriados devem ser devidamente seguidos. Todos os procedimentos de biossegurança estão descritos na Biossegurança nos Laboratórios Microbiológicos e Biomédicos (BMBL) 5ª Edição (https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm), incluindo o uso de equipamentos de proteção individual (EPI) adequados e exigência de vacinação conforme descrito12. Além disso, deve ser seguida a contenção e manuseio adequados de produtos químicos perigosos (como formalina, AEC e xileno), (por exemplo, capuzes de fumaça).
1. Fixação formalina de tecidos
- Coloque 3-5 mm de tecido cerebral coletado após a necropsia13 em 10% de solução de formalina tamponada fosfato (1:20 a 1:50 razão tecido/formalina) para 24-72 h.
ATENÇÃO: Formalina é um fixador tóxico. - Registo o peso aproximado do tecido (tamanho), o tipo de tecido (áreas cerebrais) e o volume de formalina. É importante que os laboratórios documentem e mantenham registros sobre os tempos de fixação.
- Para maior armazenamento de tecido após fixação de formalina e antes do processamento, coloque o tecido em 70% de etanol.
2. Processamento de tecidos
- Após a fixação da amostra, disseque o tecido para incluir as áreas cerebrais importantes, por exemplo, seções transversais do tronco cerebral, cerebelo (3 lóbulos) ou hipocampo (ambos hipocampi) cortaram de 3 a 5 mm de espessura e colocados em de processamento.
- Processe as fitas de tecido para infiltração de cera de parafina, embutidas em blocos de parafina e seccionadas (3 a 6 μm) em um microtome.
3. Preparação de Materiais / Pratos de coloração
- Configure o prato de coloração14 (Tabela de Materiais),conforme mostrado na Figura 1. Encha cada prato com 250 mL da solução.
- Preparação da solução de estoque de substrato 3-Amino-9-ethylcarbizol (AEC)
- Dissolva um comprimido de 20 mg de 3-amino 9-ethylcarbazole (AEC) em 5 mL de N,N, dimetilformamida usando uma pipeta de vidro.
ATENÇÃO: A AEC é um cancerígeno.
- Dissolva um comprimido de 20 mg de 3-amino 9-ethylcarbazole (AEC) em 5 mL de N,N, dimetilformamida usando uma pipeta de vidro.
- Preparação da solução de estoque protease (por exemplo, Pronase) para a recuperação de antígenos
- Dissolva 7 mg do protease em 200 mL de PBS.
- Preparação do tampão de enxaguar PBS-T
- Adicione 10 mL de Tween 80 a 990 mL de PBS. Misture bem para formar uma solução homogênea.
4. Desparafinação e reidratação tecidual
- Faça uma seção de parafina de 5 μm usando um microtome, flutue-a em um banho de água a 38 °C e colete em lâminas de vidro. Rotule os slides com uma caneta/marcador resistente ao reagente.
- Coloque os slides sobre uma bandeja e derreta em um forno de 55-60 °C por 1 h. Não aumente a temperatura acima de 60 °C, pois pode destruir o antígeno viral.
- Retire os slides do forno e desparafinar imediatamente em 3 lavagem de xileno consecutivo de 5 min cada nos pratos 1, 2 e 3.
- Reidratar as seções no slide por imersões sequenciais na diminuição da diluição do etanol para a água desionizada: (4 a 11 é um mergulho enxaguar) prato 4: xileno/100% etanol (1:1); prato 5: 100% etanol; prato 6: 100% etanol; prato 7: 95% etanol; prato 8: 95% etanol; prato 9: 80% etanol; prato 10: 70% etanol; prato 11: água deionizada(Figura 1. Configuração de pratos).
ATENÇÃO: O xileno é um produto químico perigoso e o trabalho deve ser conduzido em um capô de fumaça.
5. Recuperação de antígeno proteolítico
- Trate slides com a protease (2,5 μg/mL de PBS) por 30 min para recuperação de antígeno proteolítico no prato 12.
- Em seguida, enxágue em PBS-T por 10 min (prato 13).
- Trate com 3% de peróxido de hidrogênio por 10 min (prato 14).
- Novamente, lave com PBS-T por 10 min (prato 15).
6. Procedimento de coloração
- Manuseie slides um de cada vez mantendo os slides restantes submersos no buffer (não remova todo o suporte de lâminas - mantenha os slides molhados). Remova um slide e limpe o excesso de tampão (usando uma toalha de papel) ao redor da seção tecidual, tomando cuidado para não perturbar a seção do tecido. Incubar lâminas em uma câmara de umidade, feita colocando toalhas de papel umedecidas, no banco de laboratório superior14 em temperatura ambiente com soro de cabra normal (bloqueio) por 15 minutos.
- Incubar com o anticorpo antirraiva primário pré-determinado ideal de diluição (1:250 diluição do soro antirrábica do camundongo, inédito) (controle positivo) e anticorpos de controle negativos à temperatura ambiente mesmo que acima (passo 6.1.) por 60 minutos sem lavagens no meio.
- Depois de 60 min, lave com PBS-T por 10 min (prato 16).
- Incubar com o anticorpo biotinilado (espécies específicas) em uma câmara de umidade à temperatura ambiente por 15 minutos (manuseando o mesmo que o passo 6.1.).
- Lave com PBS-T por 10 min (prato 16).
- Incubar com complexo Streptavidin-HRP em uma câmara de umidade à temperatura ambiente por 15 minutos (manuseando o mesmo que 6.1.).
- Lave com PBS-T por 10 min (prato 16).
- Incubar com substrato peroxidase, amino-etilcarbazol (AEC), em uma câmara de umidade em temperatura ambiente por 10 minutos. Faça AEC pouco antes de usar. Para isso, adicione 1 mL de solução de estoque AEC a 14 mL de tampão de acetato de 0,1M, pH 5.2. Adicione 0,15 mL de 3% H2O2. Filtre a mistura pouco antes do uso (filtro de 0,45 μm).
NOTA: A solução de trabalho da AEC é apenas estável por 2-3 h. A solução de estoque AEC pode ser armazenada na geladeira por períodos mais longos. - Lave em água deionizada 10 min (prato 17)
- Contra-manchada com hematoxilina de Gill diluída 1:2 com água deionizada por 2 min (prato 18).
- Enxágüe o excesso de hematoxilina com enxaguação de água deionizada (prato 19 e 20).
- Enxágüe no prato 30 s (solução bluing) da Torneira de Scott.
- Lave em água deionizada 10 min (prato 22)
- Remova slides um de cada vez - monte com meio de montagem solúvel em água.
- Leia slides em um microscópio leve.
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Representative Results
A Figura 2 demonstra resultados representativos de coloração do IHC de amostras de controle positivas e negativas em diferentes tecidos cerebrais testados. A Figura 2A,D,G representa amostras positivas em 200x, enquanto a Figura 2B,E,H corresponde à ampliação de 400x, respectivamente. Figura 2A-C correspondem ao tronco cerebral; Figura 2D-F correspondem às células cerebelo e purkinje; e Figura 2G-I correspondem ao hipocampo. Figura 2C,F, sou amostras de controle negativos. A coloração vermelha magenta demonstra o desenvolvimento de cores usando substrato AEC no fundo azul (contrastain de hematoxilina) devido à reatividade de anticorpos contra o antígeno da raiva. AEC é um substrato peroxidase, que após a reação de oxidação, catalisado pelo HRP, resulta em água insolúvel precipitado observável sob um microscópio leve.
Um resultado positivo no IHC corresponde à coloração vermelha magenta em seções de tecido. A coloração de inclusões citoplasmáticas e inclusões granulares de tamanho variado são indicativos de amostras positivas para infecções de RABV. As amostras são consideradas negativas se não for observada nenhuma coloração vermelha específica ou apenas o fundo azul devido à hematoxilina. Além da coloração positiva, a distribuição das inclusões poderia proporcionar quantificação indireta dos níveis de antígeno da raiva na amostra, o que pode corresponder à carga viral das amostras de tecido. Independentemente dos níveis de distribuição, qualquer coloração específica classificará a amostra como positiva para detecção de antígenos RABV.
Figura 1: Gráfico de fluxo indicando diferentes etapas para o teste de IHC. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Coloração imunohistoquímica do tecido cerebral da raiva positiva e negativa. (A) Inclusões virais intracytoplasmáticas e detecção de antígenos do vírus da raiva no tronco cerebral 200x ampliação total; (B) tronco cerebral positivo 400x; (C) controle negativo do tronco cerebral 200x; (D) inclusões do vírus da raiva no cérebro 200x; (E) células de cerebelo e purkinje 400x; (F) controle negativo do cerebelo; (G) Inclusões virais dentro do hipocampo 200x; (H) hipocampo 400x; controle negativo do hipocampo 200x. A mancha vermelha indica a presença de antígeno do vírus da raiva usando o método de coloração complexo Streptavidin-biotin (substrato AEC). Contra-mancha de hematoxilina (azul). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Devido à alta taxa de letalidade da raiva após o início dos sintomas, o diagnóstico de animais suspeitos para infecção por RABV é extremamente crítico para um tratamento profilático pós-exposição adequado. O diagnóstico da raiva depende principalmente de técnicas baseadas em DFA, DRIT e PCR usando tecidos frescos ou congelados. Para testes de tecidos fixos de formalina, o teste IHC fornece um método alternativo para a detecção sensível e específica do antígeno RABV. Embora os tecidos fixados em formalina tenham proteínas estabilizadas devido à modificação de cadeias laterais como a ligação cruzada, as amostras precisam ser processadas antes da detecção do antígeno. Neste protocolo, os epítopos foram recuperados através da digestão proteolítica parcial pela protease (por exemplo, Pronase) para permitir a ligação dos anticorpos primários ao complexo RNP. Enquanto os mAbs reativos contra a proteína N são predominantemente confiados em DFA e DRIT, pAbs que são reativos contra vários epítopos em proteína N seriam preferidos para um teste de IHC. Além disso, a reatividade ou pAbs poderia ser mais ampla contra diferentes variantes de RABV e contra lyssavírus não-raiva em comparação com mAbs.
Uma das principais limitações do teste IHC é que o protocolo envolve várias etapas sequenciais e leva cerca de 6 horas para ser concluído. Se o tecido precisa ser fixado em formalina e embutido em blocos de parafina, requer um adicional de 1 a 2 dias antes que o tecido possa ser manchado. Outra limitação é a não disponibilidade de anticorpos antirrábica primários comerciais para o teste de IHC. No entanto, o IHC oferece uma opção para realizar o diagnóstico de raiva quando apenas tecidos FF estão disponíveis para testes. O teste de IHC é particularmente importante para testar casos de raiva se metade dos tecidos são armazenados em formalina (e outros tecidos não fixados testados pela DFA) e foi necessário testar seção transversal completa do tronco cerebral e outros tecidos, conforme necessário para o diagnóstico. A detecção de antígenos por teste de IHC pode ser utilizada para amostras cerebrais pós-morte humanas para o diagnóstico e/ou análise retrospectiva de casos suspeitos com base nos sintomas clínicos. Embora o IHC não tenha sido aprovado como teste primário ou confirmatório para diagnóstico de raiva, como o DFA, o método detecta antígeno usando anticorpos específicos da raiva. A comparação da DFA utilizando tecidos frescos/congelados vs FF proporcionou sensibilidade e especificidade semelhantes15. A menos que os anticorpos sejam diretamente conjugados ao FITC (o requisito para o teste de DFA), anticorpos rotulados hrp podem ser usados em IHC para colorir antígeno da raiva. A vantagem com a detecção baseada em HRP é a capacidade de usar um microscópio de luz para a observação. Os reagentes DFA disponíveis comercialmente atualmente, os anticorpos específicos da raiva conjugada fitc (mAbs) não detectam antígeno após fixação de formalina devido à modificação de epítopos. No entanto, se os pAbs específicos da raiva conjugadas do FITC estiverem disponíveis, ele pode ser usado como método de coloração, conforme recomendado pela Organização Mundial da Saúde16. Além da detecção de antígenos, os tecidos FF podem ser submetidos ao isolamento do RNA seguido de PCR e sequenciamento usando primers específicos para confirmar a presença de RNA genômica RABV.
As outras vantagens dos tecidos fixos formalina incluem a determinação de alterações histológicas pelo método de coloração de hematoxilina e eosina. Embora o tratamento formalin preserve proteína, ele inativa completamente a maioria dos patógenos na amostra devido ao extenso cruzamento de proteínas e degradação ou modificação de ácidos nucleicos. Assim, o método melhora a segurança do manuseio biológico de amostras, envio e testes em relação ao DFA. A etapa de fixação de acetona no DFA não inativar o RABV e deve ser tratada com EPI17apropriado . As amostras após a fixação da formalina são estáveis e podem ser armazenadas à temperatura ambiente, que é adequada para áreas de baixo recurso onde o acesso a um armazenamento a frio é limitado. Da mesma forma, tecidos fixos de formalina incorporados à parafina podem ser considerados para o armazenamento a longo prazo a temperaturas ambientais sem perder a reatividade do anticorpo contra proteínas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos aos laboratórios, epidemiologistas e afiliados às secretarias de saúde pública pelas submissões de amostras aos Centros de Controle e Prevenção de Doenças. Os achados e conclusões deste relatório são dos autores e não representam necessariamente a posição oficial dos Centros de Controle e Prevenção de Doenças. O uso de nomes comerciais e fontes comerciais são apenas para identificação e não implicam endosso pelos Centros de Controle e Prevenção de Doenças.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3% hydrogen peroxide | Pharamacy brands | Off the shelf 3% H2O2 | |
| 3-Amino-9-ethylcarbazole (AEC) | Millipore Sigma | A6926 | |
| Acetate Buffer pH 5.2 | Poly Scientific R&D Corp. | s140 | |
| Buffered Formalin 10% Phosphate Buffered | Fisher Scientific | SF100-4 | Certified |
| Cover slips Corning | Fisher Scientific | 12-553-471 | 24 X 50 mm |
| Ethanol 190 Proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol 200 Proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Gill's hematoxylin formulation #2 | Fisher Scientific | CS401-1D | |
| HistoMark Biotin-Streptavidin Peroxidase Kit | seracare | 71-00-18 | Mouse Primary Antibody |
| ImmunoHistoMount | Millipore Sigma | i1161 | Mounting media |
| N,N, Dimethyl formamide GR | Fisher Scientific | D119 | |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone | RR14440.01 | 01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6) |
| Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Objective | Multiple vendors | ||
| Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Objective | Multiple vendors | ||
| Pronase | Millipore Sigma | 53702 | Protease, Streptomyces griseus |
| Scott's Tap Water | Poly Scientific R&D Corp. | s1887 | |
| Tissue-Tek Slide stain set | Fisher Scientific | 50-294-72 | |
| TWEEN-80 | Millipore Sigma | P1754 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3S-4 | Histological Grade |
| Zeiss Axioplan 2 imaging - microscope | Multiple vendors |
References
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