Summary
O modelo animal da falha de fígado aguda desenvolvido no estudo atual apresenta uma alternativa praticável para o estudo de terapias potenciais. O modelo atual emprega o efeito combinado de ferimento hepático físico e droga-induzido e fornece uma janela de tempo apropriada para estudar o potencial de terapias novas.
Abstract
A insuficiência hepática aguda (ALF) é uma condição clínica causada por várias etiologias, resultando na perda de funções metabólicas, bioquímicas, sintetizantes e desintoxicantes do fígado. Na maioria dos casos irreversíveis de danos hepáticos, o transplante de fígado ortotrópico (OLT) continua sendo o único tratamento disponível. Para estudar o potencial terapêutico de um tratamento para ALF, seu teste prévio em um modelo animal de ALF é essencial. No presente estudo, um modelo ALF em ratos foi desenvolvido apartir da combinação de hepatectomia parcial de 70% (PHx) e injeções de paracetamol (APAP) que fornece uma janela terapêutica de 48 h. Os lobos laterais medianos e esquerdos do fígado foram removidos para extirpar 70% da massa do fígado e O APAP foi dado 24 h postsurgically por 2 dias. A sobrevivência em animais induzidos por ALF foi encontrada para ser diminuída severamente. O desenvolvimento da ALF foi confirmado por níveis alterados de soro das enzimas alanina amino transferase (ALT), aspartate amino transferase (AST), fósforo alcalino (ALP); mudanças no tempo de protrombina (PT); e avaliação do rácio normalizado internacional (INR). Estudo do perfil de expressão gênica por qPCR revelou um aumento nos níveis de expressão de genes envolvidos na apoptose, inflamação e na progressão da lesão hepática. A degeneração difusa de hepatócitos e a infiltração de células imunes foram observadas pela avaliação histológica. A reversibilidade da ALF foi confirmada pela restauração dos níveis de sobrevivência e soro de ALT, AST e ALP após transplante intrasplenic de hepatócitos de ratos saudáveis singênicos. Este modelo apresenta uma alternativa confiável para os modelos animais ALF disponíveis para estudar a fisiopatologia da ALF, bem como para avaliar o potencial de uma nova terapia para ALF. O uso de duas abordagens diferentes também permite estudar o efeito combinado da lesão hepática induzida por drogas e drogas. A reprodutibilidade e viabilidade do procedimento atual são um benefício adicional do modelo.
Introduction
A insuficiência hepática aguda (ALF) é definida pela Associação Americana para o Estudo de Doenças Hepáticas como o rápido desenvolvimento de lesão hepática aguda sem quaisquer sinais prévios de dano e é caracterizada por comprometimento grave das funções sintéticas, metabólicas e desintoxicantes do fígado1. ALF difere da insuficiência hepática crônica, onde a falha ocorre como resultado de lesão hepática causada durante um longo período de tempo e de insuficiência hepática crônica aguda (ACLF), onde danos bruscos abruptos ocorre como resultado de doenças hepáticas crônicas2,3,4. A única cura disponível para ALF é o transplante de fígado ortotópico (OLT), ou a morte pode ocorrer. Devido à escassez de doadores de fígado, a taxa de mortalidade em pacientes que sofrem de ALF é muito alta.
Para estudar o potencial de abordagens terapêuticas alternativas e para entender melhor a fisiopatologia da ALF, são necessários modelos animais que possam refletir a ALF que ocorre em seres humanos. Muitos dos modelos animais ALF já disponíveis têm várias deficiências. Os efeitos do paracetamol (APAP) são difíceis de reproduzir, mas têm as semelhanças mais próximas em termos de parâmetros temporais, clínicos, bioquímicos e patológicos. Modelos animais induzidos por APAP freqüentemente encontram problemas devido à presença de methemoglobinemia causada pela oxidação da hemoglobina pela APAP e seus intermediários5,6,7. Outro problema é a falta de reprodutibilidade refletida por respostas de dose imprevisíveis e a hora da morte. Os modelos animais ALF produzidos com cloreto de tetra carbono (CCl4)têm baixa reprodutibilidade8,9,10,11. Concavalin A (Con A) e lipoplysaccharide (LPS) induzida a modelos animais ALF não refletem o padrão clínico da doença humana, embora tenham vantagens no estudo de mecanismos celulares envolvidos em doenças hepáticas auto-imunes e no estudo da sepse respectivamente12,13,14,15. Da mesma forma, o thioacetamide (TAA) também requer biotransformação para um metabolito ativo tiaacetamide sulfoxida e mostra variação de espécies16,17,18,19. D-galactosamina (D-Gal) produz algumas alterações bioquímicas, metabólicas e fisiológicas semelhantes a ALF, mas não é capaz de refletir toda a condição patológica ALF20,21,22,23. Houve muito poucas tentativas de combinar dois ou mais desses métodos para desenvolver um modelo ALF que é capaz de refletir a síndrome de ALF de uma maneira melhor13. Portanto, mais estudos são necessários para desenvolver um modelo que possa refletir os parâmetros da doença, tenha melhor reprodutibilidade e proporcione tempo suficiente para estudar os efeitos de uma intervenção terapêutica.
No estudo atual, um modelo alternativo de ALF nos ratos foi criado combinando os efeitos da hepatectomia parcial (PHx) e doses mais baixas de um reagente hepatotoxic. APAP tem um papel bem estabelecido na causa de lesão hepática5,24,25. É um analgésico amplamente utilizado e é tóxico para o fígado em doses supraterapêuticas, formando metabólitos tóxicos. A APAP é a causa de muitas mortes em países desenvolvidos. Lesão física causada pela hepatectomia parcial inicia ativação de vários processos envolvidos na inflamação, bem como regeneração hepática. A injeção do agente hepatotóxico APAP causa um ambiente hostil no fígado, impedindo a proliferação de hepatócitos. Isso reduz o período de estresse sobre o animal, que quando combinado com doses menores de hepatotoxina, leva a uma melhor reprodutibilidade do procedimento. Portanto, usando este modelo, um efeito combinatório de dois tipos de lesões hepáticas tem sido estudado. Para caracterizar o modelo animal alf desenvolvido, parâmetros fisiológicos e bioquímicos têm sido estudados. A reversibilidade bem sucedida da ALF foi confirmada pelo transplante de hepatócitos de ratos saudáveis singênicos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
O procedimento descrito abaixo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Ética Animal do Instituto Nacional de Imunologia, Nova Deli. O número de referência em série da aprovação é o IAEC#355/14.
1. Preparação
- Prepare-se para o procedimento cirúrgico, como descrito anteriormente por Das B et al.26.
- Use 6-8 semanas de idade ratos Wistar consanguíneos com um peso corporal de 200-250 g.
- Abrigar os animais em condições padrão de cuidados com os animais e alimentá-los com rat chow e libitum antes e depois do procedimento.
- Ao realizar 70% de PHx, use uma mistura padrão de coquetel de cloridrato de cetamina (100 mg/kg de peso corporal) e xilina (10 mg/kg de peso corporal), que é injetado intraperitoneally.
NOTA: O tipo de anestésico utilizado pode ter efeitos pós-operatórios sobre a mortalidade e morbidade. - Durante o transplante celular, use a anestesia inalante Isoflurane (2-cloro-2-(difluoromethoxy)-1,1,1-trifluoro-etano) para reduzir o tempo de recuperação do animal após a cirurgia de transplante.
- Induzir e manter a anestesia inalação usando um sistema de anestesia personalizado. Mantenha o fluxo de oxigênio em 4 L/min. Para uso de indução isoflurane em 4% e para uso de manutenção 2-3% durante o procedimento cirúrgico.
2. Procedimentos pré-operatórios
- Anestesie o rato injetando a mistura de cetamina-xilázine descrita no passo 3.1 intraperitoneally. Confirme a anestesia completa beliscando o dedo do animal. Outros procedimentos são realizados apenas quando não há reflexo de pedal.
- Para evitar a dessecação da córnea, aplique uma gota de olho à base de metilcelio carboxy em ambos os olhos.
- Contenha o animal anestesiado a uma placa cirúrgica usando a fita branca. Coloque o animal com o lado abdominal voltado para cima, garantindo que a boca está no lado distal da pessoa que executa a operação.
- Retire o cabelo da área cirúrgica abdominal superior direita usando um clipper elétrico.
- Desinfete o local cirúrgico por três esfoliantes alternados de iodo povidone e 70% de etanol usando almofadas de algodão esterilizadas em movimento circular.
3. Hepatectomia parcial (PHx) para remover 70% da massa do fígado
NOTA: Realize todo o procedimento cirúrgico um ambiente estéril em um capô de fluxo laminar. Use apenas instrumentos cirúrgicos estéreis para minimizar o risco de infecção pós-cirúrgica. A remoção de 70% da massa hepática, denominada hepatectomia parcial de 70% (70% PHx), foi realizada conforme descrito por C. Mitchell e H. Willenbring,2008 27.
- Antes do início da cirurgia, confirme a anestesia completa do animal beliscando o dedo do dedo do dedo do dedo do dia. Outros procedimentos são realizados apenas quando não há reflexo de pedal.
- Marque a pele a ser cortada logo abaixo do esterno, perpendicular ao xifórido, e paralelo à caixa torácica.
- Coloque uma folha de cortina estéril com uma abertura de cerca de 3 cm x 1 cm sobre a pele marcada.
- Realize uma incisão transversal de cerca de 2-3 cm ao longo da linha marcada com um bisturi. Use a lâmina cirúrgica nº 22. Remova delicadamente o acessório da pele à camada subjacente do músculo na vizinhança da área incisada usando pontas estérils do algodão umedecido.
- Em seguida, faça uma incisão transversal através da camada peritoneal logo abaixo do processo xifórico.
- Com a ajuda de duas pontas de algodão umedecido soro fisiológico, expor o lobo esquerdo do fígado, aplicando uma pressão suave sobre o tórax. Coloque uma ponta de algodão na região diafragmática da porção incisa e a outra ponta de algodão abaixo da região incisa para levantar o lóbulo do fígado.
- Deslize um loop de fio de nylon estéril de 8-10 cm de comprimento (tamanho 4-0, 0,15 mm de diâmetro) ao redor do lobo do fígado exposto. Leve o laço para a base do lóbulo perto do hilum com a ajuda de fórceps microdissecting ou cotonetes umedecidos.
- Com a ajuda do suporte da agulha da microcirurgia e dos microforceps, amarre as duas extremidades do laço, coloc o nó tão perto da base do lóbulo como possível para constrição do vaso sanguíneo e reduzir o sangramento depois que o lóbulo do fígado é removido. Amarre dois nós adicionais do outro lado.
- Tome precauções para não amarrar o nó muito perto dos vasos sanguíneos próximos, o que pode causar obstrução venosa (estenose).
- Use tesouras de microcirurgia para cortar o lobo amarrado logo acima do nó, o que deixa uma massa detecido descolorida chamada um coto isquêmico no lugar do lobo.
NOTA: O fígado de rato, como os de camundongos, é dividido em quatro lobos distintos: o lobo mediano, lobo lateral direito, lobo lateral esquerdo e lóbulo caudado, que representam cerca de 40%, 20%, 30% e 7% da massa hepática total, respectivamente. Qualquer combinação desses lobos pode ser removida para extirpar 70% de massa hepática. No estudo atual, o lóbulo mediano e os lóbulos laterais esquerdos foram removidos. - Localização cuidadosa do lobo mediano sem danificar o toco restante do lobo lateral esquerdo. Puxe-o delicadamente fora da cavidade abdominal, e na base do lobe amarra um fio de nylon de 8-10 cm de comprimento (tamanho 4-0) nó como mencionado anteriormente. Amarre dois nós adicionais do outro lado. Cuidadosamente extirpar e remover o lobo mediano amarrado tomando todas as precauções mencionadas.
- Após a remoção dos lobos, sutura do peritônio usando uma sutura cronômica absorvível 4-0 com pontos contínuos seguidos de sutura da pele com uma sutura interrompida.
- Aplique iodo povidone na pele em torno das suturas para prevenir a infecção.
- Retire a folha de cortina e retire o animal do tabuleiro de cirurgia.
4. Cuidados pós-operatórios em animais
- Intraperitoneally injetar o animal com uma dose de 12 mg de antibiótico cefotaxime em 1 mL de 5% solução de glicose com uma seringa de 1 mL para protegê-lo do risco de infecção pós-operatória.
- Administrar uma injeção subcutânea de meloxicam analgésico (1 mg/kg de peso corporal) para alívio da dor após a cirurgia e segui-lo por mais duas doses, mantendo o regime como uma dose por dia.
- Abrigar os animais operados em condições padrão de 12 h de luz / ciclo escuro e monitorar em intervalos regulares.
5. Injeção de droga em animais parcialmente hepatectomizados para induzir insuficiência hepática
- Após 24 h pós-cirurgia, quando os animais se recuperaram com sucesso de 70% de PHx, medir o peso corporal do animal seguido pelas injeções.
- Injetar 750 mg/kg de peso corporal de APAP intraperitoneally em animais parcialmente hepatectomizados 24 h após o PHx de 70% após a recuperação bem sucedida dos animais do procedimento cirúrgico. Repita a dose novamente após 24 h.
NOTA: Duas doses de APAP são administradas intraperitoneally ao animal (isto é, 24 h e 48 h borne o procedimento de 70% PHx, respectivamente). - Em cada ponto de tempo após a injeção de APAP, medir o peso corporal do animal em recuperação.
NOTA: APAP (biocetamol) é injetado em animais como uma solução de 150 mg/mL em 2% de álcool benzyl.
6. Transplante de hepatócitos saudáveis em modelos animais ALF
NOTA: Para estudar a reversibilidade da ALF em ratos, transplante de hepatócitos de rato singêneo saudável intrasplenicamente nos animais induzidos por ALF, juntamente com a dose de 1st de APAP. No presente estudo, para proporcionar tempo suficiente às células transplantadas para homing e enxerto, o transplante foi feito logo após dar a dose de1º apap. Hepatócitos de ratos são isolados por um protocolo publicado pela primeira vez pela Berry and Friends etal. 28 e mais tarde adaptados em vários outros estudos29,30,31 com algumas modificações. Para transplante intrasplenic de células no modelo animal ALF, siga os passos mencionados abaixo.
- Coloque o rato em uma câmara poli (metilme metacrilato) para indução de anestesia com 4% isoflurano e fluxo de oxigênio L/min para um rato de 250-350 g de peso corporal. Verifique se há profundidade de anestesia pela falta de reflexos do pedal ao beliscar o dedo do animal.
- Coloque o rato anestesiado no tabuleiro cirúrgico de tal forma que sua porção lateral esquerda está enfrentando. Manter anestesia em 2-3% inalação isoflurane através de um porta-voz adequado.
- Raspe a pele na região lateral esquerda e a esteriliza por solução de iodo povidone.
- Faça uma incisão transversal na região raspada da pele.
- Faça um corte de 1-2 cm na camada peritoneal para expor o baço.
- Gentilmente tirar o baço da cavidade peritoneal e levantá-lo com a ajuda de duas pontas de algodão umedecido.
- Mantenha as células (tipicamente 107 por animal) para serem transplantadas suspensas em 50 μL IMDM em uma seringa de insulina de 1 mL com uma agulha de 29 G.
- Gentilmente perfurar a agulha no córtex do baço e liberar a suspensão celular no baço dentro de 2-3 min.
- Após o transplante de células é concluída, retire cuidadosamente a agulha e dab a área da punção da agulha com uma ponta de algodão umedecido para evitar vazamento da suspensão celular do local.
- Feche o peritônio e a pele por uma sutura absorvente 4-0 com sutura contínua e descontínua, respectivamente.
- Aplique a solução de iodo povidone na pele no local das suturas para evitar a infecção no local operado.
- Injete iperneally 1 mL volume de 12 mg/mL de antibiótico (por exemplo, cefotaxime) solução e subcutâneamente injetar analgésico (por exemplo, meloxicam) 1 mg / kg de peso corporal para o animal como parte do cuidado pós-operatório. Mova o animal para uma gaiola de recuperação quente.
- Mantenha o animal operado em isolamento em condições normais de 12 h de luz / ciclo escuro até que as feridas cirúrgicas são completamente curadas. Isso pode levar de 3 a 4 dias.
7. Caracterização do desenvolvimento da ALF
- Eutanásia os animais por overdose de solução de cetamina-xilázine 2 h após adose 2 de tratamento APAP e coletar amostras de sangue e tecido.
- Coletar soro de sangue para estudos bioquímicos32.
- Amostras de tecido hepático processo para estudos histológicos e de expressão gênica33,34,35.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Percentual de sobrevivência em modelos animais de ALF
A dose ideal de APAP para causar ALF em combinação com 70% PHx foi padronizado como 750 mg / kg de peso corporal. O regime de tratamento começou 24 h após 70% de PHx, quando os animais se recuperaram completamente da cirurgia, e consistiu em duas doses de APAP em intervalos de 24 h. A mortalidade foi observada à taxa de 80% após a administração da segunda dose de APAP, 48 h pós-cirurgia. A porcentagem de sobrevivência foi analisada e traçada através do método Kaplan-Meier (Figura 1). A reprodutibilidade em tempo de morte e período de tempo proporcionado por este modelo torna-o um candidato adequado para estudar uma intervenção terapêutica contra a ALF.
Quatro grupos de animais foram considerados para o estudo: Grupo 1 (grupo controle, apenas tratamento soro fisiológico), Grupo 2 (apenas APAP com 750 mg/kg de peso corporal), Grupo 3 (tratamento soro fisiológico com 70% PHx) e Grupo 4 (APAP a 750 mg/kg de peso corporal com 70% PHx). Três animais cada um foram incluídos em todos os grupos e duas imagens representativas são incluídas de cada grupo. Animais de todos os quatro grupos foram sacrificados 2 h após a administração da2ª dose do respectivo tratamento. Amostras de fígado colhidas de todos os quatro grupos mostraram morfologia distinta umada uma da outra. O grupo 1 mostrou a morfologia avermelhada-marrom de um fígado saudável do roedor. Amostras hepáticas do Grupo 2 não mostraram sinais aparentes de danos em um nível morfológico e mostraram aparência semelhante aos fígados saudáveis do Grupo 1. As amostras de fígado retiradas dos Grupos 3 e 4 não pareciam saudáveis e tinham descoloração e uma aparência irregular. A descoloração corresponde ao dano no tecido hepático e foi mais aparente no Grupo 4. Os dados representativos são apresentados na Figura 2.
A extensão da lesão hepática foi determinada pela verificação dos níveis de soro das enzimas ALT, AST e ALP36,37,38. Os níveis de ALT, AST e ALP apresentaram diferenças acentuadas entre os quatro grupos correspondentes à extensão dos danos no fígado. O Grupo 4 apresentou um aumento significativo nos níveis ast e alpino em comparação com o Grupo 1(Figura 3).
Para comparar o perfil de expressão gênica no controle e grupos induzidos por ALF, a análise q-PCR de genes envolvidos na morte celular(Bax2, Caspase3, Fas)em amostras de tecido hepático foi realizada35,39. Verificou-se que estes foram regulados no Grupo 3 em comparação com o grupo de controlo 1, ao longo do qual não foi observada qualquer diferença no Grupo 2 e no Grupo 4. Genes que são conhecidos por serem superexpressos em resposta a lesão hepática (Mcp1 e Mmp2)33,40 foram encontrados para ser upregulated em todos os três grupos em comparação ao controle do Grupo 1. O Mmp9 foi regulado nos Grupos 3 e 4, enquanto o Grupo 2 não apresentou diferença acentuada em relação ao Grupo 1 de controle. Os níveis de expressão de Timp1 e Timp234 foram encontrados para ser mais elevados no Grupo 3, mas não mostrou superexpressão acentuada no Grupo 4 (Figura 4).
Genes envolvidos na inflamação do fígado (Tnfa, IL1a, Tgfbr1 e IL1b)41,42,43,44foram encontrados para ser superexpressa no Grupo 3 em comparação com o controle do Grupo 1, mas seu nível de expressão foi diminuída no Grupo 4. Alr é superexpressa no tecido hepático após a indução de lesão hepática. As cascatas a jusante deste gene ajudam na regeneração hepática. A proteína RIP1 é necessária na toxicidade induzida por APAP. Verificou-se que a ALR e o RIP1 foram regulados nos Grupos 2 e 3 em comparação com o grupo de controle 1, enquanto seus níveis permanecem semelhantes ou mais baixos no Grupo 4. A actina muscular aléscie alfa (aSMA),um marcador de deposição excessiva de ECM que leva à fibrose, foi considerada desregulada no Grupo 3 e 4 em comparação ao controle do Grupo 1 (Figura 4). Os dados da expressão gênica sugerem que os biomarcadores acima mencionados de inflamação e morte celular que são conhecidos por serem superexpressos durante a lesão hepática são upregulated em amostras de tecido hepático de animais em que ALF foi induzida pelo método proposto, confirmando assim a ocorrência de lesão hepática no nível molecular.
Hematoxilina e eosina (H&E) coloração
A coloração da hematoxilina e da eosina (H&E) foi feita para avaliar a gravidade da lesão hepática observando a extensão da degeneração hepatocito. As seções de tecido hepático manchadas com H&E foram submetidas a análisecega por terceiros. Na degeneração gordurosa vesicular do grupo hepatectomia parcial de 70% foi observada e no grupo de paracetamol inflamação periportal e necrose foi observada juntamente com dilatação sinusoidal leve. A degeneração gordurosa vesicular foi observada principalmente no grupo ALF(Figura 5).
Tempo de protrombina e níveis de glicose no sangue
Protrombina Tempo (PT) é um parâmetro que depende da atividade da trombolastina do tecido sintetizado pelo fígado e é usado para caracterizar a eficiência do mecanismo de coagulação sanguínea45. Geralmente, observa-se um aumento do PT nas condições de doenças hepáticas. O PT foi significativamente maior no grupo induzido pela ALF em comparação com o grupo controle. A razão normalizada internacional (INR)45 também foi encontrada para ser maior, representando um defeito no mecanismo de coagulação do sangue como resultado da fisiologia hepática ineficiente (Figura 6).
Avaliação da sobrevivência após transplante de hepatócitos de ratos singênicos saudáveis celulares
Um critério importante de um modelo de ALF é a reversibilidade da insuficiência hepática na presença de uma intervenção terapêutica. No estudo atual, 10 milhão hepatocytes saudáveis do rato singéneos foram transplantados instrasplenically para observar o efeito da terapia da transplantação da pilha na falha de fígado. O número adequado de células a serem transplantadas foi determinado pela observação da reversibilidade da insuficiência hepática após o transplante de diferentes números celulares (dados não mostrados). As células foram transplantadas após a administração da1ª dose de APAP, e verificou-se que a sobrevivência foi restaurada em animais após o transplante de células(Figura 7). Os níveis de soro das enzimas ALT, AST e ALP foram normalizados após 10 dias de transplante de células(Figura 8).
Figura 1: Porcentagem de sobrevivência no grupo induzido pela ALF. Curva de Sobrevivência Kaplan-Meier mostrando a porcentagem de sobrevivência de animais após a indução de ALF com a combinação de 70% de dose de PHx e APAP (750 mg/kg de peso corporal). O tempo 0 h denota o tempo de 70% pHx. Asdoses de 1º e2º apap foram administradas 24 e 48 h postsurgically (n = 12, total de animais). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Imagens representativas da morfologia hepática nos quatro grupos diferentes incluídos no estudo. Painéis de imagem A-D mostram a morfologia dos fígados de diferentes grupos depois de ter sido sacrificado 2 h após adose 2 do respectivo tratamento. (A)A morfologia hepática do Grupo de controle 1 em que apenas soro fisiológico foi dado. (B) A morfologia hepática do Grupo 2 em que apenas APAP foi dada na dose de 750 mg/kg de peso corporal. (C) A morfologia hepática do Grupo 3 em que a soro fisiola foi dada após 70% PHx. (D)A morfologia hepática no Grupo 4 em que a APAP foi dada após 70% de PHx na dose semelhante ao Grupo 3 (n = 3 animais por grupo). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 3: Uma comparação do perfil bioquímico do soro nos diferentes grupos. Os gráficos de barras representam o valor médio de ALT, AST e ALP em amostras de soro dos quatro grupos incluídos no estudo. O soro foi coletado 2 h após a2ª dose do respectivo tratamento. Barras de erro = S.E.M; = p < 0,001; * = p < 0,05; n = 3. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 4: Perfil da expressão do gene de amostras do tecido do fígado. Os gráficos de barras representam a quantificação relativa da expressão de mRNA de vários genes envolvidos na inflamação e morte celular nos quatro grupos submetidos a diferentes tratamentos. Todos os genes foram normalizados contra a expressão de controle Gapdh. Barra de erro = erro padrão significa das três amostras diferentes (n = 3). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 5: Estudo histológico de amostras de tecido hepático. Imagens representativas de hematoxilina e eosina manchando amostras de tecido hepático dos quatro grupos incluídos no estudo, como observado ampliação de 200x em microscopia de campo brilhante. Havia principalmente hepatócitos normais no Grupo 1 de controle com infiltração periportal leve (setas verdes). No Grupo 3 (70% hepatectomia parcial) a degeneração gordurosa vesicular foi observada (setas brancas) e no grupo de paracetamol 2 inflamação periportal (setas vermelhas) e necrose foram observadas juntamente com dilatação sinusoidal leve (setas amarelas). A degeneração gordurosa macrovesicular foi observada principalmente no Grupo ALF 4 (setas laranja). Barra de escala = 50 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 6: Comparação do tempo de protrombina (PT) e relação normalizada internacional (INR). (A)Comparação do PT entre o Grupo de Controle 1 (injeção sorino pós 70% PHx) e o Grupo 4 induzido por ALF (posto de injeção APAP 70% PHx). O sangue foi coletado 2 h após a2ª dose do respectivo tratamento e tempo (em segundos) necessários para a formação de coágulos de fibrina é mostrado no eixo Y (**** = p < 0,0001, n = 5). (B) O INR no Grupo 4 induzido pela ALF em comparação com o controle do Grupo 1. O valor médio do INR no Grupo 4 foi de 2,28, que cai no efeito anti coagulante induzido pela Varfarina (n = 5). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 7: Porcentagem de sobrevivência no grupo induzido por ALF após transplante celular. Curva de sobrevivência Kaplan-Meier mostrando a porcentagem de sobrevivência após transplante saudável de hepatocitos no Grupo 4 induzido pela ALF em comparação ao Grupo 1 de controle (n = 5). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 8: Perfil bioquímico do soro de animais ALF-induzidos após a transplantação da pilha. Níveis de soro de enzimas ALT, AST e ALP 10 dias após o transplante celular em comparação com os níveis de soro de animais induzidos por ALF eutanasiados após umadose 2 da administração APAP. Barra de erro = erro padrão de média de cinco amostras diferentes; = p < 0,0001; ** = p > 0,01; n = 5. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O desenvolvimento de um modelo animal adequado para ALF é fundamental para uma melhor compreensão da patogênese e progressão da ALF. Um modelo animal alf bem caracterizado também oferece a oportunidade para o desenvolvimento e julgamento de novas abordagens terapêuticas contra a ALF. Muitas tentativas foram feitas para desenvolver um modelo clinicamente relevante de ALF6,12,21,23,46,47,48. A maioria destes estudos utiliza procedimentos cirúrgicos ou induz a lesão hepática por produtos químicos hepatotóxicos.
É difícil criar um modelo De ALF por PHx sozinho porque o PHx não refletiria a patologia de ALF devido à ausência de inflamação causada pelos tecidos necróticos e apoptotáticos. Em doses terapêuticas, a APAP é metabolizada completamente pelos processos de glucoronia e sulfação. Em doses mais elevadas, quando estas vias estão saturadas, APAP é metabolizada por enzimas citocromáticas p450 que são sintetizadas principalmente por hepatócitos, resultando na formação de um intermediário tóxico, NAPQI (N-acetil-p-benzoquinona imine). Em condições normais, o NAPQI é neutralizado pelas reservas de glutationa (GSH) das células, enquanto que em doses supraterapêuticas causa estresse oxidativo em hepatócitos, resultando em morte hepatocito4,24,25,46. Assim, combinando os efeitos fisiológicos de 70% de PHx e lesão hepática induzida por APAP, um modelo de rato ALF foi criado no presente estudo. Uma janela terapêutica menor reduz o período de esforço no animal. Quando combinado com doses menores de APAP, isso leva a uma melhor reprodutibilidade do procedimento.
A dose de APAP foi selecionada para fornecer uma janela terapêutica adequada durante a qual uma intervenção terapêutica pode ser dada ao animal (ou seja, dentro de 48 h dadose 1 e 24 h de 2ª dose). Dentro de 24 h após a2ª dose de APAP, observou-se 100% de mortalidade. No entanto, o tempo de morte dentro desse período foi variável para cada animal. Assim, com a finalidade de estudar o desenvolvimento da ALF, os animais foram sacrificados em um ponto de tempo padrão de 2 h após adose 2 de APAP.
O tempo de intervenção terapêutica pode ser decidido dependendo do estudo individual e do tipo de terapia que está sendo estudado, que no presente estudo foi o transplante de hepatócitos de ratos singênicos logo após adose 1 de APAP, permitindo que as células tempo suficiente para casa e enxerto. No modelo atual, o transplante de pelo menos 10 milhões de células é necessário para um resgate bem sucedido da ALF.
Para garantir o sucesso do procedimento cirúrgico, alguns pontos importantes devem ser considerados. Recomenda-se o uso de diferentes tipos de anestésicos em diferentes procedimentos cirúrgicos. Para realizar hepatectomia parcial, um coquetel de cetamina-xiláquia deve ser usado nas doses recomendadas porque dá tempo suficiente para completar o procedimento cirúrgico. Durante o transplante de células, a anestesia inalável isoflurane deve ser usada porque reduz o estresse físico em animais induzidos por ALF.
Em conclusão, devido a uma taxa de mortalidade uniforme e uma janela terapêutica conveniente, um modelo combinado a APAP e 70% pHx foi usado para estudar a reversibilidade da ALF por transplante celular. Para avaliar a reversibilidade da ALF, 10 milhões de hepatócitos de ratos singêneos saudáveis foram transplantados intrasplenicamente nos animais induzidos por ALF. Após o transplante, verificou-se que o percentual de sobrevida foi aumentado em animais induzidos por ALF. A melhoria nos níveis de soro de ALT, AST e ALP também foi observada em animais após transplante de células, sugerindo a restauração do metabolismo hepático. Este modelo animal ALF apresenta uma alternativa para avaliar o potencial terapêutico das células que colam a lacuna entre insuficiência hepática aguda e transplante de fígado. Ele também fornece a oportunidade de estudar os danos do fígado causados por lesões físicas e agente hepatotóxico.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela concessão principal recebida do Departamento de Biotecnologia, Governo da Índia para o Instituto Nacional de Imunologia, Nova Deli.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetaminophen (Biocetamol) | EG Pharmaceuticals | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Betadine (Povidon-Iodine Solution) | Win-Medicare; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Biological safety cabinet (Class I) | Kartos international; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| Cefotaxime (Taxim®) | AlKem; India | cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Cell Strainer | Sigma; US | CLS431752 | |
| Collagenase Type I | Gibco by Life Technologies | 17100-017 | |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Drape Sheet | JSD Surgicals, Delhi, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| DPX Mountant | Sigma; US | 6522 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma; US | HT110132 | |
| Forceps | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Glucose | Himedia, India | GRM077 | |
| Hair removing cream (Veet®) | Reckitt Benckiser, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma; US | MHS16 | |
| Heparin sodium salt | Himedia; India | RM554 | |
| Hyaluronidase From Sheep Testes | Sigma; US | H6254 | |
| I.V. Cannula (Plusflon) | Mediplus, India | Ref 1732411420 | |
| Insulin Syringes | BD; US | REF 303060 | |
| Isoflurane (Forane®) | Asecia Queenborough | No B506 | Inhalation Anaesthetic |
| Ketamine (Ketamax®) | Troikaa Pharmaceuticals Ltd. | Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Meloxicam (Melonex®) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Micro needle holders straight & curved |
Mercian; England | BS-13-8 | |
| Micro needle holders straight & curved |
Mercian; England | BS-13-8 | |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Nylon Thread | Mighty; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Percoll® | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Refresh Tears/Eyemist Gel | Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India | P3060 | No specific Catalog Number |
| RPMI | Himedia; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scalpel | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scissors | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation; US | No specific Catalog Number | |
| Sucrose | Sigma; US | S0389 | |
| Surgical Blade No. 22 | La Medcare, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical Board | Locally made | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical White Tape | 3M India; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Sutures | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| Syringes (1ml, 26 G) | Dispo Van; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Trimmer (Clipper) | Philips | NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005 | |
| Weighing Machine | Braun | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| William's E Media | Himedia; India | AT125 | |
| Xylazine (Xylaxin®) | Indian Immunologicals Limited | Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant |
References
- Polson, J., Lee, W. M. AASLD position paper: the management of acute liver failure. Hepatology. 41, 1179-1197 (2005).
- Chung, R. T., et al. Pathogenesis of liver injury in acute liver failure. Gastroenterology. 143, 1-7 (2012).
- Fyfe, B., Zaldana, F., Liu, C. The Pathology of Acute Liver Failure. Clinical Liver Disease. 22, 257-268 (2018).
- Lefkowitch, J. H. The Pathology of Acute Liver Failure. Advances in Anatomic Pathology. 23, 144-158 (2016).
- Mitchell, J. R., et al. Acetaminophen-induced hepatic necrosis. I. Role of drug metabolism. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 187, 185-194 (1973).
- Rahman, T. M., Hodgson, H. J. Animal models of acute hepatic failure. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 81, 145-157 (2000).
- Rahman, T. M., Selden, A. C., Hodgson, H. J. A novel model of acetaminophen-induced acute hepatic failure in rabbits. Journal of Surgical Research. 106, 264-272 (2002).
- Dashti, H., et al. Thioacetamide- and carbon tetrachloride-induced liver cirrhosis. European Surgical Research. 21, 83-91 (1989).
- Demirdag, K., et al. Role of L-carnitine in the prevention of acute liver damage-induced by carbon tetrachloride in rats. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 19, 333-338 (2004).
- Sheweita, S. A., Abd El-Gabar, M., Bastawy, M. Carbon tetrachloride-induced changes in the activity of phase II drug-metabolizing enzyme in the liver of male rats: role of antioxidants. Toxicology. 165, 217-224 (2001).
- Sinicrope, R. A., Gordon, J. A., Little, J. R., Schoolwerth, A. C. Carbon tetrachloride nephrotoxicity: a reassessment of pathophysiology based upon the urinary diagnostic indices. American Journal of Kidney Diseases. 3, 362-365 (1984).
- Takada, Y., Ishiguro, S., Fukunaga, K. Large-animal models of fulminant hepatic failure. Journal of Artificial Organs. 6, 9-13 (2003).
- Takada, Y., et al. Increased intracranial pressure in a porcine model of fulminant hepatic failure using amatoxin and endotoxin. Journal of Hepatology. 34, 825-831 (2001).
- Leist, M., Wendel, A. A novel mechanism of murine hepatocyte death inducible by concanavalin A. Journal of Hepatology. 25, 948-959 (1996).
- Mizuhara, H., et al. Strain difference in the induction of T-cell activation-associated, interferon gamma-dependent hepatic injury in mice. Hepatology. 27, 513-519 (1998).
- Bruck, R., et al. Hypothyroidism minimizes liver damage and improves survival in rats with thioacetamide-induced fulminant hepatic failure. Hepatology. 27, 1013-1020 (1998).
- Chieli, E., Malvaldi, G. Role of the microsomal FAD-containing monooxygenase in the liver toxicity of thioacetamide S-oxide. Toxicology. 31, 41-52 (1984).
- Fontana, L., et al. Serum amino acid changes in rats with thioacetamide-induced liver cirrhosis. Toxicology. 106, 197-206 (1996).
- Peeling, J., et al. Cerebral metabolic and histological effects of thioacetamide-induced liver failure. American Journal of Physiology. 265, 572-578 (1993).
- Blitzer, B. L., et al. A model of fulminant hepatic failure in the rabbit. Gastroenterology. 74, 664-671 (1978).
- Diaz-Buxo, J. A., Blumenthal, S., Hayes, D., Gores, P., Gordon, B. Galactosamine-induced fulminant hepatic necrosis in unanesthetized canines. Hepatology. 25, 950-957 (1997).
- Maezono, K., Mawatari, K., Kajiwara, K., Shinkai, A., Maki, T. Effect of alanine on D-galactosamine-induced acute liver failure in rats. Hepatology. 24, 1211-1216 (1996).
- Patzer, J. F., et al. D-galactosamine based canine acute liver failure model. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 1, 354-367 (2002).
- Newsome, P. N., Plevris, J. N., Nelson, L. J., Hayes, P. C. Animal models of fulminant hepatic failure: a critical evaluation. Liver Transplantation. 6, 21-31 (2000).
- Yoon, E., Babar, A., Choudhary, M., Kutner, M., Pyrsopoulos, N. Acetaminophen-Induced Hepatotoxicity: a Comprehensive Update. Journal of Clinical and Translational Hepatology. 4, 131-142 (2016).
- Das, B., et al. Intrasplenic Transplantation of Hepatocytes After Partial Hepatectomy in NOD.SCID Mice. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nature Protocols. 3, 1167-1170 (2008).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. Journal of Cell Biology. 43, 506-520 (1969).
- Fry, J. R., Jones, C. A., Wiebkin, P., Bellemann, P., Bridges, J. W. The enzymic isolation of adult rat hepatocytes in a functional and viable state. Analytical Biochemistry. 71, 341-350 (1976).
- Green, C. J., et al. The isolation of primary hepatocytes from human tissue: optimising the use of small non-encapsulated liver resection surplus. Cell Tissue Bank. 18, 597-604 (2017).
- Ismail, T., et al. Growth of normal human hepatocytes in primary culture: effect of hormones and growth factors on DNA synthesis. Hepatology. 14, 1076-1082 (1991).
- Greenfield, E. A. Sampling and Preparation of Mouse and Rat Serum. Cold Spring Harbor Protocols. 11, (2017).
- Walsh, K. M., Timms, P., Campbell, S., MacSween, R. N., Morris, A. J. Plasma levels of matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and tissue inhibitors of metalloproteinases -1 and -2 (TIMP-1 and TIMP-2) as noninvasive markers of liver disease in chronic hepatitis C: comparison using ROC analysis. Digestive Diseases and Sciences. 44, 624-630 (1999).
- Thiele, N. D., et al. TIMP-1 is upregulated, but not essential in hepatic fibrogenesis and carcinogenesis in mice. Scientific Reports. 7, 714 (2017).
- Li, C. P., Li, J. H., He, S. Y., Li, P., Zhong, X. L. Roles of Fas/Fasl, Bcl-2/Bax, and Caspase-8 in rat nonalcoholic fatty liver disease pathogenesis. Genetics and Molecular Research. 13, 3991-3999 (2014).
- Kim, W. R., Flamm, S. L., Di Bisceglie, A. M., Bodenheimer, H. C. Serum activity of alanine aminotransferase (ALT) as an indicator of health and disease. Hepatology. 47, 1363-1370 (2008).
- Henry, L. Serum transaminase levels in liver disease. Journal of Clinical Pathology. 12, 131-137 (1959).
- Giannini, E. G., Testa, R., Savarino, V. Liver enzyme alteration: a guide for clinicians. Canadian Medical Association Journal. 172, 367-379 (2005).
- Hammam, O., et al. The role of fas/fas ligand system in the pathogenesis of liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Hepatitis Monthly. 12, 6132 (2012).
- Prystupa, A., et al. Activity of MMP-2, MMP-8 and MMP-9 in serum as a marker of progression of alcoholic liver disease in people from Lublin Region, eastern Poland. The Annals of Agricultural and Environmental Medicine. 22, 325-328 (2015).
- Sekiyama, K. D., Yoshiba, M., Thomson, A. W. Circulating proinflammatory cytokines (IL-1 beta, TNF-alpha, and IL-6) and IL-1 receptor antagonist (IL-1Ra) in fulminant hepatic failure and acute hepatitis. Clinical and Experimental Immunology. 98, 71-77 (1994).
- Schwabe, R. F., Brenner, D. A. Mechanisms of Liver Injury. I. TNF-alpha-induced liver injury: role of IKK, JNK, and ROS pathways. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 290, 583-589 (2006).
- Ataseven, H., et al. The levels of ghrelin, leptin, TNF-alpha, and IL-6 in liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma due to HBV and HDV infection. Mediators of Inflammation. 2006, 78380 (2006).
- Ambrosino, G., et al. Cytokines and liver failure: modification of TNF- and IL-6 in patients with acute on chronic liver decompensation treated with Molecular Adsorbent Recycling System (MARS). Acta Bio Medica Atenei Parmensis. 74, Suppl 2 7-9 (2003).
- Robert, A., Chazouilleres, O. Prothrombin time in liver failure: time, ratio, activity percentage, or international normalized ratio. Hepatology. 24, 1392-1394 (1996).
- Francavilla, A., et al. A dog model for acetaminophen-induced fulminant hepatic failure. Gastroenterology. 96, 470-478 (1989).
- Terblanche, J., Hickman, R. Animal models of fulminant hepatic failure. Digestive Diseases and Sciences. 36, 770-774 (1991).
- Tunon, M. J., et al. Rabbit hemorrhagic viral disease: characterization of a new animal model of fulminant liver failure. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 141, 272-278 (2003).
