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Immunology and Infection

मंगस-होस्ट इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए मलासेज़िया पीपी के साथ चूहों को संक्रमित करना

Published: November 6, 2019 doi: 10.3791/60175
Automatic Translation
1, 1
1Section of Immunology, Vetsuisse Faculty, University of Zürich

Summary

यह प्रोटोकॉल त्वचा में मलासेज़िया-मेजबानबातचीत का अध्ययन करने के लिए एक माउस मॉडल की स्थापना की रूपरेखा तैयार करता है। यह विट्रो में मलासेज़िया की खेती, मलासेज़ियाके साथ मूत्र त्वचा के संक्रमण और त्वचा के ऊतकों में सूजन और फंगल बोझ के बाद के विश्लेषण का वर्णन करता है।

Abstract

पशु मॉडल संक्रामक रोग अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण हैं। वे ऊतक-विशिष्ट तरीके से वीवो में रोगाणुओं और उनके मेजबान के बीच होने वाली बातचीत के पूर्ण स्पेक्ट्रम का विश्लेषण करने के लिए एक महत्वपूर्ण आधार प्रदान करते हैं। रोगजनक कवक को मनुष्यों के लिए एक गंभीर खतरे के रूप में तेजी से पहचाना जाता है और इस तरह के संक्रमण मॉडलों का शोषण करने से कवक रोगजनकता की हमारी समझ में काफी सुधार हुआ है। मलसेज़िया जीनस की प्रजातियां मानव त्वचा माइक्रोबायोटा की सबसे प्रचुर मात्रा में कवक हैं और वे गंभीर भड़काऊ त्वचा विकारों जैसे सेबोरेनिक त्वचा विशेषज्ञ और एटोपिक डर्मेटाइटिस के विकास से भी जुड़े हुए हैं। हालांकि, मलासेज़िया और रोग रोगजनकता के बीच एक कारक लिंक अज्ञात रहता है, एक तथ्य यह है कि त्वचा प्रतिरक्षा प्रणाली के साथ Malassezia के जटिल क्रॉसटॉक के गरीब ज्ञान के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है । यह प्रोटोकॉल एक प्रयोगात्मक माउस मॉडल की स्थापना का वर्णन करता है जो वीवो में स्तनधारी त्वचा के साथ मालासेज़िया की बातचीत का अध्ययन करने की अनुमति देता है। यह प्रयोगशाला की स्थिति के तहत Malassezia spp की खेती के लिए विधि रूपरेखा, कैसे Malassezia spp के साथ मूत्र त्वचा को संक्रमित करने के लिए और कैसे त्वचा सूजन और कवक बोझ विश्लेषण के माध्यम से संक्रमण के परिणाम का आकलन करने के लिए । यहां वर्णित मॉडल पूरी तरह से इम्यूनोसक्षम जानवरों में काम करता है और जानवरों के प्रतिरक्षा दमनकारी या एंटीबायोटिक प्रीट्रीटमेंट पर भरोसा नहीं करता है। यह इसके अलावा लगभग सभी आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस उपभेदों के लिए अनुकूलनीय है और अन्य त्वचा रोग मॉडल के साथ जोड़ा जा सकता है। ये विशेषताएं इस संक्रमण मॉडल को वीवो में त्वचा में मालसेज़िया के खिलाफ मेजबान की जन्मजात और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का विस्तार से अध्ययन करने के लिए एक बहुत शक्तिशाली उपकरण बनाती हैं।

Introduction

त्वचा कई अलग-अलग रोगाणुओं से आबाद है। माइक्रोबायोटा के लिए त्वचा का निरंतर जोखिम मेजबान की प्रतिरक्षा प्रणाली को आकार देने और शिक्षित करने में योगदान देता है। कवक को माइक्रोबायोटा के एक महत्वपूर्ण हिस्से के रूप में तेजी से पहचाना जाता है और वे बैक्टीरिया और वायरस1के समान मेजबान शरीर विज्ञान और प्रतिरक्षा के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका को पूरा करते हैं। मलसेज़िया जीनस की प्रजातियां गर्म खून वाले कशेरुकी की त्वचा को उपनिवेश बनाने वाली अब तक की सबसे प्रचुर मात्रा में कवक हैं और वे मानव त्वचा माइकोबायोम2,3के 90% से अधिक के लिए बनाते हैं। मलसेज़िया की अठारह विभिन्न प्रजातियों की पहचान अब तक मानव और पशु त्वचा4से की गई है ।

त्वचा की विभिन्न विकृतियों को कम से कम आंशिक रूप से उत्पन्न होने के लिए सोचा जाता है, एक डिस्बैलेंस्ड माइक्रोबायोटा संरचना के परिणामस्वरूप। डिस्बायोसिस रोगजनक क्षमता के साथ प्रजातियों के अति वृद्धि के लिए नेतृत्व कर सकते हैं अवसरवादी संक्रमण और रोग5में जिसके परिणामस्वरूप । लगातार, इस बात के सबूत बढ़ रहे हैं कि मलासेज़िया,अपनी कॉममेंसल जीवन शैली के अलावा, विभिन्न त्वचा विकृतियों के विकास में योगदान देता है, जिसमें डैंड्रफ और पिट्रियासिस वर्सीकलर से लेकर अधिक गंभीर भड़काऊ विकार ों तक सेबोरेरिक डर्मेटाइटिस और एटोपिक डर्मेटाइटिस4,6के रूप में . जबकि मलासेज़िया और पिट्रियार्सिस वर्सिकलर के बीच एक कारक लिंक स्थापित किया गया है, अधिक गंभीर त्वचा विकृतियों में कवक की रोगविज्ञानी भूमिका काफी हद तक अज्ञात बनी हुई है।

त्वचा homeostasis और रोग में Malasssezia की भूमिका का निर्धारण त्वचा और cutaneous प्रतिरक्षा प्रणाली के साथ कवक की बातचीत के बारे में अधिक गहराई से ज्ञान के लिए कहते हैं । ध्यान दें, मलासेज़िया पर शोध अन्य मानव फंगल रोगजनकों (जैसे, कैंडिडा एल्बिकान या एस्परगिलस फ्यूमिगाटस)की तुलना में अभी भी नवेली चरण में है। यह प्रयोगशाला की स्थिति के तहत Malassezia की खेती में कठिनाई और वीवो में मेजबान के साथ संपर्क में कवक का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त प्रयोगात्मक मॉडल की कमी के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है । संस्कृति में अलग कोशिकाओं के साथ पिछले प्रयोगों ने मलासेज़िया और विभिन्न प्रतिरक्षा और गैर-प्रतिरक्षा कोशिकाओं7के बीच प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष बातचीत की एक विस्तृत श्रृंखला का संकेत दिया। हालांकि, ये इन विट्रो प्रयोग केवल आंशिक रूप से वीवो में जटिल त्वचा पर्यावरण की स्थिति को फिर से दोहराते हैं जहां कई सेलुलर और आणविक घटनाएं कवक और विभिन्न कोशिका प्रकारों के बीच सहवर्ती रूप से होती हैं।

इसके साथ, हम चूहों में मलासेज़िया त्वचा संक्रमण के एक प्रयोगात्मक मॉडल के लिए प्रोटोकॉल की रूपरेखा तैयार करते हैं, जिसे हमने हाल ही में स्थापित किया था, वीवो7में कवक-मेजबान बातचीत का अध्ययन करने के लिए। इसमें (1) विट्रो में मालासेज़िया की सफल खेती, (2) मूत्र कान की त्वचा पर मालासेज़िया का एपिक्यूटेनेस एप्लिकेशन, और (3) मलसेज़िया-प्रेरित त्वचा का विश्लेषण करने के तकनीकी विवरण शामिल हैं सूजन और संक्रमित त्वचा का फंगल बोझ। महत्वपूर्ण बात, यह मॉडल संक्रमण से पहले इम्यूनोसप्रेसिंग (उदाहरण के लिए, कॉर्टिकोस्टेरॉयड द्वारा) या चूहों के एंटीबायोटिक उपचार पर भरोसा नहीं करता है, क्योंकि यह फंगल संक्रमण8,9के अन्य माउस मॉडल में अभ्यास किया जाता है। बदले में, यह सामान्य त्वचा में मालसेज़िया के खिलाफ जन्मजात और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के पूर्ण स्पेक्ट्रम का अध्ययन करने की अनुमति देता है। नोट की, विशिष्ट रोगजनक मुक्त (एसपीएफ) स्थितियों के तहत रखे गए जंगली प्रकार के चूहों को स्वाभाविक रूप से मालासेज़िया के साथ उपनिवेश नहीं किया जाता है और इसलिए, कवक के संपर्क में आने से लगातार उपनिवेशीकरण नहीं होता है, लेकिन मेजबान से भीतर मंजूरी दे दी जाती है लगभग 1.5 सप्ताह। हालांकि, मॉडल एंटीफंगल होस्ट रिस्पांस दीक्षा और विनियमन के तंत्र का अध्ययन करने की अनुमति देता है, जो बदले में, प्रतिरक्षा स्मृति उत्पन्न होने का आधार है। मॉडल बहुमुखी है कि यह आसानी से आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस उपभेदों की एक विस्तृत विविधता के लिए लागू किया जा सकता है और यह बाधा की कमी के मॉडल के रूप में अंय मौजूदा त्वचा रोग मॉडल के साथ जोड़ा जा सकता है, के तहत Malassezia के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए पैथोलॉजिकल एंड भड़काऊ स्किन कंडीशन7. इसलिए, चूहों में प्रायोगिक Malassezia त्वचा संक्रमण का वर्णित मॉडल होमोस्टोसिस और रोग के संदर्भ में त्वचा प्रतिरक्षा प्रणाली के साथ कवक की बातचीत की जांच करने के लिए उच्च स्तर का लचीलापन प्रदान करता है।

यह प्रोटोकॉल मलसेज़िया एसपीपी के साथ चूहों के प्रायोगिक त्वचा संक्रमण का वर्णन करता है। इसकी रोगजनक क्षमता के कारण, मलासेज़िया एसपीपी को स्विट्जरलैंड सहित कुछ देशों में BSL2 रोगजनकों के रूप में वर्गीकृत किया गया है। कृपया स्थानीय दिशा-निर्देशों की जांच करें और स्थानीय प्राधिकारियों द्वारा विनियमों का पालन करें । बीएसएल2-वर्गीकृत जीवों को बीएसएल2-प्रमाणित जैव सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) के तहत प्रशिक्षित कर्मियों द्वारा संभाला जाना चाहिए। बीएसएल2-वर्गीकृत जीवों से दूषित जैविक अपशिष्ट, साथ ही, ऐसे जीवों से संक्रमित चूहों से शवों को निपटान से पहले स्वचालित किया जाना चाहिए। चूहों के साथ प्रयोगों के लिए, दुख को कम करने और 3आर सिद्धांतों के अनुसार उच्चतम नैतिक और मानवीय मानकों को सुनिश्चित करने के लिए सभी प्रयास किए जाने चाहिए (प्रतिस्थापित, परिष्कृत, कम)10। इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रयोगों में एम पचिडरमैटिस (एटीसीसी 14522), एम फर्फर (एटीसीसी 14521) और एम संगोष्ठी (एटीसीसी 42132)7के साथ किए गए थे।

Protocol

इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी प्रक्रियाओं को पर्यावरण, स्विट्जरलैंड (www.bafu.admin.ch) के लिए संघीय कार्यालय के निहित प्रणालियों में जीवों को संभालने पर अध्यादेश के अनुसार किया गया था । माउस प्रयोग स्विस पशु संरक्षण कानून के दिशा निर्देशों के अनुसार सख्त ी से आयोजित किए गए थे और कैंटन ज्यूरिख, स्विट्जरलैंड (लाइसेंस संख्या 168/2018) के पशु चिकित्सा कार्यालय द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत किया गया था ।

1. प्रयोगशाला की परिस्थितियों में मालासेज़िया की खेती

नोट: कमरे के तापमान (आरटी, 20 - 25 डिग्री सेल्सियस) पर इस प्रोटोकॉल के लिए उपयोग किए जाने वाले सभी अभिकर्मकों और मीडिया को स्टोर करें, जब तक कि अन्यथा नहीं कहा जाता है, क्योंकि कम तापमान फंगल विकास को बाधित कर सकता है।

  1. मालसेज़िया ग्रोथ के लिए लिक्विड मॉडिफाइड डिक्सन (एमडिक्सन) मीडियम तैयार करें। तरल mDixon माध्यम के 500 मीटर तैयार करने के लिए, 18 ग्राम माल्ट निकालने, 10 ग्राम desiccated बैल पित्त, 5 mL ट्वीन-40, 3 ग्राम पेप्टोन, 1 mL ग्लाइसेरोल और 1 mL ओलिक एसिड में 500 मीटर आसुत एच2ओ (dH2O) भंग करें। एचसीएल और ऑटोक्लेव के साथ पीएच 6 के माध्यम को समायोजित करें। आरटी पर माध्यम स्टोर करें।
  2. ऑटोक्लेव िंग से पहले 500 मीटर एमडिक्स मीडियम में 7.5 ग्राम एगर जोड़कर एमडिक्सएगर प्लेट्स तैयार करें। ठंडा करते समय मध्यम के आंशिक ठोसीकरण से बचने के लिए स्टीयरिंग बार और चुंबकीय हीटिंग प्लेट का उपयोग करके स्वचालित करने के बाद धीरे-धीरे एमडिक्सन एगर को ठंडा करें।
  3. एक बार आगर 50 - 60 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा हो गया है, एक लैमिनार प्रवाह हुड में पेट्री व्यंजनों में तरल बांटना और उन्हें रात भर आरटी पर सूखने दें।
    नोट: एगर प्लेटों को वाष्पीकरण से बचने के लिए लपेटे और उल्टा रखे जाने पर कई हफ्तों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
  4. मालसेज़िया को अलग-थलग और प्रदाता द्वारा प्राप्त निर्देशों के अनुसार मालासेज़िया के लियोफिलेइज्ड स्टॉक्स को पुनर्जीवित करें।
  5. प्रदाता द्वारा प्राप्त निर्देशों के अनुसार पुनर्जीवित मलासेज़िया निलंबन के साथ एक बाँझ 100 मिलीएल एर्लेनमेयर फ्लास्क में तरल mDixon माध्यम के 10 मिलील का टीका लगाया। संस्कृति को 30 डिग्री सेल्सियस और 180 आरपीएम पर मिलाते हुए इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
  6. क्रीम रंग और टर्बिडिटी की उपस्थिति की जांच करके नियमित रूप से मलासेज़िया संस्कृति के विकास का निरीक्षण करें। विकास गतिज मलसेज़िया की प्रजातियों और तनाव पर निर्भर करते हैं और विशेष रूप से धीमा हो सकता है जब मालासेज़िया को लाइओफिलेइज्ड स्टॉक से हौसले से पुनर्जीवित किया जाता है। (चित्रा 1ए)।
  7. मिडिक्स मीडियम में घनी उगाई गई मालासेज़िया कल्चर के 3 हिस्सों को मिलाकर ग्लाइसेरोल स्टॉक्स तैयार करें, जिसमें बाँझ 99% ग्लाइसेरोल के 1 हिस्से हैं। अलीकोट मलासेज़िया/ग्लाइसेरोलमिश्रण बाँझ पेंच-कैप ट्यूबों में और स्टोर-८० डिग्री सेल्सियस पर ।
  8. इन विट्रो प्रचार के लिए, एक टीका पाश का उपयोग करके एमडिक्सन में तरल संस्कृति से या जमे हुए ग्लाइसेरोल स्टॉक से एक mDixon आगर प्लेट (4 डिग्री सेल्सियस से आरटी में लाया गया) पर प्लेट मलासेज़िया।
    नोट: उपयोग से पहले 4 डिग्री सेल्सियस से आरटी में एमडिक्सएगर प्लेटों को स्थानांतरित करें, क्योंकि ठंडे mDixon आगर फंगल विकास को रोकता है।
  9. 30 डिग्री सेल्सियस पर एक (गैर मिलाते हुए) इनक्यूबेटर में ऊपर मलासेज़िया के साथ आगर प्लेट (एस) इनक्यूबेट करें। नियमित रूप से मालसेज़िया कॉलोनियों के विकास का निरीक्षण करें।
    नोट: mDixon आगर प्लेटों पर Malasssezia कालोनियों 3-5 दिनों के भीतर दिखाई देते है और क्रीम रंग सुस्त, उत्तल ऊंचाई के साथ चिकनी(चित्रा 1बी)हैं ।
  10. ~ 2 सप्ताह के लिए आरटी पर mDixon आगर प्लेटों पर मालसेज़िया उपनिवेशों की दुकान। इसके बाद, 1.7 में वर्णित जमे हुए ग्लाइसेरोल स्टॉक से मलासेज़िया को लकीर देकर एक नई mDixon agar प्लेट तैयार करें।

2. चूहों के प्रयोगात्मक Malassezia संक्रमण के लिए इनोकुलम की तैयारी

  1. एक बाँझ 100 मीटर Erlenmeyer फ्लास्क में तरल mDixon माध्यम के 10 mL एक mDixon आगर प्लेट से 3 -5 व्यक्तिगत Malassezia कालोनियों के साथ टीका (कदम 1, चित्रा 1बीदेखें) ।
  2. 30 डिग्री सेल्सियस और 180 आरपीएम पर ~ 48 से 96 घंटे के लिए मलासेज़िया संस्कृति को इनक्यूबेट करें जब तक कि संस्कृति क्रीम-रंगीन और टर्बिड(चित्रा 1ए)न हो।
    नोट: Malassezia विकास के लिए आवश्यक समय Malassezia प्रजातियों और तनाव और टीका के लिए इस्तेमाल कवक की मात्रा पर निर्भर करता है ।
  3. एक बाँझ 2 mL माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब में Malassezia संस्कृति के 2 mL हस्तांतरण और 1 000 x ग्राम पर 1 मिन के लिए अपकेंद्रित्र ।
  4. सुपरनेट को त्यागें और फॉस्फेट-बफर्ड नमक समाधान (पीबीएस) के 1 मिलील में निलंबित करके पैलेट को धोलें। 10, 000 x ग्रामपर 1 मिन के लिए फिर से अपकेंद्रित्र ।
  5. धोने के बाद, पेलेट को पीबीएस के 1 एमएल में जोरदार पाइपिंग द्वारा निलंबित करें और स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करके 600 एनएम (ओडीA600)पर समाधान के ऑप्टिकल घनत्व को मापें। ओडी माप के लिए पीबीएस के साथ 20 - 50 x को कमजोर करें कि पढ़ना 0.1 और 1 के बीच है।
    नोट: Malassezia की एक 3 दिन की संस्कृति का घनत्व आम तौर पर 15 और 30 ODA600के बीच बदलता है, Malasssezia प्रजातियों और तनाव पर निर्भर करता है और खमीर संस्कृति के टीका के लिए इस्तेमाल कोशिकाओं की संख्या पर (कदम २.१) । Malassezia समुचतरीके बनाने के लिए जाता है, इसलिए, निलंबन की एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए जोरदार पाइपिंग आवश्यक है।
  6. अलीकोट पीबीएस में मलासेज़िया निलंबन की मात्रा जो 4 ओडीA600 के घनत्व से मेल खाती है जो बाँझ 2 एमएल ट्यूब में है। संक्रमित होने के लिए प्रति जानवर 1 ट्यूब तैयार करें।
  7. 10, 000 x ग्राम पर 1 मिन के लिए Malassezia युक्त ट्यूबों अपकेंद्रित्र ।
  8. अलौकिक त्यागें और देशी जैतून का तेल के २०० μL में Malassezia गोली निलंबित (2 ODA600 खमीर कोशिकाओं के अनुरूप/
    नोट: जैतून का तेल Malasseziaके साथ epicutaneous संक्रमण के लिए एक अच्छा वाहन पाया गया था, के रूप में Malassezia एक लिपोफिलिक और लिपिड पर निर्भर खमीर है । जैतून का तेल पीबीएस की तुलना में त्वचा द्वारा बेहतर अवशोषित किया जाता है। हालांकि, ध्यान रखें कि जैतून के तेल में मालासेज़िया को निलंबित करना आसान नहीं है। भंवर द्वारा Malassezia/जैतूनका तेल निलंबन में सुधार । निलंबन को आरटी पर तब तक रखें जब तक कि इसका उपयोग संक्रमण के लिए न हो।
  9. नियंत्रण जानवरों के नकली संक्रमण के लिए अकेले जैतून के तेल के साथ ट्यूब तैयार करें।

3. मलसेज़िया के साथ चूहों को संक्रमित करना

  1. आदेश महिला C57BL/6 चूहों 6-8 सप्ताह की उम्र में और उन्हें प्रयोगात्मक पशु सुविधा में कम से एक सप्ताह के लिए स्वीकार करने के लिए अनुमति देते हैं । एक असंक्रमित नियंत्रण समूह सहित प्रति समूह 3 - 5 चूहों के लिए गणना करें।
  2. बाँझ संवेदनाहेतम कॉकटेल तैयार करें जिसमें पीबीएस में 1.3 मिलीग्राम/एमएल जाइलाज़ीन और 6.5 मिलीग्राम/एमएल केटामाइन हो। संवेदनानक कॉकटेल का 5 mL 20 जानवरों को संवेदनानित करने के लिए पर्याप्त है। जानवरों की संख्या के अनुसार कॉकटेल की मात्रा को एनेस्थेटाइज्ड करने के लिए समायोजित करें।
    1. एनेस्थेटिक कॉकटेल इंट्रापेरिटोनी (65 मिलीग्राम केटामाइन और 13 मिलीग्राम जाइलाज़ीन प्रति किलो शरीर के वजन के अनुरूप) के 10 μL/g बॉडीवेट इंजेक्शन द्वारा जानवरों को एनेस्थेटाइज़ करें और एनेस्थेटाइज्ड जानवरों को 37 डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग पैड पर रखें।
      नोट: संकेतित खुराक पर, जानवर आमतौर पर ~ 30 - 60 मिन के लिए एनेस्थेटाइज्ड रहते हैं।
  3. पीछे के पैर को संदंश के साथ चुटकी देकर सजगता की जांच करें ताकि यह आश्वस्त किया जा सके कि जानवर पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड हैं।
  4. संज्ञाहरण के दौरान निर्जलीकरण को रोकने के लिए आंखों पर एक आई क्रीम लगाएं।
  5. वैकल्पिक रूप से, कैलिपर (0 - 5 मिमी रेंज) का उपयोग करके दोनों कानों के कान की मोटाई को मापें। प्रत्येक कान के दो अलग-अलग क्षेत्रों को मापें और प्रति कान औसत कान की मोटाई की गणना करें।
    नोट: कान की मोटाई को मापना वैकल्पिक है और अनुसंधान प्रश्न पर निर्भर करता है। हालांकि, अगर कान की मोटाई का उपयोग त्वचा की सूजन के लिए रीडआउट के रूप में किया जाता है, तो संक्रमण से पहले बेसलाइन कान की मोटाई को मापना आवश्यक है। (चरण 4 देखें)।
  6. वैकल्पिक रूप से, हल्के टेप विपठ्ठन द्वारा पृष्ठीय कान की त्वचा के एपिडर्मल बाधा को बाधित करें: मैन्युअल रूप से त्वचा पर टेप का एक छोटा सा टुकड़ा लागू करें और इसे फिर से हटा दें। प्रत्येक दौर के लिए टेप के एक ताजा टुकड़े का उपयोग कर लगातार 5 दौर के लिए दोहराएं ।
    नोट: Malassezia बेफिक्र त्वचा की तुलना में बाधा बाधित त्वचा में एक अधिक स्पष्ट त्वचा सूजन लाती है(चित्रा 2ए)7।
  7. टॉपिकली एक बाँझ पिपेट का उपयोग करके प्रत्येक कान के पृष्ठीय पक्ष पर Malassezia/जैतूनका तेल निलंबन के १०० μL (2 ODA600)लागू होते हैं । जानवरों का एक नियंत्रण समूह शामिल करें जो केवल जैतून के तेल (वाहन-उपचारित नियंत्रण समूह) के साथ इलाज किया जाता है।
    नोट: भंवर Malassezia/जैतूनका तेल निलंबन सख्ती से एक समरूप Malassezia निलंबन सुनिश्चित करने के लिए तुरंत आवेदन से पहले ।
  8. हाइपोथर्मिया से बचने के लिए हीटिंग पैड पर एनेस्थेटाइज्ड जानवरों को तब तक छोड़ दें जब तक कि वे वसूली के लक्षण न दिखाएं (मूंछ आंदोलन, सांस लेने की दर में वृद्धि, आदि)।
  9. बाँझ और पूर्व गर्म 2% ग्लूकोज समाधान के 200 μL सुई उनके चयापचय और रिहाइड्रेशन का समर्थन करने के लिए nuchal गुना में चमड़े के नीचे।
    नोट: एक बाँझ 2% ग्लूकोज समाधान तैयार करने के लिए, 50 मिलीग्राम पीबीएस में 1 मिलीग्राम ग्लूकोज भंग करें और 0.2 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग करके इसे फ़िल्टर करें। समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  10. जानवरों को वापस उनके पिंजरे में स्थानांतरित करें।

4. मलासेज़ियाका विश्लेषण -प्रेरित त्वचा सूजन

नोट: यह प्रक्रिया संक्रमण के दौरान मलासेज़िया-प्रेरितकान सूजन के विश्लेषण का वर्णन करती है जो त्वचा की सूजन के पैरामीटर के रूप में कार्य करती है। कवक प्रेरित कान सूजन का विश्लेषण करने के लिए एक शर्त टेप-विपठ्ठन और/या संक्रमण (चरण ३.५) से पहले बेसलाइन कान की मोटाई को मापने के लिए है ।

  1. मलसेज़ियाके अल्पकालिक संज्ञाहरण के लिए आइसोफ्लोरीन चैंबर तैयार करें - संक्रमित और जानवरों को नियंत्रित करें।
  2. एक समय में एक जानवर को कक्ष में स्थानांतरित करें और जानवर को पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड होने का इंतजार करें।
    नोट: उचित संज्ञाहरण के लक्षण पूर्ण शरीर विश्राम के साथ ही धीमी और भारी (पार्श्व) सांस लेने में शामिल हैं । आइसोफ्लोरीन के विस्तारित जोखिम के रूप में सावधानी से संज्ञाहरण की निगरानी घातक हो सकती है।
  3. जानवर को कक्ष से निकालें और इसे ऊतक पर रखें।
  4. कैलिपर (रेंज 0 - 5 मिमी) का उपयोग करके कान (एस) की मोटाई को मापें। प्रत्येक कान के दो अलग-अलग क्षेत्रों को मापें और प्रति कान औसत मोटाई की गणना करें (चरण 3.5 देखें)।
  5. जानवर को वापस पिंजरे में स्थानांतरित करें।
    नोट: Isoflurane संज्ञाहरण बहुत कम रहता है, और जानवरों के भीतर ठीक ~ 30 एस isoflurane चैंबर से हटाने के बाद ।
  6. औसत बेसलाइन कान मोटाई घटाना द्वारा कान की मोटाई में वृद्धि की गणना, टेप अलग करना और/या संक्रमण से पहले मापा, औसत कान मोटाई से संक्रमण के बाद हर समय बिंदु पर मापा ।
  7. गणना मूल्यों को कान की मोटाई में वृद्धि के रूप में या वैकल्पिक रूप से, प्रत्येक जानवर या जानवरों के समूह(चित्रा 2बी)के लिए समय के साथ कुल कान की मोटाई के रूप में प्लॉट करें।

5. संक्रमित त्वचा में फंगल बोझ का विश्लेषण

  1. प्रत्येक कान को काटा जाने के लिए एक बाँझ 2 मिलीएम माइक्रोसेंट्रिकफ्यूज ट्यूब तैयार करें, जिसमें डीएच2ओ में बाँझ 0.05% NP40 का 0.5 मिलील और एक ऑटोक्लेव ्ड स्टील बॉल (5 मिमी व्यास)।
  2. एक सटीक संतुलन का उपयोग कर ट्यूबों वजन और सटीक वजन नीचे लिखें।
  3. सीओ2 श्वासावरोध द्वारा चूहों को इच्छामृत्यु दें।
  4. आधार पर कान (एस) निकालें और डीएच2ओ में बाँझ 0.05% NP40 के 0.5 mL युक्त ट्यूब में स्थानांतरित करें, जैसा कि चरण 5.1 - 5.2 में वर्णित है।
  5. कान के ऊतकों वाली ट्यूब को तौलें और अंग के साथ ट्यूब के वजन से अंग के बिना ट्यूब के वजन को घटाकर प्रत्येक नमूने के वास्तविक वजन की गणना करें।
  6. ऊतक समरूपता का उपयोग करके 25 हर्ट्ज पर 6 मिन के लिए कान के ऊतकों को समरूप करें। सुनिश्चित करें कि ऊतक अच्छी तरह से समरूप है।
  7. प्रत्येक नमूने की प्लेट 100 माइक्रोन (प्रत्येक समरूप, कमजोर पड़ने का कारक = 5) के 1/5 के अनुरूप, एमडिक्सएगर प्लेटों पर और प्लेटों को 30 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में उल्टा इनक्यूबेट करें।
    नोट: होमोजेनेट प्लेटेड की मात्रा को अपेक्षित होने वाले फंगल लोड के अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए। आसान गणना की अनुमति देने के लिए प्रति प्लेट कम से कम 10 और 250 से अधिक उपनिवेशों को प्राप्त करने के लिए पर्याप्त समरूप प्लेट करना सुनिश्चित करें। वैकल्पिक रूप से, होमोजेनेट के विभिन्न कमजोर होने के साथ प्रति नमूने में कई प्लेटें प्लेट करें।
  8. नियमित रूप से मालसेज़िया कॉलोनियों के विकास का निरीक्षण करें।
    नोट: उपनिवेश आमतौर पर 2 - 3 दिनों के बाद दिखाई देने लगते हैं। मलासेज़िया उपनिवेशों के बढ़ने के लिए आवश्यक समय मलसेज़ियाकी प्रजातियों और तनाव पर निर्भर करता है ।
  9. प्रति प्लेट कॉलोनियों की गिनती।
  10. निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके सीएफयू/जी ऊतक की संख्या की गणना करें:
    CFU/g ऊतक = (कालोनियों/प्लेट की संख्या) एक्स (कमजोर पड़ने कारक)/(जी में त्वचा के नमूने का वजन) ।
    नोट: अनुमानित न्यूनतम पहचान सीमा का आकलन निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके किया जा सकता है: न्यूनतम पता लगाने की सीमा = (1 कॉलोनी/प्लेट) एक्स (कमजोर पड़ने वाला कारक)/ (जी में सभी त्वचा नमूनों का औसत वजन)।
  11. फंगल भार आमतौर पर एक logarithmic पैमाने पर साजिश रची जाती है(चित्रा 2सी)।

Representative Results

मलासेज़िया की इन विट्रो खेती
सी एल्बिकान या ए फ्यूमिगाटसजैसे अन्य अधिक आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले फंगल मॉडल रोगजनकों की तुलना में, मलासेज़िया विट्रो में संस्कृति के लिए अधिक कठिन है। यह इस तथ्य के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है कि मलासेज़िया फैटी एसिड11को संश्लेषित करने में असमर्थता के कारण अपनी पोषक आवश्यकताओं के लिए बहिर्जात लिपिड स्रोतों पर निर्भर करता है। एमडिक्सन माध्यम एम पचिडरमैटिस, एम फरफर, एम संगोष्ठी, एम स्लोफोफी, एम ग्लोबोसा और एम यामाटोएंसिस इन विट्रो 7 सहित कई मलासेज़िया प्रजातियों को संभोग करने के लिए उपयुक्त है। ,12. चित्रा 1 तरल mDixon माध्यम में एम संगोष्ठी के विकास के लिए प्रतिनिधि छवियों से पता चलता है और mDixon आगर पर के रूप में कदम 1 और चरण 2 में वर्णित है ।

त्वचा की सूजन और मलासेज़िया त्वचा सूजन के फंगल बोझ का विश्लेषण
माउस कान की त्वचा के लिए मलासेज़िया का एक्सपोजर जो संक्रमण से पहले टेप-विपठ्ठन से बाधित बाधा थी, जिसके परिणामस्वरूप त्वचा की सूजन बढ़ जाती है, जिसकी विशेषता एपिडर्मल और डर्मल हाइपरप्लासिया और एडीमा7का विकास होता है। चरण 4 और 5 मलासेज़िया-प्रेरित कान सूजन और त्वचा के फंगल बोझ का विश्लेषण करने के तरीकों की रूपरेखा तैयार करते हैं। दोनों पैरामीटर संक्रमण के पाठ्यक्रम की निगरानी के लिए प्रमुख रीडआउट का प्रतिनिधित्व करते हैं। चित्रा 2ए कान की मोटाई में वृद्धि को दर्शाता है जो एम फर्फर के बाद त्वचा के संपर्क में आने के बाद देखा जा सकता है जो WT C57BL/6 चूहों की बेफिक्र त्वचा की तुलना में बाधा-बाधित था । चित्रा 2बी समय के साथ कान की मोटाई में वृद्धि का एक प्रतिनिधि सारांश ग्राफ दिखाता है। चित्रा 2सी एम पचिडडर्मैटिसके साथ संक्रमण के बाद 2 दिन कान की त्वचा में फंगल बोझ प्रदर्शित करता है ।

Figure 1
चित्रा 1: मलासेज़िया की इन विट्रो खेती।
(A) एम संगोष्ठी तनाव ATCC ४२१३२ 3 दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस और तरल mDixon माध्यम में १८० आरपीएम (बाएं) एक नियंत्रण Erlenmeyer फ्लास्क युक्त mDixon माध्यम है कि टीका नहीं था (सही) के बगल में उगाया । } एम सिम्फोडिलिस की कॉलोनियां 30 डिग्री सेल्सियस पर इन्विटेशन के 5 दिन बाद एमडिक्सएआगर पर एटीसीसी 42132 स्ट्रेन करती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: कान की मोटाई और फंगल बोझ के आधार पर मलासेज़िया त्वचा संक्रमण का विश्लेषण।
(A)C57BL/6 चूहों से प्राप्त कान वर्गों की हिटोलॉजी जिनका इलाज जैतून के तेल (वाहन, बाएं) या एम फर्फर स्ट्रेन जेपीएलके23 से 5 दिनों (मध्य और दाएं) के साथ किया गया था । दाईं ओर, कान की त्वचा को संक्रमण से पहले टेप-छीन लिया गया था। अनुभागों को हेमैटोक्सीलिन और इओसिन (एच एंड ई) से दाग दिया गया था। (ख)सारांश रेखांकन C57BL/6 चूहों के लिए समय के साथ कान की मोटाई में वृद्धि दिखा रहा है कि Malassezia के संपर्क में थे या नियंत्रण के रूप में असंक्रमित छोड़ दिया । एम pachydermatis तनाव ATCC १४५२२-उजागर या वाहन का इलाज कान त्वचा की पूर्ण मोटाई हर समय बिंदु पर बाईं ओर प्रदर्शित किया जाता है; 0 दिन 0 पर बेसलाइन के सापेक्ष संकेत समय बिंदुओं पर कान की मोटाई में वृद्धि दाईं ओर दिखाया गया है। (C)C57BL/6 चूहों की त्वचा में फंगल बोझ जो एम पचिडडर्मैटिस से संक्रमित थे, एटीसीसी 14522 तनाव या जैतून के तेल के साथ एक नियंत्रण (वाहन) के रूप में इलाज किया जाता है। दोनों ही मामलों में त्वचा टेप से छीन ली गई । सारांश रेखांकन बी और सी में प्रत्येक प्रतीक एक जानवर का प्रतिनिधित्व करता है। समूहों के बीच मतभेदों के सांख्यिकीय महत्व की गणना एक तरह से ANOVA (बी) या छात्र के टी-टेस्ट (सी) का उपयोग करके की गई थी । पी एंड एलटी 0.001, ****p <0.0001, D.L.: डिटेक्शन लिमिट इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

यह प्रोटोकॉल मलासेज़िया पीपी द्वारा आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले इंब्रीड माउस स्ट्रेन C57BL/6 की त्वचा के संक्रमण का वर्णन करता है । इस प्रोटोकॉल को एक अलग आनुवंशिक पृष्ठभूमि (जैसे, बाल्ब/सी) या आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस के साथ अन्य माउस उपभेदों के लिए अनुकूलित करना उपभेदों को संक्रमण खुराक, विश्लेषण के समय बिंदु (एस) आदि के समायोजन की आवश्यकता हो सकती है। प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए, चूहों के समूह हमेशा एक ही उम्र और सेक्स के होने चाहिए। चूहों के स्रोत को स्थिर रखा जाना चाहिए, क्योंकि आनुवंशिक पृष्ठभूमि में मामूली परिवर्तन और माइक्रोबायोटा में अंतर, जो विक्रेताओं के बीच मौजूद है और एक प्रजनन सुविधा की विभिन्न इकाइयों के बीच भी मौजूद हो सकता है, पर अप्रत्याशित प्रभाव पड़ सकता है संक्रमण का कोर्स। इस प्रोटोकॉल में वर्णित मलासेज़िया संक्रमण मॉडल की स्थापना करते समय, संक्रमण के पाठ्यक्रम की सावधानीपूर्वक निगरानी करने के लिए एक प्रायोगिक अध्ययन करने की सलाह दी जाती है, जिसमें उपनिवेशीकरण की सीमा, कवक निकासी की गतिज और डिग्री शामिल है सूजन और विकृति जिसे प्रेरित किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, यदि कान की त्वचा संक्रमण से पहले बाधा बाधित होती है) इष्टतम परख की स्थिति निर्धारित करने के लिए।

प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने और प्रयोगात्मक समूहों के बीच मतभेदों का मज़बूती से पता लगाने के लिए, प्रति समूह उपयोग किए जाने वाले जानवरों की संख्या की गणना सांख्यिकीय विश्लेषण के आधार पर की जानी चाहिए । नमूना आकार की गणना प्रभाव आकार, त्रुटि दर और शक्ति के आधार पर की जाती है, जो प्रतिरक्षा प्रणाली में भिन्नता के कारण जैविक और प्रयोगात्मक विविधताओं (उदाहरण के लिए) पर विचार करती है। नैतिक कारणों से जानवरों की अनावश्यक रूप से अधिक संख्या का उपयोग करने से बचें। Malassezia त्वचा संक्रमण के बारे में, कवक के साथ केवल एक कान का इलाज और एक ही माउस के भीतर एक नियंत्रण के रूप में दूसरे कान का उपयोग कर, सलाह नहीं दी है क्योंकि चूहों दोनों कानों को कवक फैल सकता है जब संवारने । हालांकि, विभिन्न पद्धतिविज्ञान ी रीड आउट के लिए 1/2 कान का उपयोग करना जैसे फंगल बोझ का निर्धारण, प्रतिरक्षा कोशिकाओं का अलगाव या हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण अक्सर पर्याप्त होता है और इसके परिणामस्वरूप प्रयोगों के लिए उपयोग किए जाने वाले पशु संख्या में महत्वपूर्ण कमी आती है।

मलासेज़िया की 18 विभिन्न प्रजातियों को अद्यतित बताया गया है। मलसेज़िया जीनस के भीतर अंतर और इंट्राप्रजाति विविधताएं मेजबान के साथ बातचीत को प्रभावित कर सकती हैं, जैसा कि हमने अन्य मानव रोगजनक कवक13पर अध्ययन से भी सीखा है। विभिन्न Malassezia प्रजातियों और उपभेदों उनके मूल में अलग है (जैसे, एम pachydermatis सबसे अक्सर जानवरों से अलग प्रजातियों है, जबकि एम प्रतिबंधित, एम ग्लोबोसा और एम संगोष्ठी सबसे अधिक हैं विभिन्न त्वचा क्षेत्रों के बीच इन प्रजातियों के चर वितरण के साथ मनुष्यों में कवक त्वचा माइक्रोबायोम के प्रमुख सदस्य)। कुछ प्रजातियां commensalism के साथ जुड़े हुए हैं, जबकि दूसरों को और अधिक रोगजनक माना जाता है, हालांकि विस्तृत सबूत अपेक्षाकृत कमजोर रहता है । महत्वपूर्ण बात, कुछ प्रजातियों और उपभेदों स्वाभाविक रूप से दूसरों की तुलना में विकसित करने के लिए और अधिक कठिन हैं । इस प्रकार, संक्रमण के लिए किस प्रजाति/तनाव का उपयोग करने का निर्णय अनुसंधान प्रश्न पर आधारित होना चाहिए ।

कुछ माइक्रोबियल जीवों जैसे कैंडिडा एल्बिकान या स्टेफिलोकोकस ऑरियस के साथ मूत्र त्वचा के प्रायोगिक संक्रमण के लिए संक्रमण से पहले एपिडर्मल बाधा के व्यवधान की आवश्यकता होती है, उदाहरण के लिए, रेत के कागज14केसाथ, 15,16. इसके विपरीत, यहां वर्णित मालासेज़िया संक्रमण का मॉडल बाधा व्यवधान7के साथ और बिना समान रूप से कुशल है। यदि त्वचा को संक्रमण7से पहले टेप छीन लिया जाता है तो कवक द्वारा प्रेरित सूजन की डिग्री को बड़े पैमाने पर बढ़ाया जाता है । इसलिए, क्या मलसेज़िया के आवेदन से पहले त्वचा में हेरफेर किया जाना चाहिए शोध के सवाल पर निर्भर करता है। पुरानी और तीव्र त्वचा सूजन के विभिन्न मॉडल (उदाहरण के लिए, विलंबित प्रकार अतिसंवेदनशीलता (डीटीएच) और संपर्क अतिसंवेदनशीलता (सीएचएस) के लिए मॉडल और बाधा की कमी के मॉडल मौजूद हैं जो कॉममेंसल खमीर के योगदान की जांच के लिए रुचि रखते हैं त्वचा विकृतियों के लिए।

विशिष्ट रोगजनक मुक्त (एसपीएफ) शर्तों के तहत बनाए गए Inbred चूहों (हमारे ज्ञान के लिए) स्वाभाविक रूप से Malasseziaके साथ उपनिवेश नहीं हैं । इसलिए, माउस कान की त्वचा पर मलासेज़िया का प्रयोगात्मक अनुप्रयोग कवक के प्राथमिक संपर्क का प्रतिनिधित्व करता है जो मेजबान में एक तीव्र प्रतिक्रिया को प्रेरित करता है, जो बदले में 1 - 2 सप्ताह7के भीतर फंगल निकासी की ओर जाता है। जबकि इस प्रोटोकॉल में वर्णित मॉडल इसलिए केवल आंशिक रूप से इम्यूनोसक्षम मनुष्यों या अन्य मेजबान जीवों की स्थिति को दर्शाता है जो स्थायी रूप से Malasseziaके साथ उपनिवेश हैं, प्रयोगात्मक संक्रमण की पर्याप्त खिड़की की अनुमति देता है एंटीफंगल प्रतिरक्षा और सेलुलर और आणविक तंत्र का अध्ययन करने का अवसर जो इस प्रतिक्रिया को रेखांकित करते हैं। यह विभिन्न प्रयोगात्मक परिस्थितियों में विभिन्न Malassezia प्रजातियों और उपभेदों के जवाब में भिन्नता की जांच करने की अनुमति देता है (उदाहरण के लिए, त्वचा के बाधा व्यवधान के साथ और बिना)।

मलासेज़िया का अध्ययन - मेजबान बातचीत अतीत में संस्कृतियों में अलग सेल प्रकार (जैसे, keratinocyte सेल लाइनों, PBMCs) के साथ इन विट्रो प्रयोगों के लिए सीमित किया गया है। हालांकि इन अध्ययनों ने फंगल और होस्ट निर्धारकों पर कुछ प्रकाश डाला है जो मलासेज़िया और मेजबान17के बीच परस्पर क्रिया को आकार देते हैं, वे परिसर में कवक-मेजबान बातचीत की व्यापक समझ हासिल करने की अनुमति नहीं देते हैं त्वचा का वातावरण, जिसमें कई सेल प्रकार शामिल हैं जो लगातार संचार में हैं, जैसे कि केराटिनोसाइट्स, फाइब्रोब्लास्ट और ऊतक-निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाएं, लेकिन ल्यूकोसाइट आबादी भी जो ऊतक में केवल माइक्रोबियल मुठभेड़ पर घुसपैठ करती है त्वचा. इस बहुकोशिकीय नेटवर्क को इन विट्रो मॉडल में पूरी तरह से पुन: पेश नहीं किया जा सकता है, यहां तक कि सबसे उन्नत ऑर्गनॉइड सिस्टम के साथ भी। इस प्रकार, चूहों का प्रायोगिक संक्रमण अभी भी इम्यूनोलॉजी और संक्रामक रोग अनुसंधान में सोने के मानक का प्रतिनिधित्व करता है, और यहां वर्णित मॉडल की उपलब्धता मालासेज़िया अनुसंधान के क्षेत्र में एक सफलता का प्रतिनिधित्व करती है। महत्वपूर्ण बात, यह मॉडल अन्यथा बेफिक्र माउस कान की त्वचा पर Malassezia के epicutaneous आवेदन पर निर्भर करता है, और यह ऊतक में इंजेक्शन द्वारा कवक के टीका फंसाने नहीं है, जैसे, चमड़े या इंट्रापेरिटोनी, के रूप में पिछले अध्ययनोंमें 18की सूचना दी गई, जिनमें से दोनों स्वाभाविक रूप से उपनिवेश मेजबानों की स्थिति से अधिक दूर हैं।

अन्य उपलब्ध माउस मॉडल के साथ इस प्रोटोकॉल में वर्णित मालासेज़िया संक्रमण के मॉडल को संयोजित करने की संभावना आवेदन के दायरे और लचीलेपन को बहुत बढ़ाती है। उत्तरार्द्ध में विशिष्ट त्वचा विकारों के विभिन्न मॉडल शामिल हैं, जैसे बाधा की कमी का मॉडल जो एटोपिक डर्मेटाइटिस की महत्वपूर्ण विशेषताओं की नकल करता है, जो मनुष्यों और कुत्तों दोनों में मालासेज़िया से जुड़ी बीमारी है। इसके अलावा, Malassezia के साथ त्वचा के epicutaneous संक्रमण आसानी से ब्याज की मेजबान जीन में आनुवंशिक दोषों के साथ चूहों के लिए लागू किया जा सकता है, या चूहों जिसमें ब्याज की एक सेल प्रकार आनुवंशिक रूप से हटा रहे है या औषधीय रूप से समाप्त किया जा सकता है (जैसे, साधनों से डिप्थीरिया टॉक्सिन रिसेप्टर-व्यक्त चूहों में डिप्थीरिया टॉक्सिन प्रशासन की। इस तरह के मॉडल मलसेज़ियासहित कॉममेंसल और रोगजनक रोगाणुओं के लिए मेजबान प्रतिक्रिया को विच्छेदन करने और कवक-मेजबान बातचीत में इन जीन और सेल प्रकार की भूमिका का आकलन करने के लिए एक अपरिहार्य उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं। इस प्रोटोकॉल में वर्णित मलसेज़िया-मेजबानत्वचा संपर्क के विश्लेषणों का विस्तार अभी तक किया जा सकता है। इनमें हिस्टोलॉजी (उदाहरण के लिए, त्वचा विकृति की डिग्री या कवक द्वारा प्रेरित एपिडर्मल मोटाकरने की डिग्री निर्धारित करने के लिए), इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री या कोशिका प्रकार के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी का उपयोग करके ऊतक वर्गों के इम्यूनोफ्लोरेसेंटिंग द्वारा विश्लेषण शामिल हैं विशिष्ट मार्कर या ब्याज के अन्य अणु। इसमें कोशिकाओं के अलगाव (जैसे, ऊतक निवासी या ऊतक-घुसपैठ ल्यूकोसाइट सबसेट) संक्रमित त्वचा ऊतक से ध्रुवीकरण, विनियमन और बड़ी गहराई में मलासेज़िया की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए भी शामिल हो सकता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को स्विट्जरलैंड के ज़ुरिच विश्वविद्यालय ने समर्थन दिया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Sigma-Aldrich A1296-1KG
Attane Isoflurane Piramal Healthcare -
Biosaftey cabinet (BSC) Faster Ultra Safe DASIT GROUP TEC 5594 BSL2 certified
Centrifuge Eppendorf 5415D compatible with 2ml Eppendorf tubes
Dessicated Ox-bile Sigma-Aldrich 70168-100G
Eppendorf Tubes (2 ml) Eppendorf 0030 120.094
Glucose Sigma-Aldrich 49159-5KG
Gylcerol (99 %) Honeywell 10314830
Heating pad Eickenmeyer 648048
Incubator Hereaus B20 Heraeus 412047753 BSL2 certified
Ketasol (100 mg) Graeub AG 6680416
Magentic heating plate MR Hei-Standard Heidolph Instruments 442-1355
Malassezia spp. ATCC 14522, 14521, 42132
Malt extract Sigma-Aldrich 70167-500G
Multiply Biosphere Tubes (200 µl) Sarstedt AG 7084211 Safelock
Native olive oil - - commerc. available
Nonidet P40 Axon Lab A1694,0250
Oditest measurment devise Kroeplin S0247 range 0-5 mm
Oleic Acid Sigma-Aldrich 75090-5ML
Peptone Oxoid LP0037
Petri dishes Sarstedt AG 82.1473
Phosphat buffered salt solution (PBS, 1x) Amimed/Bioconcept 3-05F39
Rompun (2 %) Bayer KP0BFHR
Shaking incubator Infors Minitron Infors - BSL2 certified
Spectrometer Jenway 20308 optical density measurement at 600nm
Spectrometer Cuvettes Greiner Bio-One 613101
Stainless Steel balls (5mm) ABF KU.5G80 1.3541
Syringes 1 ml Sub-Q BD Bioscience 305501
Tissue Lyzer II Quiagen 85300
Transpore Hypoallergic Tape 3M 1527-1
Tween 40 Sigma-Aldrich P1504-100ML
Vitamin A Retinoli Palmitas Eye Cream BAUSCH & LOMB commerc. available

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References

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इम्यूनोलॉजी और इंफेक्शन इश्यू 153 मलासेज़िया,इंफेक्शन मॉडल माउस मॉडल स्किन होस्ट-पैमोजन इंटरैक्शन फंगल कॉमेसेल्ज़्म
मंगस-होस्ट इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए <em>मलासेज़िया</em> पीपी के साथ चूहों को संक्रमित करना
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Sparber, F., LeibundGut-Landmann, S. … More

Sparber, F., LeibundGut-Landmann, S. Infecting Mice with Malassezia spp. to Study the Fungus-Host Interaction. J. Vis. Exp. (153), e60175, doi:10.3791/60175 (2019).

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