Summary
Ce protocole décrit la mise en place d'un modèle de souris pour l'étude des interactions Malassezia-hôtedans la peau. Il décrit la culture de Malassezia in vitro, l'infection de la peau murine avec Malassezia, et l'analyse ultérieure de l'inflammation et le fardeau fongique dans le tissu cutané.
Abstract
Les modèles animaux sont cruciaux pour la recherche sur les maladies infectieuses. Ils fournissent une base importante pour analyser l'ensemble des interactions qui se produisent entre les microbes et leur hôte in vivo d'une manière spécifique aux tissus. Les champignons pathogènes sont de plus en plus reconnus comme une menace sérieuse pour les humains et l'exploitation de ces modèles d'infection a grandement amélioré notre compréhension de la pathogénicité fongique. Les espèces du genre Malassezia sont les champignons les plus abondants du microbiote de peau humaine et elles sont également associées au développement des désordres inflammatoires graves de peau tels que la dermatite séborrhéique et la dermatite atopique. Cependant, un lien causatif entre Malassezia et la pathogénie de maladie demeure inconnu, un fait qui peut être attribué à la connaissance pauvre du crosstalk complexe de Malassezia avec le système immunitaire de peau. Ce protocole décrit l'établissement d'un modèle expérimental de souris qui permet d'étudier l'interaction de Malassezia avec la peau des mammifères in vivo. Il décrit la méthode de culture de Malassezia spp. dans des conditions de laboratoire, comment infecter la peau murine avec Malassezia spp. et comment évaluer les résultats de l'infection au moyen de l'inflammation de la peau et des analyses de la charge fongique. Le modèle décrit ici fonctionne chez les animaux entièrement immunocompétents et ne repose pas sur le prétraitement immunosuppresseur ou antibiotique des animaux. Il est en outre adaptable à pratiquement toutes les souches de souris génétiquement modifiées et peut être combiné avec d'autres modèles de maladies de la peau. Ces caractéristiques font de ce modèle d'infection un outil très puissant pour étudier en détail la réponse immunitaire innée et adaptative de l'hôte contre Malassezia dans la peau in vivo.
Introduction
La peau est peuplée de nombreux microbes différents. L'exposition constante de la peau au microbiote contribue à façonner et à éduquer le système immunitaire de l'hôte. Les champignons sont de plus en plus reconnus comme une partie vitale du microbiote et ils remplissent un rôle important pour la physiologie et l'immunité de l'hôte, semblable aux bactéries et aux virus1. Les espèces du genre Malassezia sont de loin les champignons les plus abondants colonisant la peau des vertébrés à sang chaud et ils représentent plus de 90% de la peau humaine mycobiome2,3. Dix-huit espèces différentes de Malassezia ont jusqu'à présent été identifiées à partir de la peau humaine et animale4.
Diverses pathologies de la peau sont pensés pour surgir, au moins partiellement, en raison d'une composition de microbiote dysbalanced. La dysbiose peut entraîner la prolifération d'espèces au potentiel pathogène entraînant des infections opportunistes et la maladie5. Constamment, il ya une preuve croissante que Malassezia, en plus de son mode de vie commensal, contribue au développement de diverses pathologies de la peau, allant de pellicules et pityriarsis versicolor à des troubles inflammatoires plus graves tels que dermatite séborrhéique et dermatite atopique4,6. Tandis qu'un lien causatif entre Malassezia et pityriarsis versicolor a été établi, le rôle pathophysiologique du mycète dans les pathologies plus graves de peau reste largement inconnu.
Déterminer le rôle de Malassezia dans l'homéostasie de la peau et la maladie exige des connaissances plus approfondies sur l'interaction du champignon avec la peau et le système immunitaire cutané. Il est à noter que la recherche sur Malassezia est, par rapport à d'autres pathogènes fongiques humains (par exemple, Candida albicans ou Aspergillus fumigatus), encore à l'étape naissante. Cela peut être attribué à la difficulté dans la culture de Malassezia dans des conditions de laboratoire et à l'absence de modèles expérimentaux appropriés pour étudier le champignon en contact in vivo avec l'hôte. Des expériences antérieures avec des cellules isolées en culture ont indiqué un large éventail d'interactions directes et indirectes entre Malassezia et diverses cellules immunitaires et non immunitaires7. Cependant, ces expériences in vitro ne récapitulent que partiellement la situation de l'environnement cutané complexe in vivo où de nombreux événements cellulaires et moléculaires se produisent simultanément entre le champignon et divers types de cellules.
Ici, nous énoncions le protocole d'un modèle expérimental d'infection de la peau de Malassezia chez la souris, que nous avons récemment établi, pour étudier l'interaction champignon-hôte in vivo7. Cela comprend les procédures pour (1) la culture réussie de Malassezia in vitro, (2) l'application épicutanée de Malassezia sur la peau de l'oreille murine, et (3) les détails techniques de la façon d'analyser malassezia-induit la peau l'inflammation et le fardeau fongique de la peau infectée. Fait important, ce modèle ne repose pas sur l'immunosuppression (par exemple, par des corticostéroïdes) ou le traitement antibiotique des souris avant l'infection, comme il est pratiqué dans d'autres modèles murins de l'infection fongique8,9. À son tour, il permet d'étudier tout le spectre de la réponse immunitaire innée et adaptative contre Malassezia dans la peau normale. Il convient de noter que les souris de type sauvage consanguines conservées dans des conditions spécifiques exemptes d'agents pathogènes (FPS) ne sont pas naturellement colonisées par Malassezia et, par conséquent, leur exposition au champignon n'entraîne pas de colonisation persistante, mais est éliminée de l'hôte à l'intérieur environ 1,5 semaine. Cependant, le modèle permet d'étudier les mécanismes de l'initiation et de la régulation de la réponse de l'hôte antifongique qui, à son tour, est la base de la façon dont la mémoire immunitaire est générée. Le modèle est polyvalent en ce qu'il peut facilement être appliqué à une grande variété de souches de souris génétiquement modifiées et il peut être combiné avec d'autres modèles existants de maladies de la peau, tels que les modèles de carence en barrière, pour étudier l'impact de Malassezia sous conditions pathologiques et inflammatoires de la peau7. Par conséquent, le modèle décrit de l'infection expérimentale de peau de Malassezia chez les souris fournit un degré élevé de flexibilité pour étudier l'interaction du champignon avec le système immunitaire de peau dans le contexte de l'homéostasie et de la maladie.
Ce protocole décrit l'infection cutanée expérimentale de souris atteintes de Malassezia spp. En raison de son potentiel pathogène, Malassezia spp. sont classés comme pathogènes BSL2 dans certains pays, y compris la Suisse. Veuillez consulter les directives locales et suivre les règlements des autorités locales. Les organismes classés BSL2 devraient être manipulés par du personnel qualifié dans le cadre d'un cabinet de biosécurité certifié BSL2 ( BSC). Les déchets biologiques contaminés par des organismes classés BSL2, ainsi que les carcasses de souris infectées par ces organismes devraient être autoclaved avant l'élimination. Pour les expériences avec des souris, tous les efforts doivent être faits pour minimiser la souffrance et assurer les normes éthiques et humaines les plus élevées selon les principes 3R (remplacer, affiner, réduire)10. Les expériences décrites dans ce protocole ont été menées avec M. pachydermatis (ATCC 14522), M. furfur (ATCC 14521) et M. sympodialis (ATCC 42132)7.
Protocol
Toutes les procédures décrites dans ce protocole ont été effectuées conformément à l'ordonnance sur la manipulation des organismes dans les systèmes contenus de l'Office fédéral de l'environnement, en Suisse (www.bafu.admin.ch). Les expériences sur la souris ont été menées dans le strict respect des directives de la Loi suisse sur la protection des animaux et ont été réalisées selon les protocoles approuvés par l'Office vétérinaire du canton de Zurich, en Suisse (numéro de licence 168/2018).
1. Cultivation de Malassezia dans des conditions de laboratoire
REMARQUE : Conservez tous les réactifs et les supports utilisés pour ce protocole à température ambiante (RT, 20 à 25 oC) sauf indication contraire, car la température plus basse peut inhiber la croissance fongique.
- Préparer le liquide modifié Dixon (mDixon) milieu pour la croissance Malassezia. Pour préparer 500 mL de mDixon liquide, dissoudre 18 g d'extrait de malt, 10 g de bile de bœuf desséchée, 5 mL de tween-40, 3 g de peptone, 1 mL de glycérol et 1 mL d'acide oleique en 500 ml distillé H2O (dH2O). Ajuster le milieu à pH 6 avec HCl et autoclave. Stockez le support chez RT.
- Préparer les plaques d'agar mDixon en ajoutant 7,5 g d'agar à 500 mL mDixon moyen avant l'autoclacage. Refroidir lentement l'agar mDixon après l'autoclacage à l'aide d'une barre de direction et d'une plaque de chauffage magnétique pour éviter une solidification partielle du milieu pendant le refroidissement.
- Une fois que l'agar a refroidi jusqu'à 50 à 60 oC, distribuez le liquide dans les plats Petri dans une hotte à écoulement laminaire et laissez-les sécher à RT pendant la nuit.
REMARQUE : Les plaques d'agar peuvent être stockées à 4 oC pendant plusieurs semaines lorsqu'elles sont enveloppées et conservées à l'envers pour éviter l'évaporation. - Obtenir malassezia isole et raviver les stocks lyophilisés de Malassezia selon les instructions obtenues par le fournisseur.
- Inoculer 10 ml de mDixon liquide dans un flacon erlenmeyer stérile de 100 mL avec la suspension Malassezia relancée selon les instructions obtenues par le fournisseur. Incuber la culture dans un incubateur secouant à 30 oC et 180 tr/min.
- Inspectez régulièrement la croissance de la culture Malassezia en vérifiant l'apparence de la couleur crème et de la turbidité. La cinétique de croissance dépend de l'espèce et de la souche de Malassezia et peut être particulièrement lente lorsque Malassezia est fraîchement réanimé d'un stock lyophilisé. (Figure 1A).
- Préparer les stocks de glycérol en mélangeant 3 parties de la culture De Malassezia densément cultivée dans le milieu mDixon avec 1 partie de glycérol stérile à 99 %. Aliquot le mélange Malassezia/glycéroldans des tubes à bouchons à vis stériles et stocker à -80 oC.
- Pour la propagation in vitro, plaqueZ Malassezia de la culture liquide dans mDixon ou du stock de glycérol congelé sur une plaque d'agar mDixon (apportée à RT à partir de 4 oC) à l'aide d'une boucle d'inoculation.
REMARQUE : Transférer les plaques d'agar mDixon à RT à partir de 4 oC avant l'utilisation, puisque l'agar mDixon froid inhibe la croissance fongique. - Incuber la plaque d'agar (s) avec Malassezia à l'envers dans un incubateur (non-secouant) à 30 oC. Inspecter régulièrement la croissance des colonies de Malassezia.
REMARQUE : Les colonies de Malassezia sur les plaques d'agar de mDixon apparaissent dans les 3 à 5 jours et sont ternes de couleur crème, lisses avec l'élévation convexe (figure 1B). - Stockez les colonies de Malassezia sur des plaques d'agar mDixon à RT pendant 2 semaines. Par la suite, préparer une nouvelle plaque d'agar mDixon en striant Malassezia du stock de glycérol congelé tel que décrit dans 1.7.
2. Préparation de l'inoculum pour l'infection expérimentale de Malassezia des souris
- Inoculer 10 ml de mDixon liquide dans un flacon erlenmeyer stérile de 100 ml avec 3 à 5 colonies individuelles de Malassezia à partir d'une plaque d'agar mDixon (voir l'étape 1, Figure 1B).
- Incuber la culture Malassezia pour 48 à 96 h à 30 oC et 180 tr/min jusqu'à ce que la culture soit de couleur crème et turbide(figure 1A).
REMARQUE : Le temps nécessaire à la croissance de Malassezia dépend de l'espèce et de la souche Malassezia et de la quantité de champignons utilisés pour l'inoculation. - Transférer 2 ml de la culture Malassezia dans un tube stérile de 2 mL de microcentrifuge et une centrifugeuse pendant 1 min à 10 000 x g.
- Jeter le supernatant et laver le granule en le suspendant dans 1 ml de solution de sel tamponnée au phosphate (PBS). Centrifugeuse à nouveau pendant 1 min à 10 000 x g.
- Après le lavage, suspendre la pastille dans 1 ml de PBS par tuyauterie vigoureuse et mesurer la densité optique de la solution à 600 nm (ODA600) à l'aide d'un spectromètre. Diluer la suspension Malassezia 20 à 50 x avec PBS pour la mesure OD pour s'assurer que la lecture se situe entre 0,1 et 1.
REMARQUE : La densité d'une culture de Malassezia de 3 jours varie généralement entre 15 et 30 ODA600, selon l'espèce et la souche de Malassezia et sur le nombre de cellules de levure utilisées pour l'inoculation de la culture (étape 2.1). Malassezia a tendance à former des agrégats, par conséquent, un tuyauterie vigoureux est nécessaire pour assurer l'homogénéité de la suspension. - Aliquot un volume de la suspension Malassezia en PBS qui correspond à une densité de 4 ODA600 dans un tube stérile de 2 ml. Préparer 1 tube par animal à infecter.
- Centrifuger les tubes contenant Malassezia pendant 1 min à 10 000 x g.
- Jeter le supernatant et suspendre le granule de Malassezia dans 200 l d'huile d'olive indigène (correspondant à 2 cellules de levure ODA600/100 'l huile d'olive).
REMARQUE: L'huile d'olive s'est avérée être un bon véhicule pour l'infection épicutanée avec Malassezia, comme Malassezia est une levure lipophile et lipidique-dépendante. L'huile d'olive est mieux absorbée par la peau que le PBS. Cependant, sachez qu'il n'est pas facile de suspendre Malassezia à l'huile d'olive. Améliorer la suspension Malassezia/huiled'olive par vortex. Gardez la suspension à RT jusqu'à ce qu'elle soit utilisée pour l'infection. - Préparer les tubes avec de l'huile d'olive seul pour l'infection simulée des animaux témoins.
3. Infecter des souris avec Malassezia
- Commandez des souris femelles C57BL/6 à l'âge de 6 à 8 semaines et laissez-les s'acclimater dans l'établissement animalier expérimental pendant au moins une semaine. Calculez pour 3 - 5 souris par groupe, y compris un groupe témoin non infecté.
- Préparer un cocktail anesthésique stérile contenant 1,3 mg/mL de xylazine et 6,5 mg/mL de kétamine dans PBS. 5 ml du cocktail anesthésique suffit à anesthésier 20 animaux. Ajuster le volume du cocktail en fonction du nombre d'animaux à anesthésier.
- Anesthésiez les animaux en injectant 10 l/g de poids corporel anesthésique intrapéritone (correspondant à 65 mg de kétamine et 13 mg de Xylazine par kg) et placez les animaux anesthésiés sur un coussin chauffant à 37 oC.
REMARQUE : À la dose indiquée, les animaux restent habituellement anesthésiés pendant 30 à 60 min.
- Anesthésiez les animaux en injectant 10 l/g de poids corporel anesthésique intrapéritone (correspondant à 65 mg de kétamine et 13 mg de Xylazine par kg) et placez les animaux anesthésiés sur un coussin chauffant à 37 oC.
- Vérifiez les réflexes en pinçant le pied arrière avec des forceps pour s'assurer que les animaux sont entièrement anesthésiés.
- Appliquer une crème pour les yeux sur les yeux pour prévenir la déshydratation pendant l'anesthésie.
- En option, mesurer l'épaisseur de l'oreille des deux oreilles à l'aide d'un étrier (0 à 5 mm de portée). Mesurez deux zones différentes de chaque oreille et calculez l'épaisseur moyenne de l'oreille par oreille.
REMARQUE : La mesure de l'épaisseur de l'oreille est facultative et dépend de la question de recherche. Cependant, si l'épaisseur de l'oreille est utilisée comme une lecture pour l'inflammation de la peau, il est nécessaire de mesurer l'épaisseur de l'oreille de base avant l'infection. (voir étape 4). - Optionnellement, perturber la barrière épidermique de la peau de l'oreille dorsale par un léger décapage du ruban adhésif : appliquez manuellement un petit morceau de ruban adhésif sur la peau et retirez-la à nouveau. Répéter l'opération pendant 5 tours consécutifs à l'aide d'un morceau de ruban adhésif frais pour chaque tour.
REMARQUE : La malassezie induit une inflammation de la peau plus prononcée dans la peau perturbée par la barrière par rapport à la peau non perturbée (Figure 2A)7. - Appliquer topiquement 100 oL (2 ODA600) de la suspension À l'huile d'olive Malasseziasur le côté dorsal de chaque oreille à l'aide d'une pipette stérile. Inclure un groupe témoin d'animaux qui sont traités avec de l'huile d'olive seulement (groupe témoin traité par véhicule).
REMARQUE : Vortex la suspension Malassezia/huile d'olive vigoureusement pour assurer une suspension homogène de Malassezia immédiatement avant l'application. - Laissez les animaux anesthésiés sur le coussin chauffant pour éviter l'hypothermie jusqu'à ce qu'ils montrent des signes de rétablissement (mouvement de la moustache, augmentation du taux de respiration, etc.).
- Injecter 200 L de solution de glucose stérile et pré-chauffée de 2 % sous-cutanée dans le pli nucal pour soutenir leur métabolisme et leur réhydratation.
REMARQUE : Pour préparer une solution stérile de 2 % de glucose, dissoudre 1 mg de glucose dans 50 ml de PBS et filtrer à l'aide d'un filtre de 0,2 m. La solution peut être stockée à 4 oC. - Retransférer les animaux dans leur cage.
4. Analyse de Malassezia-inflammation cutanée induite
REMARQUE : Cette procédure décrit l'analyse de malassezia-induitle gonflement d'oreille pendant l'infection qui sert de paramètre de l'inflammation de peau. Une condition préalable pour analyser l'enflure induite par le champignon d'oreille est de mesurer l'épaisseur de base d'oreille avant le décapage de bande et/ou l'infection (étape 3.5).
- Préparer la chambre isoflurane pour l'anesthésie à court terme des animaux malassezia-infectéset contrôler.
- Transférer un animal à la fois à la chambre et attendre que l'animal soit entièrement anesthésié.
REMARQUE : Les signes d'une bonne anesthésie comprennent une relaxation complète du corps ainsi qu'une respiration lente et lourde (flank). Surveiller attentivement l'anesthésie car une exposition prolongée à l'isoflurane peut être fatale. - Retirer l'animal de la chambre et le placer sur un mouchoir.
- Mesurer l'épaisseur de l'oreille à l'aide d'un étrier (gamme 0 à 5 mm). Mesurez deux zones différentes de chaque oreille et calculez l'épaisseur moyenne par oreille (voir l'étape 3.5).
- Transférer l'animal dans la cage.
REMARQUE : L'anesthésie d'isoflurane est de très courte durée, et les animaux récupèrent dans les 30 s après l'enlèvement de la chambre d'isoflurane. - Calculez l'augmentation de l'épaisseur de l'oreille en soustrayant l'épaisseur moyenne de l'oreille de base, mesurée avant le décapage du ruban adhésif et/ou l'infection, à partir de l'épaisseur moyenne de l'oreille mesurée à chaque moment après l'infection.
- Tracer les valeurs calculées comme l'augmentation de l'épaisseur de l'oreille ou, subsidiairement, comme l'épaisseur totale de l'oreille au fil du temps pour chaque animal ou groupe d'animaux (Figure 2B).
5. Analyse du fardeau fongique dans la peau infectée
- Préparer un tube de microcentrifuge sterile de 2 ml pour chaque oreille à récolter, contenant 0,5 mL de NP40 stérile 0,05% en dH2O et une boule d'acier autoclaved (5 mm de diamètre).
- Pesez les tubes à l'aide d'un équilibre de précision et notez le poids précis.
- Euthanasier les souris par asphyxie au CO2.
- Retirez l'oreille à la base et transférez-la dans le tube contenant 0,5 ml de NP40 stérile de 0,05 % en dH2O, tel que décrit dans les étapes 5.1 - 5.2.
- Peser le tube contenant le tissu auditif et calculer le poids réel de chaque échantillon en soustrayant le poids du tube sans l'organe du poids du tube avec l'organe.
- Homogénéiser le tissu auditif pendant 6 min à 25 Hz à l'aide d'un homogénéisateur tissulaire. Assurez-vous que le tissu est bien homogénéisé.
- Plaque 100 'L de chaque échantillon (correspondant à 1/5 de chaque homogénéisme, facteur de dilution 5) sur les plaques d'agar mDixon et incuber les plaques à l'envers dans un incubateur de 30 oC.
REMARQUE : La quantité d'homogénéisation plaquée doit être ajustée en fonction de la charge fongique à prévoir. Assurez-vous d'enfaire suffisamment d'homogénéité pour obtenir au moins 10 colonies et pas plus de 250 colonies par assiette pour permettre un recensement facile. Optionnellement, plaquer plusieurs plaques par échantillon avec différentes dilutions d'homogénéisation. - Inspecter régulièrement la croissance des colonies de Malassezia.
REMARQUE : Les colonies deviennent généralement visibles après 2 à 3 jours. Le temps nécessaire à la croissance des colonies de Malassezia dépend de l'espèce et de la souche de Malassezia. - Comptez les colonies par assiette.
- Calculez le nombre de tissus CFU/g en utilisant la formule suivante :
CFU/g tissu - (nombre de colonies/plaque) x (facteur de dilution) / (poids de l'échantillon de peau en g).
REMARQUE : La limite minimale approximative de détection peut être évaluée à l'aide de la formule suivante : limite minimale de détection (1 colonie/plaque) x (facteur de dilution) / (poids moyen de tous les échantillons de peau en g). - Les charges fongiques sont généralement tracées à l'échelle logarithmique (figure 2C).
Representative Results
Culture in vitro de Malassezia
Comparé à d'autres pathogènes de modèle fongique s'habitués plus couramment utilisés tels que C. albicans ou A. fumigatus, Malassezia est plus difficile à culture in vitro. Cela peut être attribué au fait que Malassezia s'appuie sur des sources de lipides exogènes pour ses besoins nutritionnels, en raison de son incapacité à synthétiser les acides gras11. Le milieu mDixon est adapté pour la culture de plusieurs espèces de Malassezia dont M. pachydermatis, M. furfur, M. sympodialis, M. slooffiae, M. globosa et M. yamatoensis in vitro7 ,12. La figure 1 montre des images représentatives de la croissance de M. sympodialis dans le milieu mDixon liquide et sur l'agar mDixon tel que décrit à l'étape 1 et à l'étape 2.
Analyse de l'inflammation de la peau et du fardeau fongique de l'inflammation de la peau Malassezia
L'exposition de Malassezia à la peau d'oreille de souris qui a été barrière perturbée par le ruban adhésif avant l'infection a comme conséquence l'inflammation exacerbée de la peau, caractérisée par l'hyperplasie épidermique et cutanée et le développement de l'oedème7. Les étapes 4 et 5 décrivent les méthodes d'analyse de l'enflure de l'oreille induite par Malasseziaet le fardeau fongique de la peau. Les deux paramètres représentent des réadmissions clés pour surveiller le cours de l'infection. La figure 2A illustre l'augmentation de l'épaisseur de l'oreille qui peut être observée après l'exposition de M. furfur à la peau qui a été barrière-perturbée comparée à la peau non perturbée des souris de WT C57BL/6. La figure 2B montre un graphique récapitulatif représentatif de l'augmentation de l'épaisseur de l'oreille au fil du temps. Figure 2C affiche le fardeau fongique dans la peau de l'oreille le jour 2 après l'infection par M. pachydermatis.
Figure 1 : Culture in vitro de Malassezia.
(A) M. sympodialis souche ATCC 42132 cultivé pendant 3 jours à 30 oC et 180 tr/min dans le milieu mDixon liquide (à gauche) à côté d'un flacon de contrôle Erlenmeyer contenant mDixon milieu qui n'a pas été inoculé (à droite). (B) Colonies de M. sympodialis souche ATCC 42132 sur l'agar mDixon après 5 jours d'incubation à 30 oC. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Analyse de l'infection cutanée de Malassezia sur la base de l'épaisseur de l'oreille et du fardeau fongique.
(A) Histologie des sections d'oreilles obtenues à partir de souris C57BL/6 qui ont été traitées à l'huile d'olive (véhicule, gauche) ou infectées par la souche De furfur JPLK23 pendant 5 jours (milieu et droite). Sur la droite, la peau d'oreille a été scotchée avant l'infection. Les sections ont été tachées d'hématoxylin et d'éosine (H et E). (B) Graphiques sommaires montrant l'augmentation de l'épaisseur de l'oreille au fil du temps pour les souris C57BL/6 qui ont été exposées à Malassezia ou laissées non infectées comme témoins. L'épaisseur absolue de la souche M. pachydermatis ATCC 14522-exposée ou traitée par véhicule peau d'oreille à chaque moment est affiché sur la gauche; l'augmentation de l'épaisseur de l'oreille aux points de temps indiqués par rapport à la ligne de base le jour 0 est indiquée sur la droite. (C) Charge fongique dans la peau des souris C57BL/6 qui ont été infectées par la souche M. pachydermatis ATCC 14522 ou traitées avec de l'huile d'olive comme un contrôle (véhicule). Dans les deux cas, la peau a été rayée de ruban adhésif. Chaque symbole dans les graphiques graphiques B et C représente un animal. L'importance statistique des différences entre les groupes a été calculée à l'aide de l'ANOVA à sens unique (B) ou du test t de l'étudiant (C). p 'lt;0.001, 'p 'lt;0.0001, D.L.: Limite de détection S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Discussion
Ce protocole décrit l'infection de la peau de la souche de souris consanguine couramment utilisée C57BL/6 par Malassezia spp. Adapter ce protocole à d'autres souches de souris ayant un bagage génétique différent (p. ex. Balb/c) ou à une souris génétiquement modifiée. les souches peuvent avoir besoin d'ajustement de la dose d'infection, du point de temps de l'analyse, etc. Pour assurer la reproductibilité, les groupes de souris doivent toujours être du même âge et du même sexe. La source des souris doit rester stable, car même de légers changements dans le contexte génétique et des différences dans le microbiote, qui existent entre les fournisseurs et peuvent exister même entre les différentes unités d'une seule installation de reproduction, peuvent avoir un impact imprévisible sur le cours de l'infection. Lors de la mise en place du modèle d'infection de Malassezia décrit dans ce protocole, il est conseillé d'effectuer une étude pilote pour surveiller attentivement le cours de l'infection, y compris l'étendue de la colonisation, la cinétique du dégagement fongique et le degré de inflammation et pathologie qui pourraient être induites (p. ex., si la peau de l'oreille est perturbée par la barrière avant l'infection) afin de déterminer les conditions optimales d'analyse.
Afin d'assurer la reproductibilité et de détecter de manière fiable les différences entre les groupes expérimentaux, le nombre d'animaux utilisés par groupe doit être calculé sur la base de l'analyse statistique. La taille de l'échantillon est calculée en fonction de la taille de l'effet, du taux d'erreur et de la puissance, qui tiennent compte des variations biologiques et expérimentales (p. ex., en raison de la variation du système immunitaire). Pour des raisons éthiques, évitez d'utiliser un nombre inutilement élevé d'animaux. En ce qui concerne l'infection cutanée Malassezia, le traitement d'une seule oreille avec le champignon et l'utilisation de l'autre oreille comme un contrôle au sein de la même souris, n'est pas conseillé parce que les souris peuvent propager le champignon aux deux oreilles lors du toilettage. Cependant, l'utilisation d'une demi-oreille pour différentes sorties méthodologiques telles que la détermination de la charge fongique, l'isolement des cellules immunitaires ou l'analyse histologique est souvent suffisant et entraîne une réduction significative du nombre d'animaux utilisés pour les expériences.
18 espèces différentes de Malassezia ont été décrites à ce jour. Les variations inter-espèces et intraspécifiques au sein du genre Malassezia peuvent affecter l'interaction avec l'hôte, comme nous l'avons également appris d'études sur d'autres champignons pathogènes humains13. Différentes espèces et souches de Malassezia diffèrent par leur origine (p. ex., M. pachydermatis est l'espèce la plus fréquente isolée des animaux, tandis que M. restricta, M. globosa et M. sympodialis sont les plus membres éminents du microbiome de peau fongique chez l'homme avec la distribution variable de ces espèces entre différentes zones de peau). Certaines espèces ont été associées au commensalisme, tandis que d'autres sont considérées comme plus pathogènes, bien que les preuves détaillées restent relativement faibles. Fait important, certaines espèces et souches sont intrinsèquement plus difficiles à cultiver que d'autres. Ainsi, la décision de l'espèce/souche à utiliser pour l'infection doit être fondée sur la question de la recherche.
L'infection expérimentale de la peau murine avec certains organismes microbiens tels que Candida albicans ou Staphylococcus aureus nécessitent la perturbation de la barrière épidermique avant l'infection, par exemple, avec du papier de sable14, 15,16. En revanche, le modèle de l'infection de Malassezia décrit ici est également efficace avec et sans perturbation de barrière7. Le degré d'inflammation induit par le champignon est massivement amélioré si la peau est dépouillée avant l'infection7. Par conséquent, si la peau doit être manipulée avant l'application de Malassezia dépend de la question de recherche. Divers modèles d'inflammation chronique et aigue de la peau (p. ex., modèles d'hypersensibilité de type retardé (DTH) et d'hypersensibilité au contact (SCH)) et de modèles d'insuffisance de barrière qui peuvent être d'intérêt pour étudier la contribution de la levure commensal aux pathologies cutanées.
Les souris consanguines maintenues dans des conditions spécifiques exemptes d'agents pathogènes (SPF) ne sont pas (à notre connaissance) naturellement colonisées avec Malassezia. Par conséquent, l'application expérimentale de Malassezia à la peau de l'oreille de la souris représente une exposition primaire au champignon qui induit une réponse aigue chez l'hôte, qui à son tour conduit à un dégagement fongique dans les 1 - 2 semaines7. Alors que le modèle décrit dans ce protocole ne reflète donc que partiellement la situation chez les humains immunocompétents ou d'autres organismes hôtes qui sont colonisés en permanence avec Malassezia, l'infection expérimentale permet une fenêtre ample de l'occasion d'étudier l'immunité antifongique et les mécanismes cellulaires et moléculaires qui sous-tendent cette réponse. Il permet également d'étudier les variations dans la réponse à différentes espèces et souches de Malassezia dans différentes conditions expérimentales (par exemple, avec et sans perturbation de barrière de la peau).
L'étude de Malassezia - interactions hôtes ont été limitées dans le passé à des expériences in vitro avec des types de cellules isolées dans les cultures (par exemple, les lignées cellulaires de kératinocytes, PBMCs). Bien que ces études aient mis en lumière les déterminants fongiques et hôtes qui façonnent l'interaction entre Malassezia et l'hôte17, elles ne permettent pas d'acquérir une compréhension complète du champignon - l'interaction hôte dans le complexe l'environnement de la peau, qui implique de multiples types de cellules qui sont en communication constante, tels que les kératinocytes, les fibroblastes et les cellules immunitaires résident esparent des tissus, mais aussi les populations de leucocytes qui n'infiltrent le tissu qu'à la rencontre microbienne de la Peau. Ce réseau multicellulaire ne peut pas être entièrement reproduit dans les modèles in vitro, même avec la plupart des systèmes organoïdes avancés. Ainsi, l'infection expérimentale des souris représente toujours l'étalon-or dans la recherche sur l'immunologie et les maladies infectieuses, et la disponibilité du modèle décrit ici représente une percée dans le domaine de la recherche Malassezia. Fait important, ce modèle repose sur l'application épicutanée de Malassezia sur la peau de l'oreille de souris par ailleurs non perturbée, et il n'implique pas l'inoculation du champignon par injection dans le tissu, par exemple, sous-cutanée ou par voie intrapéritone, comme des études antérieures ont rapporté18, qui sont tous deux plus éloignés de la situation dans les hôtes naturellement colonisés.
La possibilité de combiner le modèle de l'infection de Malassezia décrit dans ce protocole avec d'autres modèles de souris disponibles augmente considérablement la portée et la flexibilité de l'application. Ces derniers comprennent divers modèles de troubles spécifiques de la peau, tels que le modèle de carence en barrière qui imite les caractéristiques importantes de la dermatite atopique, une maladie associée à La Malassezia chez les humains et les chiens. En outre, l'infection épicutanée de la peau par Malassezia peut facilement être appliquée à des souris présentant des défauts génétiques dans les gènes hôtes d'intérêt, ou à des souris dans lesquelles un type cellulaire d'intérêt est génétiquement supprimé ou peut être épuisé par la pharmacologie (par exemple, par des moyens de l'administration de la toxine de diphtérie dans les souris récepteurs de la diphtérie). Ces modèles représentent un outil inévitable pour disséquer la réponse de l'hôte aux microbes commensal et pathogènes, y compris Malassezia, et pour évaluer le rôle de ces gènes et le type de cellule dans l'interaction champignon-hôte. Les analyses de l'interaction peau Malassezia-hôtepeuvent être étendues bien au-delà de ce qui est décrit dans ce protocole. Il s'agit notamment d'analyses par histologie (p. ex., pour déterminer le degré de pathologie cutanée ou l'épaississement épidermique induit par le champignon), par l'immunohistochimie ou la coloration immunofluorescente des sections tissulaires à l'aide d'anticorps dirigés contre le type cellulaire. marqueurs spécifiques ou d'autres molécules d'intérêt. Il peut également impliquer l'isolement des cellules (par exemple, les sous-ensembles de loucoocytes infiltrants de tissu ou de tissu-infiltrant) du tissu cutané infecté pour étudier la polarisation, la régulation, et la dynamique de la réponse immunitaire à Malassezia en profondeur.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par l'Université de Zurich, en Suisse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | |
| Attane Isoflurane | Piramal Healthcare | - | |
| Biosaftey cabinet (BSC) Faster Ultra Safe | DASIT GROUP | TEC 5594 | BSL2 certified |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415D | compatible with 2ml Eppendorf tubes |
| Dessicated Ox-bile | Sigma-Aldrich | 70168-100G | |
| Eppendorf Tubes (2 ml) | Eppendorf | 0030 120.094 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 49159-5KG | |
| Gylcerol (99 %) | Honeywell | 10314830 | |
| Heating pad | Eickenmeyer | 648048 | |
| Incubator Hereaus B20 | Heraeus | 412047753 | BSL2 certified |
| Ketasol (100 mg) | Graeub AG | 6680416 | |
| Magentic heating plate MR Hei-Standard | Heidolph Instruments | 442-1355 | |
| Malassezia spp. | ATCC | 14522, 14521, 42132 | |
| Malt extract | Sigma-Aldrich | 70167-500G | |
| Multiply Biosphere Tubes (200 µl) | Sarstedt AG | 7084211 | Safelock |
| Native olive oil | - | - | commerc. available |
| Nonidet P40 | Axon Lab | A1694,0250 | |
| Oditest measurment devise | Kroeplin | S0247 | range 0-5 mm |
| Oleic Acid | Sigma-Aldrich | 75090-5ML | |
| Peptone | Oxoid | LP0037 | |
| Petri dishes | Sarstedt AG | 82.1473 | |
| Phosphat buffered salt solution (PBS, 1x) | Amimed/Bioconcept | 3-05F39 | |
| Rompun (2 %) | Bayer | KP0BFHR | |
| Shaking incubator Infors Minitron | Infors | - | BSL2 certified |
| Spectrometer | Jenway | 20308 | optical density measurement at 600nm |
| Spectrometer Cuvettes | Greiner Bio-One | 613101 | |
| Stainless Steel balls (5mm) | ABF | KU.5G80 1.3541 | |
| Syringes 1 ml Sub-Q | BD Bioscience | 305501 | |
| Tissue Lyzer II | Quiagen | 85300 | |
| Transpore Hypoallergic Tape | 3M | 1527-1 | |
| Tween 40 | Sigma-Aldrich | P1504-100ML | |
| Vitamin A Retinoli Palmitas Eye Cream | BAUSCH & LOMB | commerc. available |
References
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