En protokol præsenteres for formulering af en blodfri kunstig kost til foder Anopheles myg i fangenskab. Denne kost har en lignende præstation til hvirveldyr blod og udløser oogenesis og æg modning og producerer levedygtige voksne afkom.
Malaria forskning kræver store avl og produktion betingelser for myg(Anopheles spp.) i fangenskab. Den bæredygtige og pålidelige produktion af myg er i øjeblikket hæmmet af levering af frisk hvirveldyr blod. Alternativer til blod er nødvendige for at fremme effektive kontrolstrategier for malaria og andre vektorbårne sygdomme, der overføres af blodfodring insekter. Med dette i tankerne, kunstige flydende kost vaner blev formuleret som erstatninger for frisk hvirveldyr blod. Heri rapporterer vi en blodfri kunstig flydende kost, der leverer fodring satser svarende til blod og efterligner de fysiologiske virkninger af en frisk hvirveldyr blodmåltid. Kosten inducerer æggestokkene og æg modning af Anopheles myg og producerer også god larve overlevelse og udvikling af funktionelle voksne. Den formulerede blodfri flydende kost er et vigtigt fremskridt i retning af bæredygtig myg avl i fangenskab og vil reducere vedligeholdelsesomkostningerne for myg kolonier og fjerne behovet for frisk hvirveldyr blod.
Vektorbårne sygdomme påvirker flere millioner mennesker på verdensplan og forårsager millioner af dødsfald hvert år. De overføres af insekter inficeret med sygdomsproducerende mikroorganismer (protozoer, vira), der erhverves, når de lever af blod fra en inficeret vært. Efterfølgende vil den inficerede vektor overføre patogenet til en ny vært under det næste blodmåltid. Malaria er den dødeligste vektorbårne sygdom, der overføres af flere forskellige arter af Anopheles myg og påvirker 40% af verdens befolkning1. Malaria protist parasit er ansvarlig for mere end 400.000 dødsfald hvert år, hvoraf de fleste er børn under 5 år (Verdenssundhedsorganisationen). Den kvindelige Anopheles myg overfører malaria parasit af Plasmodium slægten mellem mennesker og andre dyr, når det lever af hvirveldyr blod, et nødvendigt skridt for ægproduktion og udvikling2.
Nuværende strategier for udryddelse af malaria og andre nye dødbringende myg vektor-bårne sygdomme er afhængige af udviklingen af innovative myg kontrol strategier3,4,5, som omfatter frigivelse i naturen af et stort antal myg opdrættet i insektæle. Men en afgørende begrænsende faktor er afhængigheden af en levering af frisk blod til effektiv myg opdræt og avl. Den variable sammensætning af hvirveldyr blod kan have en negativ indvirkning myg frugtbarhed og afkom fitness og kan begrænse pålideligheden og bæredygtigheden af fangenskab avl kolonier. Mosquito frigivelse og kontrol programmer kræver store myg produktionssystemer og en regelmæssig forsyning af store mængder af hvirveldyr blod. Dette er en væsentlig hindring for myg produktion og rejser en række etiske spørgsmål i forbindelse med brugen af levende dyr og logistiske begrænsninger forårsaget af de dermed forbundne krævende sikkerhedsbestemmelser. Dette gør omkostningerne ved vedligeholdelse og sikkerhed af myg kolonier høje og udfordrer bæredygtigheden af de nuværende myg opdræt praksis især i lavindkomstlande, hvor truslen om malaria er langt større.
For nylig forskning har været fokuseret på udviklingen af blod erstatninger, der efterligner en hvirveldyr blodmåltid, men hidtil, kun begrænset succes er opnået6,7,8,9. En vellykket kunstig kost skal (1) provokere fuld kvindelig myg engorgement, (2) udløse vitellogenin produktion, (3) producere store partier af levedygtige æg, og (4) generere hedenske afkom10. Desuden har kunstig kost en standard sammensætning og dermed er mere pålidelige til produktion af myg til forsknings- og kontrolformål. Vellykket blodfri kost er blevet udviklet til Aedes myg (anmeldt af Gonzales og Hansen11),men ikke for Anopheles spp. Eksisterende kunstige kostvaner indeholder en phagostimulant (f.eks ATP10),en proteinkilde til ægmodning6,12, kulhydrater som energikilde, og aminosyrer (aa)13, der er grundlæggende for ægproduktion og er en vigtig begrænsende faktor for myg frugtbarhed14. En kunstig blodfri kost også nødt til at give kolesterol15, hvilket forbedrer ægproduktion. Her beskriver vi en kunstig blodfri kost for kvindelige Anopheles myg og viser, at det har en konsekvent og tilsvarende ydelse til en høj kvalitet hvirveldyr blodmåltid.
Succesen med vores formulerede blodfri kost er sandsynligvis et resultat af den synergistiske fysiologiske effekt af alle komponenter tilsættes i-liq_diet (rig på sukker, aminosyrer, vitaminer og mikroelementer): BSA (protein kilde), ATP (phagostimulant) og kolesterol (lipid kilde). Tilskud af r-liq_diet med de enkelte komponenter alene var ikke effektiv til at stimulere ægproduktion (data ikke vist). En ulempe ved protokollen kan være omkostningerne ved nogle af komponenterne, såsom kolesterol. Alligevel, dens tilstedeværelse er grundlæggende, som insekter er ude af stand til at syntetisere det19 og dette molekyle er forløberen for ecdysteroidhormoner, der regulerer æggeblomme syntese og æg modning i leddyr20. Lavere mængder af kolesterol bør testes for at optimere den mængde, der er nødvendig med henblik på at reducere omkostningerne og øge fordelene ved den kunstige kost.
En anden begrænsning af metoden er, at den kunstige kost skal være frisklavet af lageropløsninger, som når den er fremstillet i sin endelige flydende form, mister den kvalitet efter opbevaring. I fremtiden vores formulerede kost kunne fremstilles som en tørret magt, svarende til SkitoSnackt, en kunstig blod måltid erstatning for Aedes aegypti myg21.
Udover at levere de nødvendige næringsstoffer, et kunstigt måltid skal tiltrække og stimulere kvindelige myg til foder på samme måde, som når de lever af hvirveldyr frisk blod. Den kunstige blodfri kost heri beskrevet resulterede i en 20% stigning i fuldt engorged kvindelige myg i forhold til hvirveldyr blod fodret gruppe. Denne indirekte mål for tiltrækning kunne præciseres yderligere ved at bruge olfactometers til at bekræfte, at den kunstige kost er mere attraktiv og mere tiltrækkende for myg end frisk blod.
Den højeste virkning af kosten på larve dødelighed blev observeret for larver stammer fra myg fodret med blod, hvilket tyder på, at en kunstig kost af stabil sammensætning kan bidrage til at reducere dødeligheden og forbedre myg avl succes i forhold til frisk blod. Det mindre forudsigelige resultat af et blodmåltid kan opstå som følge af værtsvariationer i sammensætning17 og tilstedeværelsen i blodet af molekyler, der kan forstyrre mygfysiologi22. De foregående fakta understrege fordelene for høj kvalitet myg opdræt af frisk blod-fri kost.
Samlet set var det gennemsnitlige antal æg, der blev lagt i vores undersøgelse, lavt i forhold til dem, der blev rapporteret hos nogle insektæke, men det gennemsnitlige antal æg, der var fremstillet af ovipositeæg, var sammenligneligt med den A. gambiae laboratorieopdrættede stamme, der blev fodret med humant blod (22,6 ± 5,5 æg/hunn)23. Der blev ikke observeret væsentlige statistiske forskelle mellem vores eksperimentelle grupper, der blev fodret med enten frisk blod eller på de kunstige måltider (tabel 2), hvilket tyder på, at implementeringen af et kunstigt membranfodringssystem med vores formulerede kost er tilstrækkelig til at vedligeholde og udbrede Anopheles mygkolonier i fangenskab.
Kunstige blod-fri måltider kan opretholde Aedes kolonier 22,men når de anvendes til Anopheles myg de er af begrænset eller ingen succes11. For nylig, en plasma-baseret kunstigt måltid for Anopheles myg blev beskrevet24, men fodring satser og reproduktive potentiale var lav. Vores resultater repræsenterer et betydeligt fremskridt i state-of-art (gennemgået af Gonzales og Hansen11)som vores formulerede r-liq_diet havde en lignende eller bedre ydeevne end standard hvirveldyr blodmåltid. Yderligere forbedringer af lagerstabiliteten og omkostningerne bør udvide anvendelsesområdet.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Dinora Lopes (IHMT-NOVA Animal Facility) for teknisk support, Joana Gomes og Ana Catarina Alves (IHMT-NOVA Insectary Facility) for at opretholde Anopheles myg kolonier. Finansieret af Bill and Melinda Gates Foundation (OPP1138841), Fundação para a Ciência e Tecnologia (UID/Multi/04413/201, UID/Multi/04326/2013, SFRH/BPD/89811/2012, CEECIND/00450/2017).
Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate | Sigma Aldrich | A2383 | |
BSA-Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A790G | |
Cholesterol | MP Biomedicals | 199342 | |
Dulbecco's modified Eagle's medium (high glucose with L-glutamine) | Lonza Bioscience | BE12-604F | |
Entellan mounting medium | Merck | 1079610100 | |
Glassfeeder | Local glazier | by design | |
Heparin Sodium Salt | Pan Reac AppliChem | A3004,0001 | |
Imalgène 1000 | Merial, Portugal | 01MER122 | |
Needle 20 G x 1" 0.9 x 25 mm needle | Terumo Europe | NN-2025R | |
Parafilm | Sigma Aldrich | P6543-1EA | |
Rompun | Bayer, Portugal | 7427831 | |
Sterilization Millex-HV 0,45 | Millipore | SLHVR25KS | |
Syringe, 1ml, 27 G x ½" 0.4 x 12 mm needle | Terumo Europe | BS-NIN2713 | |
Teich Mix Astra Pond | Astra | 4030733100957 | |
Tetra Goldfish Flakes | Tetra | 4004218742642 |