Summary
Dit protocol schetst de oprichting van een muismodel voor het bestuderen van Malassezia-host interacties in de huid. Het beschrijft de teelt van Malassezia in vitro, de infectie van de murinehuid met Malassezia, en de daaropvolgende analyse van de ontsteking en de schimmel last in het huid weefsel.
Abstract
Diermodellen zijn cruciaal voor onderzoek naar besmettelijke ziekten. Ze vormen een belangrijke basis voor het analyseren van het volledige spectrum van interacties tussen microben en hun gastheer in vivo op een weefsel-specifieke manier. Pathogene schimmels worden steeds meer erkend als een ernstige bedreiging voor de mens en exploiteren van dergelijke infectie modellen hebben sterk verbeterd ons begrip van schimmel pathogeniteit. Soorten van het geslacht Malassezia zijn de meest voorkomende schimmels van de menselijke huid microbiota en ze zijn ook geassocieerd met de ontwikkeling van ernstige inflammatoire huidaandoeningen zoals Seborrheic dermatitis en atopische dermatitis. Echter, een causatieve verbinding tussen Malassezia en ziekte pathogenese blijft onbekend, een feit dat kan worden toegeschreven aan de slechte kennis van de complexe Overspraak van Malassezia met het huid immuunsysteem. Dit protocol beschrijft de oprichting van een experimenteel muismodel waarmee de interactie van Malassezia met de huid van zoogdieren in vivo kan worden bestudeerd. Het schetst de methode voor het cultiveren van Malassezia spp. onder laboratoriumomstandigheden, hoe de Murine huid te infecteren met Malassezia spp. en hoe de uitkomst van de infectie te beoordelen door middel van de huidontsteking en schimmel last analyses. Het hier beschreven model werkt in volledig immunocompetente dieren en is niet afhankelijk van immuun suppressieve of antibiotica voor behandeling van de dieren. Het is bovendien aanpasbaar aan vrijwel alle genetisch gemodificeerde muizenstammen en kan worden gecombineerd met andere huidziekte modellen. Deze functies maken deze infectie model een zeer krachtige tool voor het bestuderen van gedetailleerd de aangeboren en adaptieve immuunrespons van de gastheer tegen Malassezia in de huid in vivo.
Introduction
De huid wordt bevolkt door veel verschillende microben. De constante blootstelling van de huid aan de microbiota draagt bij aan het vorm geven en opleiden van het immuunsysteem van de gastheer. Schimmels worden steeds meer erkend als een vitaal onderdeel van de microbiota en ze vervullen een belangrijke rol voor de gastheer fysiologie en immuniteit, vergelijkbaar met bacteriën en virussen1. Soorten van het geslacht Malassezia zijn veruit de meest overvloedige schimmels die de huid van warmbloedige gewervelde dieren koloniseren en ze maken meer dan 90% van de menselijke huid mycobiome2,3. Achttien verschillende soorten Malassezia zijn tot nu toe geïdentificeerd op de huid van mens en dier4.
Er wordt gedacht dat verschillende pathologieën van de huid, althans gedeeltelijk, ontstaan als gevolg van een disevenwichtige microbiota-samenstelling. Dysbiose kan leiden tot de overmatige groei van soorten met pathogene potentieel resulterend in opportunistische infecties en ziekte5. Consequent is er een toenemend bewijs dat Malassezia, naast zijn commensaal Lifestyle, bijdraagt aan de ontwikkeling van verschillende huid pathologieën, variërend van roos en pityriarsis versicolor tot ernstigere ontstekings stoornissen zoals Als Seborrheic dermatitis en atopische dermatitis4,6. Terwijl een causatieve verbinding tussen Malassezia en pityriarsis versicolor is vastgesteld, blijft de pathofysiologische rol van de schimmel in ernstigere huid pathologieën grotendeels onbekend.
Het bepalen van de rol van Malassezia in de huid homeostase en ziekte vraagt om meer diepgaande kennis over de interactie van de schimmel met de huid en het cutane immuunsysteem. Van nota, onderzoek naar Malassezia is, in vergelijking met andere menselijke schimmel pathogenen (bijvoorbeeld Candida albicans of Aspergillus fumigatus), nog steeds in de beginnende fase. Dit kan worden toegeschreven aan de moeilijkheid in de teelt van Malassezia onder laboratoriumomstandigheden en het ontbreken van geschikte experimentele modellen voor het bestuderen van de schimmel in contact met de gastheer in vivo. Eerdere experimenten met geïsoleerde cellen in de cultuur gaven een breed scala aan directe en indirecte interacties tussen Malassezia en verschillende immuuncellen en niet-immuuncel7. Echter, deze in vitro experimenten slechts gedeeltelijk recapituleren de situatie van de complexe huid omgeving in vivo waar tal van cellulaire en moleculaire gebeurtenissen optreden gelijktijdig tussen de schimmel en verschillende celtypen.
Hierin schetsen we het protocol voor een experimenteel model van Malassezia huidinfectie bij muizen, die we onlangs hebben vastgesteld, om de schimmel-host-interactie in vivo7te bestuderen. Dit omvat procedures voor (1) de succesvolle teelt van Malassezia in vitro, (2) de epicutane toepassing van Malassezia op de muriene oorhuid, en (3) de technische details van het analyseren van de Malassezia-geïnduceerde huid ontsteking en de schimmel last van de geïnfecteerde huid. Belangrijk is dat dit model niet afhankelijk is van immunosuppressie (bijv. door corticosteroïden) of antibioticabehandeling van muizen voorafgaand aan de infectie, aangezien het wordt beoefend in andere Muismodellen van schimmelinfectie8,9. Op zijn beurt maakt het het mogelijk om het volledige spectrum van de aangeboren en adaptieve immuunrespons tegen Malassezia in de normale huid te bestuderen. Van nota, ingeteelde wilde muizen die onder specifieke pathogeen-vrije (SPF) condities worden gehouden, worden niet natuurlijk gekoloniseerd met Malassezia en daarom leidt hun blootstelling aan de schimmel niet tot aanhoudende kolonisatie, maar wordt deze van de gastheer binnen ongeveer 1,5 weken. Echter, het model maakt het mogelijk voor het bestuderen van de mechanismen van schimmelwerende gastheer respons initiatie en regulering die, op zijn beurt, is de basis van hoe immuun geheugen wordt gegenereerd. Het model is veelzijdig omdat het gemakkelijk kan worden toegepast op een breed scala aan genetisch gemodificeerde muizenstammen en het kan worden gecombineerd met andere bestaande huidziekte modellen, zoals modellen van barrière deficiëntie, om de impact van Malassezia te bestuderen onder pathologische en inflammatoire huidaandoeningen7. Daarom biedt het beschreven model van experimentele Malassezia huidinfectie bij muizen een hoge mate van flexibiliteit om de interactie van de schimmel met het huid immuunsysteem in de context van homeostase en ziekte te onderzoeken.
Dit protocol beschrijft de experimentele huidinfectie van muizen met Malassezia spp. vanwege zijn pathogene potentieel, Malassezia spp. worden geclassificeerd als BSL2 pathogenen in sommige landen, met inbegrip van Zwitserland. Raadpleeg de lokale richtlijnen en volg de voorschriften van de lokale autoriteiten. BSL2 ingedeelde organismen moeten worden behandeld door opgeleid personeel onder een BSL2-gecertificeerde bioveiligheid Cabinet (BSC). Biologisch afval dat is verontreinigd met BSL2-ingedeelde organismen, alsmede karkassen van muizen die met dergelijke organismen zijn geïnfecteerd, moeten vóór de verwijdering worden geautoclaveerd. Voor experimenten met muizen moeten alle inspanningen worden gedaan om het lijden te minimaliseren en de hoogste ethische en humane normen te waarborgen volgens de 3R-principes (vervangen, verfijnen, verminderen)10. De in dit protocol beschreven experimenten werden uitgevoerd met m. marbofloxacine (ATCC 14522), m. furfur (ATCC 14521) en m. sympodialis (ATCC 42132)7.
Protocol
Alle in dit protocol beschreven procedures zijn uitgevoerd overeenkomstig de verordening betreffende de hantering van organismen in ingesloten systemen van het Federaal Bureau voor milieubeheer, Zwitserland (www.bafu.admin.ch). De muis experimenten werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de richtlijnen van de wet bescherming Zwitserse dieren en werden uitgevoerd onder de protocollen goedgekeurd door het Veterinair Bureau van het kanton Zürich, Zwitserland (licentienummer 168/2018).
1. teelt van Malassezia onder laboratoriumomstandigheden
Opmerking: Bewaar alle reagentia en dragers die voor dit protocol worden gebruikt bij kamertemperatuur (RT, 20 – 25 °C), tenzij anders vermeld, aangezien de lagere temperatuur de schimmelgroei kan remmen.
- Bereid de vloeibare gemodificeerde Dixon (mDixon) medium voor Malassezia groei. Om 500 mL vloeibaar mDixon medium te bereiden, Los 18 g moutextract op, 10 g drooghoudende Ox-gal, 5 mL tween-40, 3 g Peptone, 1 mL glycerol en 1 mL oliezuur in 500 mL gedistilleerd H2o (DH2o). Stel het medium in op pH 6 met HCl en autoclaaf. Bewaar het medium op RT.
- Bereid mDixon agar-platen door toevoeging van 7,5 g agar aan 500 mL mDixon medium voorafgaand aan autoclaven. Koel de mDixon agar langzaam af na Autoclaveren met behulp van een stuurstang en een magnetische verwarmingsplaat om gedeeltelijke stolling van het medium te voorkomen tijdens het afkoelen.
- Zodra de agar is afgekoeld tot 50 – 60 °C, breng de vloeistof dan in Petri schaaltjes in een laminaire stroom afzuigkap en laat ze 's nachts drogen bij RT.
Let op: de agar-platen kunnen gedurende enkele weken bij 4 °C worden bewaard wanneer ze worden verpakt en ondersteboven worden gehouden om verdamping te voorkomen. - Het verkrijgen van Malassezia isolaten en het herleven van gelyofiliseerde voorraden van Malassezia volgens de instructies verkregen door de aanbieder.
- Inoculeren 10 mL vloeibaar mDixon medium in een steriele 100 mL erlenmeyer met de heropvoede Malassezia suspensie volgens de instructies van de aanbieder. Incuberen de cultuur in een schud incubator bij 30 °C en 180 rpm.
- Inspecteer de groei van de Malassezia cultuur regelmatig door te controleren op de verschijning van crème kleur en troebelheid. De groei kinetiek is afhankelijk van de soort en de stam van Malassezia en kan bijzonder traag zijn wanneer Malassezia vers uit een gelyofiliseerd bestand wordt herleven. (Figuur 1A).
- Bereid de glycerol-voorraden door 3 delen van de dicht gekweekte Malassezia cultuur in mdixon medium te mengen met 1 deel van steriele 99% glycerol. Aliquot het Malassezia/glycerol mengsel in steriele schroefdop buizen en bewaren bij-80 °c.
- Voor in vitro vermeerdering, plaat Malassezia van de vloeibare cultuur in mdixon of van de bevroren glycerol kolf op een mdixon agar plaat (gebracht naar RT van 4 °c) met behulp van een inoculatie lus.
Opmerking: Breng mDixon agar-platen over naar RT vanaf 4 °C voorafgaand aan het gebruik, omdat de koude mDixon agar de schimmelgroei remt. - Incuberen de agar-plaat (en) met Malassezia ondersteboven in een (niet-schudden) incubator op 30 °c. Inspecteer de groei van Malassezia kolonies regelmatig.
Opmerking: Malassezia kolonies op mdixon agar-platen verschijnen binnen 3-5 dagen en zijn crèmekleurig saai, glad met bolle hoogte (Figuur 1B). - Bewaar Malassezia kolonies op mdixon agar-platen bij RT gedurende ~ 2 weken. Bereid daarna een nieuwe mdixon agar plaat voor met strepen Malassezia uit de bevroren glycerol kolf zoals beschreven in 1,7.
2. bereiding van het entmateriaal voor experimentele Malassezia infectie van muizen
- Inoculeren 10 mL vloeibaar mDixon medium in een steriele 100 mL erlenmeyer met 3-5 individuele Malassezia kolonies uit een mdixon agar plaat (zie stap 1, Figuur 1B).
- Inbroed de Malassezia -cultuur voor ~ 48 tot 96 uur bij 30 °c en 180 rpm tot de cultuur crèmekleurig is en troebel is (Figuur 1A).
NB: de tijd die nodig is voor de groei van Malassezia hangt af van de Malassezia soort en stam en de hoeveelheid schimmel die wordt gebruikt voor de inoculatie. - Breng 2 mL Malassezia cultuur over in een steriele micro centrifugebuis van 2 ml en Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 10.000 x g.
- Gooi het supernatant weg en was de pellet door het op te schorten in 1 mL fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Centrifugeer nogmaals gedurende 1 minuut bij 10.000 x g.
- Na het wassen, de pellet in 1 mL PBS onderbreken door krachtig pipetteren en meten van de optische dichtheid van de oplossing bij 600 nm (ODA600) met behulp van een spectrometer. Verdun de Malassezia -suspensie 20 – 50 x met PBS voor de OD-meting om te verzekeren dat de meting tussen 0,1 en 1 ligt.
Opmerking: de dichtheid van een 3-daagse cultuur van Malassezia varieert over het algemeen tussen 15 en 30 odA600, afhankelijk van de Malassezia soorten en stam en het aantal gistcellen dat wordt gebruikt voor de inoculatie van de cultuur (stap 2,1). Malassezia heeft de neiging om aggregaten te vormen, daarom is krachtig pipetteren noodzakelijk om de homogeniteit van de suspensie te garanderen. - Aliquot een volume van de Malassezia suspensie in PBS dat overeenkomt met een dichtheid van 4 odA600 in een steriele 2 ml buis. Bereid 1 buis per dier om besmet te zijn.
- Centrifugeer de buisjes met Malassezia gedurende 1 minuut bij 10.000 x g.
- Gooi de supernatant weg en onderbreek de Malassezia pellet in 200 μL inheemse olijfolie (overeenkomend met 2 odA600 gistcellen/100 μL olijfolie).
Opmerking: olijfolie bleek een goed voertuig te zijn voor de epicutane infectie met Malassezia, omdat Malassezia een lipofiele en lipide-afhankelijke gist is. Olijfolie wordt beter geabsorbeerd door de huid dan PBS. Houd er echter rekening mee dat het niet gemakkelijk is om Malassezia in olijfolie op te schorten. Verbeter de Malassezia/olijfolie suspensie door vortexing. Houd de suspensie op RT totdat deze wordt gebruikt voor infectie. - Bereid alleen buizen met olijfolie voor een mock infectie van de controledieren.
3. infecterende muizen met Malassezia
- Bestel vrouwelijke C57BL/6 muizen op een leeftijd van 6-8 weken en laat ze gedurende ten minste één week acclimatiseren in de experimentele dieren faciliteit. Bereken voor 3-5 muizen per groep, inclusief een niet-geïnfecteerde controlegroep.
- Bereid een steriele anestheticum cocktail met 1,3 mg/mL Xylazine en 6,5 mg/mL ketamine in PBS. 5 mL van de verdovings cocktail is genoeg om 20 dieren te verdoving. Pas het volume van de cocktail aan volgens het aantal dieren dat moet worden verdoeseerd.
- Verdoving dieren door het injecteren van 10 μL/g lichaamsgewicht van anestheticum cocktail intraperitoneaal (overeenkomend met 65 mg ketamine en 13 mg xylazine per kg lichaamsgewicht) en plaats de verdovings dieren op een verwarmingskussen bij 37 ° c.
Opmerking: bij de aangegeven dosis blijven dieren meestal verdoiliseerd voor ~ 30-60 min.
- Verdoving dieren door het injecteren van 10 μL/g lichaamsgewicht van anestheticum cocktail intraperitoneaal (overeenkomend met 65 mg ketamine en 13 mg xylazine per kg lichaamsgewicht) en plaats de verdovings dieren op een verwarmingskussen bij 37 ° c.
- Controleer de reflexen door de achterste voet te knijpen met een tang om te verzekeren dat de dieren volledig verdoken zijn.
- Breng een oogcrème op de ogen om uitdroging tijdens de anesthesie te voorkomen.
- Meet desgewenst de oordikte van beide oren met behulp van een Remklauw (0-5 mm bereik). Meet twee verschillende delen van elk oor en bereken de gemiddelde oordikte per oor.
Opmerking: het meten van de oordikte is optioneel en hangt af van de onderzoeksvraag. Echter, als de oordikte wordt gebruikt als een uitlezen voor huidontsteking, is het noodzakelijk om de baseline oordikte te meten vóór de infectie. (zie stap 4). - (Optioneel) de epidermale barrière van de rughuid verstoren door milde tape strippen: breng handmatig een klein stukje tape aan op de huid en verwijder het opnieuw. Herhaal dit voor 5 opeenvolgende rondes met een nieuw stukje tape voor elke ronde.
Opmerking: Malassezia induceert een meer uitgesproken huidontsteking in een barrière verstoorde huid in vergelijking met een ondoordringende huid (Figuur 2a)7. - Breng met een steriele pipet topisch 100 μL (2 ODA600) van de Malassezia/olijfolie suspensie aan op de dorsale zijde van elk oor. Een controlegroep van dieren bevatten die uitsluitend met olijfolie worden behandeld (met een voertuig behandelde controlegroep).
Opmerking: Vortex de Malassezia/olijfolie suspensie krachtig om een homogene Malassezia suspensie onmiddellijk voorafgaand aan de toepassing te garanderen. - Laat de verdoken dieren op de verwarmingskussen om hypothermie te voorkomen, totdat ze tekenen van herstel vertonen (whisker beweging, verhoogde ademhaling, enz.).
- Injecteer 200 μL steriele en voorverwarmde 2% glucoseoplossing subcutaan in de dwarskam fold ter ondersteuning van hun metabolisme en rehydratatie.
NB: om een steriele 2% glucoseoplossing te bereiden, los 1 mg glucose op in 50 mL PBS en filtreer het met een 0,2 μm filter. De oplossing kan worden bewaard bij 4 °C. - Breng de dieren terug naar hun kooi.
4. analyse van Malassezia-geïnduceerde huidontsteking
Opmerking: deze procedure beschrijft de analyse van Malassezia-geïnduceerde oorzwelling tijdens infectie die dient als een parameter van de huidontsteking. Een voorwaarde voor het analyseren van de schimmel-geïnduceerde oorzwelling is het meten van de baseline oordikte voorafgaand aan tape-strippen en/of infectie (stap 3,5).
- Bereid Isofluraan kamer voor korte termijn anesthesie van Malassezia-geïnfecteerde en controledieren.
- Breng één dier per keer naar de kamer en wacht tot het dier volledig is verdoiliseerd.
Opmerking: tekenen van een goede anesthesie omvatten volledige lichaamsontspanning, evenals langzame en zware (flank) ademhaling. Zorgvuldig controleren anesthesie als uitgebreide blootstelling aan Isofluraan kan fataal. - Verwijder het dier uit de kamer en plaats het op een weefsel.
- Meet de dikte van het oor (en) met behulp van een Remklauw (bereik 0-5 mm). Meet twee verschillende delen van elk oor en bereken de gemiddelde dikte per oor (zie stap 3,5).
- Breng het dier terug naar de kooi.
Opmerking: Isofluraan anesthesie is zeer kortstondig, en de dieren herstellen binnen ~ 30 s na verwijdering uit de Isofluraan kamer. - Bereken de toename van de oordikte door de gemiddelde oordikte van de basislijn af te trekken, gemeten vóór de tape strip en/of de infectie, van de gemiddelde oordikte gemeten op elk tijdstip na de infectie.
- Plot de berekende waarden als de toename van de oordikte of, als alternatief, als de totale oordikte in de tijd voor elk dier of elke groep dieren (Figuur 2B).
5. analyse van de schimmel last in de geïnfecteerde huid
- Bereid een steriele micro centrifugebuis van 2 mL voor elk te oogsten oor, bevattende 0,5 mL steriele 0,05% NP40 in dH2O en een geautoclaveerd stalen kogel (diameter van 5 mm).
- Weeg de buizen af met een precisie balans en noteer het precieze gewicht.
- Euthanaseren de muizen door CO2 verstikking.
- Verwijder het oor (en) aan de basis en breng het in de buis met 0,5 mL steriele 0,05% NP40 in dH2O, zoals beschreven in de stappen 5,1-5,2.
- Weeg de buis met het oorweefsel af en bereken het werkelijke gewicht van elk monster door het gewicht van de buis zonder het orgel te aftrekken van het gewicht van de buis met het orgel.
- Homogeniseren het oorweefsel gedurende 6 minuten bij 25 Hz met behulp van een weefselhomogenisator. Zorg ervoor dat het weefsel goed gehomogeniseerd is.
- Plaat 100 μL van elk monster (overeenkomend met 1/5 van elk homogenaat, verdunningsfactor = 5) op de mDixon agar-platen en incueren de platen ondersteboven in een incubator van 30 °C.
Opmerking: de hoeveelheid geplateerde homogenaat moet worden aangepast volgens de te verwachten schimmel belasting. Zorg ervoor dat u voldoende homogenaat plaat om ten minste 10 en niet meer dan 250 kolonies per plaat te verkrijgen voor een gemakkelijke inventarisatie. Optioneel, plaat meerdere platen per monster met verschillende verdunningen van homogenaat. - Inspecteer de groei van Malassezia kolonies regelmatig.
Opmerking: kolonies worden meestal zichtbaar na 2-3 dagen. De tijd die nodig is voor de groei van Malassezia kolonies hangt af van de soort en de stam van Malassezia. - Tel de kolonies per plaat.
- Bereken het aantal KVE/g weefsel met behulp van de volgende formule:
KVE/g weefsel = (aantal kolonies/plaat) x (verdunningsfactor)/(gewicht van het huid monster in g).
Opmerking: de geschatte minimale detectielimiet kan worden beoordeeld met behulp van de volgende formule: minimale detectielimiet = (1 kolonie/plaat) x (verdunningsfactor)/(gemiddeld gewicht van alle huid monsters in g). - Schimmel belastingen worden meestal getekend op een logaritmische schaal (Figuur 2C).
Representative Results
In vitro teelt van Malassezia
Vergeleken met andere meer algemeen gebruikte schimmel model pathogenen zoals C. albicans of A. fumigatus, is Malassezia moeilijker te kweken in vitro. Dit kan worden toegeschreven aan het feit dat Malassezia afhankelijk is van exogene lipide bronnen voor zijn voedingsbehoeften, vanwege het onvermogen om vetzuren te synthetiseren11. Het mdixon medium is geschikt voor het kweken van verschillende Malassezia soorten, waaronder m. marbofloxacine, m. furfur, m. sympodialis, m. slooffiae, m. Globosa en m. yamatoensis in vitro7 ,12. Figuur 1 toont representatieve beelden voor de groei van M. sympodialis in vloeibaar mDixon medium en op mdixon agar zoals beschreven in stap 1 en stap 2.
Analyse van huidontsteking en schimmel last van Malassezia huidontsteking
Blootstelling van Malassezia aan de muis oor huid die barrière verstoorde door tape-strippen voorafgaand aan infectie resulteert in verergerd ontsteking van de huid, gekenmerkt door epidermale en dermale hyperplasie en ontwikkeling van oedeem7. Stap 4 en 5 schetsen de methoden voor het analyseren van Malassezia-geïnduceerde oorzwelling en de schimmel last van de huid. Beide parameters vertegenwoordigen belangrijke uitlezingen voor het bewaken van het verloop van de infectie. Figuur 2A illustreert de toename van de oordikte die kan worden waargenomen na M. furfur blootstelling aan de huid die barrière-verstoord was in vergelijking met ONPERTURBED huid van WT C57BL/6 muizen. Figuur 2B toont een representatieve overzichtsgrafiek van de toename van de oordikte na verloop van tijd. Figuur 2C geeft de schimmel last in de oorhuid weer op dag 2 na infectie met M. marbofloxacine.
Figuur 1: in vitro teelt van Malassezia.
A) M. sympodialis stam ATCC 42132 gekweekt voor 3 dagen bij 30 °c en 180 rpm in vloeibaar mdixon medium (links) naast een erlenmeyer kolf met mdixon medium dat niet geënt is (rechts). B) kolonies van M. sympodialis stam ATCC 42132 op mdixon agar na 5 dagen incubatie bij 30 °c. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: analyse van de huidinfectie met Malassezia op basis van oordikte en schimmel Last.
A) histologie van oorsecties verkregen uit C57BL/6 muizen die met olijfolie (voertuig, links) of geïnfecteerd met M. FURFUR stam JPLK23 gedurende 5 dagen (midden en rechts) werden behandeld. Aan de rechterkant, de oorhuid was tape-ontdaan voorafgaand aan de infectie. Secties waren bevlekt met HEMA oxylin en eosine (H & E). B) overzichts grafieken met de toename van de oordikte in de loop van de tijd voor C57BL/6 muizen die aan Malassezia zijn blootgesteld of niet-besmet zijn gebleven als controles. De absolute dikte van M. marbofloxacine strain ATCC 14522-blootgestelde of door het voertuig behandelde oorhuid op elk tijdstip wordt aan de linkerzijde getoond; de toename van de oordikte op de aangegeven tijdstippen ten opzichte van de basislijn op dag 0 wordt rechts weergegeven. C) de schimmel last in de huid van C57BL/6 muizen die zijn geïnfecteerd met M. marbofloxacine strain ATCC 14522 of behandeld met olijfolie als controle (voertuig). In beide gevallen werd de huid op tape gestript. Elk symbool in de samenvattende grafieken B en C representeert één dier. De statistische significantie van de verschillen tussen groepen werd berekend met behulp van One-way ANOVA (B) of student t-toets (C). p < 0,001, * * * * p < 0,0001, D.L.: detectielimiet Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
Dit protocol beschrijft de infectie van de huid van de veelgebruikte inteelt muis stam C57BL/6 door Malassezia spp. aanpassing van dit protocol aan andere muizenstammen met een andere genetische achtergrond (bijv. Balb/c) of aan genetisch gemodificeerde muizen stammen kunnen aanpassing van de infectie dosis nodig, de tijdpunt (en) van de analyse, enz. Om de reproduceerbaarheid te garanderen, moeten groepen muizen altijd van dezelfde leeftijd en geslacht zijn. De bron van muizen moet stabiel worden gehouden, omdat zelfs kleine veranderingen in de genetische achtergrond en verschillen in de microbiota, die bestaan tussen leveranciers en zelfs tussen verschillende eenheden van een enkele kweek faciliteit, kunnen bestaan, een onvoorspelbare invloed kunnen hebben op de verloop van de infectie. Bij het instellen van het in dit protocol beschreven Malassezia -infectie model wordt geadviseerd om een pilot-studie uit te voeren om het verloop van de infectie zorgvuldig te controleren, inclusief de omvang van de kolonisatie, de kinetiek van de schimmel klaring en de mate van ontsteking en pathologie die kunnen worden geïnduceerd (bijv. als de oorhuid barrière-verstoord is vóór de infectie) om de optimale testcondities te bepalen.
Om de reproduceerbaarheid te garanderen en de verschillen tussen experimentele groepen betrouwbaar te detecteren, moet het aantal dieren per groep worden berekend op basis van de statistische analyse. De steekproefgrootte wordt berekend op basis van de grootte van het effect, het foutenpercentage en het vermogen, die biologische en experimentele variaties overwegen (bijvoorbeeld vanwege variatie in het immuunsysteem). Om ethische redenen Vermijd het gebruik van onnodig hoge aantallen dieren. Met betrekking tot Malassezia huidinfectie, behandeling van slechts één oor met de schimmel en het gebruik van het andere oor als een controle binnen dezelfde muis, wordt niet geadviseerd, omdat muizen de schimmel kan verspreiden naar beide oren bij het verzorgen. Echter, met behulp van 1/2 oor voor verschillende methodologische Read outs zoals bepaling van de schimmel last, isolatie van immuuncellen of histologische analyse is vaak genoeg en resulteert in een significante vermindering van dierlijke aantallen gebruikt voor experimenten.
18 verschillende soorten Malassezia zijn up-to-date beschreven. Inter-en intraspecies variaties binnen het genus Malassezia kunnen de interactie met de gastheer beïnvloeden, zoals we ook hebben geleerd van studies over andere menselijke pathogene schimmels13. Verschillende Malassezia soorten en stammen verschillen in hun oorsprong (bijv. m. marbofloxacine is de meest voorkomende soort geïsoleerd van dieren, terwijl m. restricta, m. Globosa en m. sympodialis de meest prominente leden van de schimmel huid microbiome bij mensen met variabele verdeling van deze soorten tussen verschillende huidgebieden). Sommige soorten zijn in verband gebracht met het Commensalisme, terwijl anderen worden verondersteld meer pathogeen te zijn, hoewel gedetailleerd bewijs relatief zwak blijft. Belangrijk is dat sommige soorten en stammen inherent moeilijker te kweken zijn dan andere. De beslissing welke soort/stam te gebruiken voor de besmetting moet dus gebaseerd zijn op de onderzoeksvraag.
Experimentele infectie van de murinehuid met sommige microbiële organismen zoals Candida albicans of Staphylococcus aureus vereisen de verstoring van de epidermale barrière voorafgaand aan de infectie, bijvoorbeeld met zand papier14, 15,16. Daarentegen is het hier beschreven model van de Malassezia infectie even efficiënt met en zonder barrière verstoring7. De mate van ontsteking geïnduceerd door de schimmel is massaal verbeterd als de huid is tape ontdaan vóór infectie7. Daarom, of de huid moet worden gemanipuleerd voordat de toepassing van Malassezia afhankelijk is van de onderzoeksvraag. Er bestaan verschillende modellen van chronische en acute huidontsteking (bijv. modellen voor vertraagde type overgevoeligheid (DTH) en contact overgevoeligheid (CHS)) en modellen van barrière deficiëntie die van belang kunnen zijn voor het onderzoeken van de bijdrage van commensale gist tot huid pathologieën.
Inteelt muizen die onder specifieke pathogeen vrije (SPF) condities worden gehouden, zijn (voor onze kennis) niet natuurlijk gekoloniseerd met Malassezia. Daarom vormt de experimentele toepassing van Malassezia op de muis oorhuid een primaire blootstelling aan de schimmel die een acute respons induceert in de gastheer, die op zijn beurt leidt tot schimmel klaring binnen 1-2 weken7. Hoewel het in dit protocol beschreven model slechts gedeeltelijk de situatie weerspiegelt in immunocompetente mensen of andere gastheerorganismen die permanent gekoloniseerd zijn met Malassezia, kan de experimentele infectie een ruim venster van mogelijkheid tot het bestuderen van schimmelwerende immuniteit en de cellulaire en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan dit antwoord. Het laat ook het onderzoeken van variaties in de respons op verschillende Malassezia soorten en stammen onder verschillende experimentele omstandigheden (bijvoorbeeld, met en zonder barrière verstoring van de huid).
De studie Malassezia -host interacties zijn in het verleden beperkt tot in vitro experimenten met geïsoleerde celtypen in culturen (bijv. in cellijnen, PBMCs). Hoewel deze studies enig licht werpen op schimmel-en gastheer determinanten die de wisselwerking tussen Malassezia en de gastheer17vorm geven, laten ze niet toe om een uitgebreid begrip te krijgen van de schimmel-gastheer interactie in het complex omgeving van de huid, waarbij meerdere celtypen die in constante communicatie, zoals keratinocyten, fibroblasten en weefsel-Resident immuuncellen, maar ook leukocyten populaties die het weefsel alleen infiltreren na microbiële ontmoeting van de Huid. Dit multicellulaire netwerk kan niet volledig worden gereproduceerd in de in vitro-modellen, zelfs niet met de meest geavanceerde organoïde-systemen. De experimentele infectie van muizen vertegenwoordigt dus nog steeds de gouden standaard in immunologie en infectieuze ziekte onderzoek, en de beschikbaarheid van het hier beschreven model vertegenwoordigt een doorbraak op het gebied van Malassezia Research. Belangrijk is dat dit model gebaseerd is op de epicutane toepassing van Malassezia op de anders ondoorlaatmuis oorhuid, en het impliceert niet dat de schimmel door injectie in het weefsel wordt inoculatie, bijvoorbeeld subcutaan of intraperitoneaal, als eerdere studies rapporteerden18, die beide meer ver verwijderd zijn van de situatie in natuurlijk gekoloniseerde gastheren.
De mogelijkheid om het model van Malassezia infectie zoals beschreven in dit protocol met andere beschikbare Muismodellen te combineren, vergroot de reikwijdte en flexibiliteit van de toepassing aanzienlijk. Deze laatste omvatten verschillende modellen van specifieke huidaandoeningen, zoals het model van barrière deficiëntie dat belangrijke kenmerken van atopische dermatitis nabootst, een ziekte die gepaard gaat met Malassezia bij zowel mensen als honden. Bovendien kan de epicutane infectie van de huid met Malassezia gemakkelijk worden toegepast op muizen met genetische defecten in gastheer genen van belang, of muizen waarin een celtype van belang is genetisch verwijderd of kan farmacologisch uitgeput zijn (bijv. door middel van difterie toxine toediening in difterie toxine receptor-uitdrukken muizen). Dergelijke modellen vormen een onvermijdelijk hulpmiddel voor het ontleden van de reactie van de gastheer op commensale en pathogene microben, waaronder Malassezia, en om de rol van deze genen en celtype in de schimmel-host interactie te beoordelen. De analyse van de Malassezia-host huid interactie kan worden uitgebreid tot ver buiten wat in dit protocol wordt beschreven. Deze omvatten analyses op basis van histologie (bijv. om de mate van huid pathologie of de epidermale verdikking geïnduceerd door de schimmel te bepalen), door immunohistochemie of immunofluorescentie kleuring van weefsel secties met antilichamen gericht tegen celtype specifieke markers of andere moleculen van belang. Het kan ook het isoleren van cellen (bijvoorbeeld weefsel resident of weefselinfiltrerende leukocyten subgroepen) inhouden van het besmette huid weefsel om de polarisatie, regulatie en dynamiek van de immuunrespons op Malassezia in grote diepte te bestuderen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de Universiteit van Zürich, Zwitserland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | |
| Attane Isoflurane | Piramal Healthcare | - | |
| Biosaftey cabinet (BSC) Faster Ultra Safe | DASIT GROUP | TEC 5594 | BSL2 certified |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415D | compatible with 2ml Eppendorf tubes |
| Dessicated Ox-bile | Sigma-Aldrich | 70168-100G | |
| Eppendorf Tubes (2 ml) | Eppendorf | 0030 120.094 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 49159-5KG | |
| Gylcerol (99 %) | Honeywell | 10314830 | |
| Heating pad | Eickenmeyer | 648048 | |
| Incubator Hereaus B20 | Heraeus | 412047753 | BSL2 certified |
| Ketasol (100 mg) | Graeub AG | 6680416 | |
| Magentic heating plate MR Hei-Standard | Heidolph Instruments | 442-1355 | |
| Malassezia spp. | ATCC | 14522, 14521, 42132 | |
| Malt extract | Sigma-Aldrich | 70167-500G | |
| Multiply Biosphere Tubes (200 µl) | Sarstedt AG | 7084211 | Safelock |
| Native olive oil | - | - | commerc. available |
| Nonidet P40 | Axon Lab | A1694,0250 | |
| Oditest measurment devise | Kroeplin | S0247 | range 0-5 mm |
| Oleic Acid | Sigma-Aldrich | 75090-5ML | |
| Peptone | Oxoid | LP0037 | |
| Petri dishes | Sarstedt AG | 82.1473 | |
| Phosphat buffered salt solution (PBS, 1x) | Amimed/Bioconcept | 3-05F39 | |
| Rompun (2 %) | Bayer | KP0BFHR | |
| Shaking incubator Infors Minitron | Infors | - | BSL2 certified |
| Spectrometer | Jenway | 20308 | optical density measurement at 600nm |
| Spectrometer Cuvettes | Greiner Bio-One | 613101 | |
| Stainless Steel balls (5mm) | ABF | KU.5G80 1.3541 | |
| Syringes 1 ml Sub-Q | BD Bioscience | 305501 | |
| Tissue Lyzer II | Quiagen | 85300 | |
| Transpore Hypoallergic Tape | 3M | 1527-1 | |
| Tween 40 | Sigma-Aldrich | P1504-100ML | |
| Vitamin A Retinoli Palmitas Eye Cream | BAUSCH & LOMB | commerc. available |
References
- Iliev, I. D., Leonardi, I. Fungal dysbiosis: immunity and interactions at mucosal barriers. Nature Reviews Immunology. 17 (10), 635-646 (2017).
- Findley, K., et al. Topographic diversity of fungal and bacterial communities in human skin. Nature. 498 (7454), 367-370 (2013).
- Gemmer, C. M., DeAngelis, Y. M., Theelen, B., Boekhout, T., Dawson, T. L. Fast, noninvasive method for molecular detection and differentiation of Malassezia yeast species on human skin and application of the method to dandruff microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 40 (9), 3350-3357 (2002).
- Theelen, B., et al. Malassezia ecology, pathophysiology, and treatment. Medical Mycology. 56, suppl_1 10-25 (2018).
- Williams, M. R., Gallo, R. L. The role of the skin microbiome in atopic dermatitis. Current Allergy and Asthma Reports. 15 (11), 65 (2015).
- Malassezia and the Skin. , Springer. (2010).
- Sparber, F., et al. The Skin Commensal Yeast Malassezia Triggers a Type 17 Response that Coordinates Anti-fungal Immunity and Exacerbates Skin Inflammation. Cell Host Microbe. 25 (3), 389-403 (2019).
- Koh, A. Y. Murine models of Candida gastrointestinal colonization and dissemination. Eukaryotic Cell. 12 (11), 1416-1422 (2013).
- Solis, N. V., Filler, S. G.
- Russel, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , Methuen & Co. London. (1959).
- Wu, G., et al. Genus-Wide Comparative Genomics of Malassezia Delineates Its Phylogeny, Physiology, and Niche Adaptation on Human Skin. PLoS Genetics. 11 (11), 1005614 (2015).
- Leong, C., Buttafuoco, A., Glatz, M., Bosshard, P. P. Antifungal Susceptibility Testing of Malassezia spp. with an Optimized Colorimetric Broth Microdilution Method. Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1883-1893 (2017).
- Schonherr, F. A., et al. The intraspecies diversity of C. albicans triggers qualitatively and temporally distinct host responses that determine the balance between commensalism and pathogenicity. Mucosal Immunology. 10 (5), 1335-1350 (2017).
- Igyarto, B. Z., et al. Skin-resident murine dendritic cell subsets promote distinct and opposing antigen-specific T helper cell responses. Immunity. 35 (2), 260-272 (2011).
- Liu, H., et al. Staphylococcus aureus Epicutaneous Exposure Drives Skin Inflammation via IL-36-Mediated T Cell Responses. Cell Host Microbe. 22 (5), 653-666 (2017).
- Nakagawa, S., et al. Staphylococcus aureus Virulent PSMalpha Peptides Induce Keratinocyte Alarmin Release to Orchestrate IL-17-Dependent Skin Inflammation. Cell Host Microbe. 22 (5), 667-677 (2017).
- Sparber, F., LeibundGut-Landmann, S. Host Responses to Malassezia spp. in the Mammalian Skin. Frontiers in Immunology. 8, 1614 (2017).
- Yamasaki, S., et al. C-type lectin Mincle is an activating receptor for pathogenic fungus, Malassezia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (6), 1897-1902 (2009).
