En protokoll presenteres for formulering av et blodfritt kunstig kosthold for å mate Anopheles mygg i fangenskap. Denne dietten har en lignende ytelse til virveldyr blod og utløser oogenese og egg modning og produserer levedyktig voksen avkom.
Malariaforskning krever store avls- og produksjonsforhold for mygg (Anopheles spp.) i fangenskap. Den bærekraftige og pålitelige produksjonen av mygg er for tiden hemmet av tilførselav ferskvirveldyr blod. Alternativer til blod er nødvendig for å fremme effektive kontrollstrategier for malaria og andre vektorbårne sykdommer som overføres av blodfôring insekter. Med dette i tankene ble kunstige flytende dietter formulert som erstatninger for friskvirveldyrblod. Her rapporterer vi et blodfritt kunstig flytende kosthold som leverer fôringshastigheter som ligner på blod og etterligner de fysiologiske effektene av et friskt virveldyr blodmåltid. Kostholdet induserer ovarie- og eggmodning av Anopheles mygg og gir også god larval overlevelse og utvikling av funksjonelle voksne. Det formulerte blodfrie flytende dietten er et viktig fremskritt mot bærekraftig myggavl i fangenskap og vil redusere vedlikeholdskostnadene til myggkolonier og eliminere behovet for friskt virveldyrblod.
Vektorbårne sykdommer påvirker flere millioner mennesker over hele verden og forårsaker millioner av dødsfall hvert år. De overføres av insekter smittet med sykdomsproduserende mikroorganismer (protozoan, virus) som er anskaffet når de spiser blod fra en smittet vert. Deretter vil den infiserte vektoren overføre patogenet til en ny vert under neste blodmåltid. Malaria er den dødeligste vektorbårne sykdommen som overføres av flere forskjellige arter av Anopheles mygg og påvirker 40% av verdens befolkning1. Malariaprotistparasitten er ansvarlig for mer enn 400.000 dødsfall hvert år, hvorav de fleste er barn under 5 år (Verdens helseorganisasjon). Den kvinnelige Anopheles mygg overfører malaria parasitten av Plasmodium slekten mellom mennesker og andre dyr når den feeds på virveldyr blod, et nødvendig skritt for egg produksjon og utvikling2.
Nåværende strategier for utryddelse av malaria og andre fremvoksende dødelige myggvektorbårne sykdommer er avhengige av utviklingen av innovative myggkontrollstrategier3,4,5, som inkluderer utgivelsen i naturen av et stort antall mygg avlet i insektære. En avgjørende begrensende faktor er imidlertid avhengigheten av tilførsel av friskt blod for effektiv myggoppdrett og avl. Den variable sammensetningen av virveldyr blod kan negativt påvirke myggfruktbarhet og avkom fitness og kan begrense påliteligheten og bærekraften til fangede avlskolonier. Myggfrigjørings- og kontrollprogrammer krever store myggproduksjonssystemer og en regelmessig tilførsel av store mengder virveldyr blod. Dette er et stort hinder for myggproduksjon og reiser en rekke etiske problemstillinger knyttet til bruk av levende dyr og logistiske begrensninger forårsaket av de tilhørende krevende sikkerhetsforskriftene. Dette gjør kostnadene ved vedlikehold og sikkerhet av myggkolonier høye og utfordrer bærekraften til dagens myggoppdragspraksis, spesielt i lavinntektsland der trusselen om malaria er langt større.
Nylig forskning har vært fokusert på utviklingen av blod substitutter som etterligner en virveldyr blod måltid, men så langt, bare begrenset suksess har blitt oppnådd6,7,8,9. En vellykket kunstig diett må (1) provosere full kvinnelig myggengorgement, (2) utløser vitellogenin produksjon, (3) produsere store grupper av levedyktige egg, og (4) generere hedningavkomgen10. I tillegg har kunstige dietter en standard sammensetning og er dermed mer pålitelig for produksjon av mygg for forskning og kontrollformål. Vellykkede blodfrie dietter er utviklet for Aedes mygg (anmeldt av Gonzales og Hansen11), men ikke for Anopheles spp. Eksisterende kunstige dietter inneholder et fagossentralstimulerende middel (f.eks. ATP10), en proteinkilde for eggmodning6,12, karbohydrater som energikilde og aminosyrer (aa)13 som er grunnleggende for eggproduksjon og er en viktig begrensende faktor for myggfruktbarhet14. En kunstig blodfri diett må også gi kolesterol15, noe som forbedrer eggproduksjonen. Her beskriver vi et kunstig blodfritt kosthold for kvinnelige Anopheles mygg og viser at det har en konsekvent og tilsvarende ytelse til et høykvalitets virveldyr blodmåltid.
Suksessen til vårt formulerte blodfrie kosthold er sannsynligvis et resultat av den synergistiske fysiologiske effekten av alle komponentene som legges til i-liq_diet (rik på sukker, aminosyrer, vitaminer og mikroelementer): BSA (proteinkilde), ATP (phagostimulant) og kolesterol (lipidkilde). Tilskudd av r-liq_diet med de enkelte komponentene alene var ikke effektiv i å stimulere eggproduksjon (data ikke vist). En ulempe med protokollen kan være kostnaden for noen av komponentene, for eksempel kolesterol. Likevel er dens tilstedeværelse grunnleggende, da insekter ikke er i stand til å syntetisere det19, og dette molekylet er forløperen til ecdysteroidhormonene som regulerer eggeplommesyntese og eggmodning hos leddyr20. Lavere mengder kolesterol bør testes for å optimalisere mengden som trengs med sikte på å redusere kostnadene og øke fordelene med det kunstige kostholdet.
En annen begrensning av metoden er at det kunstige kostholdet må tilberedes på lagerløsninger, da det en gang er utarbeidet i sin endelige væskeform, mister kvaliteten etter lagring. I fremtiden kan vårt formulerte kosthold tilberedes som en tørket kraft, lik SkitoSnackt, en kunstig blodmåltiderstatning for Aedes aegypti mygg21.
Ved siden av å levere de nødvendige næringsstoffene, må et kunstig måltid tiltrekke seg og stimulere kvinnelige mygg til å mate på samme måte som når de spiser på virveldyr friskt blod. Det kunstige blodfrie kostholdet her i beskrevet resulterte i en 20% økning i fullt oppslukte kvinnelige mygg sammenlignet med virveldyr blodmatet gruppe. Dette indirekte målet på attraksjon en ytterligere avklart ved hjelp av olfactometers for å bekrefte at det kunstige kostholdet er mer attraktivt og mer attraktivt for mygg enn friskt blod.
Den høyeste virkningen av dietten på larvaldødelighet ble observert for larver avledet fra mygg matet på blod, noe som tyder på at et kunstig kosthold med stabil sammensetning kan bidra til å redusere dødeligheten og forbedre myggavlssuksess sammenlignet med friskt blod. Det mindre forutsigbare resultatet av et blodmåltid kan oppstå fra vertsvariasjoner i sammensetning17 og tilstedeværelsen i blodet av molekyler som kan forstyrre myggfysiologi22. De foregående fakta understreker fordelene for mygg av høy kvalitet som oppdrar seg av ferskblodfrie dietter.
Totalt var gjennomsnittlig antall egg lagt i vår studie lav i forhold til de som ble rapportert hos noen insektmidler, men gjennomsnittlig antall ovipositerte egg var sammenlignbart med A. gambiae laboratorie-oppdrettet stamme matet på humant blod (22,6 ± 5,5 egg / kvinne)23. Ingen signifikante statistiske forskjeller ble observert mellom våre eksperimentelle grupper matet på enten friskt blod eller på de kunstige måltidene (tabell 2),noe som tyder på at implementeringen av en kunstig membranfôringssystemer med vårt formulerte diett er tilstrekkelig til å opprettholde og forplante Anopheles myggkolonier i fangenskap.
Kunstige blodfrie måltider kan opprettholde Aedes kolonier22,men når de brukes på Anopheles mygg, er de av begrenset eller ingen suksess11. Nylig ble et plasmabasert kunstig måltid for Anopheles mygg beskrevet24, men fôringshastigheter og reproduktive potensial var lavt. Våre resultater representerer et betydelig fremskritt i toppmoderne (anmeldt av Gonzales og Hansen11)da våre formulerte r-liq_diet hadde en lignende eller bedre ytelse enn standard virveldyr blodmåltid. Ytterligere forbedringer på lagringsstabilitet og kostnader bør utvide omfanget av søknaden.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Dinora Lopes (IHMT-NOVA Animal Facility) for teknisk støtte, Joana Gomes og Ana Catarina Alves (IHMT-NOVA Insectary Facility) for å opprettholde Anopheles myggkolonier. Fundação para a Ciência e Tecnologia (UID/Multi/04413/201, UID/Multi/04313/201, UID/Multi/04326/2013, SFRH/BPD/89811/2012, CEECIND/00450/2017).
Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate | Sigma Aldrich | A2383 | |
BSA-Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A790G | |
Cholesterol | MP Biomedicals | 199342 | |
Dulbecco's modified Eagle's medium (high glucose with L-glutamine) | Lonza Bioscience | BE12-604F | |
Entellan mounting medium | Merck | 1079610100 | |
Glassfeeder | Local glazier | by design | |
Heparin Sodium Salt | Pan Reac AppliChem | A3004,0001 | |
Imalgène 1000 | Merial, Portugal | 01MER122 | |
Needle 20 G x 1" 0.9 x 25 mm needle | Terumo Europe | NN-2025R | |
Parafilm | Sigma Aldrich | P6543-1EA | |
Rompun | Bayer, Portugal | 7427831 | |
Sterilization Millex-HV 0,45 | Millipore | SLHVR25KS | |
Syringe, 1ml, 27 G x ½" 0.4 x 12 mm needle | Terumo Europe | BS-NIN2713 | |
Teich Mix Astra Pond | Astra | 4030733100957 | |
Tetra Goldfish Flakes | Tetra | 4004218742642 |