Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

A Blood-Free Diyet Arka Anopheline Sivrisinekler için

doi: 10.3791/60144 Published: January 31, 2020

Summary

Anopheles sivrisineklerini esaret altında beslemek için kansız yapay diyet formülasyonu için bir protokol sunulmuştur. Bu diyet omurgalı kan benzer bir performansa sahiptir ve oogenez ve yumurta olgunlaşma tetikler ve canlı yetişkin döl üretir.

Abstract

Sıtma araştırmaları, esaret altındaki sivrisinekler(Anopheles spp.) için büyük ölçekli üreme ve üretim koşulları gerektirir. Sivrisinek sürdürülebilir ve güvenilir üretim şu anda taze omurgalı kan kaynağı tarafından inhibe edilir. Kanalternatiflersıtma ve kan besleme böcekler tarafından bulaşan diğer vektör kaynaklı hastalıklar için etkili kontrol stratejileri teşvik etmek için gereklidir. Bunu göz önünde bulundurarak, yapay sıvı diyetler taze omurgalı kanı yerine formüle edildi. Burada kana benzer beslenme oranları sunan ve taze omurgalı kan öğününün fizyolojik etkilerini taklit eden kaniçermeyen yapay sıvı diyeti rapor ediyoruz. Diyet anopheles sivrisinek yumurtalık ve yumurta olgunlaşma neden olur ve aynı zamanda iyi larva sağkalım ve fonksiyonel yetişkinlerin gelişimi üretir. Formüle edilen kansız sıvı diyet esaret sürdürülebilir sivrisinek ıslahı yolunda önemli bir ilerleme dir ve sivrisinek kolonilerinin bakım maliyetlerini azaltmak ve taze omurgalı kan ihtiyacını ortadan kaldıracaktır.

Introduction

Vektör kaynaklı hastalıklar dünya çapında milyonlarca insan etkiler ve her yıl milyonlarca ölüme neden olur. Enfekte bir konaktan kanla beslendiklerinde hastalık üreten mikroorganizmalar (protozoon, virüsler) ile enfekte olan böcekler tarafından bulaşırlar. Daha sonra, enfekte vektör bir sonraki kan yemeği sırasında yeni bir konak için patojen iletecektir. Sıtma Anopheles sivrisinek birkaç farklı türler tarafından bulaşan ve dünya nüfusunun% 40 etkiler ölümcül vektör kaynaklıhastalıktır 1. Sıtma protist paraziti her yıl 400.000'den fazla ölümden sorumludur ve bunların çoğu 5 yaşın altındaki çocuklardır (Dünya Sağlık Örgütü). Dişi Anopheles sivrisinek omurgalı kan, yumurta üretimi ve gelişimi için gerekli bir adım beslenir insanlar ve diğer hayvanlar arasında Plasmodium cinsinin sıtma paraziti iletir2.

Sıtma ve diğer gelişmekte olan ölümcül sivrisinek vektör kaynaklı hastalıkların eradikasyonu için mevcut stratejiler yenilikçi sivrisinek kontrol stratejilerinin geliştirilmesi güveniyor3,4,5, hangi sivrisinek çok sayıda böcek yetiştirilen vahşi içine serbest bırakılması içerir. Ancak, önemli bir sınırlayıcı faktör etkili sivrisinek yetiştirme ve ıslah ıslahı için taze kan kaynağı üzerinde bağımlılıktır. Omurgalı kanının değişken bileşimi sivrisinek doğurganlığını ve döl formunu olumsuz etkileyebilir ve esir üreme kolonilerinin güvenilirliğini ve sürdürülebilirliğini sınırlayabilir. Sivrisinek salınım ve kontrol programları büyük ölçekli sivrisinek üretim sistemleri ve omurgalı kan büyük miktarlarda düzenli bir kaynağı gerektirir. Bu sivrisinek üretimi için önemli bir engeldir ve ilgili zorlu güvenlik yönetmeliklerinin neden olduğu canlı hayvanların kullanımı ve lojistik sınırlamalar ile ilgili etik sorunlar bir dizi yükseltir. Bu da sivrisinek kolonilerinin bakım ve güvenlik maliyetlerini yüksek kyapmaktadırretmekte ve özellikle sıtma tehdidinin çok daha fazla olduğu düşük gelirli ülkelerde mevcut sivrisinek yetiştirme uygulamalarının sürdürülebilirliğine meydan okuyor.

Son zamanlarda araştırma bir omurgalı kan unu taklit kan yerine geliştirilmesi üzerinde duruldu ama şimdiye kadar, sadece sınırlı başarı elde edilmiştir6,7,8,9. Başarılı bir yapay diyet ihtiyacı (1) tam dişi sivrisinek tıkanması kışkırtmak, (2) tetik vitellogenin üretimi, (3) canlı yumurta büyük gruplar üretmek, ve (4) heathy döl10üretmek . Buna ek olarak, yapay diyetler standart bir kompozisyon var ve böylece araştırma ve kontrol amaçlı sivrisinek üretimi için daha güvenilir. Başarılı kan-free diyetler Aedes sivrisinekler için geliştirilmiştir (Gonzales ve Hansen tarafından gözden11)ama Anopheles spp için değil. Mevcut yapay diyetler bir fagosans içeren (örneğin, ATP10), yumurta olgunlaşması için bir protein kaynağı6,12, enerji kaynağı olarak karbonhidratlar, ve amino asitler (aa)13 bu temel yumurta üretimi için temel faktör ve sivrisinek için önemli bir faktördür144 . Yapay bir kan ücretsiz diyet de kolesterol sağlamak gerekiyor15, hangi yumurta üretimini artırır. Burada kadın Anopheles sivrisinekler için yapay bir kan ücretsiz diyet tanımlamak ve yüksek kaliteli omurgalı kan yemek tutarlı ve eşdeğer bir performansa sahip olduğunu göstermektedir.

Protocol

Fareler IHMT hayvan evinden elde edildi. Hayvan deneyleri Portekiz yasalarına ve laboratuvar hayvanlarının kullanımına ilişkin kurallara uygun olarak yapılmıştır. Direção-Geral de Veterinária, Ministério da Agricultura do Desenvolvimento Rural e das Pescas, Portekiz tüm çalışma protokollerini onayladı (id onayları: 023351 ve 023355).

NOT: ~26 °C'de tüm besleme tahlillerini gerçekleştirin.

1. Sivrisinekler

  1. Anopheles coluzzii koruyun (eski Anopheles gambiae M formu) Yaoundé suşu sivrisinek 26 °C, 75% nem altında 12 h:12 h ışık:karanlık döngüsü. Ev sivrisinekler standart böcek koşulları kullanarak çiftlik garanti etmek.
  2. Küçük bir su kabıiçine sivrisinek pupa toplamak. Yetişkin sivrisinek ler ortaya ve çiftleşmek için bir sivrisinek kafes içinde konteyner yerleştirin. %10 glikoz besleme çözeltisi sağlayın. Ortaya çıktıktan üç gün sonra bir aspiratör kullanarak stok kafesten gerekli sayıda sivrisinek toplamak.
  3. Beslenme denemelerinden bir gün önce% 10 glikoz besleme çözeltisi çıkarın.
    NOT: Deneyler boyunca 3 günlük sivrisinekler kullanılmıştır.

2. Sivrisinek Besleme

  1. Yapay sıvı diyetlerinin hazırlanması
    1. Bir laminar akış kabininde steril koşullar altında yapay sıvı diyetler hazırlayın. İlk sıvı diyet (i-liq_diet) aşağıdaki ekleyerek zengin sıvı diyet (r-liq_diet) hazırlayın; Dulbecco modifiye Eagle orta [L-glutamin ile yüksek glikoz], Tablo 1bakınız: 0.55 g / L ATP, 1 g / L kolesterol, ve 200 g / L sığır serum albumin (BSA). Tüm malzemeleri iyice karıştırın ve 0,45 μm mikrofiltre kullanarak süzün.
      NOT: Diyetleri saklamayın; depolandığında kaliteyi kaybettikleri için her deney için stok çözümlerinden taze olarak diyetler hazırlayın. Diyetlerin bileşenleri Tablo 1'deaçıklanmıştır.
  2. Fare kan toplama
    1. İntraperitoneal rotayı kullanarak ketamin (120 mg/kg) ve ksilazin (16 mg/kg) ile 6−8 haftalık CD1 dişi fareleri(Mus musculus)anestezik.
    2. Fare farklı fiziksel uyaranlara (örneğin, ton ve kuyruk çimdikleri) yanıt olarak hiçbir kas reaksiyonu gösterdiğinde kardiyak delinme(Şekil 1)gerçekleştirin.
    3. Kan pıhtılaşmasıoluşumunu önlemek için 100 μL 1 mg/mL heparin (sodyum tuzu) içeren 27 G x1/20(0,4 x 12 mm 2 ) iğneiçeren steril 1 mL şırınga kullanarak kan toplayın. Su banyosu kullanarak 37 °C'de kan bakımı yaptırın.
  3. Yapay besleme
    1. Bir aspiratör kullanarak stok kafesyaklaşık 30 kadın sivrisinek toplamak.
    2. Dişi sivrisinekleri 500 mL kağıt bardaklara aktarın ve kaçabilmeleri için ince bir sivrisinek ağı örgüsünü kapatın. Her bardağın üstüne sabit bir su akışını korumak için plastik tüplere bağlı bir cam besleyici uygulayın(Şekil 2). Silindirik boru ve besleyiciye sabit bir su akışı sağlayın, böylece içindeki sıcaklık yaklaşık 37,5 °C'de tutulur.
      NOT: Standart cam çan yapay besleme cihazı16 dişi sivrisinekler için formüle diyetler sağlamak için kullanılmıştır.
    3. Yemek içerecek şekilde cam besleyici ağız boyunca streç parafin film membran.
    4. Su banyosu kullanarak 37 °C'de i-liq_diet ve r-liq_diet önceden ısıtın. Cam besleyiciye 1 mL uygulayın. Ya i-liq_diet, r-liq_diet ya da taze fare kanı ile karanlıkta 60 dakika boyunca sivrisinek beslemek. Tahlilleri 26 °C'de gerçekleştirin.
  4. Beslenme hızının değerlendirilmesi.
    1. Yapay beslenmeden sonra, 30 s. 30 s. için -20 °C sivrisinek anestezi bir soğutulmuş Petri kabına sivrisinek yerleştirin.
    2. Tam tıkanmış (Şekil 3) dişi sivrisinek lerin sayısını kaydedin.
      NOT: Beslenen sivrisinek yüzdesi başarı besleme için bir proxy olarak kullanılır.

3. Yaşam Öyküsü Özellikleri

  1. Yumurta üretimi ve bereketi
    1. Tamamen tıkanmış dişileri fırça kullanarak tek tek kafeslere (20 cm x 20 cm x 20 cm) aktarın.
    2. Sivrisinekleri 26 ± 1 °C, %75 nem ve %12 saat açık:%10 glikoz reklam libitum ile karanlık döngüde tutun.
    3. Beslenmeden sonra kırk sekiz saat, yumurta yumurtlama için alt kısmında nemlendirilmiş bir filtre kağıdı ekleyin (Şekil 4). Bir el büyüteç kullanarak yumurta döşeme kağıdı eklenmesinden sonra 48 saat ve 72 saat yumurta saymak. Yumurtaları toplamak için filtre kağıdını distile suyla doldurun.
  2. Larva ölümleri
    1. Yumurtaları distile su ile doldurulmuş tepsilere (23 cm x 15 cm x 6 cm) toplayın(Şekil 5). Deneyler sırasında tepsilerde su seviyesini sabit tkoruyun.
    2. Tepsi başına yaklaşık 13 mg yer balığı gıda ile günlük larvaları besleyin. Tüm çoğaltma tepsilerine benzer bir besleme rejimi uygulayın.
    3. Ölü pupa ve larvaları her gün çıkarın. Tüm pupayetişkinler haline geldi ve yetişkin erkek ve kadın sayısını saymak deneyler ilerler.
    4. Kuluçka ve ölüm tarihlerini kaydedin ve ölüm oranlarını hesaplayın.
  3. Uzun ömürlü
    1. Her diyet grubunun F1 neslinden 15 yetişkin erkek ve 15 yetişkin kadın toplayın. Erkekleri ve dişileri aynı kafeste tut.
    2. Yetişkinleri %10 glikoz çözeltisi reklam libitumla besleyin. Ölü yetişkinleri her gün çıkarın.
    3. Sivrisinekleri yukarıda açıklandığı gibi aynı sıcaklıkta, nemde, ışık döngüsü koşullarında ve şeker besleme rejiminde koruyun.
    4. Ölüm tarihlerini kaydedin ve uzun ömürlü olun.
  4. Kanat uzunluğu ölçümü
    1. -20 °C'de her diyet grubundan 90 s'de beş günlük F1 yetişkin sivrisineklerini (erkek ve dişi) soğuk anestezi.
    2. Bir stereoskop altında, yavaşça forceps ile her sivrisinek toraks kavramak ve onları ventral tarafı kadar yerleştirin.
    3. Bir neşter kullanarak her iki kanat toplamak ve montaj ortamı kurutulmuş bir damla içeren temiz bir mikroskop slayt üzerine yerleştirin. 20 G iğne yardımı ile kapak kayma sınırlarına ekstra montaj ortamı ekleyin ve yavaşça kanatlar üzerine coverslip indirin.
    4. Kanat uzunluğunu(Şekil 6)bir mikrometre kullanarak stereoskopla ölçün.

Representative Results

Aşağıda açıklanan sonuçlar formüle edilmiş zengin yapay yemek (r-liq_diet) ve sivrisinekler ilk sıvı diyet (i-liq_diet) veya taze kan yemek beslenen beslenen kadın Anopheles sivrisinek performansını karşılaştırın. Diyet Şekil 7'degösterilen şematik protokole göre test edilmiştir. Burada açıklanan r-liq_diet bir patentin parçasıdır (PCT/IB2019/052967).

Tam tıkanmış dişilerin yüzdesi

R-liq_diet ile beslenen tıkanmış dişi sivrisinek lerin sayısı (%89) kanla beslenen tıkanmış kadın sayısından anlamlı olarak daha yüksekti (%56) (Şekil 8).

Fecundity ve doğurganlık

İlk gonotrofik döngü için kadın fecundity ve doğurganlık i-liq_diet ve r-liq_diet beslenme kalitesini değerlendirmek için kullanılmıştır. Taze omurgalı kanıyla beslenen dişiler ortalama 24 ± 11 yumurta yumurtlarken, r-liq_diet beslenen dişiler ortalama 25 ± 5 yumurta(Tablo 2)koydular. I-liq_diet beslenen dişiler tarafından yumurtlama gözlenmedi.

F1 mortalitesi

F1 sivrisineklerinin zindeliği omurgalı kanı veya r-liq_diet ile beslenen koloniler arasında değerlendirildi. Larva, pupa ve erişkin mortalite kaydedildi. R-liq_diet beslenen sivrisineklere göre kanla beslenen sivrisineklerde(Şekil 9 ve Tablo 2)değişkenlik (ortalama [SEM]'nin standart hatası daha yüksekti. Kan veya r-liq_diet beslenen sivrisinekLerin F1 nesli benzer mortalite ve sağkalım oranlarına sahipti.

F1 yaşam beklentisi

Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezi tarafından yabani yetişkin dişi sivrisineklerin bir aya kadar yaşadığı ancak muhtemelen 1−2 haftadan fazla yaşayamadığı ve erkeklerin yaklaşık bir hafta yaşadığı ve sadece nektar ve diğer şeker kaynaklarıyla beslendiği tahmin edilmektedir. Bu ebeveyn gıda alımındaki farklılıklar sivrisinek atasının hayatta kalmasını etkileyebileceği belirtilmiştir17. Deneyimizde, kandaki yetişkin kadın ve erkekler (kadın 24.5 ± 6.8; erkek 18.5 ± 6.9) ve r-liq_diet (kadın: 22.5 ± 8.1; erkek: 11.9 ± 6.9) grupları benzer ortalama yaşam beklentisi ortalamasına(Tablo 3)sahipti ve kadınlar erkeklere göre yaşam süresinin arttığını gösterdi.

F1 gövde boyutu

Kanat uzunluğu yetişkin vücut büyüklüğünün bir göstergesi olarak kullanılmıştır. Diğer türlerile karşılaştırıldığında, Anopheles yetişkin arasında bir kanat uzunluğu 2.8 için 4.4 mm kanat uzunluğu18olan küçük ve orta ölçekli sivrisinekler vardır. R-liq_diet beslenen F1 Anopheles sivrisinekyetişkin vücut büyüklüğü beklenen aralıkta ve kanla beslenen böcek sivrisinek benzer(Şekil 10).

İstatistiksel analiz

Sunulan veriler en az üç bağımsız denemenin ortalamasını temsil eder (aksi belirtilmedikçe). Hata çubukları SEM'yi temsil ediyor. Veriler Gaussian dağılımını takip ettiğinde, bağımsız gruplar Öğrencinin t testi kullanılarak karşılaştırıldı, aksi takdirde Mann-Whitney testi uygulandı. Yapay diyetle beslenen gruplar arasındaki farklar Fisher'ın tam testi kullanılarak analiz edildi ve P ≤ 0.05'te anlamlı olduğu değerlendirildi.

Figure 1
Şekil 1: Cd1 fare kan toplama intrakardiyak delinme ile. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Standart yapay besleme cihazı. Cam besleyici dişi Anopheles sivrisinek beslenen r-liq_diet içerir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Yapay beslenmeden sonra anopheles sivrisinek. Soldan sağa: r-liq_diet sunulan tam tıkanmış bir kadın, r-liq_diet, erkek ve fare kanı teklif edildi tamamen tıkanmış kadın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Anopheles yumurtar-liq_diet ile dişilerin beslenmesi sonrası 48 saat yumurtlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Yumurtalardan geliştirilen ve filtre kağıdına toplanan ve distile su içeren tepsilere yerleştirilen L2 larva ları etapları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Bir Anopheles coluzzii dişi sivrisinek bir F1 nesil sağ kanat. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: Suni diyet testişetiği protokolü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 8
Şekil 8: Dişi sivrisineklerin beslenme oranları ya yapay diyetler ya da kan ile beslenir. Yıldız işaretleri, r-sıvı ve i-sıvı diyetleri ile kanla beslenen kontrol grubu ile beslenen sivrisinekler arasında önemli farklar olduğunu gösterir. İki taraflı Fisher'ın kesin testi: ****P ≤ 0.0001 (göreceli risk: 0.4828, %95 kendinden emin Seviye [CL]: 0.3776 ila 0.6194) kana karşı r-sıvı diyeti için, *P = 0.0335 (göreceli risk: 1.379, %95 CL: 1.044- 1.836) kan-i diyet i-i için. Mavi: beslenmemiş; kırmızı: beslenen. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 9
Şekil 9: Formüle edilmiş kansız yemeğin F1 Anopheles coluzzii sivrisineklerinin mortalite ve erkek/kadın oranı üzerine etkisi. Her biri diyet başına 30 sivrisinek kullanılarak üç bağımsız deney yapıldı. Eşleşmeyen bir t-testi, kanla beslenen grup ile r-liq_diet beslenen grup(P değerleri 0,5047 ile 0,8491 arasında değişmektedir) arasında anlamlı bir fark göstermedi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 10
Şekil 10: Kanat uzunluğu. Kanat uzunluğunu belirlemek için eksenel kesiden R4+5 ven'e kadar olan mesafe saçak setahariç kullanılmıştır. Büyüklük her diyet grubundan 5 kadın ve 5 erkek için değerlendirildi (ortalama ± SEM). Değerler ortalama ± SEM. Somon: r-liq_diet; kırmızı: omurgalı kanı. Eşleşmemiş t-testi; kadın sol kanat: t = 1.300, df = 8, P = 0.2298; erkek sol kanat: t = 2.400, df = 8, P = 0.0432; kadın sağ kanat: t = 1.300, df = 8, P = 0.2298; erkek sağ kanat: t = 2.277, df = 7, P = 0.0569. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bileşen g/L
*Adenozin Trifosfat 0.55
*Büyükbaş Serum Albumin 200
*Kolesterol 1
Kalsiyum klorür susuz 0.2
Kolin klorür 0.004
D-kalsiyum pantotenat (B5 vitamini) 0.004
D-glikoz susuz 4.5
Ferrik nitrat nonahidrat 0.0001
Folik asit 0.004
Glycine 0.03
I-inositol 0.007
L-arginin monohidroklorür 0.084
L-sistin dihidroklorür 0.063
L-glutamin 0.584
L-histidin monohidroklorür monohidrat 0.042
L-isoleucine 0.105
L-lösin 0.105
L-lizin monohidroklorür 0.146
L-metiyonin 0.03
L-fenilalanin 0.066
L-serine 0.042
L-threonine 0.095
L-triptofan 0.016
L-tirozin disodyum tuzu dihidrat 0.104
L-valine 0.094
Magnezyum sülfat susuz 0.098
Niacinamide (nikotinamid) 0.004
Fenol kırmızısı 0.015
Potasyum klorür 0.4
Piridoksin Monohidroklorür 0.004
Piruvik asit sodyum tuzu 0.011
Riboflavin (B2 vitamini) 0.0004
Sodyum bikarbonat 3.7
Sodyum klorür 6.4
Sodyum fosfat monobazik susuz 0.109
Tiamin amonohidroklorür (B1 vitamini) 0.004
*Sadece r-liq_diet

Tablo 1: i-sıvı diyet ve r-sıvı diyet bileşimi.

Toplam yumurta sayısı (± SEM) Yumurta/dişi (± SEM)
Kan 733 ± 330 24 ± 11
r-liq_diet 763 ± 164 25 ± 5
i-liq_diet 0 0

Tablo 2: Anopheles coluzzii dişileri tarafından üretilen yumurta serileri. Her deney için her birinde 30 dişi sivrisinek kullanılarak üç bağımsız deney yapıldı.

Dişiler (gün ± SEM) Erkekler (gün ± SEM)
Kan 24.5 ± 6.8 18.5 ± 6.9
r-liq_diet 22.5 ± 8.1 11.9 ± 6.9

Tablo 3: F1 Anopheles sivrisineklerinin yaşam beklentisi. Yapay olarak beslenen F0'den gelen F1 sivrisineklerinin uzun ömürlülüğü, aynı beslenme grubundan gelen her bir sivrisineğin doğum ve ölüm tarihleri nin kaydedilmesiyle değerlendirildi (15 kadın ve 15 erkek takip edildi). Sonuçlar diyet grubu başına ortalama sivrisinek yaşam süresi olarak temsil edilmektedir.

Discussion

Formüle edilmiş kansız beslenmemizin başarısı, büyük olasılıkla i-liq_diet eklenen tüm bileşenlerin sinerjik fizyolojik etkisinin (şeker, amino asitler, vitaminler ve mikroelementler açısından zengin): BSA (protein kaynağı), ATP (fagostimulant) ve kolesterolün (lipid kaynağı) sonucudur. R-liq_diet tek başına tek tek bileşenleri ile takviyesi yumurta üretimini teşvik etkili değildi (veriler gösterilmedi). Protokolün bir dezavantajı kolesterol gibi bazı bileşenlerin maliyeti olabilir. Buna rağmen, varlığı temeldir, böcekler onu sentezlemek mümkün değildir gibi19 ve bu molekül eklembacaklılar sarısı sentezi ve yumurta olgunlaşma düzenleyen ecdysteroid hormonların öncüsüdür20. Düşük miktarda kolesterol maliyetleri azaltmak ve yapay diyetin faydalarını artırmak amacıyla gerekli miktarı optimize etmek için test edilmelidir.

Yöntemin bir diğer sınırlaması, yapay diyetin stok çözeltilerinden taze olarak hazırlanması gerektiğidir, çünkü bir kez son sıvı formunda hazırlandıktan sonra depolama dan sonra kalitesini kaybeder. Gelecekte formüle edilmiş diyet kurutulmuş bir güç olarak hazırlanabilir, SkitoSnackt benzer, Aedes aegypti sivrisinek ler için yapay bir kan unu yerine21.

Gerekli besin lerin sağlanmasının yanı sıra, yapay bir öğün, kadın sivrisinekleri omurgalı taze kanla besledikleri gibi beslemek için cezbetmesi ve uyarması gerekir. Burada açıklanan yapay kansız diyet omurgalı kan labeslenen gruba göre tam tıkanmış dişi sivrisineklerde %20'lik bir artışa yol açmıştır. Bu dolaylı çekim ölçüsü, yapay diyetin taze kandan daha çekici ve sivrisineklere daha çekici geldiğini doğrulamak için olfactometers kullanılarak daha da açıklığa kavuşturulabilir.

Kanla beslenen sivrisineklerden elde edilen larvalarda diyetin larva ölümleri üzerindeki en yüksek etkisi gözlenmiştir ve bu da yapay bir bileşimin taze kana kıyasla mortaliteyi azaltmaya ve sivrisinek üreme başarısını artırmaya katkıda bulunabileceğini düşündürmektedir. Bir kan yemeği daha az tahmin edilebilir sonucu kompozisyon17 konak varyasyonları ve sivrisinek fizyolojisi22müdahale edebilir moleküllerin kan varlığı ortaya çıkabilir. Önceki gerçekler taze kansız diyetler yüksek kaliteli sivrisinek yetiştirme için avantajları vurgulamak.

Genel olarak çalışmamızda yatırılan ortalama yumurta sayısı bazı böceklerde bildirilenlere göre düşüktü, ancak ortalama yumurta sayısı insan kanıyla beslenen A. gambiya laboratuvar tarafından yetiştirilen suşuyla karşılaştırılabilirdi (22.6 ± 5.5 yumurta/dişi)23. Taze kanla veya yapay öğünlerle beslenen deneysel gruplarımız arasında anlamlı istatistiksel farklılıklar gözlenmemiştir(Tablo 2),formüle edilmiş diyetimizle yapay membran besleme sistemlerinin uygulanmasının Anopheles sivrisinek kolonilerini esaret altında tutmak ve yaymak için yeterli olduğunu düşündürmektedir.

Yapay kan sızdırmaz yemekler Aedes kolonileri koruyabilirsiniz22, ama Anopheles sivrisinek uygulandığında onlar sınırlı veya hiçbir başarı11. Son zamanlarda, Anopheles sivrisinekler için plazma bazlı yapay yemek tarif edildi24 ama beslenme oranları ve üreme potansiyeli düşüktü. Bizim formüle r-liq_diet standart omurgalı kan yemek daha benzer veya daha iyi bir performans olduğu gibi bizim sonuçlar state-of-art (Gonzales ve Hansen11tarafından gözden) önemli bir ilerleme temsil eder. Depolama kararlılığı ve maliyeti üzerinde daha fazla iyileştirmeler uygulamanın kapsamını genişletmek gerekir.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Teknik destek için Dinora Lopes'e (IHMT-NOVA Hayvan Tesisi), Joana Gomes ve Ana Catarina Alves'e (IHMT-NOVA Böcek Tesisi) Anopheles sivrisinek kolonilerini koruduklarından dolayı teşekkür ederiz. Bill ve Melinda Gates Vakfı (OPP1138841), Fundação para a Ciência e Tecnologia (UID/Multi/04413/201, UID/Multi/04326/2013, SFRH/BPD/89811/2012, CEECIND/00450/2017) tarafından finanse edilmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate Sigma Aldrich A2383
BSA-Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A790G
Cholesterol MP Biomedicals 199342
Dulbecco's modified Eagle's medium (high glucose with L-glutamine) Lonza Bioscience BE12-604F
Entellan mounting medium Merck 1079610100
Glassfeeder Local glazier by design
Heparin Sodium Salt Pan Reac AppliChem A3004,0001
Imalgène 1000 Merial, Portugal 01MER122
Needle 20 G x 1" 0.9 x 25 mm needle Terumo Europe NN-2025R
Parafilm Sigma Aldrich P6543-1EA
Rompun Bayer, Portugal 7427831
Sterilization Millex-HV 0,45 Millipore SLHVR25KS
Syringe, 1ml, 27 G x ½" 0.4 x 12 mm needle Terumo Europe BS-NIN2713
Teich Mix Astra Pond Astra 4030733100957
Tetra Goldfish Flakes Tetra 4004218742642

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. WHO. World Malaria Report. World Health Organization. (2016).
  2. Hansen, I. A., Attardo, G. M., Rodriguez, S. D., Drake, L. L. Four-way regulation of mosquito yolk protein precursor genes by juvenile hormone-, ecdysone-, nutrient-, and insulin-like peptide signaling pathways. Frontiers in Physiology. 5, 103 (2014).
  3. Catteruccia, F., Crisanti, A., Wimmer, E. A. Transgenic technologies to induce sterility. Malaria Journal. 8, Suppl 2 7 (2009).
  4. Dame, D. A., Curtis, C. F., Benedict, M. Q., Robinson, A. S., Knols, B. G. J. Historical applications of induced sterilisation in field populations of mosquitoes. Malaria Journal. 8, Suppl 2 2 (2009).
  5. Lacroix, R., et al. Open Field Release of Genetically Engineered Sterile Male Aedes aegypti in Malaysia. PLoS One. 7, 42771 (2012).
  6. Lea, A. O., Knierim, J. A., Dimond, J. B., Delong, D. M. A Preliminary Note on Egg Production from Milk-Fed Mosquitoes. The Ohio Journal of Science. 55, 1-21 (1955).
  7. Kogan, P. H. Substitute blood meal for investigating and maintaining Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 27, 709-712 (1990).
  8. Griffith, J. S., Turner, G. D. Culturing Culex quinquefasciatus mosquitoes with a blood substitute diet for the females. Medical and Veterinary Entomology. 10, 265-268 (1996).
  9. Jason Pitts, R. A blood-free protein meal supporting oogenesis in the Asian tiger mosquito, Aedes albopictus (Skuse). Journal of Insect Physiology. 64, 1-6 (2014).
  10. Gonzales, K. K., Tsujimoto, H., Hansen, I. A. Blood serum and BSA, but neither red blood cells nor hemoglobin can support vitellogenesis and egg production in the dengue vector Aedes aegypti. PeerJ. 3, 938 (2015).
  11. Gonzales, K. K., Hansen, I. A. Artificial Diets for Mosquitoes. International Journal of Environmental Research and Public Health. 13, (12), 1267 (2016).
  12. Cosgrove, J. B., Wood, R. J. Effects of variations in a formulated protein meal on the fecundity and fertility of female mosquitoes. Medical and Veterinary Entomology. 10, 260-264 (1996).
  13. Attardo, G. M., Hansen, I. A., Shiao, S. -H., Raikhel, A. S. Identification of two cationic amino acid transporters required for nutritional signalling during mosquito reproduction. Journal of Experimental Biology. 209, 3071-3078 (2006).
  14. Clements, A. N. The biology of mosquitoes: Development, nutrition, and reproduction. Chapman & Hall. New York, NY. (1992).
  15. Talyuli, O. A., et al. The use of a chemically defined artificial diet as a tool to study Aedes aegypti physiology. Journal of Insect Physiology. 83, 1-7 (2015).
  16. Lopes, L. F., Abrantes, P., Silva, A. P., Dorosario, V. E., Silveira, H. Plasmodium yoelii: The effect of second blood meal and anti-sporozoite antibodies on development and gene expression in the mosquito vector, Anopheles stephensi. Experimental Parasitology. 115, 259-269 (2007).
  17. Phasomkusolsil, S., et al. Maintenance of mosquito vectors: effects of blood source on feeding, survival, fecundity, and egg hatching rates. Journal of Vector Ecology. 38, 38-45 (2013).
  18. Gillies, M. T., De Meillon, B. The Anophelinae of Africa South of the Sahara (Ethiopian zoogeographical region). Publications of the South African Institute for Medical Research. 54, 1 (1968).
  19. Canavoso, L. E., Jouni, Z. E., Karnas, K. J., Pennington, J. E., Wells, M. A. Fat metabolism in insects. Annual Review of Nutrition. 21, 23-46 (2001).
  20. Clifton, M. E., Noriega, F. G. The fate of follicles after a blood meal is dependent on previtellogenic nutrition and juvenile hormone in Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 58, 1007-1019 (2012).
  21. Gonzales, K. K., et al. The Effect of SkitoSnack, an Artificial Blood Meal Replacement on Aedes aegypti Life History Traits and Gut Microbiota. Scientific Reports. 8, 11023 (2018).
  22. Vodovotz, Y., Zamora, R., Lieber, M. J., Luckhart, S. Cross-talk between nitric oxide and transforming growth factor-beta1 in malaria. Current Molecular Medicine. 4, 787-797 (2004).
  23. Sumba, L. A., et al. Daily oviposition patterns of the African malaria mosquito Anopheles gambiae Giles (Diptera: Culicidae) on different types of aqueous substrates. Journal of Circadian Rhythms. 2, 6 (2004).
  24. Baughman, T., et al. A highly stable blood meal alternative for rearing Aedes and Anopheles mosquitoes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11, 0006142 (2017).
A Blood-Free Diyet Arka Anopheline Sivrisinekler için
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marques, J., Cardoso, J. C. R., Félix, R. C., Power, D. M., Silveira, H. A Blood-Free Diet to Rear Anopheline Mosquitoes. J. Vis. Exp. (155), e60144, doi:10.3791/60144 (2020).More

Marques, J., Cardoso, J. C. R., Félix, R. C., Power, D. M., Silveira, H. A Blood-Free Diet to Rear Anopheline Mosquitoes. J. Vis. Exp. (155), e60144, doi:10.3791/60144 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter