Summary
Den akuta leversvikt djurmodell som utvecklats i den aktuella studien presenterar ett genomförbart alternativ för studiet av potentiella terapier. Den nuvarande modellen använder den kombinerade effekten av fysisk och läkemedelsinducerad leverskada och ger ett lämpligt tidsfönster för att studera potentialen av nya terapier.
Abstract
Akut leversvikt (ALF) är ett kliniskt tillstånd som orsakas av olika etiologier resulterar i förlust av metabola, biokemiska, syntetisera, och avgiftande funktioner i levern. I de flesta oåterkalleliga leverskador fall, ortotropisk levertransplantation (OLT) förblir den enda tillgängliga behandlingen. För att studera den terapeutiska potentialen hos en behandling av ALF är dess tidigare test i en djurmodell av ALF viktigt. I den aktuella studien, en Alf modell i råttor utvecklades genom att kombinera 70% partiell hepatektomi (PHX) och injektioner av paracetamol (APAP) som ger ett terapeutiskt fönster av 48 h. Median och vänster laterala loberna i levern avlägsnades till punktskatt 70% av levern massa och APAP gavs 24 h postkirurgiskt för 2 dagar. Överlevnad hos ALF-inducerad djur visade sig vara kraftigt minskad. Utvecklingen av ALF bekräftades genom förändrade serumnivåer av enzymerna alanin-aminotransferas (ALAT), aspartataminotransferas (ASAT), alkaliskt fosfatas (ALP); förändringar i protrombintid (PT); och bedömning av INR (International normaliserade ratio). Studiet av gen uttrycks profilen av qPCR avslöjade en ökning av uttrycks nivåer av gener involverade i apoptos, inflammation, och i utvecklingen av leverskada. Diffus degeneration av hepatocyter och infiltration av immunceller observerades av histologisk utvärdering. Reversibiliteten av Alf bekräftades genom återställande av överlevnad och serumnivåer av ALAT, ASAT och Alp efter intrasplenic transplantation av uterustransplantat friska råtta hepatocyter. Denna modell presenterar ett tillförlitligt alternativ till de tillgängliga ALF-djurmodellerna för att studera Alfs patofysiologi samt för att utvärdera potentialen hos en ny terapi för ALF. Användningen av två olika metoder gör det också möjligt att studera den kombinerade effekten av fysisk och läkemedelsinducerad leverskada. Det aktuella förfarandets reproducerbarhet och genomförbarhet är en extra fördel med modellen.
Introduction
Akut leversvikt (ALF) definieras av den amerikanska föreningen för studiet av leversjukdomar som snabb utveckling av akut leverskada utan några tidigare tecken på skada och kännetecknas av allvarlig försämring av syntetiska, metaboliska, och avgiftande funktioner i levern1. Alf skiljer sig från kronisk leversvikt där felet uppstår som en följd av leverskada orsakad under en lång tid och från akut kronisk leversvikt (aclf), där abrupt leverskada sker till följd av kroniska leversjukdomar2,3,4. Den enda tillgängliga botemedlet för ALF är ortotopisk levertransplantation (OLT), eller dödsfall kan förekomma. På grund av bristen på lever donatorer, dödligheten hos patienter som lider av ALF är mycket hög.
För att studera potentialen i alternativa terapeutiska metoder och för att bättre förstå den patofysiologi av ALF, djurmodeller som kan återspegla ALF förekommer i människor behövs. Många av de redan tillgängliga ALF-djurmodellerna har flera brister. Acetaminophen (APAP) effekter är svåra att reproducera men har de närmaste likheter i termer av temporala, kliniska, biokemiska, och patologiska parametrar. APAP-inducerad djurmodeller stöter ofta problem på grund av närvaron av methemoglobinemi orsakas av oxidation av hemoglobin av APAP och dess intermediärer5,6,7. Ett annat problem är bristen på reproducerbarhet reflekteras av oförutsägbara dos svar och tidpunkten för döden. De Alf djurmodeller som produceras med hjälp av kol Tetra klorid (CCL4) har dålig reproducerbarhet8,9,10,11. Concavalin a (CON a) och lipoplysaccharide (LPS)-inducerad Alf djurmodeller återspeglar inte det kliniska mönstret av den mänskliga sjukdomen, även om de har fördelar i studien av cellulära mekanismer inblandade i autoimmuna leversjukdomar och i studien av sepsis respektive12,13,14,15. Likaså, tioacetamid (TAA) kräver också biotransformation till en aktiv metabolit tioacetamid sulfoxid och visar Art variation16,17,18,19. D-galaktosamin (d-gal) producerar vissa biokemiska, metabola, och fysiologiska förändringar som liknar Alf men inte kan återspegla hela Alf patologiska tillstånd20,21,22,23. Det har varit mycket få försök att kombinera två eller flera av dessa metoder för att utveckla en ALF modell som kan återspegla ALF syndrom på ett bättre sätt13. Därför krävs ytterligare studier för att utveckla en modell som kan återspegla sjukdoms parametrarna, har bättre reproducerbarhet, och ger tillräckligt med tid för att studera effekterna av en terapeutisk intervention.
I den aktuella studien, en alternativ Alf modell hos råttor har skapats genom att kombinera effekterna av partiell hepatektomi (PHX) och lägre doser av en hepatotoxisk reagens. APAP har en väletablerad roll i att orsaka leverskada5,24,25. Det är en allmänt använd smärtstillande och är giftigt för levern vid supraterapeutiska doser genom att bilda giftiga metaboliter. APAP är orsaken till många dödsfall i de utvecklade länderna. Fysisk skada orsakad av partiell hepatektomi initierar aktivering av olika processer involverade i inflammation samt lever förnyelse. Injektion av hepatotoxiska medlet APAP orsakar en fientlig miljö i levern, förhindra spridning av hepatocyter. Detta minskar stressperioden på djuret, som i kombination med mindre doser av hepatotoxin, leder till bättre reproducerbarhet av förfarandet. Därför, med hjälp av denna modell, en kombinatorisk effekt av två typer av leverskador har studerats. För att karakterisera den utvecklade ALF-djurmodellen har fysiologiska och biokemiska parametrar studerats. Lyckad reversibilitet av Alf bekräftades genom transplantation av uterustransplantat friska råtta hepatocyter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Det förfarande som beskrivs nedan har godkänts av den institutionella Animal etikkommittén för nationella institutet för immunologi, New Delhi. Det seriella referensnumret för godkännandet är IAEC # 355/14.
1. förberedelser
- Förbered dig för det kirurgiska ingreppet som beskrivits tidigare av das B et al.26.
- Använd 6 – 8 veckor gamla inavlade Wistar råttor med en kroppsvikt på 200 – 250 g.
- Husdjuren under standard djur hygienvillkor och mata dem med råtta Chow och libitum före och efter ingreppet.
- När du utför 70% PHx, Använd en vanlig cocktailblandning av ketaminhydroklorid (100 mg/kg kroppsvikt) och xylazin (10 mg/kg kroppsvikt), som injiceras intraperitonealt.
Anmärkning: den typ av bedövningsmedel som används kan ha postoperativa effekter på dödlighet och morbiditet. - Under celltransplantation, använda inhalant anestesi isofluran (2-klor-2-(difluoromethoxy)-1, 1,1-trifluoro-etan) för att minska tiden för återvinning av djuret efter transplantation kirurgi.
- Inducera och bibehålla inhalationanestesin med hjälp av ett anpassat anestesisystem. Bibehålla syreflödet vid 4 L/min. För induktions användning isofluran vid 4% och för underhålls användning 2 – 3% under det kirurgiska ingreppet.
2. preoperativa förfaranden
- Anesthetize råttan genom att injicera ketamin-xylazin blandningen beskrivs i steg 3,1 intraperitonealt. Bekräfta den kompletta anestetization genom att nypa tån av djuret. Ytterligare procedurer utförs endast när det inte finns någon pedal reflex.
- För att förhindra korneal uttorkning, tillämpa en karboxy metyl-cellulosa baserade ögondroppe till båda ögonen.
- Begränsa det sövda djuret till ett kirurgiskt bräde med hjälp av vit tejp. Placera djuret med buk sidan vänd uppåt, se till att munnen är på distala sidan från den person som utför operationen.
- Ta bort hår från övre högra buken kirurgiska området med en elektrisk klippare.
- Desinficera operationsstället genom tre alternerande Scrubs av povidon jod och 70% etanol med steriliserade bomull kuddar i cirkelrörelse.
3. partiell hepatektomi (PHx) för att avlägsna 70% av massan av levern
Anmärkning: utför hela kirurgiska ingrepp under en steril miljö i ett laminärt flödes skydd. Använd endast sterila kirurgiska instrument för att minimera risken för infektion postsurgically. Avlägsnande av 70% av lever massan, som heter 70% partiell hepatektomi (70% PHx), utfördes som beskrivs av C. Mitchell och H. Willenbring, 200827.
- Före starten av operationen, bekräfta den kompletta anestetization av djuret genom att nypa sin tå. Ytterligare procedurer utförs endast när det inte finns någon pedal reflex.
- Markera huden som ska klippas strax under bröstbenet, vinkelrät mot xiphoid, och parallellt med ribcage.
- Placera ett sterilt draperi blad med en öppning på ca 3 cm x 1 cm över den markerade huden.
- Utför ett tvärgående snitt på ca 2 – 3 cm längs den markerade linjen med en skalpell. Använd kirurgiskt blad nr 22. Ta försiktigt bort tillbehöret av huden till det underliggande muskellagret i närheten av det anskurna området med hjälp av sterila fuktad bomull tips.
- Nästa, gör ett tvärgående snitt genom peritonealskiktet precis under xiphoid processen.
- Med hjälp av två saltlösning fuktad bomull tips, exponera vänster LOB i levern genom att tillämpa lätt tryck på bröstkorgen. Placera en bomulls spets på diafragmabråck regionen av den anskurna delen och den andra bomulls spetsen under den anskäras regionen att lyfta levern LOB upp.
- Slip en 8 – 10 cm lång steril nylongängögla (storlek 4 – 0, 0,15 mm diameter) runt den exponerade leverlob. Ta slingan till basen av LOB nära hilum med hjälp av microdissecting pinps eller fuktad bomulls knoppar.
- Med hjälp av mikrokirurgi nål innehavaren och microforceps, knyta de två ändarna av slingan, placera Knut så nära basen av LOB som möjligt att tygla blodkärlet och minska blödning efter leverlob avlägsnas. Knyt två extra knutar på den andra sidan.
- Vidta försiktighetsåtgärder inte knyta knuten för nära de närliggande blodkärlen, som annars kan orsaka venösa obstruktion (stenos).
- Använd mikrokirurgi sax för att skära den bundna LOB strax ovanför knuten, som lämnar en missfärgad massa av vävnad som kallas en ischemisk stubbe i stället för LOB.
Obs: råtta levern, liksom de av möss, är uppdelad i fyra distinkta lober: median LOB, höger lateral LOB, vänster lateral LOB, och caudatus LOB, som utgör cirka 40%, 20%, 30%, och 7% av den totala lever massan, respektive. Varje kombination av dessa lober kan avlägsnas till punktskatt 70% lever massa. I den aktuella studien, median LOB och vänster laterala loberna togs bort. - Noggrant lokalisera median LOB utan att skada den återstående stubben av vänster lateral LOB. Dra försiktigt ut den ur bukhålan, och vid basen av LOB slips en 8-10 cm lång nylontråd (storlek 4-0) Knut som nämnts tidigare. Knyt två extra knutar på den andra sidan. Försiktigt punktskatter och ta bort bundet median LOB med alla försiktighetsåtgärder som nämns.
- Efter avlägsnande av loberna, sutur bukhinnan med hjälp av en absorberbara kromic 4-0 sutur med kontinuerliga stygn följt av hud suturering med en avbruten sutur.
- Applicera povidon jod på huden som omger suturer att förhindra infektion.
- Ta bort drapera arket och ta bort djuret från operationsbordet.
4. postoperativ vård hos djur
- Intraperitonealt injicera djuret med en dos av 12 mg Cefotaxim antibiotikum i 1 mL 5% glukoslösning med en 1 mL spruta för att skydda den mot risken för postoperativ infektion.
- Administrera en subkutan injektion av analgetiska meloxikam (1 mg/kg kroppsvikt) för smärtlindring efter operationen och följ upp det med ytterligare två doser, hålla regimen som en dos per dag.
- Hus de manövrerade djuren under standardförhållanden på 12 h ljus/mörker cykel och Monitor med jämna mellanrum.
5. injektion av läkemedel i delvis hepatectomiserade djur för att inducera leversvikt
- Efter 24 h postsurgery, när djuren har framgångsrikt återhämtat sig från 70% PHx, mäta kroppsvikten av djuret följt av injektionerna.
- Injicera 750 mg/kg kroppsvikt av APAP intraperitonealt hos delvis hepatectomiserade djur 24 h efter 70% PHx efter djurens framgångsrika återhämtning från det kirurgiska ingreppet. Upprepa dosen igen efter 24 timmar.
Anmärkning: två doser av APAP administreras intraperitonealt till djuret (dvs 24 h och 48 h efter 70% PHx förfarande, respektive). - Vid varje tidpunkt efter injektion av APAP, Mät kroppsvikten hos det återhämtade djuret.
Anmärkning: APAP (biocetamol) injiceras i djur som en 150 mg/mL lösning i 2% bensylalkohol.
6. transplantation av friska hepatocyter i ALF djurmodeller
Anmärkning: för att studera reversibiliteten av Alf hos råttor, transplantera friska uterustransplantat råtta hepatocyter intrasplenically hos Alf-inducerad djur tillsammans med 1St dos APAP. I den aktuella studien, att ge riklig tid till de transplanterade cellerna för homing och Inympning, transplantation gjordes strax efter att ha gett 1St dos APAP. Råtta hepatocyter isoleras av ett protokoll först utgiven av Berry och Friends et al.28 och senare anpassas i olika andrastudier 29,30,31 med några ändringar. För intrasplenic transplantation av celler i ALF djur modellen, Följ stegen som nämns nedan.
- Placera råttan i en poly (metyl methacrylate) kammare för induktion av anestesi med 4% isofluran och 4 L/min syre flöde för en råtta av 250 – 350 g kroppsvikt. Kontrollera om djupet av anestesi av avsaknaden av pedal reflexer när klämmande tån av djuret.
- Placera nedsövd råtta på kirurgiska styrelsen så att dess vänstra laterala delen är vänd uppåt. Bibehålla anestesi vid 2 – 3% isofluran inandning genom ett lämpligt munstycke.
- Raka huden på den vänstra laterala regionen och sterilisera den med povidon jodlösning.
- Gör ett tvärgående snitt på den rakade regionen av huden.
- Gör en 1-2 cm skuren i peritonealskiktet för att exponera mjälten.
- Ta försiktigt ut mjälten i peritonealhålan och lyft upp den med hjälp av två fuktade bomulls spetsar.
- Håll cellerna (typiskt 107 per djur) transplanterade suspenderade i 50 μl imdm-media i en 1 ml insulinspruta med en 29 G nål.
- Försiktigt punktera nålen i Mjältens cortex och släpp cellsuspensionen i mjälten inom 2 – 3 min.
- Efter celltransplantation är klar, ta försiktigt ut nålen och badda området av nålen punktering med en fuktad bomull spets för att undvika läckage av cellsuspensionen från platsen.
- Stäng bukhinnan och huden med en 4 – 0 resorberbar sutur med kontinuerlig och diskontinuerlig suturering respektive.
- Applicera povidon jodlösning på huden på platsen för suturer att förhindra infektion på den manövrerade platsen.
- Intraperitonealt injicera 1 mL volym av 12 mg/mL av antibiotika (t. ex., Cefotaxim) lösning och subkutant injicera analgetikum (t. ex. meloxikam) 1 mg/kg kroppsvikt till djuret som en del av postoperativ vård. Flytta djuret till en varm återvinna bur.
- Håll det manövrerade djuret isolerat under normala förhållanden av 12 h ljus/mörker-cykel tills de kirurgiska såren är helt läkta. Detta kan ta 3 – 4 dagar.
7. karaktärisering av ALF utveckling
- Euthanize djuren genom överdosering av ketamin-xylazin lösning 2 h efter den 2nd dos APAP behandling och samla in blod och vävnadsprover.
- Samla serum från blod för biokemiska studier32.
- Bearbeta levervävnads prov för histologiska och gen uttrycks studier33,34,35.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Överlevnads procent i djurmodeller av ALF
Den optimala dosen av APAP för att orsaka ALF i kombination med 70% PHx standardiserades som 750 mg/kg kroppsvikt. Behandlingsregimen började 24 h efter 70% PHx, när djuren helt hade återhämtat sig från kirurgi, och bestod av två APAP doser på 24 h intervall. Dödligheten observerades med en hastighet av 80% efter administrering av den andra dosen APAP, 48 h efter operationen. Överlevnads procenten analyserades och plottas via Kaplan-Meier-metoden (figur 1). Reproducerbarheten i tid av död och tidsperiod som tillhandahålls av denna modell gör det en lämplig kandidat för att studera en terapeutisk intervention mot ALF.
Fyra grupper av djur ansågs för studien: grupp 1 (kontrollgrupp, endast saltlösning), grupp 2 (endast APAP på 750 mg/kg kroppsvikt), grupp 3 (saltlösning med 70% PHx) och grupp 4 (APAP på 750 mg/kg kroppsvikt med 70% PHx). Tre djur var inkluderade i alla grupper och två representativa bilder ingår i varje grupp. Djur från alla fyra grupperna var euthanized 2 h efter administrering av den 2nd dos av respektive behandling. Leverprover tagna från alla fyra grupperna visade distinkt morfologi från varandra. Grupp 1 visade den rödbruna morfologin hos en frisk gnagare lever. Leverprover av grupp 2 visade inga uppenbara tecken på skador på en morfologisk nivå och visade liknande utseende för friska lever i grupp 1. Leverprover tagna från grupp 3 och 4 verkar inte friska och hade missfärgning och ett fläckigt utseende. Missfärgningen motsvarar skadan i lever vävnaden och var mer uppenbar i grupp 4. Representativa data presenteras i figur 2.
Omfattningen av leverskada bestämdes genom att kontrollera serumnivåerna av ALAT, ASAT och Alp enzymer36,37,38. Nivåerna av ALAT, ASAT och ALP uppvisade markant skillnader mellan de fyra grupperna som motsvarade omfattningen av leverskador. Grupp 4 uppvisade en signifikant ökning av ASAT-och ALP nivåerna jämfört med grupp 1 (figur 3).
För att jämföra gen uttrycks profilen i kontroll-och Alf-inducerade grupper utfördes q-PCR-analys av gener involverade i celldöd (Bax2, Caspase3, fas) i levervävnads prov35,39. Dessa konstaterades vara uppreglerad i grupp 3 jämfört med kontrollgrupp 1, medan ingen skillnad sågs i grupp 2 och grupp 4. Gener som är kända för att vara överuttryckta som svar på leverskada (Mcp1 och Mmp2)33,40 befanns vara uppreglerad i alla tre grupperna jämfört med kontrollgrupp 1. Mmp9 var uppreglerad i grupperna 3 och 4, medan grupp 2 inte uppvisade någon markant skillnad från kontrollgrupp 1. Uttrycksnivåerna Timp1 och Timp234 befanns vara högre i grupp 3, men visade inga markerade överuttryck i grupp 4 (figur 4).
Gener som är involverade i inflammation i levern (tnfa, IL1a, Tgfbr1 och IL1b)41,42,43,44 befanns vara överuttryckta i grupp 3 jämfört med kontrollgrupp 1, men deras uttrycksnivå minskade i grupp 4. ALR överuttrycks i levervävnad efter induktion av leverskada. Nedströms kaskader av denna gen hjälp i levern förnyelse. RIP1 protein är nödvändigt vid APAP-inducerad toxicitet. ALR och RIP1 befanns vara uppreglerad i grupperna 2 och 3 jämfört med kontrollgrupp 1, medan deras nivåer fortfarande var likartade eller lägre i grupp 4. Alfa glattmuskulatur aktin (aSMA), en markör för överdriven ECM-deposition som ytterligare leder till fibros, befanns vara uppreglerad i grupp 3 och 4 jämfört med kontrollgrupp 1 (figur 4). Gen uttrycks data tyder på att de ovan nämnda biomarkörer för inflammation och celldöd som är kända för att vara överuttrycks under leverskada är uppreglerad i levervävnads prov av djur där ALF var-inducerad av Föreslagen metod, vilket bekräftar förekomsten av leverskada på molekylär nivå.
Hematoxylin och eosin (H & E) färgning
Hematoxylin och eosin (H & E) färgning gjordes för att bedöma svårighetsgraden av leverskada genom att observera omfattningen av hepatocyte degeneration. Den levervävnad sektioner färgade med H & E utsattes för blind analys av en tredje part. I 70% partiell hepatektomi grupp vesikulär fettdegeneration observerades och i paracetamol gruppen periportal inflammation och nekros sågs tillsammans med mild sinusformad dilatation. Vesikulär fettdegeneration observerades mestadels i ALF-gruppen (figur 5).
Protrombintid och blodglukosnivåer
Protrombintid (PT) är en parameter som beror på aktiviteten av levern-syntetiseras vävnad tromboplastin och används för att karakterisera effektiviteten i blodets koagulationsmekanism45. Generellt, en ökning av PT observeras i villkoren för leverrelaterade sjukdomar. PT visade sig vara signifikant högre i den ALF-inducerade gruppen jämfört med kontrollgruppen. Det internationella normaliserade förhållandet (INR)45 konstaterades också vara högre, vilket motsvarar en defekt i mekanismen för blodkoagulering till följd av ineffektiv Leverfysiologi (figur 6).
Utvärdering av överlevnad efter cell friska uterustransplantat råtta hepatocyter transplantation
Ett viktigt kriterium för en ALF-modell är reversibiliteten av leversvikt i närvaro av en terapeutisk intervention. I den aktuella studien, 10 000 000 friska uterustransplantat råtta hepatocyter transplanterades instrasplenically att observera effekten av celltransplantation terapi på leversvikt. Lämpligt antal celler som ska transplanteras bestämdes genom att observera reversibiliteten av leversvikt efter transplantation av olika cell nummer (data som inte visas). Cellerna transplanterades efter administrering av den 1St dos APAP, och överlevnad konstaterades återställas hos djur efter transplantation av celler (figur 7). Serumnivåerna av enzymer ALAT, ASAT och ALP konstaterades vara normaliserade efter 10 dagars celltransplantation (figur 8).
Figur 1: överlevnads procent i den Alf-inducerade gruppen. Kaplan-Meier överlevnads kurva som visar överlevnaden hos djur efter induktion av ALF med kombinationen av 70% PHx och APAP-dos (750 mg/kg kroppsvikt). Tid 0 h betecknar tiden för 70% PHx. Doserna 1 och 2 av APAP administrerades24 och 48 h postkirurgiskt (n = 12, totalt antal djur). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativa bilder av levermorfologi i de fyra olika grupper som ingick i studien. Bildpaneler A – D visar morfologin hos lever i olika grupper efter att ha varit euthanized 2 h efter den 2:A dosen av respektive behandling. A) levermorfologin för kontrollgrupp 1 där endast saltlösning gavs. B) levermorfologin i grupp 2 där endast APAP gavs vid dosen 750 mg/kg kroppsvikt. C) Levermorfologin i grupp 3 där saltlösning gavs efter 70% PHX.Dlevermorfologin i grupp 4, där apap gavs efter 70% PHX vid den dos som liknar grupp 3 (n = 3 djur per grupp). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: en jämförelse av den biokemiska profilen för serum i de olika grupperna. Stapeldiagram representerar medelvärdet av ALAT, ASAT och ALP i serumprover av de fyra grupper som ingår i studien. Serum samlades in 2 timmar efter den 2nd -dosen av respektive behandling. Fel staplar = S. E. M; = p < 0,001; * = p < 0,05; n = 3. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: gen uttrycks profil för levervävnads prov. Stapeldiagram representerar den relativa kvantifieringen av mRNA-uttrycket för olika gener som är involverade i inflammation och celldöd i de fyra grupper som utsätts för olika behandlingar. Alla gener normaliserades mot uttrycket av kontroll GAPDH. Error bar = standardfel medelvärde av de tre olika proverna (n = 3). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Histologisk undersökning av levervävnads prov. Representativa hematoxylin och eosin färgning bilder av levervävnads prov från de fyra grupper som ingår i studien, som observerats under 200x förstoring i ljusa fältmikroskopi. Det fanns mestadels normala hepatocyter i kontrollgrupp 1 med mild periportal infiltration (gröna pilar). I grupp 3 (70% partiell hepatektomi) vesikulär fettdegeneration observerades (vita pilar) och i paracetamol grupp 2 periportal inflammation (röda pilar) och nekros sågs tillsammans med mild sinusformad dilatation (gula pilar). Makrovesikulär fettdegeneration observerades mestadels i ALF-gruppen 4 (orange pilar). Scale bar = 50 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: jämförelse av protrombintid (PT) och internationellt normaliserat ratio (INR). A) jämförelse av PT mellan kontrollgrupp 1 (koksalt injektion efter 70% PHX) och Alf-inducerad grupp 4 (APAP-injektion efter 70% PHX). Blod samlades in 2 timmar efter den 2nd -dos av respektive behandling och tid (i sekunder) som krävs för bildandet av fibrinkoagulering visas på Y-axeln (* * * * = p < 0,0001, n = 5). (B) INR i Alf-inducerad grupp 4 jämfört med kontrollgrupp 1. Medelvärdet av INR i grupp 4 konstaterades vara 2,28, som faller i warfarin-inducerad anti koagulerande effekt (n = 5). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: överlevnads procent i Alf-inducerad grupp efter celltransplantation. Kaplan-Meier överlevnads kurva som visar överlevnads procenten efter friska hepatocyte transplantation i ALF-inducerad grupp 4 jämfört med kontrollgrupp 1 (n = 5). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: serum biokemisk profil för Alf-inducerad djur efter celltransplantation. Serumnivåer av enzymer ALAT, ASAT och ALP 10 dagar efter celltransplantation i jämförelse med serumnivåerna av ALF-inducerad djur euthanized efter en 2nd dos APAP administration. Error bar = standardfel på medelvärdet av fem olika prover; = p < 0,0001; * * = p > 0,01; n = 5. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utvecklingen av en lämplig djurmodell för ALF är av största vikt för en bättre förståelse av patogenes och progression av ALF. En väl karaktäriserad ALF djurmodell ger också möjlighet till utveckling och prövning av nya terapeutiska metoder mot ALF. Många försök har gjorts att utveckla en kliniskt relevant modell av Alf6,12,21,23,46,47,48. De flesta av dessa studier antingen utnyttja kirurgiska ingrepp eller inducera leverskada av hepatotoxiska kemikalier.
Det är svårt att skapa en ALF modell av PHx ensam eftersom PHx inte skulle återspegla patologi ALF på grund av frånvaron av inflammation som orsakats av nekrotiska och apoptotiska vävnader. Vid terapeutiska doser metaboliseras APAP helt av processerna för glucoronidering och sulfatering. Vid högre doser, när dessa vägar är mättade, APAP metaboliseras av cytokrom P450-enzymer som främst syntetiseras av hepatocyter, vilket resulterar i bildandet av en toxisk mellanliggande, NAPQI (N-acetyl-p-benzoquinone imine). Under normala förhållanden NAPQI neutraliseras av glutation (GSH) reserver av celler, medan vid supraterapeutiska doser det orsakar oxidativ stress i hepatocyter, vilket resulterar i hepatocyte död4,24,25,46. Därför, genom att kombinera de fysiologiska effekterna av 70% PHx och APAP-inducerad leverskada, en ALF råtta modell skapades i den aktuella studien. Ett mindre terapeutiskt fönster minskar stressperioden på djuret. I kombination med mindre doser av APAP, detta leder till bättre reproducerbarhet av förfarandet.
Dosen av APAP valdes ut för att ge ett lämpligt terapeutiskt fönster under vilket ett terapeutiskt ingrepp kan ges till djuret (dvs. inom 48 h av 1St -dosen och 24 h av 2nd -dos). Inom 24 timmar efter den 2nd -dosen av apap observerades 100% dödlighet. Tidpunkten för dödsfallet inom denna period var dock varierande för varje djur. Därför, i syfte att studera utvecklingen av ALF, djuren var euthanized vid en normal tidpunkt av 2 h efter den 2nd dos APAP.
Tiden för terapeutisk intervention kan beslutas beroende på den individuella studien och vilken typ av behandling som studeras, som i den aktuella studien var transplantation av uterustransplantat råtta hepatocyter strax efter den 1St dos av APAP, vilket gör att cellerna tillräckligt med tid att hem och engraft. I den nuvarande modellen krävs transplantation av minst 10 000 000 celler för en lyckad räddning från ALF.
För att säkerställa framgången för det kirurgiska ingreppet, bör några viktiga punkter övervägas. Det rekommenderas att använda olika typer av anestetika i olika kirurgiska ingrepp. För att utföra partiell hepatectomy, en cocktail av ketamin-xylazin bör användas i de rekommenderade doserna eftersom det ger gott om tid att slutföra det kirurgiska ingreppet. Under celltransplantation, inandningsbar anestesi isofluran bör användas eftersom det minskar den fysiska stressen på Alf-inducerad djur.
Sammanfattningsvis, på grund av en enhetlig dödlighet och ett bekvämt terapeutiskt fönster, en APAP och 70% PHx kombinerade modellen användes för att studera reversibilitet av ALF genom celltransplantation. För att bedöma reversibiliteten av Alf, 10 000 000 friska uterustransplantat råtta hepatocyter transplanterades intrasplenically hos Alf-inducerad djur. Efter transplantation konstaterades överlevnads procenten öka hos ALF-inducerad djur. Förbättring av serumnivåerna av ALAT, ASAT och ALP observerades också hos djur efter celltransplantation, vilket tyder på återställande av levermetabolism. Denna ALF djurmodell presenterar ett alternativ för att utvärdera den terapeutiska potentialen hos celler som överbryggar klyftan mellan akut leversvikt och levertransplantation. Det ger också möjlighet att studera leverskador orsakade av fysisk skada och hepatotoxiska medel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av det centrala bidraget från Institutionen för bioteknik, Indiens regering till nationella institutet för immunologi, New Delhi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetaminophen (Biocetamol) | EG Pharmaceuticals | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Betadine (Povidon-Iodine Solution) | Win-Medicare; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Biological safety cabinet (Class I) | Kartos international; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| Cefotaxime (Taxim®) | AlKem; India | cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Cell Strainer | Sigma; US | CLS431752 | |
| Collagenase Type I | Gibco by Life Technologies | 17100-017 | |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Drape Sheet | JSD Surgicals, Delhi, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| DPX Mountant | Sigma; US | 6522 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma; US | HT110132 | |
| Forceps | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Glucose | Himedia, India | GRM077 | |
| Hair removing cream (Veet®) | Reckitt Benckiser, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma; US | MHS16 | |
| Heparin sodium salt | Himedia; India | RM554 | |
| Hyaluronidase From Sheep Testes | Sigma; US | H6254 | |
| I.V. Cannula (Plusflon) | Mediplus, India | Ref 1732411420 | |
| Insulin Syringes | BD; US | REF 303060 | |
| Isoflurane (Forane®) | Asecia Queenborough | No B506 | Inhalation Anaesthetic |
| Ketamine (Ketamax®) | Troikaa Pharmaceuticals Ltd. | Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Meloxicam (Melonex®) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Micro needle holders straight & curved |
Mercian; England | BS-13-8 | |
| Micro needle holders straight & curved |
Mercian; England | BS-13-8 | |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Nylon Thread | Mighty; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Percoll® | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Refresh Tears/Eyemist Gel | Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India | P3060 | No specific Catalog Number |
| RPMI | Himedia; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scalpel | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scissors | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation; US | No specific Catalog Number | |
| Sucrose | Sigma; US | S0389 | |
| Surgical Blade No. 22 | La Medcare, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical Board | Locally made | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical White Tape | 3M India; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Sutures | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| Syringes (1ml, 26 G) | Dispo Van; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Trimmer (Clipper) | Philips | NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005 | |
| Weighing Machine | Braun | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| William's E Media | Himedia; India | AT125 | |
| Xylazine (Xylaxin®) | Indian Immunologicals Limited | Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant |
References
- Polson, J., Lee, W. M. AASLD position paper: the management of acute liver failure. Hepatology. 41, 1179-1197 (2005).
- Chung, R. T., et al. Pathogenesis of liver injury in acute liver failure. Gastroenterology. 143, 1-7 (2012).
- Fyfe, B., Zaldana, F., Liu, C. The Pathology of Acute Liver Failure. Clinical Liver Disease. 22, 257-268 (2018).
- Lefkowitch, J. H. The Pathology of Acute Liver Failure. Advances in Anatomic Pathology. 23, 144-158 (2016).
- Mitchell, J. R., et al. Acetaminophen-induced hepatic necrosis. I. Role of drug metabolism. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 187, 185-194 (1973).
- Rahman, T. M., Hodgson, H. J. Animal models of acute hepatic failure. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 81, 145-157 (2000).
- Rahman, T. M., Selden, A. C., Hodgson, H. J. A novel model of acetaminophen-induced acute hepatic failure in rabbits. Journal of Surgical Research. 106, 264-272 (2002).
- Dashti, H., et al. Thioacetamide- and carbon tetrachloride-induced liver cirrhosis. European Surgical Research. 21, 83-91 (1989).
- Demirdag, K., et al. Role of L-carnitine in the prevention of acute liver damage-induced by carbon tetrachloride in rats. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 19, 333-338 (2004).
- Sheweita, S. A., Abd El-Gabar, M., Bastawy, M. Carbon tetrachloride-induced changes in the activity of phase II drug-metabolizing enzyme in the liver of male rats: role of antioxidants. Toxicology. 165, 217-224 (2001).
- Sinicrope, R. A., Gordon, J. A., Little, J. R., Schoolwerth, A. C. Carbon tetrachloride nephrotoxicity: a reassessment of pathophysiology based upon the urinary diagnostic indices. American Journal of Kidney Diseases. 3, 362-365 (1984).
- Takada, Y., Ishiguro, S., Fukunaga, K. Large-animal models of fulminant hepatic failure. Journal of Artificial Organs. 6, 9-13 (2003).
- Takada, Y., et al. Increased intracranial pressure in a porcine model of fulminant hepatic failure using amatoxin and endotoxin. Journal of Hepatology. 34, 825-831 (2001).
- Leist, M., Wendel, A. A novel mechanism of murine hepatocyte death inducible by concanavalin A. Journal of Hepatology. 25, 948-959 (1996).
- Mizuhara, H., et al. Strain difference in the induction of T-cell activation-associated, interferon gamma-dependent hepatic injury in mice. Hepatology. 27, 513-519 (1998).
- Bruck, R., et al. Hypothyroidism minimizes liver damage and improves survival in rats with thioacetamide-induced fulminant hepatic failure. Hepatology. 27, 1013-1020 (1998).
- Chieli, E., Malvaldi, G. Role of the microsomal FAD-containing monooxygenase in the liver toxicity of thioacetamide S-oxide. Toxicology. 31, 41-52 (1984).
- Fontana, L., et al. Serum amino acid changes in rats with thioacetamide-induced liver cirrhosis. Toxicology. 106, 197-206 (1996).
- Peeling, J., et al. Cerebral metabolic and histological effects of thioacetamide-induced liver failure. American Journal of Physiology. 265, 572-578 (1993).
- Blitzer, B. L., et al. A model of fulminant hepatic failure in the rabbit. Gastroenterology. 74, 664-671 (1978).
- Diaz-Buxo, J. A., Blumenthal, S., Hayes, D., Gores, P., Gordon, B. Galactosamine-induced fulminant hepatic necrosis in unanesthetized canines. Hepatology. 25, 950-957 (1997).
- Maezono, K., Mawatari, K., Kajiwara, K., Shinkai, A., Maki, T. Effect of alanine on D-galactosamine-induced acute liver failure in rats. Hepatology. 24, 1211-1216 (1996).
- Patzer, J. F., et al. D-galactosamine based canine acute liver failure model. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 1, 354-367 (2002).
- Newsome, P. N., Plevris, J. N., Nelson, L. J., Hayes, P. C. Animal models of fulminant hepatic failure: a critical evaluation. Liver Transplantation. 6, 21-31 (2000).
- Yoon, E., Babar, A., Choudhary, M., Kutner, M., Pyrsopoulos, N. Acetaminophen-Induced Hepatotoxicity: a Comprehensive Update. Journal of Clinical and Translational Hepatology. 4, 131-142 (2016).
- Das, B., et al. Intrasplenic Transplantation of Hepatocytes After Partial Hepatectomy in NOD.SCID Mice. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nature Protocols. 3, 1167-1170 (2008).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. Journal of Cell Biology. 43, 506-520 (1969).
- Fry, J. R., Jones, C. A., Wiebkin, P., Bellemann, P., Bridges, J. W. The enzymic isolation of adult rat hepatocytes in a functional and viable state. Analytical Biochemistry. 71, 341-350 (1976).
- Green, C. J., et al. The isolation of primary hepatocytes from human tissue: optimising the use of small non-encapsulated liver resection surplus. Cell Tissue Bank. 18, 597-604 (2017).
- Ismail, T., et al. Growth of normal human hepatocytes in primary culture: effect of hormones and growth factors on DNA synthesis. Hepatology. 14, 1076-1082 (1991).
- Greenfield, E. A. Sampling and Preparation of Mouse and Rat Serum. Cold Spring Harbor Protocols. 11, (2017).
- Walsh, K. M., Timms, P., Campbell, S., MacSween, R. N., Morris, A. J. Plasma levels of matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and tissue inhibitors of metalloproteinases -1 and -2 (TIMP-1 and TIMP-2) as noninvasive markers of liver disease in chronic hepatitis C: comparison using ROC analysis. Digestive Diseases and Sciences. 44, 624-630 (1999).
- Thiele, N. D., et al. TIMP-1 is upregulated, but not essential in hepatic fibrogenesis and carcinogenesis in mice. Scientific Reports. 7, 714 (2017).
- Li, C. P., Li, J. H., He, S. Y., Li, P., Zhong, X. L. Roles of Fas/Fasl, Bcl-2/Bax, and Caspase-8 in rat nonalcoholic fatty liver disease pathogenesis. Genetics and Molecular Research. 13, 3991-3999 (2014).
- Kim, W. R., Flamm, S. L., Di Bisceglie, A. M., Bodenheimer, H. C. Serum activity of alanine aminotransferase (ALT) as an indicator of health and disease. Hepatology. 47, 1363-1370 (2008).
- Henry, L. Serum transaminase levels in liver disease. Journal of Clinical Pathology. 12, 131-137 (1959).
- Giannini, E. G., Testa, R., Savarino, V. Liver enzyme alteration: a guide for clinicians. Canadian Medical Association Journal. 172, 367-379 (2005).
- Hammam, O., et al. The role of fas/fas ligand system in the pathogenesis of liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Hepatitis Monthly. 12, 6132 (2012).
- Prystupa, A., et al. Activity of MMP-2, MMP-8 and MMP-9 in serum as a marker of progression of alcoholic liver disease in people from Lublin Region, eastern Poland. The Annals of Agricultural and Environmental Medicine. 22, 325-328 (2015).
- Sekiyama, K. D., Yoshiba, M., Thomson, A. W. Circulating proinflammatory cytokines (IL-1 beta, TNF-alpha, and IL-6) and IL-1 receptor antagonist (IL-1Ra) in fulminant hepatic failure and acute hepatitis. Clinical and Experimental Immunology. 98, 71-77 (1994).
- Schwabe, R. F., Brenner, D. A. Mechanisms of Liver Injury. I. TNF-alpha-induced liver injury: role of IKK, JNK, and ROS pathways. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 290, 583-589 (2006).
- Ataseven, H., et al. The levels of ghrelin, leptin, TNF-alpha, and IL-6 in liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma due to HBV and HDV infection. Mediators of Inflammation. 2006, 78380 (2006).
- Ambrosino, G., et al. Cytokines and liver failure: modification of TNF- and IL-6 in patients with acute on chronic liver decompensation treated with Molecular Adsorbent Recycling System (MARS). Acta Bio Medica Atenei Parmensis. 74, Suppl 2 7-9 (2003).
- Robert, A., Chazouilleres, O. Prothrombin time in liver failure: time, ratio, activity percentage, or international normalized ratio. Hepatology. 24, 1392-1394 (1996).
- Francavilla, A., et al. A dog model for acetaminophen-induced fulminant hepatic failure. Gastroenterology. 96, 470-478 (1989).
- Terblanche, J., Hickman, R. Animal models of fulminant hepatic failure. Digestive Diseases and Sciences. 36, 770-774 (1991).
- Tunon, M. J., et al. Rabbit hemorrhagic viral disease: characterization of a new animal model of fulminant liver failure. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 141, 272-278 (2003).
