Summary
El modelo animal de insuficiencia hepática aguda desarrollado en el estudio actual presenta una alternativa factible para el estudio de posibles terapias. El modelo actual emplea el efecto combinado de la lesión hepática física y inducida por fármacos y proporciona un período de tiempo adecuado para estudiar el potencial de las nuevas terapias.
Abstract
La insuficiencia hepática aguda (ALF) es una condición clínica causada por varias etiologías que resulta en la pérdida de funciones metabólicas, bioquímicas, sintetizadoras y desintoxicantes del hígado. En la mayoría de los casos de daño hepático irreversible, el trasplante de hígado ortotrópico (OLT) sigue siendo el único tratamiento disponible. Para estudiar el potencial terapéutico de un tratamiento para la ALF, sus pruebas previas en un modelo animal de ALF son esenciales. En el estudio actual, se desarrolló un modelo de ALF en ratas combinando un 70% de hepatectomía parcial (PHx) e inyecciones de paracetamol (APAP) que proporciona una ventana terapéutica de 48 h. La mediana y los lóbulos laterales izquierdos del hígado fueron retirados para extirpar el 70% de la masa hepática y a APAP se le administró 24 h postquirúrgicamente durante 2 días. Se encontró que la supervivencia en animales inducidos por ELA disminuyó gravemente. El desarrollo de ALF fue confirmado por niveles séricos alterados de las enzimas alanina amino transferasa (ALT), aspartato amino transferasa (AST), fosfatasa alcalina (ALP); cambios en el tiempo de protrombina (PT); y evaluación de la relación internacional normalizada (INR). El estudio del perfil de expresión génica por qPCR reveló un aumento en los niveles de expresión de genes implicados en la apoptosis, inflamación y en la progresión de la lesión hepática. La evaluación histológica observó la degeneración difusa de hepatocitos y la infiltración de células inmunitarias. La reversibilidad de la ALF se confirmó mediante la restauración de la supervivencia y los niveles séricos de ALT, AST y ALP después del trasplante intraesplénico de hepatocitos de ratas sanas singénicas. Este modelo presenta una alternativa fiable a los modelos animales ALF disponibles para estudiar la fisiopatología de ALF, así como para evaluar el potencial de una novedosa terapia para ALF. El uso de dos enfoques diferentes también permite estudiar el efecto combinado de la lesión hepática física y no inducida por drogas. La reproducibilidad y viabilidad del procedimiento actual es una ventaja añadida del modelo.
Introduction
La insuficiencia hepática aguda (ALF) es definida por la Asociación Americana para el Estudio de Enfermedades Hepáticas como un rápido desarrollo de lesión hepática aguda sin ningún signo previo de daño y se caracteriza por un deterioro grave de las funciones sintéticas, metabólicas y desintoxicantes del hígado1. LA ALF difiere de la insuficiencia hepática crónica cuando la insuficiencia se produce como resultado de una lesión hepática causada durante un largo período de tiempo y de insuficiencia hepática crónica aguda (ACLF), donde el daño hepático abrupto tiene lugar como resultado de enfermedades hepáticas crónicas2,3,4. La única cura disponible para la ALF es el trasplante de hígado ortotópico (OLT), o puede ocurrir la muerte. Debido a la escasez de donantes hepáticos, la tasa de mortalidad en pacientes que sufren de ALF es muy alta.
Para estudiar el potencial de los enfoques terapéuticos alternativos y para entender mejor la fisiopatología de la ALF, se necesitan modelos animales que puedan reflejar la ALF que ocurre en los seres humanos. Muchos de los modelos animales ALF ya disponibles tienen varias deficiencias. Los efectos del paracetamol (APAP) son difíciles de reproducir, pero tienen las similitudes más cercanas en términos de parámetros temporales, clínicos, bioquímicos y patológicos. APAP- modelos animales inducidos con frecuencia encuentran problemas debido a la presencia de metahemoglobinemia causada por la oxidación de la hemoglobina por APAP y sus intermedios5,6,7. Otro problema es la falta de reproducibilidad reflejada por respuestas de dosis impredecibles y el momento de la muerte. Los modelos animales ALF producidos con cloruro de tetra carbono (CCl4) tienen una reproducibilidad deficiente8,9,10,11. Los modelos animales ALF inducidos por Concavalina A (Con A) y lipoplysaccharide (LPS) no reflejan el patrón clínico de la enfermedad humana, aunque tienen ventajas en el estudio de los mecanismos celulares implicados en enfermedades hepáticas autoinmunes y en el estudio de la sepsis respectivamente12,13,14,15. Del mismo modo, la tioacetamida (TAA) también requiere biotransformación a un metabolito activo sulfóxido de tioacetamida y muestra la variación de la especie16,17,18,19. D-galactosamine (D-Gal) produce algunos cambios bioquímicos, metabólicos y fisiológicos similares a ALF pero no es capaz de reflejar toda la condición patológica de ALF20,21,22,23. Ha habido muy pocos intentos de combinar dos o más de estos métodos para desarrollar un modelo de ALF que sea capaz de reflejar el síndrome de ALF de una mejor manera13. Por lo tanto, se requieren más estudios para desarrollar un modelo que pueda reflejar los parámetros de la enfermedad, tenga mejor reproducibilidad y proporcione suficiente tiempo para estudiar los efectos de una intervención terapéutica.
En el estudio actual, se ha creado un modelo alternativo de ALF en ratas combinando los efectos de la hepatectomía parcial (PHx) y dosis más bajas de un reactivo hepatotóxico. APAP tiene un papel bien establecido en la causa de lesiones hepáticas5,24,25. Es un analgésico ampliamente utilizado y es tóxico para el hígado a dosis supraterapéuticas mediante la formación de metabolitos tóxicos. La APAP es la causa de muchas muertes en los países desarrollados. La lesión física causada por la hepatectomía parcial inicia la activación de varios procesos involucrados en la inflamación, así como la regeneración hepática. La inyección del agente hepatotóxico APAP causa un ambiente hostil en el hígado, evitando la proliferación de hepatocitos. Esto reduce el período de estrés en el animal, que cuando se combina con dosis más pequeñas de hepatotoxina, conduce a una mejor reproducibilidad del procedimiento. Por lo tanto, utilizando este modelo, se ha estudiado un efecto combinatorio de dos tipos de lesiones hepáticas. Para caracterizar el modelo animal desarrollado de ALF, se han estudiado parámetros fisiológicos y bioquímicos. La reversibilidad exitosa de la ALF se confirmó mediante el trasplante de hepatocitos de ratas sanas singénes.
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Protocol
El procedimiento descrito a continuación ha sido aprobado por el Comité Institucional de ética animal del Instituto Nacional de Inmunología, Nueva Delhi. El número de referencia de serie de la aprobación es IAEC-355/14.
1. Preparación
- Prepárese para el procedimiento quirúrgico como se describió anteriormente por Das B et al.26.
- Utilice ratas Wistar endogámicas de 6 a 8 semanas de edad con un peso corporal de 200–250 g.
- Alimentar a los animales en condiciones estándar de cuidado animal y alimentarlos con comida de rata y libitum antes y después del procedimiento.
- Al realizar 70% PHx, utilice una mezcla de cóctel estándar de clorhidrato de ketamina (100 mg/kg de peso corporal) y xilazina (10 mg/kg de peso corporal), que se inyecta por vía intraperitoneal.
NOTA: El tipo de anestésico utilizado puede tener efectos postoperatorios sobre la mortalidad y la morbilidad. - Durante el trasplante de células, utilice la anestesia inhalante Isoflurano (2-cloro-2-(difluorometoxi)-1,1,1-trifluoro-etano) para reducir el tiempo de recuperación del animal después de la cirugía de trasplante.
- Inducir y mantener la anestesia inhalacional utilizando un sistema de anestesia personalizado. Mantenga el flujo de oxígeno a 4 L/min. Para el uso de inducción isoflurano al 4% y para el uso de mantenimiento 2–3% durante el procedimiento quirúrgico.
2. Procedimientos preoperatorios
- Anestetizar la rata inyectando la mezcla de ketamina-xilazina descrita en el paso 3.1 por vía intraperitoneal. Confirme la anestesia completa pellizcando el dedo del dedo del la nariz del animal. Los procedimientos adicionales se llevan a cabo sólo cuando no hay reflejo del pedal.
- Para prevenir la desecación corneal, aplique una gota ocular a base de metilcelulosa carboxial en ambos ojos.
- Sujeta randelel el animal anestesiado a un tablero quirúrgico con cinta blanca. Coloque el animal con el lado abdominal hacia arriba, asegurándose de que la boca esté en el lado distal de la persona que realiza la operación.
- Retire el vello de la zona quirúrgica abdominal superior derecha con una cortadora eléctrica.
- Desinfectar el sitio quirúrgico mediante tres exfoliantes alternos de yodo de povidona y 70% de etanol utilizando almohadillas de algodón esterilizadas en movimiento circular.
3. Hepatectomía parcial (PHx) para extirpar el 70% de la masa del hígado
NOTA: Realice todo el procedimiento quirúrgico bajo un ambiente estéril en una campana de flujo laminar. Utilice únicamente instrumentos quirúrgicos estériles para minimizar el riesgo de infección postquirúrgica. La extirpación del 70% de la masa hepática, denominada 70% de hepatectomía parcial (70% PHx), se realizó según lo descrito por C. Mitchell y H. Willenbring, 200827.
- Antes del inicio de la cirugía, confirme la anestesia completa del animal pellizcando su dedo del dedo del tiempo. Los procedimientos adicionales se llevan a cabo sólo cuando no hay reflejo del pedal.
- Marque la piel que se va a cortar justo debajo del esternón, perpendicular al xifoide y paralela a la caja torácica.
- Coloque una hoja de cortina estéril con una abertura de alrededor de 3 cm x 1 cm sobre la piel marcada.
- Realice una incisión transversal de alrededor de 2-3 cm a lo largo de la línea marcada con un bisturí. Use la cuchilla quirúrgica No. 22. Retire suavemente la unión de la piel a la capa muscular subyacente en las proximidades de la zona incisa utilizando puntas de algodón humedecidas estériles.
- A continuación, haga una incisión transversal a través de la capa peritoneal justo debajo del proceso de xifoide.
- Con la ayuda de dos puntas de algodón humedecido salina, exponga el lóbulo izquierdo del hígado aplicando una presión suave sobre el tórax. Coloque una punta de algodón en la región diafragmática de la porción incisa y la otra punta de algodón debajo de la región incisa para levantar el lóbulo hepático.
- Deslice un lazo de hilo de nylon estéril de 8-10 cm de largo (tamaño 4–0, 0.15 mm de diámetro) alrededor del lóbulo hepático expuesto. Lleve el lazo a la base del lóbulo cerca del hilum con la ayuda de fórceps microdissecting o cogollos de algodón humedecidos.
- Con la ayuda del portaagujas de microcirugía y las microcótelas, ate los dos extremos del lazo, colocando el nudo lo más cerca posible de la base del lóbulo para restringir el vaso sanguíneo y reducir el sangrado después de retirar el lóbulo hepático. Ate dos nudos adicionales en el otro lado.
- Tenga en cuenta no atar el nudo demasiado cerca de los vasos sanguíneos cercanos, lo que puede causar obstrucción venosa (estenosis).
- Use tijeras de microcirugía para cortar el lóbulo atado justo por encima del nudo, que deja una masa de tejido decolorada llamada muñón isquémico en lugar del lóbulo.
NOTA: El hígado de rata, al igual que los de los ratones, se divide en cuatro lóbulos distintos: el lóbulo medio, el lóbulo lateral derecho, el lóbulo lateral izquierdo y el lóbulo caudado, que representan alrededor del 40%, 20%, 30% y 7% de la masa hepática total, respectivamente. Cualquier combinación de estos lóbulos se puede eliminar para exprimir 70% masa hepática. En el estudio actual, se eliminaron el lóbulo mediano y los lóbulos laterales izquierdos. - Localice cuidadosamente el lóbulo mediano sin dañar el muñón restante del lóbulo lateral izquierdo. Tire suavemente de la cavidad abdominal, y en la base del lóbulo atar un hilo de nylon de 8-10 cm de largo (tamaño 4-0) nudo como se mencionó anteriormente. Ate dos nudos adicionales en el otro lado. Con cuidado, exiéntese y retire el lóbulo mediano atado tomando todas las precauciones mencionadas.
- Después de retirar los lóbulos, sutura el peritoneo usando una sutura cromática absorbible 4-0 con puntadas continuas seguidas de sutura de piel con una sutura interrumpida.
- Aplique yodo povidona en la piel que rodea las suturas para prevenir la infección.
- Retire la hoja de cortina y retire el animal de la placa de cirugía.
4. Cuidado postoperatorio en animales
- Inyecte por vía intraperitoneal al animal con una dosis de 12 mg de antibiótico cefotaxime en 1 ml de solución de glucosa al 5% con una jeringa de 1 ml para protegerlo del riesgo de infección postoperatoria.
- Administrar una inyección subcutánea de meloxicam analgésico (1 mg/kg de peso corporal) para aliviar el dolor después de la cirugía y seguirlo por dos dosis más, manteniendo el régimen como una dosis por día.
- Aloje los animales operados en condiciones estándar de ciclo claro/oscuro de 12 h y monitoree a intervalos regulares.
5. Inyección de drogas en animales parcialmente hepatizados para inducir insuficiencia hepática
- Después de 24 h después de la cirugía, cuando los animales se han recuperado con éxito de 70% PHx, medir el peso corporal del animal seguido de las inyecciones.
- Inyectar 750 mg/kg de peso corporal de APAP por vía intraperitoneal en animales parcialmente hepatizados 24 h después del 70% de PHx después de la recuperación exitosa de los animales del procedimiento quirúrgico. Repita la dosis de nuevo después de las 24 h.
NOTA: Dos dosis de APAP se administran por vía intraperitoneal al animal (es decir, 24 h y 48 h después del procedimiento de 70% de PHx, respectivamente). - En cada momento después de la inyección de APAP, medir el peso corporal del animal en recuperación.
NOTA: APAP (biocetamol) se inyecta en animales como una solución de 150 mg/ml en alcohol bencílico al 2%.
6. Trasplante de hepatocitos sanos en modelos animales ALF
NOTA: Para estudiar la reversibilidad de la ALF en ratas, trasplantar hepatocitos de ratas singénicos sanos por vía intrasílica en los animales inducidos por alF junto con la1a dosis de APAP. En el estudio actual, para proporcionar tiempo suficiente a las células trasplantadas para el rastreo y el injerto, el trasplante se realizó justo después de dar la1a dosis de APAP. Los hepatocitos de rata están aislados por un protocolo publicado por Berry and Friends et al.28 y posteriormente adaptado en varios otros estudios29,30,31 con algunas modificaciones. Para el trasplante intraesplénico de células en el modelo animal de ALF, siga los pasos mencionados a continuación.
- Coloque la rata en una cámara de poli (metil metacrilato) para la inducción de la anestesia con 4% de isoflurano y 4 L/min de flujo de oxígeno para una rata de 250–350 g de peso corporal. Compruebe la profundidad de la anestesia por la falta de reflejos del pedal al pellizcar la dedo del dedo del dedo del la página del animal.
- Coloque la rata anestesia en el tablero quirúrgico de tal forma que su parte lateral izquierda esté mirando hacia arriba. Mantenga la anestesia en 2–3% de inhalación de isoflurano a través de una boquilla adecuada.
- Afeitar la piel en la región lateral izquierda y esterilizarla mediante solución de yodo povidona.
- Haga una incisión transversal en la región aficioada de la piel.
- Haga un corte de 1-2 cm en la capa peritoneal para exponer el bazo.
- Saca suavemente el bazo de la cavidad peritoneal y levántalo con la ayuda de dos puntas de algodón humedecidas.
- Mantenga las células (normalmente 107 por animal) que se trasplantan suspendidas en medios de IMDM de 50 ml en una jeringa de insulina de 1 ml con una aguja de 29 G.
- Perforar suavemente la aguja en la corteza del bazo y liberar la suspensión celular en el bazo dentro de 2-3 min.
- Después de completar el trasplante de células, saque cuidadosamente la aguja y coloque el área de la punción de la aguja con una punta de algodón humedecida para evitar la fuga de la suspensión celular del sitio.
- Cierre el peritoneo y la piel por una sutura absorbible de 4-0 con sutura continua y discontinua respectivamente.
- Aplicar solución de yodo povidona en la piel en el lugar de las suturas para prevenir la infección en el sitio operado.
- Inyectar por vía intraperitoneal 1 ml de volumen de 12 mg/ml de solución antibiótica (p. ej., cefotaxime) e inyectar por vía subcutánea analgésico (p. ej., meloxicam) 1 mg/kg de peso corporal al animal como parte del cuidado postoperatorio. Mueva al animal a una jaula de recuperación cálida.
- Mantenga al animal operado aislado en condiciones normales de 12 h de ciclo claro/oscuro hasta que las heridas quirúrgicas estén completamente curadas. Esto puede tardar de 3 a 4 días.
7. Caracterización del desarrollo de ALF
- Euantamar a los animales por sobredosis de la solución de ketamina-xilazina 2 h después de la2a dosis de tratamiento APAP y recoger muestras de sangre y tejidos.
- Recoger suero de la sangre para estudios bioquímicos32.
- Procesar muestras de tejido hepático para estudios histológicos y de expresión génica33,34,35.
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Representative Results
Porcentaje de supervivencia en modelos animales de ALF
La dosis óptima de APAP para causar ALF en combinación con 70% PHx se estandarizó como 750 mg/kg de peso corporal. El régimen de tratamiento comenzó 24 h después del 70% de PHx, cuando los animales se habían recuperado completamente de la cirugía, y consistía en dos dosis de APAP a intervalos de 24 h. Se observó mortalidad a una tasa del 80% después de la administración de la segunda dosis de APAP, 48 h después de la cirugía. El porcentaje de supervivencia se analizó y se trazó a través del método Kaplan-Meier(Figura 1). La reproducibilidad en tiempo de muerte y período de tiempo proporcionada por este modelo lo convierte en un candidato adecuado para estudiar una intervención terapéutica contra ALF.
Para el estudio se consideraron cuatro grupos de animales: Grupo 1 (grupo de control, solo tratamiento salino), Grupo 2 (sólo APAP a 750 mg/kg de peso corporal), Grupo 3 (tratamiento salino con 70% PHx) y Grupo 4 (APAP a 750 mg/kg de peso corporal con 70% PHx). Se incluyeron tres animales cada uno en todos los grupos y se incluyen dos imágenes representativas de cada grupo. Los animales de los cuatro grupos fueron eutanasiados 2 h después de la administración de la2a dosis del tratamiento respectivo. Las muestras hepáticas tomadas de los cuatro grupos mostraron una morfología distinta entre sí. El grupo 1 mostró la morfología de color marrón rojizo de un hígado de roedor sano. Las muestras hepáticas del Grupo 2 no mostraron signos aparentes de daño a nivel morfológico y mostraron un aspecto similar al de los hígados sanos del Grupo 1. Las muestras hepáticas tomadas de los Grupos 3 y 4 no parecían saludables y tenían decoloración y un aspecto irregular. La decoloración corresponde al daño en el tejido hepático y fue más evidente en el Grupo 4. Los datos representativos se presentan en la Figura 2.
La extensión de la lesión hepática se determinó comprobando los niveles séricos de las enzimas ALT, AST y ALP36,37,38. Los niveles de ALT, AST y ALP mostraron marcadas diferencias entre los cuatro grupos correspondientes a la extensión del daño hepático. El Grupo 4 mostró un aumento significativo en los niveles de AST y ALP en comparación con el Grupo 1(Figura 3).
Para comparar el perfil de expresión génica en grupos de control y inducidos por ALF, se realizó un análisis q-PCR de genes implicados en la muerte celular (Bax2, Caspase3, Fas) en muestras de tejido hepático35,39. Se constató que se regulaban en el Grupo 3 en comparación con el Grupo de control 1, mientras que no se vio ninguna diferencia en el Grupo 2 y el Grupo 4. Genes que se sabe que están sobreexpresados en respuesta a lesiones hepáticas (Mcp1 y Mmp2)33,40 se encontraron para ser regulados en los tres grupos en comparación con el grupo de control 1. Mmp9 fue regulado en los grupos 3 y 4, mientras que el Grupo 2 no mostró ninguna diferencia marcada con respecto al Grupo de control 1. Se encontró que los niveles de expresión de Timp1 y Timp234 eran más altos en el Grupo 3, pero no mostraban ninguna sobreexpresión marcada en el Grupo 4(Figura 4).
Los genes implicados en la inflamación del hígado (Tnfa, IL1a, Tgfbr1, e IL1b)41,42,43,44 se encontraron sobreexpresados en el Grupo 3 en comparación con el control del Grupo 1, pero su nivel de expresión se redujo en el Grupo 4. ALR se sobreexpresa en el tejido hepático después de la inducción de una lesión hepática. Las cascadas aguas abajo de este gen ayudan en la regeneración hepática. La proteína RIP1 es necesaria en la toxicidad inducida por APAP. Se encontró que ALR y RIP1 estaban regulados en los grupos 2 y 3 en comparación con el grupo de control 1, mientras que sus niveles siguen siendo similares o inferiores en el Grupo 4. Se encontró que la actina muscular alfa lisa (aSMA),un marcador de deposición excesiva de ECM que conduce a la fibrosis, fue regulada en los grupos 3 y 4 en comparación con el grupo de control 1(Figura 4). Los datos de expresión génica sugieren que los biomarcadores antes mencionados de la inflamación y la muerte celular que se sabe que están sobreexpresados durante la lesión hepática están regulados en muestras de tejido hepático de animales en los que el ALF fue inducido por el método propuesto, confirmando así la aparición de lesiones hepáticas a nivel molecular.
Tinción de hematoxilina y eosina (H&E)
La tinción de hematoxilina y eosina (H&E) se realizó para evaluar la gravedad de la lesión hepática observando el grado de degeneración de los hepatocitos. Las secciones de tejido hepático teñidas con H&E fueron sometidas a análisis ciegos por un tercero. En el grupo de hepatectomía parcial 70% se observó degeneración grasa vesicular y en el grupo de paracetamol se observó inflamación periportal y necrosis junto con dilatación sinusoidal leve. La degeneración grasa vesicular se observó principalmente en el grupo ALF(Figura 5).
Tiempo de protrombina y niveles de glucosa en sangre
ProtrombinTime (PT) es un parámetro que depende de la actividad de la tromboplastina tisular sintetizada por el hígado y se utiliza para caracterizar la eficiencia del mecanismo de coagulación de la sangre45. Generalmente, un aumento en PT se observa en las condiciones de enfermedades relacionadas con el hígado. Se encontró que el PT era significativamente mayor en el grupo inducido por alF en comparación con el grupo de control. También se encontró que la relación internacional normalizada (INR)45 era mayor, lo que representaba un defecto en el mecanismo de coagulación de la sangre como resultado de una fisiología hepática ineficiente(Figura 6).
Evaluación del trasplante de hepatocitos de rata singénico singéneo después de una célula
Un criterio importante de un modelo de ALF es la reversibilidad de la insuficiencia hepática en presencia de una intervención terapéutica. En el estudio actual, 10 millones de hepatocitos de ratas sinémicos sanos fueron trasplantados instrasplenáticamente para observar el efecto de la terapia de trasplante de células en la insuficiencia hepática. El número adecuado de células a trasplantar se determinó observando la reversibilidad de la insuficiencia hepática después del trasplante de diferentes números de células (datos no mostrados). Las células fueron trasplantadas después de la administración de la1a dosis de APAP, y se encontró que la supervivencia se restauraba en animales después del trasplante de células(Figura 7). Se encontró que los niveles séricos de enzimas ALT, AST y ALP se normalizaban después de 10 días de trasplante de células(Figura 8).
Figura 1: Porcentaje de supervivencia en el grupo inducido por el ALF. Kaplan-Meier Survival Curve que muestra el porcentaje de supervivencia de los animales después de la inducción de ALF con la combinación de 70% PHx y APAP dosis (750 mg/kg de peso corporal). El tiempo 0 h indica el tiempo de 70% PHx. Las dosis de1a y2a de APAP se administraron 24 y 48 h postquirúrgicamente (n.o 12, total de animales). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes representativas de la morfología hepática en los cuatro grupos diferentes incluidos en el estudio. Los paneles de imágenes A–D muestran la morfología de los hígados de diferentes grupos después de ser eutanasiados 2 h después de la2a dosis del tratamiento respectivo. (A) La morfología hepática del Grupo 1 de control en el que sólo se administró salina. (B) La morfología hepática del Grupo 2 en la que sólo se administró APAP a la dosis de 750 mg/kg de peso corporal. (C) La morfología hepática del Grupo 3 en la que se administró salina después del 70% de PHx. (D) La morfología hepática del Grupo 4 en la que se administró APAP a raíz del 70% de PHx a la dosis similar al Grupo 3 (n 3 animales por grupo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Una comparación del perfil bioquímico del suero en los diferentes grupos. Los gráficos de barras representan el valor medio de ALT, AST y ALP en muestras séricas de los cuatro grupos incluidos en el estudio. El suero se recogió 2 h después de la2a dosis del tratamiento respectivo. Barras de error: S.E.M; •p < 0,001; * < 0.05; n n 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Perfil de expresión génica de muestras de tejido hepático. Los gráficos de barras representan la cuantificación relativa de la expresión de ARNm de varios genes implicados en la inflamación y la muerte celular en los cuatro grupos sometidos a diferentes tratamientos. Todos los genes se normalizaron contra la expresión del control Gapdh. Barra de error: media de error estándar de las tres muestras diferentes (n. 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Estudio histológico de muestras de tejido hepático. Imágenes representativas de tinción de hematoxilina y eosina de muestras de tejido hepático de los cuatro grupos incluidos en el estudio, como se observa bajo aumento de 200x en microscopía de campo brillante. Había principalmente hepatocitos normales en el grupo de control 1 con infiltración periportal leve (flechas verdes). En el Grupo 3 (70% de hepatectomía parcial) se observó degeneración grasa vesicular (flechas blancas) y en el paracetamol del grupo 2 se observó inflamación periportal (flechas rojas) y necrosis junto con dilatación sinusoidal leve (flechas amarillas). La degeneración grasa macrovesicular se observó principalmente en el Grupo ALF 4 (flechas naranjas). Barra de escala de 50 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Comparación del tiempo de protrombina (PT) y la relación internacional normalizada (INR). (A) Comparación de PT entre el grupo de control 1 (inyección salina post 70% PHx) y el grupo 4 inducido por ALF (poste de inyección APAP 70% PHx). La sangre se recogió 2 h después de la2a dosis del tratamiento respectivo y el tiempo (en segundos) requerido para la formación del coágulo de fibrina se muestra en el eje Y (**** a p < 0.0001, n a 5). (B) El INR del grupo 4 inducido por alF en comparación con el grupo de control 1. Se encontró que el valor medio de INR en el Grupo 4 era 2,28, que recae en el efecto anticoagulante inducido por warfarina (n.o 5). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Porcentaje de supervivencia en el grupo inducido por el ALF después del trasplante de células. Curva de supervivencia Kaplan-Meier que muestra el porcentaje de supervivencia después del trasplante de hepatocitos saludable sano en el Grupo 4 inducido por el ALF en comparación con el Grupo de control 1 (n.o 5). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Perfil bioquímico sérico de animales inducidos por ALF después del trasplante de células. Niveles séricos de enzimas ALT, AST y ALP 10 días después del trasplante de células en comparación con los niveles séricos de animales inducidos por ALF eutanasiados después de una dosis de2a dosis de APAP. Barra de error: error estándar de la media de cinco muestras diferentes; •p < 0.0001; ** p > 0,01; n a 5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El desarrollo de un modelo animal adecuado para la ALF es primordial para una mejor comprensión de la patogénesis y la progresión de la ALF. Un modelo animal ALF bien caracterizado también ofrece la oportunidad para el desarrollo y ensayo de nuevos enfoques terapéuticos contra ALF. Se han hecho muchos intentos para desarrollar un modelo clínicamente relevante de ALF6,12,21,23,46,47,48. La mayoría de estos estudios utilizan procedimientos quirúrgicos o inducen lesiones hepáticas por sustancias químicas hepatotóxicas.
Es difícil crear un modelo ALF solo por PHx porque PHx no reflejaría la patología de LAF debido a la ausencia de inflamación causada por los tejidos necróticos y apoptóticos. A dosis terapéuticas, APAP se metaboliza completamente por los procesos de glucoronidación y sulfatación. A dosis más altas, cuando estas vías están saturadas, APAP es metabolizado por enzimas citocromo p450 que son sintetizadas principalmente por hepatocitos, lo que resulta en la formación de un intermedio tóxico, NAPQI (N-acetil-p-benzoquinona imina). En condiciones normales, el NAPQI es neutralizado por las reservas de glutatión (GSH) de las células, mientras que a dosis supraterapéuticas causa estrés oxidativo en los hepatocitos, lo que resulta en la muerte de hepatocitos4,24,25,46. Por lo tanto, mediante la combinación de los efectos fisiológicos de 70% PHx y lesión hepática inducida por APAP, se creó un modelo de rata ALF en el estudio actual. Una ventana terapéutica más pequeña reduce el período de estrés en el animal. Cuando se combina con dosis más pequeñas de APAP, esto conduce a una mejor reproducibilidad del procedimiento.
La dosis de APAP fue seleccionada para proporcionar una ventana terapéutica adecuada durante la cual se puede administrar una intervención terapéutica al animal (es decir, dentro de las 48 h de la1a dosis y 24 h de2a dosis). Dentro de las 24 h después de la2a dosis de APAP, se observó una mortalidad del 100%. Sin embargo, el momento de la muerte dentro de este período fue variable para cada animal. Por lo tanto, con el fin de estudiar el desarrollo de ALF, los animales fueron eutanasiados en un punto de tiempo estándar de 2 h después de la2a dosis de APAP.
El tiempo de intervención terapéutica se puede decidir dependiendo del estudio individual y el tipo de tratamiento que se está estudiando, que en el estudio actual fue el trasplante de hepatocitos de rata sinénico justo después de la1a dosis de APAP, permitiendo a las células tiempo suficiente para el hogar y el injerto. En el modelo actual, se requiere un trasplante de al menos 10 millones de células para un rescate exitoso de ALF.
Para asegurar el éxito del procedimiento quirúrgico, se deben considerar algunos puntos importantes. Se recomienda utilizar diferentes tipos de anestésicos en diferentes procedimientos quirúrgicos. Para realizar la hepatectomía parcial, se debe utilizar un cóctel de ketamina-xilazina en las dosis recomendadas porque da tiempo suficiente para completar el procedimiento quirúrgico. Durante el trasplante de células, se debe utilizar anestesia inhalable isoflurano porque reduce el estrés físico en animales inducidos por ALF.
En conclusión, debido a una tasa uniforme de mortalidad y una cómoda ventana terapéutica, se utilizó un modelo combinado APAP y 70% PHx para estudiar la reversibilidad de la ALF por trasplante celular. Para evaluar la reversibilidad de la ALF, se trasplantaron por vía intrasípeen a 10 millones de hepatocitos singéricos de rata en los animales inducidos por el ALF. Después del trasplante, se encontró que el porcentaje de supervivencia aumentaba en animales inducidos por el ALF. También se observó una mejora en los niveles séricos de ALT, AST y ALP en animales después del trasplante de células, lo que sugiere la restauración del metabolismo hepático. Este modelo animal ALF presenta una alternativa para evaluar el potencial terapéutico de las células que puentean la brecha entre la insuficiencia hepática aguda y el trasplante de hígado. También proporciona la oportunidad de estudiar el daño hepático causado por lesiones físicas y agente hepatotóxico.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la subvención básica recibida del Departamento de Biotecnología del Gobierno de la India al Instituto Nacional de Inmunología de Nueva Delhi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetaminophen (Biocetamol) | EG Pharmaceuticals | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Betadine (Povidon-Iodine Solution) | Win-Medicare; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Biological safety cabinet (Class I) | Kartos international; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| Cefotaxime (Taxim®) | AlKem; India | cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Cell Strainer | Sigma; US | CLS431752 | |
| Collagenase Type I | Gibco by Life Technologies | 17100-017 | |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Drape Sheet | JSD Surgicals, Delhi, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| DPX Mountant | Sigma; US | 6522 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma; US | HT110132 | |
| Forceps | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Glucose | Himedia, India | GRM077 | |
| Hair removing cream (Veet®) | Reckitt Benckiser, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma; US | MHS16 | |
| Heparin sodium salt | Himedia; India | RM554 | |
| Hyaluronidase From Sheep Testes | Sigma; US | H6254 | |
| I.V. Cannula (Plusflon) | Mediplus, India | Ref 1732411420 | |
| Insulin Syringes | BD; US | REF 303060 | |
| Isoflurane (Forane®) | Asecia Queenborough | No B506 | Inhalation Anaesthetic |
| Ketamine (Ketamax®) | Troikaa Pharmaceuticals Ltd. | Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Meloxicam (Melonex®) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Micro needle holders straight & curved |
Mercian; England | BS-13-8 | |
| Micro needle holders straight & curved |
Mercian; England | BS-13-8 | |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Nylon Thread | Mighty; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Percoll® | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Refresh Tears/Eyemist Gel | Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India | P3060 | No specific Catalog Number |
| RPMI | Himedia; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scalpel | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scissors | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation; US | No specific Catalog Number | |
| Sucrose | Sigma; US | S0389 | |
| Surgical Blade No. 22 | La Medcare, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical Board | Locally made | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical White Tape | 3M India; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Sutures | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| Syringes (1ml, 26 G) | Dispo Van; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Trimmer (Clipper) | Philips | NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005 | |
| Weighing Machine | Braun | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| William's E Media | Himedia; India | AT125 | |
| Xylazine (Xylaxin®) | Indian Immunologicals Limited | Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant |
References
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