Summary
Denne protokol beskriver mikrobielle eksperimenter under forhøjet tryk for at studere in situ biomining processer. Den eksperimentelle tilgang anvender en Rocking højtryks reaktor udstyret med en guld-titanium reaktions celle, der indeholder en mikrobiel kultur i et surt, jern rigt medium.
Abstract
Laboratorieundersøgelser, der undersøger Mikrobielle processer under overfladen, såsom udvaskning af metal i dybe malmforekomster (biomining), deler fælles og udfordrende forhindringer, herunder de særlige miljøforhold, som skal gentages, f. eks. og i nogle tilfælde sure opløsninger. Førstnævnte kræver en eksperimentel opsætning egnet til trykdannelse op til 100 bar, mens sidstnævnte kræver en væskebeholder med høj kemisk resistens mod korrosion og uønskede kemiske reaktioner med beholderen væggen. For at opfylde disse betingelser for en applikation inden for in situ-biomining blev der anvendt en særlig fleksibel guld-titanium reaktions celle i en Rocking højtryks reaktor i denne undersøgelse. Det beskrevne system tillod simulering af in situ-biomining gennem svovl-drevet mikrobiel jern reduktion i et anoxisk, tryk kontrolleret, yderst kemisk inert forsøgsmiljø. Den fleksible guld-titanium reaktions celle kan rumme op til 100 mL prøveopløsning, som kan udtages på et givet tidspunkt, mens systemet bevarer det ønskede tryk. Eksperimenter kan udføres på tidshorisonter, der spænder fra timer til måneder. Montering af højtryks reaktoren system er temmelig tidskrævende. Ikke desto mindre, når komplekse og udfordrende (mikrobiologiske) processer, der forekommer i Jordens dybe underjordiske i kemisk aggressive væsker skal undersøges i laboratoriet, fordelene ved dette system opvejer ulemperne. Resultaterne viste, at selv ved højt tryk er det mikrobielle konsortium aktivt, men med betydeligt lavere stofskifte rater.
Introduction
I løbet af det seneste årti er bestræbelserne på at minimere indvirkningen af minedrift på miljøet steget. Åben minedrift til råstofudvinding af malm (f. eks. kobber rige sulfid malm), påvirker det omgivende landskab ved udgravnings aktiviteterne og de store resterende mængder af affalds sten og rester af forarbejdet malm efter udvinding af ædle metaller som kobber. Udvinding af kobber direkte fra malm i underlaget vil reducere disse påvirkninger betydeligt. Teknologien til in situ-biomining er en lovende kandidat til denne proces1. Denne publikation beskriver brugen af stimuleret mikrobiel aktivitet til at udtrække de ædle metaller fra malm til en vandig opløsning i underlaget. Således kan en kobber-rige opløsning let pumpes tilbage til overfladen for yderligere at koncentrere metallet, for eksempel.
Aktiviteten af malm-udvaskning acidophilic mikroorganismer er blevet undersøgt i mange laboratorier for en bred vifte af parametre2,3,4,5,6. Imidlertid er trykpåvirkninger på den mikrobielle aktivitet som følge af forskellen mellem de omgivende overflade laboratorieforhold (nær 1 bar) og under overfladen i en dybde på 1.000 m med hydrostatiske forhold (~ 100 bar) ikke veldokumenterede. Derfor er virkningerne af presset på mikrobiel jern reduktion blevet undersøgt gennem forskellige eksperimentelle veje7. Her beskrives den mest velegnede teknik i detaljer.
Højtryksreaktorer er blevet brugt i udstrakt grad til at studere reaktioner ved tryk og temperaturer, der forekommer i Jordens under flade. Sådanne reaktorer består af et reaktor fartøj i bunden, der kan indeholde en væskeprøve med en mikrobiel kultur. På toppen af reaktorbeholderen tilbyder reaktor hovedet en bred vifte af tilslutninger og grænseflader til sikkerhedsforanstaltninger og overvågnings sensorer (f. eks. temperatur eller tryk). De fleste højtryks reaktorer er fremstillet af rustfrit stål. Dette materiale giver høj modstandsdygtighed og gode bearbejdningsegenskaber, men korrosions modstanden i den rustfri stål overflade er ikke tilstrækkelig til enhver applikation. For eksempel, hvis meget sure eller stærkt reducerende vandige opløsninger undersøges, signifikante reaktioner af de forbindelser af interesse med reaktoren væggen kan forekomme. En måde at undgå dette på er at indsætte en liner i reaktorbeholderen, for eksempel en liner fremstillet af borosilicat glas7. Det er let at rengøre og kan steriliseres ved autoclaving. Desuden er det ikke angrebet af sure eller reducere vandige opløsninger. Selv om en liner kan hjælpe med at forhindre kunstige reaktioner af opløsningen eller mikrober i opløsningen med den rustfri-stålreaktor væggen, flere problemer tilbage. For en, hvis en ætsende gas dannes, såsom hydrogensulfid produceret af sulfat-reducerende bakterier, denne gas kan reagere med den udækkede overflade af reaktoren hoved sidder over liner. En anden ulempe er, at det ikke er muligt at trække en prøve fra reaktoren tilbage og samtidig opretholde trykket.
For at overvinde disse begrænsninger, specialiserede fleksible reaktions celler inde i højtryksreaktorer er udviklet til en række forskellige anvendelser. En fleksibel polytetrafluorethylen (PTFE) celle8 blev designet til opløselighed undersøgelser af salte i stærkt saltvand. Men begrænsningen af dette system er, at nogle gasser let kan trænge ind i PTFE. Desuden har dette materiale stadig en relativ lav temperaturstabilitet. Således blev systemet forbedret ved at designe en fleksibel guld pose med et titanium hoved9 , der skulle anbringes i højtryks reaktoren i rustfrit stål. Guld overfladen er korrosionsbestandig mod sure eller reducerende opløsninger og gasser. Titanium overfladen er også meget inert, når passiveret grundigt at danne en kontinuerlig titandioxid lag. Under prøvetagning fra denne reaktions celle gennem et tilsluttet titanium prøvetagnings slange krymper guld posen i volumen. Systemets interne tryk opretholdes ved at pumpe den samme mængde vand, som trækkes tilbage ved prøvetagning, ind i den rustfri stål højtryks reaktor, der imødekommer reaktions cellen. Prøven inde i reaktions cellen holdes i bevægelse ved at Rocking eller vippe højtryks reaktoren med mere end 90 ° under forsøget.
Reaktions cellen består af de dele, som er afbildet i figur 1: guld posen, titanium krave, titanium hoved, rustfri stål skive, titanium kompressions bolt ring, titanium prøvetagnings slange med rustfrit kirtler og kraver til højtryks koned og gevindforbindelser på begge sider og Titanium ventilen. Guld posen er en cylindrisk guld (AU 99,99) celle med en vægtykkelse på 0,2 mm, en udvendig diameter på 48 mm og en længde på 120 mm.
Alle titanium dele er skræddersyet af workshoppen fra titanium Grade 2 stænger. Dimensionerne af kraven, hoved, Skive, og kompressions bolt ring er synlige i figur 2. Titanium prøvetagningsrøret er et kapillar af titanium med en udvendig diameter på 6,25 mm og en vægtykkelse på 1,8 mm, hvilket resulterer i en indvendig diameter på 2,65 mm. Det er fastgjort i titanium hovedet og Titanium ventilen ved højtryks koned og gevindforbindelser sikrer en forsegling af titanium-mod-titanium overflader. Højtryks titanium ventilen er udstyret med en langsom åbnings stilk for at give mulighed for meget kontrolleret åbning eller prøvetagning selv ved højt tryk. Dette system blev anvendt i talrige undersøgelser10,11,12.
Protocol
1. forberedelse af den mikrobielle kulturs medium og inokulering
- Forbered et basal salt medium til autotrofisk prokaryoter i henhold til offentliggjorte teknikker13. Kemikalierne opløses og blandes i destilleret vand (mg/L): na2så4· 10h2o (150) (NH4)2så4 (450), KCl (50), MGSO4· 7h2o (500), KH2po4 (50) og ca (no 3) 2· 4h2O (7).
- Der tilsættes 1 mL/L af en 1.000 x koncentreret sporings element opløsning indeholdende (g/L): ZnSO4· 7h2o (10), CuSO4· 5H2o (1), mnso4· H2o (0,76), CoSO4· 7h2o (1), CRK (so4)2· 12h2o (0,4), H3bo3 (0,6), namoo4· 2H2o (0,5), niso4· 6h2o (1), na 2 SeO4 (0,51), na2wo4· 2H2O (0,1) og navo3 (0,1). PH-værdien justeres til 1,8 ved tilsætning af 5 M svovlsyre.
- Steriliser mediet i en autoklave ved 121 °C og 1,2 bar i 20 min., og Sterilisér den ferriske jern opløsning ved filtrering gennem en 0,22 μm porestørrelse sprøjte filter.
- 50 ml af det steriliserede basal salt medium overføres til en serum flaske og tilsættes jern jern opløsning og elementært svovl til en endelig koncentration på henholdsvis 50 mm og 10 g/L.
- Inokulere mediet med en blandet kultur bestående af flere mesoacidophilic jern-oxiderende prokaryoter14.
- Hætte serum flasken med steriliseret butylgummiprop og tætning med aluminiums krymper.
- Kraftigt boble kulturmediet med N2 for at fratage opløst ilt i 25 min. Brug to nåle, Placer en dybere i flaske hovedet, den anden tæt på hætten.
- Der indsprøjtes CO2 for at opnå en 90% N2 -og 10% Co2 -atmosfære i serum flaskens headspace. Inkubatér kulturen uden omrøring ved 30 °C i mørket.
2. klargøring af guld-titanium-reaktions cellen og højtryks reaktoren
- Rengør guld-titanium reaktions cellen.
- Disassemblering af reaktions cellen i de enkelte dele for at undgå kontakt af syre med de rustfri ståldele eller eksponeringen af de monterede dele med forskellige termiske ekspansions egenskaber til opvarmning.
- Rengør de overflader, der vil være i kontakt med prøven under forsøget (dvs. guld posen, titanium hovedet, titanium prøvetagningsrøret og Titanium ventilen).
- Sæt guld posen og Titanium hovedet i et glasbæger.
- Tilføj nok 10% HCl til at dække alle delene.
- Syren opvarmes på en varmeplade til 50 °C i 3 timer under omrøring.
- Fjern delene med PTFE-pincet fra syreopløsningen, og skyl dem med deioniseret vand.
- Skyl den indvendige overflade af guld posen og Titanium hovedet grundigt med 65% HNO3 og derefter med deioniseret vand.
- Skyl den indvendige overflade af titanium prøvetagningsrøret og Titanium ventilen med 10% HCl, efterfulgt af deioniseret vand, 65% HNO3, og derefter deioniseret vand igen.
- Rengør alle dele mod organisk kontaminering ved at skylle dem med acetone.
- Alle dele i ovnen tørres ved 105 °C i mindst 1 time.
- Opvarm overfladerne på guld posen, titanium hovedet og Titanium prøvetagningsrøret ved at udsætte dem for en temperatur på 450 °C i 4 timer i en muffelovn i en luft atmosfære.
Bemærk: denne procedure steriliserer overfladerne og resulterer i dannelsen af et passiverende titandioxid lag på alle titanium overflader. Titanium delene skal have en gul til blå farve efter varmebehandlingen. - Anneal guld cellen for at øge fleksibiliteten af guldet ved at nulstille små krystalliserings domæner ved at anvende varme med en propan fakkel. Opvarm guld overfladen rundt for at reducere Kinks i det guld, der kunne have dannet under den sidste krympning af guld pose volumen i et eksperiment. Sørg for ikke at opvarme guldet for meget på ét sted for at undgå, at det smelter.
Bemærk: en rød glød af guld overfladen viser tilstrækkelig opvarmning. - Saml guld posen i titanium kraven, og Titanium prøvetagnings slangen i titanium hovedet ved hjælp af et drejningsmoment på 10 nm for kirtlerne.
- Undersøg højtryks reaktoren.
- Kontroller visuelt reaktoren for mulige skader, korrosion og løse dele.
Bemærk: der skal lægges særlig vægt på forseglingen og den savsporet, hvor forseglingen finder sted. Hvis en grafit pakning tidligere blev brugt til at forsegle reaktoren, kan resterne af den stadig være i savsporet og bør fjernes med en plastik stift før næste eksperiment. - Påfør kobber sulfid pasta til trykbærende bolte i højtryks reaktoren hoved. Sørg for, at fedtet er fordelt over hele tråden.
- Kontrollér den skruemonterede kompressions forsegling for længden af den resterende grafit pakning.
- Kontroller visuelt reaktoren for mulige skader, korrosion og løse dele.
3. påfyldning og samling af guld-titanium reaktions cellen under anoxiske forhold
- Læg handske æsken i.
- Forbered dyrkningsmediet i serum flaskerne i henhold til punkt 1.
- Pak de dele af goldtitanium reaktions cellen, der senere vil være i kontakt med prøven i aluminiumsfolie for at minimere enhver potentiel kontaminering.
- Åbn og lås op for handske boksens forgemakket, Læg alt det indgående materiale på den flytbare bakke, og luk og lås frontdækslet.
- Evakuer den forgemakket 3x og oversvømme den med høj renhed nitrogen.
- Bær et par handsker og få så tæt som muligt på det indvendige dæksel. Lås og Åbn det indvendige dæksel for at fjerne det indgående materiale fra den flytbare bakke.
- Luk og lås det indvendige dæksel.
- Fyld guld cellen.
- Pak den rene guld pose ud og stå op med et glasbæger, f. eks. Åbn serum flasken indeholdende 100 ml bakteriekultur og elementært svovl.
- Ryst forsigtigt serum flasken og Overfør bakterie kulturen til guld posen.
- Saml reaktions cellen.
- Indsæt titanium hovedet med det vedlagte titanium prøvetagnings slange i titanium kraven, der omslutter den øvre rand af guld posen.
Bemærk: Sørg for, at tætningsfladen på den koniske nedre del af titanium hovedet passer jævnt ved at dreje den 90 ° frem og tilbage. - Skub spændeskiven og kompressions bolt ringen over titanium prøvetagningsrøret på titanium hovedet.
Bemærk: Drej kompressions bolt ringen i titanium kraven med 30 ° for at justere flangerne på titanium kraven og stak bolt ringen. - Fastgør de seks Allen skruer i samme omfang for at sikre en jævn trykfordeling af titanium hovedet på den øverste rand af guld posen i titanium kraven (dvs. tætningsfladen af reaktions cellen).
Bemærk: Fastgør Allen-skruerne i kompressions bolt ringen, indtil den er hånd spændt, så drejningsmomentet for de modsatte skruer forøges først (krydsende), før du fortsætter med uret.
- Indsæt titanium hovedet med det vedlagte titanium prøvetagnings slange i titanium kraven, der omslutter den øvre rand af guld posen.
- Geninstaller prøvetagnings ventilen øverst på titanium røret. Fastgør forbindelsen hånd-stram og sørg for at lukke ventilen.
- Fjern alle dele fra handske kassen.
4. montering af højtryks reaktoren med reaktions cellen
- Saml reaktions cellen i reaktor hovedet.
Bemærk: installationen af højtryks reaktoren kommer med en meget kort eksponering af den åbne ende af prøvetagningsrøret til den omgivende atmosfære, da prøvetagnings ventilen skal fjernes for at styrerøret gennem skrue tætningen i reaktor hovedet. Til installationen, skal reaktoren hovedet allerede placeres i en bænk skruestik. En vinkel på 45 ° gør det nemmere at håndtere. Monteringen af kompressions forseglingen (beliggende i den centrale placering af reaktor hovedets Gage-blok samling), som holder prøvetagningsrøret på plads, skal være åben.- Fjern titanium prøvetagnings ventilen, skruen og kraven på toppen af prøvetagningsrøret.
- Guide røret med reaktions cellen fastgjort gennem det centrale hul i reaktoren hoved indtil omkring 5 cm af røret passere igennem. Skub den store skrue overrøret og fastgør den lille krave.
Bemærk: nu kan reaktions celle samlingen ikke glide tilbage gennem reaktor hovedet, og begge hænder er frie til at geninstallere prøvetagnings ventilen. - Monter titanium ventilen igen.
- Stram kompressions tætningen.
- Fjern reaktor hovedet fra bænken skruestik for at installere det på reaktoren fartøj.
- Forbered dig på at forsegle reaktoren.
- Sæt grafit forseglingen på reaktorens savsporet.
- Placer forsigtigt reaktor hovedet med den vedlagte reaktions celle på reaktorbeholderen.
Bemærk: reaktor hovedet, herunder termo parret, skal placeres forsigtigt på reaktorbeholderen for ikke at beskadige guld posen eller termo parret.
- Fyld reaktorbeholderen med en blanding af deioniseret og ledningsvand (ca. i et 1:1-forhold).
- Forsegl reaktoren.
- Kontroller kraven for at sikre, at de nederste ender af kompressions bolte ikke stikker ud af deres tråde. Ellers vil trykbeholderen ikke være korrekt installeret.
- Løft kraven og Placer den omkring de fremspringende kanter på reaktoren headvessel-grænsefladen. Forsigtigt at flytte kraven på det vil resultere i en ordentlig pasform. Luk snap låsene og hold kraven på plads.
- Fastgør kompressions skruerne efter et Krydsmønster og øg drejningsmomentet i moderate trin, indtil den endelige værdi, som anbefales af producenten, er nået.
Bemærk: forskellige højtryks reaktorsystemer kan have forskellige momentværdier. - Endelig Fastgør kompressions skruerne med uret.
- Installer højtryks reaktoren i Rocking-enheden.
Bemærk: installationen af højtryks reaktoren i Rocking-anordningen er beskrevet for en skræddersyet model fremstillet på Federal Institute for Geociences og naturressourcer i Hannover, Tyskland. Derfor er den beskrevne installation en generel retningslinje for enheder med sammenlignelige design.- Monter reaktoren forsigtigt i Rocking-enheden.
Bemærk: det er bedst at holde højtryks reaktoren af Gage-blok monteringsdelene (f. eks. manometer eller prøvetagnings rørskruer), samtidig med at den sænkes i gynge anordningen. - Fikter reaktoren med to klemmer over et par lange skruer.
- Placer Spændeskiver på hver skrue og stram klemmerne med skrue møtrikker.
- Tilslut betjeningsenhederne til termo parret, tryk transduceren og varmeelementet.
Bemærk: det er vigtigt at sikre, at alle ledninger er af tilstrækkelig længde til Rocking bevægelse og forhindre kontakt til de opvarmede overflader. - Skub varmeelementet over reaktorbeholderen, og stram skrue låsen.
Bemærk: vandet til tryk systemet er taget fra et reservoir med en højtrykspumpe. Den overføres gennem kapillærer af rustfrit stål i højtryks reaktoren.
Bemærk: Rocking af højtryks reaktoren garanterer en grundig blanding af reaktions cellens indhold (dvs. gassen, væsken og alle faste faser i den). En langsom gynge hastighed er vigtigt for at forhindre beskadigelse af guld posen ved hurtigt bevægende faste stoffer eller ved deformation på grund af tyngdekraften effekter på det fleksible guld ved forhøjede temperaturer. Gynge systemet kan rotere med tæt på 180 °.
- Monter reaktoren forsigtigt i Rocking-enheden.
5. start af eksperimentet
- Kontroller, om temperatur-og tryk grænserne i overvågnings softwaren er indstillet til de ønskede værdier.
Bemærk: i dette eksperiment blev de sat til 70 °C og 25 MPa. - Udfør en lækagekontrol.
- Tilslut tryk røret, en rustfrit stål kapillar, til reaktoren hoved.
- Løft trykket til måltrykket med forskellige intervaller, mens du løbende tjekker for lækage.
- Hold Tryk konstanten, indtil pumpens strømningshastighed er næsten nul.
Bemærk: pas på, at Komprimerbar, opløst luft i vand er synlig i lang tid i subtile flow aflæsninger.
- Start opvarmningen efter en vellykket lækagekontrol.
- Start logføringen af trykpumpe pumperne.
- Justér det indstillede punkt for opvarmningen til den ønskede værdi, og start opvarmningen med softwaren.
- Kontrollér regelmæssigt alle parametre og systemstatus.
- Skru tryk røret af efter at have nået måltemperaturen.
- Start Rocking-enheden.
6. prøvetagning af højtryks reaktoren i driftstilstand
- For at udtage en prøve skal du vedhæfte en 5 mL sprøjte til luer Lock-stikket på prøvetagnings ventilen øverst på højtryksreaktoren.
- Åbn forsigtigt ventilen, og lad Væskeprøven trænge ind i sprøjten med trykket inde i højtryksreaktoren. Luk ventilen efterprøve volumenet når 1 mL. Tag sprøjten af.
- Prøverne i sprøjten overføres straks til et 2 mL rør i en stinkhætte til forarbejdning.
7. Analyse af væskeprøve
Bemærk: kun trinene for den mindre almindeligt fotometriske ferrozinassay (dvs. afsnit 7,1) er beskrevet her i detaljer og er nævnt i videoen, fordi de andre trin er standardoperationsprocedurer i mikrobiologi.
- Der anvendes en ferrozinassay til fotometrisk bestemmelse af koncentrationen af opløst jernholdigt jern (fe2 +(aq)) og total jern (feTOT)15.
- Forbered en række jernholdige jern standardopløsninger ved at opløse kendte mængder af FeSO4· 7 H2O i vand.
- Bland 50 μL af disse standardniveauer med 1 mL af en 1 M ferrozinopløsning.
Bemærk: reaktionen af ferrozine med det opløste jernholdige jern danner et lilla kompleks. Intensiteten af farven korrelerer til jernholdige jernkoncentrationen. - Der etableres en kalibreringskurve mellem jernkoncentrationen og absorbansen af jernferrozinkomplekset.
- Koncentrationen af jernholdigt jern i en prøve beregnes ud fra to parallelle målinger i overensstemmelse med den fastlagte standardkurve.
- Analysér pH-værdien og oxidations/reduktionspotentialet (ORP) med digitale pH/redox-målere med semimikro-pH-elektroder og en sølv-chloridelektrode hhv.
- Tæl planktoniske celler direkte ved hjælp af et let mikroskop med et Thoma kammer.
- Undersøg celle morfologi ved at scanne elektronmikroskopi (SEM).
- Filtrer planktoniske celler dyrket under forskellige forhold gennem et 0,1 − 0,2 μm pore størrelses filter.
- Dehydrat prøverne med acetone, og opbevar dem natten over ved 4 °C i 90% acetone.
- Tør prøverne ved kritisk punkt tørring og pels dem med grafit eller guld.
- Undersøg prøver med et felt emissions scannings elektronmikroskop (FE-SEM) ved 10 kV.
Representative Results
Resultaterne af højtryks reaktoren eksperimenterer med den særlige guld-titanium reaktions celle viser, at den mikrobielle blandede kultur af acidophiles oxideret svovl og reduceret jern jern til jernholdigt jern (figur 3).
Ved både 1 bar eller 100 bar trykforhold, havde kulturerne en lag fase, når de dyrkes i guld-titanium reaktions cellen. Efter denne periode forekom en hurtig stigning i koncentrationen af jernholdige jern fra ca. 9 mM til 31 mM i kulturen dyrket i 1 bar. Over inkubationstiden på 22 dage blev der detekteret ~ 31 mM og 13 mM jernholdigt jern i assays på henholdsvis 1 bar og 100 bar. Dette viser tydeligt, at de mikrobielle celler var aktive på 100 bar, men deres jern-reducerende aktivitet var signifikant lavere ved forhøjet tryk. Abiotiske kontrolforsøg udført i hungatrør og serum flasker viste ikke jern jern reduktion ved 1 bar og 100 bar.
Scannings elektronmikroskopi billeder (figur 4) viser stang formede celler, som dyrkes i eksperimenter ved lavt og højt tryk. Der blev ikke observeret nogen signifikant ændring i cellernes morfologi ved 1 bar versus 100 bar. Men, cellevækst var naturligvis hæmmet af det forhøjede tryk, som celle nummeret var 1,3 x 108 celler/ml på 1 bar i forhold til 4,5 x 107 celler/ml på 100 bar7. Disse data er sammenlignelige med testene udført i Hungate tubes7. Således havde den fleksible guld-titanium reaktions celle selv ingen effekt på cellevækst og var egnet til mikrobielle vækst tests.
Resultaterne viser, at bioudvaskning mikroorganismer er aktive selv ved et højt tryk på 100 bar, hvilket er yderst relevant for in-situ biomining, fordi sådanne forhold forekommer i dybe malm aflejringer i en dybde under 1.000 m7.
Figur 1: oversigt over reaktions celle delene. Fra bund til top: guld posen, titanium krave, titanium hoved, vaskemaskine, titanium kompressions bolt ring, titanium prøvetagnings slange med rustfri kirtler og kraver til højtryks koned og gevindforbindelser på begge sider, og Titanium ventilen med en adapter til tilslutning af en luer-låse sprøjte. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: dimensionelle tegninger af titanium dele bearbejdet fra stænger af titanium grad 2. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: ændringer i de jernholdige jern koncentrationer i guld-titanium reaktions cellen med jernholdig jern oxiderende kultur. Celler blev dyrket anaerobisk ved 30 °C. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: morfologi af jernholdige jern-oxiderende kultur dyrket på 1 bar og 100 bar. Celler blev dyrket anaerobisk ved 30 °C. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Den præsenterede metode til højtryks eksperimenter med mikrobielle reaktioner i sure opløsninger var et effektivt værktøj til at simulere dybe, geomicrobiologiske processer i et laboratoriemiljø.
Der er talrige manuelle arbejdstrin involveret, hvoraf nogle kræver særlig opmærksomhed. Som generel bemærkning må der ikke anvendes overdreven kraft ved montering af de enkelte dele af den fleksible guld-titanium celle og reaktor hovedet (punkt 3 og 4). Hvis fabrikantens specifikationer (f. eks. for maksimalt tryk, temperatur, drejningsmoment) ignoreres, kan der opstå lækage og/eller materialefejl.
Rengøring af guld og Titanium dele (punkt 2,2) er et uundværligt arbejdstrin, ikke kun for dette eksperiment, men især for eksperimenter, der involverer (in-) organiske reaktioner. Rester fra tidligere eksperimenter i guld cellen kan forårsage uønskede reaktioner og derfor forspænde af resultater. Når den samlede guld-titanium celle er installeret i reaktoren hoved, er det bedst at arbejde hurtigt og præcist, fordi der på dette tidspunkt små mængder af ilt kan komme ind i guld cellen. Lukning af prøveudtagningsventilen, før du forlader handskerum er en god første foranstaltning for at minimere udvekslingen mellem den omgivende atmosfære med det indre af guld cellen.
Når reaktoren er placeret i Rocking-enheden, er det vigtigt at indstille gynge bevægelseshastigheden til ~ 170 °/min. Hvis højtryks reaktoren bevæger sig for hurtigt, kan Bristning af guld cellen ske på grund af gravitations effekter eller de skarpe kanter af sediment eller klippeprøver, når de anvendes.
Denne metode kan bruges i yderligere forskningsfelter. Den fleksible guld-titanium reaktions celle har potentialet til at blive brugt til et mangfoldigt sæt af videnskabelige undersøgelser9 studere reaktioner ved forhøjet tryk og temperatur og i meget ætsende væsker eller gasser.
Mikroorganismer i den dybe under flade ved temperaturer over 70 °C i tilstedeværelse af mineralske overflader kan stimulere produktionen af Molekylær hydrogen eller organiske syrer som acetat selv under forhøjet tryk16. Disse produkter og andre forbindelser kan fremkalde forhøjet mikrobiel aktivitet under in situ-bioudvasknings processer ud over de svovlforbindelser, der er undersøgt i dette studie.
Anvendelser omfatter bestemmelse af Opløselighed af gasser og ioner i vandige væsker, geokemiske reaktioner ved hydrotermiske ventilationssystemer17, kvantificering af isotop fraktionering18, GEOKEMISKE reaktioner under Co 2 binding19, abiotiske processer under dannelsen af olie og gas i kilde klipper20, og mikrobielle reaktioner ved forhøjet tryk i underlaget21 som i nærværende undersøgelse.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Robert Rosenbauer (USGS, Menlo Park) for at dele sin ekspertise på de fleksible guld-titanium reaktions celler, og Georg Scheeder (BGR) for hans input i den indledende fase af etableringen af det modificerede system i Hannover. Vi vil gerne takke mange videnskabsfolk (herunder Katja Heeschen, Andreas Risse, Jens Gröger-trampe, Theodor Alpermann) ved hjælp af opsætningen i Hannover i talrige projekter, der bidrog med små forbedringer undervejs, og Christian seeger for at udvikle gynge anordning til højtryksreaktorer. Vi takker Laura Castro (Complutense University of Madrid) for SEM observationer. Og endelig vil vi gerne udtrykke vores taknemmelighed over for Nils Wölki for at producere denne video af høj kvalitet til artiklen. Dette arbejde blev støttet af EU Horizon 2020 Project BIOMOre (tilskudsaftale # 642456).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Merck | 100013 | |
| CaN2O6 | Fluka | 31218 | |
| Conax compression seal fittings | Conax Technologies | PG2-250-B-G | sealant could be selected according to temperatures in experiment |
| Copper paste | Caramba | 691301 | |
| Copper paste | CRC | 41520 | |
| CoSO4x7H2O | Sigma | 10026-24-1 | |
| CrKO8S2x12H2O | Roth | 3535.3 | |
| CuSO4x5H2O | Riedel de Haen | 31293 | |
| Disposable cuvettes | Sigma | z330388 | |
| Ethanol absolute | Roth | 9065.3 | |
| FE-SEM | JEOL | model no. JSM-6330F | |
| Ferrozine | Aldrich | 180017 | |
| Fe2(SO4)3x7H2O | Alfa Aesar | 33316 | |
| FeSO4x7H2O | Merck | 103965 | |
| Gold cell | Hereaus GmbH | manufactured according to dimensions supplied by customer | |
| High-pressure reactor | PARR Instruments | model no. 4650 Series | reactors from other vendors could be used, too |
| High-pressure syringe pump | Teledyne ISCO | DM-100 | |
| HCl | Roth | 6331.3 | |
| HNO3 | Fluka | 7006 | |
| H3BO3 | Sigma | B6768 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | |
| L-(+)-Ascorbic acid/Vitamin C | Applichem | A1052 | |
| Light microscope | Leica DM3000 | ||
| MgSO4x7H2O | Merck | 105886 | |
| (NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | |
| NaMoO4x2H2O | Sigma | 331058 | |
| NaO3Sex5H2O | Sigma | 00163 | |
| NaO3V | Sigma | 590088 | |
| Na2SO4 | Merck | 106649 | |
| Na2WO4x2H2O | Sigma | 72069 | |
| NiSO4x6H2O | Sigma | 31483 | |
| Omnifix Luer | BRAUN | 4616057V | |
| pH meter | Mettler Toledo | ||
| Redox potential meter | WTW | ORP portable meter | |
| Safe-Lock Tubes, 2 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
| Serum bottle | Sigma | 33110-U | |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | model no. GENESYS 10S | |
| Sterican Hypodermic needle | BRAUN | 4657519 | |
| Stoppers | Sigma | 27234 | |
| Sulfur powder | Roth | 9304 | |
| Thoma Chamber | Hecht-Assistent | ||
| Titanium parts of reaction cell | Titan-Halbzeug GmbH | 121-238 | manufactured by workshop at BGR according to dimensions supplied from Titanium grade 2 rods from Titan-Halbzeug GmbH |
| Titanium valve | Nova Swiss Technologies | ND-5002 | |
| Whatman membrane filters nylon | Sigma | WHA7402004 | |
| ZnSO4x7H2O | Sigma | Z4750 |
References
- Johnson, D. B. Biomining goes underground. Nature Geoscience. 8 (3), 165-166 (2015).
- Bellenberg, S., et al. Manipulation of pyrite colonization and leaching by iron-oxidizing Acidithiobacillus species. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (3), 1435-1449 (2014).
- Christel, S., Fridlund, J., Watkin, E. L., Dopson, M. Acidithiobacillus ferrivorans SS3 presents little RNA transcript response related to cold stress during growth at 8 °C suggesting it is a eurypsychrophile. Extremophiles. 20 (6), 903-913 (2016).
- Dopson, M., Ossandon, F. J., Lovgren, L., Holmes, D. S. Metal resistance or tolerance? Acidophiles confront high metal loads via both abiotic and biotic mechanisms. Frontiers in Microbiology. 5, 157 (2014).
- Schippers, A., et al. Biomining: metal recovery from ores with microorganisms. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 141, 1-47 (2014).
- Shiers, D., Ralph, D., Bryan, C., Watling, H. Substrate utilisation by Acidianus brierleyi, Metallosphaera hakonensis and Sulfolobus metallicus in mixed ferrous ion and tetrathionate growth media. Minerals Engineering. 48, 86-93 (2013).
- Zhang, R., Hedrich, S., Ostertag-Henning, C., Schippers, A. Effect of elevated pressure on ferric iron reduction coupled to sulfur oxidation by biomining microorganisms. Hydrometallurgy. 178, 215-223 (2018).
- Dickson, F., Blount, C. W., Tunell, G. Use of hydrothermal solution equipment to determine the solubility of anhydrite in water from 100 degrees C to 275 degrees C and from 1 bar to 1000 bars pressure. American Journal of Science. 261 (1), 61-78 (1963).
- Seyfried, W., Gordon, P., Dickson, F. A new reaction cell for hydrothermal solution equipment. American Mineralogist. 64 (5-6), 646-649 (1979).
- Cross, M. M., Manning, D. A., Bottrell, S. H., Worden, R. H. Thermochemical sulphate reduction (TSR): experimental determination of reaction kinetics and implications of the observed reaction rates for petroleum reservoirs. Organic Geochemistry. 35 (4), 393-404 (2004).
- Frerichs, J., Rakoczy, J., Ostertag-Henning, C., Krüger, M. Viability and adaptation potential of indigenous microorganisms from natural gas field fluids in high pressure incubations with supercritical CO2. Environmental Science & Technology. 48 (2), 1306-1314 (2014).
- Heeschen, K., Risse, A., Ostertag-Henning, C., Stadler, S. Importance of co-captured gases in the underground storage of CO2: Quantification of mineral alterations in chemical experiments. Energy Procedia. 4, 4480-4486 (2011).
- Wakeman, K., Auvinen, H., Johnson, D. B. Microbiological and geochemical dynamics in simulated-heap leaching of a polymetallic sulfide ore. Biotechnology and Bioengineering. 101 (4), 739-750 (2008).
- Pakostova, E., Grail, B. M., Johnson, D. B. Indirect oxidative bioleaching of a polymetallic black schist sulfide ore. Minerals Engineering. 106, 102-107 (2017).
- Lovley, D. R., Phillips, E. J. Rapid assay for microbially reducible ferric iron in aquatic sediments. Applied and Environmental Microbiology. 53 (7), 1536-1540 (1987).
- Parkes, R. J., et al. Prokaryotes stimulate mineral H2 formation for the deep biosphere and subsequent thermogenic activity. Geology. 39 (3), 219-222 (2011).
- McCollom, T. M. Abiotic methane formation during experimental serpentinization of olivine. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 113 (49), 13965-13970 (2016).
- Pester, N. J., Conrad, M. E., Knauss, K. G., DePaolo, D. J. Kinetics of D/H isotope fractionation between molecular hydrogen and water. Geochimica et Cosmochimica Acta. 242, 191-212 (2018).
- Rosenbauer, R. J., Thomas, B., Bischoff, J. L., Palandri, J. Carbon sequestration via reaction with basaltic rocks: Geochemical modeling and experimental results. Geochimica et Cosmochimica Acta. 89, 116-133 (2012).
- Knauss, K. G., Copenhaver, S. A., Braun, R. L., Burnham, A. K. Hydrous pyrolysis of New Albany and Phosphoria Shales: production kinetics of carboxylic acids and light hydrocarbons and interactions between the inorganic and organic chemical systems. Organic Geochemistry. 27 (7-8), 477-496 (1997).
- Parkes, R. J., et al. Culturable prokaryotic diversity of deep, gas hydrate sediments: first use of a continuous high-pressure, anaerobic, enrichment and isolation system for subseafloor sediments (DeepIsoBUG). Environmental Microbiology. 11 (12), 3140-3153 (2009).
