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Biology

एनोफेलिन मच्छरों को रियर करने के लिए रक्त मुक्त आहार

doi: 10.3791/60144 Published: January 31, 2020

Summary

कैद में एनोफेल्स मच्छरों को खिलाने के लिए रक्त मुक्त कृत्रिम आहार तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है। इस आहार में रक्त को कशेरुकी करने के लिए एक समान प्रदर्शन है और ओजेनेसिस और अंडे की परिपक्वता को ट्रिगर करता है और व्यवहार्य वयस्क संतान पैदा करता है।

Abstract

मलेरिया अनुसंधान कैद में मच्छरों(Anopheles spp.) के लिए बड़े पैमाने पर प्रजनन और उत्पादन की स्थिति की आवश्यकता है । मच्छरों का टिकाऊ और विश्वसनीय उत्पादन वर्तमान में ताजा कशेरुकी रक्त की आपूर्ति से बाधित है। रक्त खिलाने वाले कीड़ों द्वारा प्रेषित मलेरिया और अन्य वेक्टर जनित रोगों के लिए कुशल नियंत्रण रणनीतियों को बढ़ावा देने के लिए रक्त के विकल्प की आवश्यकता होती है। इस बात को ध्यान में रखते हुए, कृत्रिम तरल आहार ताजा कशेरुकी रक्त के विकल्प के रूप में तैयार किए गए थे। इसमें हम एक रक्त मुक्त कृत्रिम तरल आहार की रिपोर्ट करते हैं जो रक्त के समान भोजन दरों को बचाता है और एक ताजा कशेरुकी रक्त भोजन के शारीरिक प्रभावों की नकल करता है। आहार ओनोफेल्स मच्छरों के अंडाशय और अंडे की परिपक्वता को प्रेरित करता है और कार्यात्मक वयस्कों के अच्छे लार्वा अस्तित्व और विकास का भी उत्पादन करता है। तैयार रक्त मुक्त तरल आहार कैद में टिकाऊ मच्छर प्रजनन की दिशा में एक महत्वपूर्ण अग्रिम है और मच्छर कालोनियों के रखरखाव की लागत को कम करेगा और ताजा कशेरुकी रक्त की आवश्यकता को खत्म करेगा।

Introduction

वेक्टर जनित रोग दुनिया भर में कई मिलियन मनुष्यों को प्रभावित करते हैं और हर साल लाखों मौतों का कारण बनते हैं । वे रोग उत्पादक सूक्ष्मजीवों (प्रोटोज़ोन, वायरस) से संक्रमित कीड़ों द्वारा प्रेषित होते हैं जब वे संक्रमित मेजबान से रक्त पर भोजन करते हैं। बाद में, संक्रमित वेक्टर अगले रक्त भोजन के दौरान रोगजनक को एक नए मेजबान को संचारित करेगा। मलेरिया सबसे घातक वेक्टर जनित रोग है जो एनोफेल्स मच्छर की कई विभिन्न प्रजातियों द्वारा फैलता है और दुनिया की आबादी का ४०% प्रभावित करता है1। मलेरिया प्रोटिस्ट परजीवी हर साल 400,000 से अधिक मौतों के लिए जिम्मेदार है, जिनमें से अधिकांश 5 साल से कम उम्र के बच्चे (विश्व स्वास्थ्य संगठन) हैं। मादा एनोफेल्स मच्छर मनुष्यों और अन्य जानवरों के बीच प्लाज्मोडियम जीनस के मलेरिया परजीवी को पहुंचाता है जब यह कशेरुकी रक्त पर फ़ीड करता है, अंडा उत्पादन और विकास2के लिए एक आवश्यक कदम है।

मलेरिया और अन्य उभरते घातक मच्छर वेक्टर जनित रोगों के उन्मूलन के लिए वर्तमान रणनीतियां अभिनव मच्छर नियंत्रण रणनीतियों3,4,5के विकास पर भरोसा करती हैं, जिसमें बड़ी संख्या में मच्छरों के जंगली में रिहाई शामिल है जो कीटनाशकों में पैदा हुए मच्छरों की बड़ी संख्या में शामिल हैं। हालांकि, एक महत्वपूर्ण सीमित कारक प्रभावी मच्छर पालन और प्रजनन के लिए ताजा रक्त की आपूर्ति पर निर्भरता है। कशेरुकी रक्त की चर संरचना मच्छर प्रजनन क्षमता और संतान फिटनेस को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकती है और कैप्टिव प्रजनन उपनिवेशों की विश्वसनीयता और स्थिरता को सीमित कर सकती है। मच्छर रिलीज और नियंत्रण कार्यक्रमों के लिए बड़े पैमाने पर मच्छर उत्पादन प्रणालियों और बड़ी मात्रा में कशेरुकी रक्त की नियमित आपूर्ति की आवश्यकता होती है। यह मच्छर उत्पादन के लिए एक बड़ी बाधा है और जीवित जानवरों के उपयोग और संबद्ध सुरक्षा नियमों के कारण साजो-सामान की सीमाओं से जुड़े नैतिक मुद्दों की एक श्रृंखला उठाती है। यह मच्छर कालोनियों के रखरखाव और सुरक्षा की लागत को उच्च बनाता है और विशेष रूप से कम आय वाले देशों में वर्तमान मच्छर पालन प्रथाओं की स्थिरता को चुनौती देता है जहां मलेरिया का खतरा कहीं अधिक है ।

हाल ही में शोध रक्त विकल्प के विकास पर केंद्रित किया गया है जो कशेरुकी रक्त भोजन की नकल करते हैं लेकिन अभी तक केवल सीमित सफलता6,7,8,9ही प्राप्त हुई है । एक सफल कृत्रिम आहार (1) पूर्ण मादा मच्छर engorgement भड़काने की जरूरत है, (2) विटेलोजेनिन उत्पादन ट्रिगर, (3) व्यवहार्य अंडे के बड़े बैचों का उत्पादन, और (4) हीथी संतान10उत्पन्न करते हैं । इसके अलावा, कृत्रिम आहार में एक मानक संरचना होती है और इस प्रकार अनुसंधान और नियंत्रण उद्देश्यों के लिए मच्छरों के उत्पादन के लिए अधिक विश्वसनीय हैं। एडीज मच्छरों के लिए सफल रक्त मुक्त आहार विकसित किए गए हैं (गोंजालेस और हैनसेन11द्वारा समीक्षा की गई) लेकिन एनोफेल्स एसपीपी के लिए नहीं। मौजूदा कृत्रिम आहार में एक फागोस्टिमुलैंट (उदाहरण के लिए, एटीपी10),अंडे की परिपक्वता6,12,कार्बोहाइड्रेट के लिए एक प्रोटीन स्रोत ऊर्जा के स्रोत के रूप में, और अमीनो एसिड (एए)13 शामिल हैं जो अंडे के उत्पादन के लिए मौलिक हैं और मच्छर प्रजनन14के लिए एक प्रमुख सीमित कारक हैं। एक कृत्रिम रक्त मुक्त आहार भी कोलेस्ट्रॉल15प्रदान करने की जरूरत है, जो अंडे के उत्पादन में सुधार । यहां हम मादा एनोफेल्स मच्छरों के लिए एक कृत्रिम रक्त मुक्त आहार का वर्णन करते हैं और यह प्रदर्शित करते हैं कि इसमें उच्च गुणवत्ता वाले कशेरुकी रक्त भोजन के लिए एक सुसंगत और समकक्ष प्रदर्शन है।

Protocol

आईएचएमटी एनिमल हाउस से चूहे प्राप्त किए गए थे। पशु प्रयोग पुर्तगाली कानून और प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग के लिए दिशा निर्देशों के अनुसार सख्ती से आयोजित किए गए थे । Direção-Geral de Veterinária, Ministério दा Agricultura Do Desenvolvimento ग्रामीण ई दास Pescas, पुर्तगाल सभी अध्ययन प्रोटोकॉल (आईडी मंजूरी: 023351 और 023355) को मंजूरी दे दी।

नोट: ~ 26 डिग्री सेल्सियस पर सभी खिला परख प्रदर्शन करें।

1. मच्छर

  1. एनोफेल्स कोलुज़ी (पूर्व एनोफेल्स गैम्बिया एम रूप) याउंडे तनाव मच्छरों को 26 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें, 12 घंटे:12 घंटे प्रकाश: अंधेरे चक्र के तहत 75% आर्द्रता। संभोग की गारंटी देने के लिए मानक कीटीय स्थितियों का उपयोग करके घर मच्छर।
  2. मच्छर पिल्ले को एक छोटे से पानी के कंटेनर में ले लीजिए। वयस्क मच्छरों को उभरने और साथी बनाने के लिए कंटेनर को मच्छर पिंजरे के अंदर रखें। 10% ग्लूकोज खिला समाधान प्रदान करें। उद्भव के तीन दिन बाद एक उम्मीदवार का उपयोग करस्टॉक पिंजरे से मच्छरों की आवश्यक संख्या एकत्र करते हैं।
  3. फीडिंग ट्रायल से एक दिन पहले 10% ग्लूकोज फीडिंग सॉल्यूशन को हटा दें।
    नोट: 3 दिन पुराने मच्छरों प्रयोगों में इस्तेमाल किया गया ।

2. मच्छर खिला

  1. कृत्रिम तरल आहार की तैयारी
    1. लैमिनार प्रवाह कैबिनेट में बाँझ परिस्थितियों में कृत्रिम तरल आहार तैयार करें। प्रारंभिक तरल आहार (आई-liq_diet) में निम्नलिखित जोड़कर समृद्ध तरल आहार (आर-liq_diet) तैयार करें; Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम [एल ग्लूटामाइन के साथ उच्च ग्लूकोज], तालिका 1देखें): ०.५५ g/L एटीपी, 1 जी/एल कोलेस्ट्रॉल, और २०० g/L गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) । सभी सामग्री को अच्छी तरह से मिलाएं और 0.45 माइक्रोफ़िल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर करें।
      नोट: आहार की दुकान नहीं है; प्रत्येक प्रयोग के लिए स्टॉक समाधानों से ताजा आहार तैयार करें क्योंकि वे संग्रहीत होने पर गुणवत्ता खो देते हैं। आहार के घटकतालिका 1में वर्णित हैं।
  2. माउस रक्त संग्रह
    1. इंट्रापेरिटोनियल मार्ग का उपयोग करके केटामाइन (120 मिलीग्राम/किलो) और जाइलाज़ीन (16 मिलीग्राम/किलो) के साथ 6−8 सप्ताह पुरानी सीडी1 मादा चूहों(मस मस्कस)को एनेस्थेटइज़ करें।
    2. कार्डियक पंचर(चित्रा 1)करें जब माउस विभिन्न भौतिक उत्तेजनाओं (जैसे, टो और पूंछ चुटकी) के जवाब में कोई मांसपेशी प्रतिक्रिया प्रदर्शित करता है।
    3. रक्त के थक्के के निर्माण को रोकने के लिए 1 मिलीग्राम/एमएल हेपरिन (सोडियम नमक) के 100 माइक्रोन होते हैं जिसमें 27 ग्राम x 1/2) सुई के साथ बाँझ 1 मिलीग्राम सिरिंज का उपयोग करके रक्त एकत्र करें। पानी के स्नान का उपयोग करके 37 डिग्री सेल्सियस पर रक्त बनाए रखें।
  3. कृत्रिम भोजन
    1. एक उम्मीदवार का उपयोग कर शेयर पिंजरे से लगभग 30 मादा मच्छरों को इकट्ठा करें।
    2. मादा मच्छरों को 500 मीटर पेपर कप में स्थानांतरित करें और एक ठीक मच्छर जाल जाल से कवर करें ताकि वे बच न सकें। प्रत्येक कप(चित्रा 2)के शीर्ष पर निरंतर पानी के प्रवाह को बनाए रखने के लिए प्लास्टिक ट्यूबों से जुड़ा एक ग्लास फीडर लागू करें। बेलनाकार ट्यूबिंग और फीडर के लिए एक निरंतर पानी का प्रवाह प्रदान करें ताकि भीतर का तापमान लगभग 37.5 डिग्री सेल्सियस रखा जाए।
      नोट: एक मानक ग्लास बेल कृत्रिम खिला उपकरण16 मादा मच्छरों को तैयार आहार की आपूर्ति करने के लिए इस्तेमाल किया गया था ।
    3. भोजन को नियंत्रित करने के लिए ग्लास फीडर के मुंह के पार पैराफिन फिल्म झिल्ली को स्ट्रेच करें।
    4. पानी के स्नान का उपयोग करके 37 डिग्री सेल्सियस पर आई-liq_diet और आर-liq_diet को पूर्व-गर्म करना। ग्लास फीडर में 1 एमएल लगाएं। मच्छरों को अंधेरे में 60 मिन के लिए या तो आई-liq_diet, आर-liq_diet या ताजा माउस रक्त के साथ खिलाएं। 26 डिग्री सेल्सियस पर परख प्रदर्शन करें।
  4. फीडिंग रेट का मूल्यांकन।
    1. कृत्रिम भोजन के बाद, ठंडा-एनेस्थेट3 के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर मच्छरों को एनेस्थेट करें। मच्छरों को रेफ्रिजरेटेड पेट्री डिश में रखें।
    2. पूरी तरह से engorged(चित्रा 3)मादा मच्छरों की संख्या रिकॉर्ड करें।
      नोट: खिलाया मच्छरों का प्रतिशत सफलता खिलाने के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में प्रयोग किया जाता है।

3. जीवन इतिहास लक्षण

  1. अंडा उत्पादन और प्रजनन क्षमता
    1. ब्रश का उपयोग करके, व्यक्तिगत पिंजरों (20 सेमी x 20 सेमी x 20 सेमी) में ब्रश का उपयोग करके पूरी तरह से एन्गर्ज मादाओं को स्थानांतरित करें।
    2. मच्छरों को 26 ± 1 डिग्री सेल्सियस, 75% आर्द्रता और 12 घंटे:12 घंटे का प्रकाश: 10% ग्लूकोज विज्ञापन लिमिटम के साथ अंधेरा चक्र रखें।
    3. खिलाने के बाद ४८ एच, अंडा बिछाने के लिए नीचे एक आर्द्र फिल्टर पेपर जोड़ें(चित्रा 4)। हाथ में आवर्धक ग्लास का उपयोग करके अंडे बिछाने वाले कागज के अलावा 48 एच और 72 एच पर अंडे गिनें। अंडे इकट्ठा करने के लिए आसुत पानी के साथ फिल्टर पेपर बाढ़।
  2. लार्वा मृत्यु दर
    1. आसुत पानी(चित्रा 5)से भरे ट्रे (23 सेमी x 15 सेमी x 6 सेमी) में अंडे एकत्र करें। प्रयोगों के दौरान ट्रे में जल स्तर को स्थिर बनाए रखें।
    2. लार्वा को प्रति ट्रे लगभग 13 मिलीग्राम जमीन मछली भोजन के साथ दैनिक भोजन करें। सभी दोहराने ट्रे के लिए एक समान खिला शासन लागू होते हैं ।
    3. मृत पिल्ले और लार्वा को रोजाना निकालें। प्रयोगों को अंतिम रूप दें जब सभी पिल्ले वयस्कों में विकसित हुए हैं और वयस्क पुरुषों और महिलाओं की संख्या गिनते हैं।
    4. हैचिंग और मृत्यु की तारीखों को पंजीकृत करें और मृत्यु दर की गणना करें।
  3. दीर्घायु
    1. प्रत्येक आहार समूह की F1 पीढ़ी से 15 वयस्क पुरुषों और 15 वयस्क महिलाओं को इकट्ठा करें। पुरुषों और महिलाओं को एक ही पिंजरे में रखें।
    2. वयस्कों को 10% ग्लूकोज समाधान विज्ञापन लिमिटम खिलाएं। मृत वयस्कों को रोजाना निकालें।
    3. ऊपर वर्णित एक ही तापमान, आर्द्रता, प्रकाश चक्र की स्थिति और चीनी खिला शासन पर मच्छरों को बनाए रखें।
    4. मृत्यु तिथि रजिस्टर करें और दीर्घायु की गणना करें।
  4. विंग लेंथ माप
    1. कोल्ड-एनेस्थेटाइज पांच दिन पुराने F1 वयस्क मच्छर (पुरुष और महिला) प्रत्येक आहार समूह से -20 डिग्री सेल्सियस पर 90 एस के लिए।
    2. एक स्टीरियोस्कोप के नीचे, धीरे-धीरे प्रत्येक मच्छर के छाती को संदंश के साथ समझें और उन्हें वेंट्रल साइड ऊपर रखें।
    3. स्केलपेल का उपयोग करके दोनों पंखों को एकत्र करें और उन्हें एक साफ माइक्रोस्कोप स्लाइड पर रखें जिसमें बढ़ते माध्यम की सूखी बूंद होती है। 20 जी सुई की सहायता से कवरस्लिप की सीमाओं में अतिरिक्त बढ़ते मीडिया को जोड़ें और धीरे-धीरे पंखों पर कवरस्लिप को कम करें।
    4. माइक्रोमीटर का उपयोग करके स्टीरियोस्कोप के साथ पंख की लंबाई(चित्रा 6)को मापें।

Representative Results

नीचे वर्णित परिणाम प्रारंभिक तरल आहार (आई-liq_diet) या एक ताजा रक्त भोजन पर खिलाए जाने वाले तैयार समृद्ध कृत्रिम भोजन (आर-liq_diet) और मच्छरों के साथ खिलाए गए मादा एनोफेल्स मच्छरों के प्रदर्शन की तुलना करते हैं। आहार का परीक्षण चित्र7 मेंचित्रित योजनाबद्ध प्रोटोकॉल के बाद किया गया था । यहां वर्णित आर-liq_diet एक पेटेंट (पीसीटी/IB2019/052967) का हिस्सा है ।

पूरी तरह से engorged महिलाओं का प्रतिशत

आर-liq_diet (89%) रक्त पर खिलाया engorged महिलाओं की संख्या से काफी अधिक था (५६%) (चित्रा 8)

फेकंडिटी और फर्टिलिटी

पहले गोनोट्रोफिक चक्र के लिए महिला फेकंडिटी और प्रजनन क्षमता का उपयोग आई-liq_diet और आर-liq_diet की पोषण गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था। ताजा कशेरुकी रक्त पर खिलाए गए महिलाओं द्वारा औसतन 24 ± 11 अंडे रखे गए थे, जबकि आर-liq_diet पर खिलाई गई महिलाओं ने औसतन 25 ± 5 अंडे(तालिका 2)रखे थे। आई-liq_diet पर खिलाया महिलाओं द्वारा कोई अंडा बिछाने नहीं मनाया गया था ।

F1 मृत्यु दर

कशेरुकी रक्त या आर-liq_diet पर खिलाया कॉलोनियों के बीच F1 मच्छरों की फिटनेस का मूल्यांकन किया गया था। लार्वा, पिल्ले और वयस्क मृत्यु दर दर्ज की गई थी। परिवर्तनशीलता (मतलब [एसईएम]) की मानक त्रुटि रक्त-खिलाए गए मच्छरों(चित्रा 9 और तालिका 2)में अधिक थी जो मच्छरों के सापेक्ष आर-liq_diet खिलाया जाता था। मच्छरों की F1 पीढ़ी या तो रक्त या आर liq_diet पर खिलाया तुलनीय मृत्यु दर और जीवित रहने की दर थी ।

F1 जीवन प्रत्याशा

यह रोग नियंत्रण और रोकथाम के लिए केंद्र द्वारा अनुमान लगाया गया है कि जंगली वयस्क मादा मच्छर एक महीने तक रहते हैं लेकिन शायद 1−2 सप्ताह से अधिक समय तक जीवित नहीं रहते हैं और पुरुष लगभग एक सप्ताह तक जीवित रहते हैं और विशेष रूप से अमृत और अन्य चीनी स्रोतों पर भोजन करते हैं। यह उल्लेखनीय है कि माता - पिता के भोजन के सेवन में अंतर मच्छर संतान17के अस्तित्व को प्रभावित कर सकता है . हमारे प्रयोग में, वयस्क महिलाओं और रक्त में पुरुषों (महिला 24.5 ± 6.8; पुरुष 18.5 ± 6.9) और आर-liq_diet (महिला: 22.5 ± 8.1; पुरुष: 11.9 ± 6.9) समूहों में समान औसत जीवन प्रत्याशा औसत(तालिका 3)और महिलाओं ने पुरुषों के सापेक्ष जीवन काल में वृद्धि दिखाई।

F1 शरीर का आकार

पंख लंबाई वयस्क शरीर के आकार के एक संकेतक के रूप में इस्तेमाल किया गया था। अन्य प्रजातियों की तुलना में, एनोफेल्स वयस्क छोटे से मध्यम आकार के मच्छर होते हैं जिनकी पंख लंबाई 2.8 से 4.4 मिमी विंग लंबाई18के बीच होती है। F1 एनोफेल्स मच्छरों के वयस्क शरीर का आकार आर-liq_diet को खिलाया गया था और रक्त-खिलाया कीट मच्छरों के समान था(चित्रा 10)।

सांख्यिकीय विश्लेषण

प्रस्तुत किए गए डेटा कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों (जब तक अन्यथा नहीं कहा जाता है) के औसत का प्रतिनिधित्व करता है। त्रुटि सलाखों के एसईएम का प्रतिनिधित्व करते हैं। जब डेटा एक गॉसियन वितरण के बाद, स्वतंत्र समूहों के छात्र टी परीक्षण का उपयोग कर तुलना की गई, अंयथा मान व्हिटनी परीक्षण लागू किया गया था । कृत्रिम आहार खिलाया समूहों के बीच मतभेद है फिशर सटीक परीक्षण का उपयोग कर विश्लेषण किया गया और पी में महत्वपूर्ण माना जाता था ।

Figure 1
चित्रा 1: इंट्राकार्डियक पंचर द्वारा CD1 माउस रक्त संग्रह। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: मानक कृत्रिम भोजन उपकरण। ग्लास फीडर में आर-liq_diet होता है जो मादा एनोफेल्स मच्छरों को खिलाया जा रहा है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: कृत्रिम भोजन के बाद एनोफेल्स मच्छर। बाएं से दाएं: एक पूरी तरह से engorged महिला है कि आर liq_diet, गैर engorged महिला है कि आर liq_diet, पुरुष की पेशकश की थी की पेशकश की थी, और पूरी तरह से engorged महिला है कि माउस रक्त की पेशकश की थी की पेशकश की थी । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: एनोफेल्स अंडे आर-liq_diet के साथ महिलाओं के 48 घंटे के बाद खिलारखा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: एल 2 लार्वा चरण जो अंडों से विकसित होते हैं और फ़िल्टर पेपर पर एकत्र किए जाते थे और आसुत पानी वाली ट्रे में रखे जाते थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: एक Anopheles coluzzii मादा मच्छर की एक F1 पीढ़ी से दक्षिणपंथी । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: कृत्रिम आहार परीक्षण के योजनाबद्ध प्रोटोकॉल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्रा 8: मादा मच्छरों की खिला दरया तो कृत्रिम आहार या रक्त खिलाया। तारक ों ने आर-लिक्विड और आई-लिक्विड आहार और रक्त-फेड नियंत्रण समूह को खिलाया मच्छरों के बीच महत्वपूर्ण अंतर का संकेत मिलता है। दो तरफा फिशर का सटीक परीक्षण: ****पी = 0.0001 (सापेक्ष जोखिम: 0.4828, 95% आत्मविश्वास ी स्तर [सीएल]: 0.3776 से 0.6194) आर-लिक्विड डाइट बनाम रक्त के लिए, *पी = 0.0335 (सापेक्ष जोखिम: 1.379, 95% सीएल: 1.04 से 1.836) रक्त-रक्त आहार बनाम रक्त-तरल आहार के लिए नीला: अनफेड; लाल: खिलाया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 9
चित्र9: F1 Anopheles coluzzii मच्छरों की मृत्यु दर और पुरुष/महिला अनुपात पर तैयार रक्त मुक्त भोजन का प्रभाव । तीन स्वतंत्र प्रयोग किए गए, प्रत्येक प्रति आहार 30 मच्छरों का उपयोग करके। एक अपेयद टी-टेस्ट में रक्त-फेड समूह और आर-liq_diet फेड समूह(पी मूल्यों में 0.5047 से 0.8491) के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 10
चित्रा 10: पंख लंबाई । अक्षीय चीरा से लेकर आर4 + 5 नस तक की दूरी का उपयोग फ्रिंज सेटा को छोड़कर पंख की लंबाई निर्धारित करने के लिए किया जाता था। आकार प्रत्येक आहार समूह (मतलब ± एसईएम) से 5 महिलाओं और 5 पुरुषों के लिए मूल्यांकन किया गया था । मूल्यों का मतलब ± एसईएम के रूप में प्रतिनिधित्व किया जाता है। सामन: आर-liq_diet; लाल: कशेरुकी रक्त। अनपेयर टी-टेस्ट; महिला वाम विंग: टी = 1.300, डीएफ = 8, पी = 0.2298; पुरुष वाम विंग: टी = 2.400, डीएफ = 8, पी = 0.0432; महिला दक्षिणपंथी: टी = 1.300, डीएफ = 8, पी = 0.2298; पुरुष दक्षिणपंथी: टी = 2.277, डीएफ = 7, पी = 0.0569। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

घटक जी/एल
* एडेनोसिन त्रिपोस्फेट 0.55
* गोजातीय सीरम एल्बुमिन 200
* कोलेस्ट्रॉल 1
कैल्शियम क्लोराइड एंहाइड्रोस 0.2
कोलीन क्लोराइड 0.004
डी-कैल्शियम पेंटोथेनेट (विटामिन बी 5) 0.004
डी ग्लूकोज निर्जल 4.5
फेरिक नाइट्रेट नोहाइड्रेट 0.0001
फोलिक एसिड 0.004
ग्लाइसिन 0.03
आई-इनोसिटोल 0.007
एल-आर्जिनिन मोनोहाइड्रोक्लोराइड 0.084
एल-सिस्टिन डाइहाइड्रोक्लोराइड 0.063
एल-ग्लूटामाइन 0.584
एल-हिस्टिडीन मोनोहाइड्रोक्लोराइड मोनोहाइड्रेट 0.042
एल-इसोलेल्यूसिन 0.105
एल-ल्यूसिन 0.105
एल-लिसिन मोनोहाइड्रोक्लोराइड 0.146
एल-मेथियानीन 0.03
एल-फिनाइललैन 0.066
एल-सेरिन 0.042
एल-थ्रेनोइन 0.095
एल-ट्रिप्टोफान 0.016
एल-टायरोसिन डाइसोडियम नमक डिहाइड्रेट 0.104
एल-वेलीन 0.094
मैग्नीशियम सल्फेट निर्जल 0.098
नियासिनेमाइड (निकोटिनमाइड) 0.004
फेनोल लाल 0.015
पोटेशियम क्लोराइड 0.4
पाइरिडॉक्सिन मोनोहाइड्रोक्लोराइड 0.004
पाइरुविक एसिड सोडियम नमक 0.011
रिबोफ्लेविन (विटामिन बी 2) 0.0004
सोडियम बाइकार्बोनेट 3.7
सोडियम क्लोराइड 6.4
सोडियम फॉस्फेट मोनोबेसिक एनाहाइड्रोस 0.109
थियामीन एमोनोहाइड्रोक्लोराइड (विटामिन बी 1) 0.004
* केवल आर-liq_diet में

तालिका 1: आई-लिक्विड आहार और आर-तरल आहार की संरचना।

कुल अंडे की संख्या (± एसईएम) अंडे/मादा (± एसईएम)
रक्त 733 ± 330 24 ± 11
आर-liq_diet 763 ± 164 25 ± 5
आई-liq_diet 0 0

तालिका 2: एनोफेल्स कोलुज़ी महिलाओं द्वारा उत्पादित अंडे के बैच। प्रत्येक में 30 मादा मच्छरों का उपयोग करके प्रत्येक प्रयोगात्मक आहार के लिए तीन स्वतंत्र प्रयोग किए गए थे।

महिलाओं (दिन ± एसईएम) नर (दिन ± एसईएम)
रक्त 24.5 ± 6.8 18.5 ± 6.9
आर-liq_diet 22.5 ± 8.1 11.9 ± 6.9

तालिका 3: F1 एनोफेल्स मच्छरों की जीवन प्रत्याशा। कृत्रिम रूप से खिलाया F0 से F1 मच्छरों की दीर्घायु एक ही आहार समूह से आने वाले प्रत्येक मच्छर के जन्म और मृत्यु की तारीखों को रिकॉर्ड करके मूल्यांकन किया गया था (15 महिलाओं और 15 पुरुषों का पालन किया गया) । परिणाम आहार समूह के प्रति मतलब मच्छर जीवन अवधि के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं ।

Discussion

हमारे तैयार रक्त मुक्त आहार की सफलता की संभावना आई-liq_diet (चीनी, अमीनो एसिड, विटामिन और माइक्रोएलिमेंट्स से समृद्ध) में जोड़े गए सभी घटकों के सहक्रियात्मक शारीरिक प्रभाव का परिणाम है: बीएसए (प्रोटीन स्रोत), एटीपी (फागोस्टिमुलेंट) और कोलेस्ट्रॉल (लिपिड स्रोत)। अकेले व्यक्तिगत घटकों के साथ आर-liq_diet का पूरकीकरण अंडे के उत्पादन को उत्तेजित करने में प्रभावी नहीं था (डेटा नहीं दिखाया गया)। प्रोटोकॉल की एक खामी कोलेस्ट्रॉल जैसे कुछ घटकों की लागत हो सकती है। फिर भी, इसकी उपस्थिति मौलिक है, क्योंकि कीड़े इसे19 संश्लेषित करने में असमर्थ हैं और यह अणु एसीडीवाईस्टेरॉयड हार्मोन का अग्रदूत है जो आर्थ्रोपोड्स20में जर्दी संश्लेषण और अंडे की परिपक्वता को विनियमित करता है। लागत को कम करने और कृत्रिम आहार के लाभों को बढ़ाने के उद्देश्य से आवश्यक मात्रा को अनुकूलित करने के लिए कोलेस्ट्रॉल की कम मात्रा का परीक्षण किया जाना चाहिए।

विधि की एक और सीमा यह है कि कृत्रिम आहार को स्टॉक समाधानों से हौसले से तैयार किया जाना चाहिए, जैसा कि एक बार अपने अंतिम तरल रूप में तैयार किया जाता है तो यह भंडारण के बाद गुणवत्ता खो देता है। भविष्य में हमारे तैयार आहार को एक सूखे बिजली के रूप में तैयार किया जा सकता है, जो स्कीटोस्नैट के समान है, एडीज एजिप्टी मच्छरों के लिए एक कृत्रिम रक्त भोजन प्रतिस्थापन21।

आवश्यक पोषक तत्वों की आपूर्ति के अलावा, एक कृत्रिम भोजन मादा मच्छरों को उसी तरह खिलाने के लिए आकर्षित करने और उत्तेजित करने की आवश्यकता होती है जैसे कि जब वे कशेरुकी ताजा रक्त पर खिलाते हैं। कृत्रिम रक्त मुक्त आहार यहां वर्णित कशेरुकी रक्त खिलाया समूह की तुलना में पूरी तरह से engorged महिला मच्छरों में 20% की वृद्धि हुई । आकर्षण के इस अप्रत्यक्ष उपाय को ओलफैक्टोमीटर का उपयोग करके इस बात की पुष्टि करने के लिए और स्पष्ट किया जा सकता है कि कृत्रिम आहार ताजा रक्त की तुलना में मच्छरों के लिए अधिक आकर्षक और अधिक आकर्षक है।

लार्वा मृत्यु दर पर आहार का सबसे अधिक प्रभाव रक्त पर खिलाए गए मच्छरों से प्राप्त लार्वा के लिए देखा गया था, जिससे यह सुझाव दिया गया था कि स्थिर संरचना का कृत्रिम आहार मृत्यु दर को कम करने और ताजा रक्त की तुलना में मच्छरों के प्रजनन की सफलता में सुधार करने में योगदान दे सकता है। रक्त भोजन का कम पूर्वानुमानित परिणाम संरचना17 में मेजबान विविधताओं और अणुओं के रक्त में उपस्थिति से उत्पन्न हो सकता है जो मच्छर शरीर विज्ञान22में हस्तक्षेप कर सकते हैं । पूर्ववर्ती तथ्य ताजा रक्त मुक्त आहार के पालन उच्च गुणवत्ता वाले मच्छरों के लिए लाभ पर जोर देते हैं ।

कुल मिलाकर हमारे अध्ययन में रखे गए अंडों की औसत संख्या कुछ कीटों में सूचित लोगों के सापेक्ष कम थी, लेकिन ओविपोसिइट अंडे की औसत संख्या मानव रक्त (22.6 ± 5.5 अंडे/महिला)23पर खिलाए गए ए गाम्बियाप्रयोगशाला-पाला तनाव के बराबर थी। हमारे प्रयोगात्मक समूहों के बीच कोई महत्वपूर्ण सांख्यिकीय मतभेद या तो ताजा रक्त पर या कृत्रिम भोजन(तालिका 2)पर खिलाया गया, यह सुझाव देते हुए कि हमारे तैयार आहार के साथ कृत्रिम झिल्ली खिलाने की प्रणालियों का कार्यान्वयन कैद में एनोफेल्स मच्छर उपनिवेशों को बनाए रखने और प्रचारित करने के लिए पर्याप्त है।

कृत्रिम रक्त मुक्त भोजन एडीज उपनिवेशोंको 22बनाए रख सकता है, लेकिन जब एनोफेल्स मच्छरों पर लागू किया जाता है तो वे सीमित या कोई सफलता नहीं11के होते हैं । हाल ही में, एनोफेल्स मच्छरों के लिए प्लाज्मा आधारित कृत्रिम भोजन24 वर्णित किया गया था लेकिन भोजन दर और प्रजनन क्षमता कम थी । हमारे परिणाम अत्याधुनिक (गोंजालेस और हैनसेन11द्वारा समीक्षा) में पर्याप्त अग्रिम का प्रतिनिधित्व करते हैं क्योंकि हमारे तैयार आर-liq_diet में मानक कशेरुकी रक्त भोजन की तुलना में समान या बेहतर प्रदर्शन था। भंडारण स्थिरता और लागत पर और सुधार से इसके आवेदन का दायरा बढ़ाना चाहिए ।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम तकनीकी सहायता के लिए डिनोरा लोप्स (आईएचएमटी-नोवा पशु सुविधा), जोआना गोम्स और एना कातारीना अल्व्स (आईएचएमटी-नोवा कीट सुविधा) को एनोफेल्स मच्छर कॉलोनियों को बनाए रखने के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। बिल एंड मेलिंडा गेट्स फाउंडेशन (OPP1138841), Fundação पैरा एक Ciência ई Tecnologia (UID/Multi/04413/201, UID/Multi/04326/2013, SFRH/BPD/89811/2012, CEIND/00450/2017) द्वारा वित्त पोषित ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate Sigma Aldrich A2383
BSA-Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A790G
Cholesterol MP Biomedicals 199342
Dulbecco's modified Eagle's medium (high glucose with L-glutamine) Lonza Bioscience BE12-604F
Entellan mounting medium Merck 1079610100
Glassfeeder Local glazier by design
Heparin Sodium Salt Pan Reac AppliChem A3004,0001
Imalgène 1000 Merial, Portugal 01MER122
Needle 20 G x 1" 0.9 x 25 mm needle Terumo Europe NN-2025R
Parafilm Sigma Aldrich P6543-1EA
Rompun Bayer, Portugal 7427831
Sterilization Millex-HV 0,45 Millipore SLHVR25KS
Syringe, 1ml, 27 G x ½" 0.4 x 12 mm needle Terumo Europe BS-NIN2713
Teich Mix Astra Pond Astra 4030733100957
Tetra Goldfish Flakes Tetra 4004218742642

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References

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एनोफेलिन मच्छरों को रियर करने के लिए रक्त मुक्त आहार
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Marques, J., Cardoso, J. C. R., Félix, R. C., Power, D. M., Silveira, H. A Blood-Free Diet to Rear Anopheline Mosquitoes. J. Vis. Exp. (155), e60144, doi:10.3791/60144 (2020).More

Marques, J., Cardoso, J. C. R., Félix, R. C., Power, D. M., Silveira, H. A Blood-Free Diet to Rear Anopheline Mosquitoes. J. Vis. Exp. (155), e60144, doi:10.3791/60144 (2020).

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