Summary
Denne protokol skitserer etableringen af en musemodel til at studere Malassezia-Host interaktioner i huden. Det beskriver dyrkning af Malassezia in vitro, infektion af murine hud med Malassezia, og den efterfølgende analyse af inflammation og svampe byrden i hudvævet.
Abstract
Dyremodeller er afgørende for forskning i infektionssygdomme. De udgør et vigtigt grundlag for at analysere det fulde spektrum af interaktioner, der opstår mellem mikrober og deres vært in vivo på en vævs specifik måde. Patogene svampe er i stigende grad anerkendt som en alvorlig trussel for mennesker og udnytte sådanne infektion modeller har i høj grad forbedret vores forståelse af svampe patogenicitet. Arter af slægten Malassezia er de mest rigelige svampe af den menneskelige hud mikrobiota og de er også forbundet med udviklingen af alvorlige inflammatoriske hudlidelser såsom seborrheic dermatitis og atopisk dermatitis. Men, en årsagssammenhæng mellem Malassezia og sygdoms patogenese forbliver ukendt, en kendsgerning, der kan tilskrives den ringe viden om den komplekse krydstale af Malassezia med hudens immunsystem. Denne protokol beskriver etableringen af en eksperimentel musemodel, der gør det muligt at studere samspillet mellem Malassezia og pattedyrs hud in vivo. Det skitserer metoden til dyrkning af Malassezia spp. under laboratorieforhold, hvordan man inficere murine hud med Malassezia spp. og hvordan man vurderer udfaldet af infektion ved hjælp af huden inflammation og svampe byrde analyser. Den model, der beskrives her, virker i fuldt immunkompetente dyr og er ikke afhængig af immunsuppressiv eller antibiotika forbehandling af dyrene. Det kan desuden tilpasses til stort set alle genetisk modificerede muse stammer, og det kombineres med andre hudsygdoms modeller. Disse funktioner gør denne infektion model et meget kraftfuldt værktøj til at studere i detaljer den medfødte og adaptive immunrespons af værten mod Malassezia i huden in vivo.
Introduction
Huden er befolket af mange forskellige mikrober. Den konstante udsættelse af huden for mikrobiota bidrager til at forme og uddanne immunsystemet af værten. Svampe er i stigende grad anerkendt som en vital del af mikrobiota og de opfylder en vigtig rolle for vært fysiologi og immunitet, svarende til bakterier og vira1. Arter af slægten Malassezia er langt de mest rigelige svampe koloniserer huden af varmblodede hvirveldyr og de udgør mere end 90% af den menneskelige hud mycobiome2,3. Atten forskellige arter af Malassezia er hidtil blevet identificeret fra den menneskelige og animalske hud4.
Forskellige patologier af huden menes at opstå, i det mindste delvist, som følge af en dysbalanceret mikrobiota sammensætning. Dysbiosis kan føre til overvækst af arter med patogene potentiale resulterer i opportunistiske infektioner og sygdom5. Konsekvent, der er et stigende bevis for, at Malassezia, foruden sin kommensal livsstil, bidrager til udviklingen af forskellige hudpatologier, spænder fra skæl og pityriarsis versicolor til mere alvorlige inflammatoriske lidelser såsom som seborrheic dermatitis og atopisk dermatitis4,6. Mens en årsagssammenhæng mellem Malassezia og pityriarsis versicolor er blevet etableret, er den patofysiologiske rolle af svampen i mere alvorlige hudpatologier stort set ukendt.
Bestemmelse af rollen som Malassezia i huden homøostase og sygdom kræver mere dybtgående viden om samspillet mellem svampen med huden og det kutane immunsystem. Af note, forskning på Malassezia er, sammenlignet med andre humane svampe patogener (f. eks Candida albicans eller Aspergillus fumigatus), stadig i den spæde fase. Dette kan tilskrives vanskelighederne ved dyrkning af Malassezia under laboratorieforhold og manglen på egnede forsøgsmodeller til undersøgelse af svampen i kontakt med værten in vivo. Tidligere eksperimenter med isolerede celler i kulturen indikerede en bred vifte af direkte og indirekte interaktioner mellem Malassezia og forskellige immun-og ikke-immunceller7. Men disse in vitro eksperimenter kun delvist rekapitulere situationen i det komplekse hudmiljø in vivo, hvor talrige cellulære og molekylære hændelser optræder samtidig mellem svampen og forskellige celletyper.
Heri skitserer vi protokollen for en eksperimentel model af Malassezia hudinfektion i mus, som vi for nylig etablerede, for at studere svampen-Host interaktion i vivo7. Dette omfatter procedurer for (1) en vellykket dyrkning af Malassezia in vitro, (2) den epicutanholdige anvendelse af Malassezia på murine øre hud, og (3) de tekniske detaljer om, hvordan man analyserer Malassezia-induceret hud betændelse og svampe byrden af inficeret hud. Det er vigtigt, at denne model ikke er afhængig af immunsuppression (f. eks. af kortikosteroider) eller antibiotisk behandling af mus før infektion, da den praktiseres i andre musemodeller af svampeinfektion8,9. Til gengæld, det gør det muligt at studere det fulde spektrum af det medfødte og adaptive immunrespons mod Malassezia i den normale hud. Bemærk, at indavlede vildtype mus, der holdes under specifikt patogenfrie (SPF) tilstande, ikke er naturligt koloniseret med Malassezia , og at deres udsættelse for svampen ikke resulterer i vedvarende kolonisering, men fjernes fra værten inden for ca. 1,5 uger. Men, modellen giver mulighed for at studere mekanismerne for svampedræbende vært respons indledning og regulering, som igen, er grundlaget for, hvordan immun hukommelsen genereres. Modellen er alsidig, fordi den let kan anvendes på en lang række genetisk modificerede muse stammer, og den kan kombineres med andre eksisterende hudsygdoms modeller, såsom modeller af barriere mangel, for at undersøge virkningen af Malassezia under patologiske og inflammatoriske hudlidelser7. Derfor er den beskrevne model af eksperimentel Malassezia hudinfektion i mus giver en høj grad af fleksibilitet til at undersøge samspillet mellem svampen med hudens immunsystem i forbindelse med homøostase og sygdom.
Denne protokol beskriver den eksperimentelle hudinfektion hos mus med Malassezia spp. på grund af dets patogene potentiale er Malassezia spp. klassificeret som BSL2 patogener i nogle lande, herunder Schweiz. Tjek venligst de lokale retningslinjer og Følg reglerne fra de lokale myndigheder. BSL2-klassificerede organismer bør håndteres af uddannet personale under et BSL2 certificeret biosikkerheds kabinet (BSC). Biologisk affald, der er forurenet med BSL2-klassificerede organismer, samt slagtekroppe af mus, som er inficeret med sådanne organismer, bør autoklave inden bortskaffelse. Til forsøg med mus bør alle bestræbelser gøres for at minimere lidelser og sikre de højeste etiske og humane standarder i henhold til 3R-principperne (Erstat, forfine, Reducer)10. De eksperimenter, der er beskrevet i denne protokol, blev udført med m. pachydermatis (ATCC 14522), m. ylalkohol (ATCC 14521) og m. sympodialis (ATCC 42132)7.
Protocol
Alle de procedurer, der er beskrevet i denne protokol, blev udført i overensstemmelse med bekendtgørelsen om håndtering af organismer i de indesluttede systemer under forbundskontoret for miljø, Schweiz (www.bafu.admin.ch). Mus eksperimenter blev udført i nøje overensstemmelse med retningslinjerne for den schweiziske dyr beskyttelse lov og blev udført under de protokoller, der er godkendt af Veterinærkontoret i kantonen Zürich, Schweiz (licensnummer 168/2018).
1. dyrkning af Malassezia under laboratorieforhold
Bemærk: Opbevar alle reagenser og medier, der anvendes til denne protokol, ved stuetemperatur (RT, 20 – 25 °C), medmindre andet er angivet, da den lavere temperatur kan hæmme svampe væksten.
- Forbered flydende modificeret Dixon (mDixon) medium for Malassezia vækst. Til tilberedning af 500 mL flydende mDixon medium opløses 18 g malt ekstrakt, 10 g udtørret Ox-galde, 5 mL Tween-40, 3 g pepton, 1 mL glycerol og 1 mL oliesyre i 500 mL destilleret H2o (DH2o). Juster mediet til pH 6 med HCl og autoklave. Opbevar mediet på RT.
- Forbered mDixon-agarpladerne ved at tilsætte 7,5 g agar til 500 mL mDixon medium før autoklave Rens. Langsomt afkøles mDixon-agar efter autoklaveringen ved hjælp af en styrestang og en magnetisk varmeplade for at undgå partiel størkning af mediet under afkøling.
- Når agar er kølet ned til 50 – 60 °C, dispenserer væsken til Petri skåle i en laminar flow hætte og lad dem tørre på RT natten.
Bemærk: agarpladerne kan opbevares ved 4 °C i flere uger, når de pakkes ind og holdes på hovedet for at undgå fordampning. - Opnå Malassezia isolater og genoplive frysetørret lagre af Malassezia i henhold til instruktionerne fra udbyderen.
- 10 mL flydende mDixon-medium inokuleres i en steril 100 mL Erlenmeyer-kolbe med den genoplivende Malassezia -suspension i henhold til de anvisninger, som leverandøren har indhentet. Inkubér kulturen i en ryste kubator ved 30 °C og 180 rpm.
- Undersøg væksten af Malassezia kultur regelmæssigt ved at kontrollere for udseendet af creme farve og turbiditet. Vækst kinetik afhænger af arten og stammen af Malassezia og kan være særligt langsom, når Malassezia er frisk genoplivet fra en frysetørret bestand. (Figur 1A).
- Forbered glycerol bestande ved at blande 3 dele af den tæt dyrkede Malassezia kultur i mdixon medium med 1 del af steril 99% glycerol. Aliquot Malassezia/glycerol blandingen i sterile skruelåg og opbevares ved-80 °c.
- For in vitro-formering, plade Malassezia fra den flydende kultur i mdixon eller fra den frosne glycerol bestand på en mdixon agar plade (bragt til rt fra 4 °c) ved hjælp af en inokulering loop.
Bemærk: Overfør mDixon agar plader til RT fra 4 °C før brug, da kold mDixon agar hæmmer svampevækst. - Agarpladen (-erne) inkubates med Malassezia på hovedet i en (ikke-rysten) inkubator ved 30 °c. Undersøg væksten af Malassezia kolonier regelmæssigt.
Bemærk: Malassezia kolonier på mdixon agar plader vises inden for 3-5 dage og er cremefarvet kedelig, glat med konveks elevation (figur 1B). - Opbevar Malassezia kolonier på mdixon agar plader på rt for ~ 2 uger. Forbered derefter en ny mdixon-agarplade ved at striber Malassezia fra det frosne glycerol lager som beskrevet i 1,7.
2. klargøring af inokulum til eksperimentel Malassezia infektion af mus
- 10 mL flydende mDixon-medium inokuleres i en steril 100 mL Erlenmeyer-kolbe med 3-5 individuelle Malassezia -kolonier fra en mdixon-agarplade (Se trin 1, figur 1B).
- Incubate Malassezia kulturen for ~ 48 til 96 h ved 30 °c og 180 rpm, indtil kulturen er cremefarvet og uklar (figur 1A).
Bemærk: den tid, der er nødvendig for Malassezia vækst afhænger af Malassezia arter og stamme og mængden af svamp anvendes til inokulation. - 2 mL af Malassezia -kulturen overføres til et sterilt 2 ml mikrocentrifuge glas og centrifugeres i 1 min ved 10.000 x g.
- Supernatanten kasseres, og pelleten vaskes ved suspension i 1 mL phosphatbufferet saltopløsning (PBS). Centrifugeres igen i 1 min ved 10.000 x g.
- Efter vask, suspension af pellet i 1 mL PBS ved kraftig pipettering og måle den optiske tæthed af opløsningen ved 600 nm (ODA600) ved hjælp af et spektrometer. Fortynd Malassezia suspension 20 – 50 x med PBS for OD måling for at sikre, at læsningen er mellem 0,1 og 1.
Bemærk: tætheden af en 3-dages kultur Malassezia varierer generelt mellem 15 og 30 ODA600, afhængigt af Malassezia arter og stamme og på antallet af gærceller, der anvendes til inokulering af kulturen (trin 2,1). Malassezia har tendens til at danne aggregater, derfor er kraftig pipettering nødvendig for at sikre homogeniteten af suspensionen. - Alikvot volumen af Malassezia -suspensionen i PBS, der svarer til en densitet på 4 ODA600 i et sterilt 2 ml rør. Forbered 1 Tube pr. dyr til at blive smittet.
- De rør, der indeholder Malassezia , centrifugeres i 1 min ved 10.000 x g.
- Supernatanten kasseres, og Malassezia -pellets suspenderes i 200 μl oprindelig olivenolie (svarende til 2 ODA600 gærceller/100 μl olivenolie).
Bemærk: olivenolie blev fundet at være et godt middel til timer infektion med Malassezia, som Malassezia er en lipofili og lipid-afhængige gær. Olivenolie absorberes bedre af huden end PBS. Men vær opmærksom på, at det ikke er let at suspendere Malassezia i olivenolie. Forbedre Malassezia/olivenolie suspension ved vortexing. Opbevar suspensionen ved RT, indtil den bruges til infektion. - Forbered rør med olivenolie alene til mock infektion af kontroldyrene.
3. inficerer mus med Malassezia
- Bestil kvindelige C57BL/6 mus i en alder af 6-8 uger og give dem mulighed for at akklimatisere i forsøgsdyr facilitet i mindst en uge. Beregn for 3-5 mus pr. gruppe, herunder en ikke-inficeret kontrolgruppe.
- Forbered steril bedøvelsesmiddel cocktail indeholdende 1,3 mg/mL xylazin og 6,5 mg/mL ketamin i PBS. 5 mL bedøvelsesmiddel cocktail er nok til at bedøve 20 dyr. Juster mængden af cocktail i henhold til antallet af dyr, der skal bedøvet.
- Bedøv dyrene ved at injicere 10 μL/g kropsvægt af bedøvelsesmiddel cocktail intraperitonealt (svarende til 65 mg ketamin og 13 mg Xylazine pr. kg legemsvægt) og Placer de bedøvede dyr på en varmepude ved 37 °C.
Bemærk: ved den angivne dosis forbliver dyrene normalt bedøvet i ~ 30-60 min.
- Bedøv dyrene ved at injicere 10 μL/g kropsvægt af bedøvelsesmiddel cocktail intraperitonealt (svarende til 65 mg ketamin og 13 mg Xylazine pr. kg legemsvægt) og Placer de bedøvede dyr på en varmepude ved 37 °C.
- Kontroller reflekserne ved at klemme den bageste fod med pincet for at sikre, at dyrene er fuldt bedøvet.
- Påfør en øjencreme på øjnene for at forhindre dehydrering under anæstesi.
- Valgfrit, mål øretykkelsen af begge ører ved hjælp af en kaliber (0-5 mm rækkevidde). Mål to forskellige områder af hvert øre, og Beregn den gennemsnitlige øretykkelse pr. øre.
Bemærk: måling af øretykkelse er valgfri og afhænger af forskningsspørgsmålet. Men hvis øretykkelsen bruges som en udlæser til betændelse i huden, er det nødvendigt at måle den grundlæggende øre tykkelse før infektion. (Se trin 4). - Du skal eventuelt afbryde den epidermale barriere i rygørehuden ved let tape stripping: manuelt anvende et lille stykke tape på huden og fjerne det igen. Gentag i 5 på hinanden følgende runder med et nyt stykke tape til hver runde.
Bemærk: Malassezia inducerer en mere udtalt hudbetændelse i barriere forstyrret hud sammenlignet med uperturbed hud (figur 2a)7. - Anvend topisk 100 μL (2 ODA600) af Malassezia/Olive Oil suspension på Rygsiden af hvert øre ved hjælp af en steril pipette. Omfatte en kontrolgruppe af dyr, der kun behandles med olivenolie (køretøjs behandlet kontrolgruppe).
Bemærk: vortex Malassezia/olivenolie suspensionen kraftigt for at sikre en homogen Malassezia suspension umiddelbart før påføring. - Efterlad de bedøvede dyr på varmepuden for at undgå hypotermi, indtil de viser tegn på helbredelse (Whisker bevægelse, øget vejrtrækningshastighed, etc.).
- Injicer 200 μl steril og forvarmet 2% glucoseopløsning subkutant i nakke fold for at understøtte deres metabolisme og rehydrering.
Bemærk: for at tilberede en steril 2% glucoseopløsning opløses 1 mg glucose i 50 mL PBS og filtreres med et 0,2 μm filter. Opløsningen kan opbevares ved 4 °C. - Overfør dyrene tilbage til deres bur.
4. analyse af Malassezia-induceret hudbetændelse
Bemærk: denne procedure beskriver analysen af Malassezia-induceret øre hævelse under infektion, der tjener som en parameter af betændelse i huden. En forudsætning for at analysere svampen-induceret øre hævelse er at måle grundlæggende øre tykkelse før tape-stripping og/eller infektion (trin 3,5).
- Forbered isofluran kammer til kort tids anæstesi af Malassezia-inficerede og kontrol dyr.
- Overføre et dyr ad gangen til kammeret og vente på, at dyret er fuldt bedøvet.
Bemærk: tegn på ordentlig anæstesi omfatter komplet krops afslapning samt langsom og tung (flanken) vejrtrækning. Omhyggeligt overvåge anæstesi som udvidet udsættelse for isofluran kan være dødelig. - Fjern dyret fra kammeret og Anbring det på et væv.
- Mål tykkelsen af øret (s) ved hjælp af en kaliber (rækkevidde 0-5 mm). Mål to forskellige områder af hvert øre, og Beregn den gennemsnitlige tykkelse pr. øre (Se trin 3,5).
- Overfør dyret tilbage til buret.
Bemærk: isofluran anæstesi er meget kortvarig, og dyrene restituere inden ~ 30 s efter fjernelse fra isofluran kammer. - Beregn stigningen i øretykkelse ved at trække den gennemsnitlige øretykkelse, målt før tape stripping og/eller infektion, fra den gennemsnitlige øretykkelse målt ved hvert tidspunkt efter infektion.
- De beregnede værdier afbildes som stigningen i øretykkelsen eller alternativt som den totale øretykkelse over tid for hvert dyr eller gruppe af dyr (figur 2B).
5. analyse af svampe byrden i den inficerede hud
- Der fremstilles et sterilt 2 mL mikrocentrifuge glas til hvert øre, som skal høstes, indeholdende 0,5 mL steril 0,05% NP40 i dH2O og en autoklave stålkugle (5 mm diameter).
- Veje rørene ved hjælp af en præcision balance og nedskrive den nøjagtige vægt.
- Euthanize musene ved CO2 kvælning.
- Fjern øret (erne) ved foden, og overfør det til røret, der indeholder 0,5 mL steril 0,05% NP40 i dH2O, som beskrevet i trin 5,1-5,2.
- Afvejes røret, der indeholder ørevævet, og Beregn den faktiske vægt af hver prøve ved at fratrække vægten af røret uden orgel fra vægten af røret med organet.
- Ørevævet homogeniseres i 6 minutter ved 25 Hz ved hjælp af en vævs homogenisator. Sørg for, at vævet er godt homogeniseret.
- Plade 100 μL af hver prøve (svarende til 1/5 af hver homogenat, fortyndingsfaktor = 5) på mDixon agar plader og Inkubér pladerne på hovedet i en 30 °C inkubator.
Bemærk: mængden af homogenatet belagte skal justeres i henhold til den svampe belastning, der kan forventes. Sørg for at plade tilstrækkelig homogen for at opnå mindst 10 og ikke mere end 250 kolonier pr. plade for at tillade nem optælling. Eventuelt plade flere plader pr. prøve med forskellige fortyndinger af homogenate. - Undersøg væksten af Malassezia kolonier regelmæssigt.
Bemærk: kolonier bliver normalt synlige efter 2-3 dage. Den tid, det er nødvendigt for Malassezia kolonier til at vokse afhænger af arten og stamme af Malassezia. - Tæl kolonierne pr. plade.
- Beregn antallet af CFU/g-væv ved hjælp af følgende formel:
CFU/g væv = (antal kolonier/plader) x (fortyndingsfaktor)/(vægt af hudprøven i g).
Bemærk: den omtrentlige minimums detektionsgrænse kan vurderes ved hjælp af følgende formel: minimal detektionsgrænse = (1 koloni/plade) x (fortyndingsfaktor)/(gennemsnitsvægt af alle hudprøver i g). - Svampe belastninger afbildes sædvanligvis på en logaritmisk skala (figur 2C).
Representative Results
In vitro dyrkning af Malassezia
Sammenlignet med andre mere almindeligt anvendte svampe model patogener såsom C. albicans eller A. fumigatus, Malassezia er vanskeligere at kultur in vitro. Dette kan tilskrives det faktum, at Malassezia er afhængig af eksogene lipidkilder for sine ernæringsmæssige krav, på grund af sin manglende evne til at syntetisere fedtsyrer11. Mdixon-mediet er velegnet til dyrkning af flere Malassezia -arter, herunder m. pachydermatis, m. ylalkohol, m. sympodialis, m. slooffiae, m. globosa og m. yamatoensis in vitro7 ,12. Figur 1 viser repræsentative billeder for væksten af M. sympodialis i flydende mDixon medium og på mdixon agar som beskrevet i trin 1 og trin 2.
Analyse af hudbetændelse og svampe byrde af Malassezia hudbetændelse
Eksponering af Malassezia til mus øre hud, der var barriere forstyrret af tape-stripping før infektion resulterer i forværret betændelse i huden, karakteriseret ved epidermal og dermal hyperplasi og udvikling af ødem7. Trin 4 og 5 skitserer metoderne til analyse af Malassezia-induceret øre hævelse og svampe byrden af huden. Begge parametre repræsenterer nøgle udlæsninger til overvågning af infektionsforløbet. Figur 2A illustrerer stigningen i øretykkelse, der kan observeres efter M. furpels udsættelse for hud, der var barriere-forstyrret i forhold til UPERTURBED hud af WT C57BL/6 mus. Figur 2B viser en repræsentativ oversigts graf over stigningen i øretykkelse over tid. Figur 2C viser svampe byrden i ørehuden på dag 2 efter infektion med M. pachydermatis.
Figur 1: in vitro dyrkning af Malassezia.
(A) M. sympodialis stamme ATCC 42132 dyrket i 3 dage ved 30 °c og 180 rpm i flydende mdixon medium (venstre) ved siden af en kontrol Erlenmeyer kolbe indeholdende mdixon medium, der ikke blev podet (højre). B) kolonier af M. sympodialis stamme ATCC 42132 på mdixon agar efter 5 dages inkubation ved 30 °c. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: analyse af Malassezia hudinfektion på grundlag af øre tykkelse og svampe byrde.
(A) histologi af øresektioner opnået fra C57BL/6 mus, der blev behandlet med olivenolie (køretøj, venstre) eller inficeret med M. ylalkohol stamme JPLK23 i 5 dage (midten og højre). Til højre var ørehuden tape-strippet før infektion. Sektioner blev plettet med hematoxylinlegemer og eosin (H & E). B) oversigts grafer, der viser stigningen i øretykkelse over tid for C57BL/6-mus, som blev eksponeret for Malassezia , eller som ikke blev inficeret som kontrolelementer. Den absolutte tykkelse af M. pachydermatis stamme atcc 14522-eksponeret eller køretøj-behandlet øre hud på hvert tidspunkt vises til venstre; stigningen i øretykkelsen på de angivne tidspunkter i forhold til baseline på dag 0 vises til højre. C) svampe byrde i huden på C57BL/6 mus, der er inficeret med M. pachydermatis stamme ATCC 14522 eller behandlet med olivenolie som en kontrol (køretøj). I begge tilfælde var huden tape-strippet. Hvert symbol i oversigts grafen B og C repræsenterer ét dyr. Den statistiske betydning af forskellene mellem grupperne blev beregnet ved hjælp af en-vejs ANOVA (B) eller elevens t-test (C). p < 0,001, * * * * p < 0.0001, D.L.: detektionsgrænse Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Denne protokol beskriver infektion af huden af den almindeligt anvendte indavlede musestamme C57BL/6 af Malassezia spp. tilpasning af denne protokol til andre muse stammer med en anden genetisk baggrund (f. eks. Balb/c) eller til genetisk modificerede mus stammer kan have behov for justering af infektionen dosis, tidspunkt (r) analyse, etc. For at sikre reproducerbarhed bør grupper af mus altid være af samme alder og køn. Kilden til mus bør holdes stabil, da selv små ændringer i den genetiske baggrund og forskellene i mikrobiota, der findes mellem leverandører og kan eksistere selv mellem forskellige enheder af et enkelt avls anlæg, kan have en uforudsigelig indvirkning på løbet af infektionen. Når du konfigurerer Malassezia infektion model, der er beskrevet i denne protokol, anbefales det at udføre en pilotundersøgelse for nøje at overvåge forløbet af infektion, herunder omfanget af kolonisering, kinetik af svampe clearance og graden af betændelse og patologi, der kan blive induceret (f. eks. Hvis ørehuden er forstyrret af barrieren før infektion) for at bestemme de optimale analysebetingelser.
For at sikre reproducerbarhed og for pålideligt at påvise forskelle mellem forsøgsgrupperne skal antallet af dyr, der anvendes pr. gruppe, beregnes på grundlag af den statistiske analyse. Stikprøvestørrelsen beregnes på grundlag af effekt størrelse, fejlfrekvens og effekt, som tager hensyn til biologiske og eksperimentelle variationer (f. eks. på grund af variation i immunsystemet). Af etiske grunde undgå unødigt højt antal dyr. Med hensyn til Malassezia hudinfektion, behandling kun det ene øre med svampen og ved hjælp af det andet øre som en kontrol inden for samme mus, tilrådes ikke, fordi mus kan sprede svampen til begge ører, når grooming. Men ved hjælp af 1/2 øre til forskellige metodologiske aflæsninger såsom bestemmelse af svampe byrde, isolering af immunceller eller histologisk analyse er ofte nok og resulterer i en signifikant reduktion i antallet af dyr, der anvendes til forsøg.
18 forskellige arter af Malassezia er blevet beskrevet op til dato. Inter-og intraspecies variationer inden for slægten Malassezia kan påvirke samspillet med værten, som vi også har lært af undersøgelser af andre humane patogene svampe13. Forskellige Malassezia arter og stammer afviger i deres oprindelse (f. eks m. pachydermatis er de hyppigste arter isoleret fra dyr, mens m. restricta, m. globosa og m. sympodialis er de mest fremtrædende medlemmer af det svampe hudmikrobiom hos mennesker med variabel fordeling af disse arter mellem forskellige hudområder). Nogle arter har været forbundet med commensalism, mens andre menes at være mere sygdomsfremkaldende, selv om detaljerede beviser er relativt svage. Vigtigere er, at nogle arter og stammer er i sagens natur vanskeligere at vokse end andre. Beslutningen om, hvilken art/stamme, der skal anvendes til infektionen, skal derfor baseres på forskningsspørgsmålet.
Eksperimentel infektion af murine huden med nogle mikrobielle organismer såsom Candida albicans eller Staphylococcus aureus kræver afbrydelse af epidermal barriere før infektion, f. eks, med sandpapir14, 15,16. I modsætning hertil er den model af Malassezia infektion, der er beskrevet her, lige så effektiv med og uden barriere forstyrrelse7. Graden af betændelse induceret af svampen er massivt forbedret, hvis huden er tape strippet før infektion7. Derfor, om huden skal manipuleres, før anvendelsen af Malassezia afhænger af forskningen spørgsmål. Der findes forskellige modeller for kronisk og akut hudbetændelse (f. eks. modeller for forsinket type overfølsomhed (DTH) og kontakt overfølsomhed (CHS)) og modeller for barriere mangel, som kan være af interesse for at undersøge bidraget fra kommensal gær til hudpatologier.
Indavlede mus opretholdes under specifikt patogenfrie (SPF) betingelser er (til vores kendskab) ikke naturligt koloniseret med Malassezia. Derfor, den eksperimentelle anvendelse af Malassezia til muse øre hud repræsenterer en primær eksponering for svampen, der inducerer en akut respons i værten, hvilket igen fører til svampe clearance inden for 1-2 uger7. Mens den model, der er beskrevet i denne protokol, derfor kun delvist afspejler situationen hos immunkompetente mennesker eller andre værtsorganismer, som er permanent koloniseret med Malassezia, tillader den eksperimentelle infektion en rigelig vindue af mulighed for at studere svampedræbende immunitet og de cellulære og molekylære mekanismer, der ligger til grund for dette respons. Det giver også mulighed for at undersøge variationer i reaktionen på forskellige Malassezia arter og stammer under forskellige eksperimentelle betingelser (f. eks, med og uden barriere forstyrrelse af huden).
Studiet af Malassezia -Host interaktioner har været begrænset i fortiden til in vitro eksperimenter med isolerede celletyper i kulturer (f. eks keratinocytproliferation cellelinjer, PBMCs). Selv om disse undersøgelser har kastet lys over svampe-og værts determinanter, der former samspillet mellem Malassezia og værten17, tillader de ikke at få en omfattende forståelse af svampen-Host interaktion i komplekset miljø i huden, som involverer flere celletyper, der er i konstant kommunikation, såsom keratinocytter, fibroblaster og væv-residente immunceller, men også leukocyt populationer, der infiltrerer vævet kun ved mikrobiel møde af Hud. Dette multicellulære netværk kan ikke gengives fuldt ud i in vitro-modellerne, selv med de fleste avancerede organoid-systemer. Således, den eksperimentelle infektion af mus stadig repræsenterer den gyldne standard i immunologi og infektionssygdomme forskning, og tilgængeligheden af den model, der er beskrevet her, repræsenterer et gennembrud inden for Malassezia forskning. Det er vigtigt, at denne model er afhængig af den epicutanske anvendelse af Malassezia på den ellers uperturerede muse ørepude, og den implicerer ikke inokulering af svampen ved injektion i vævet, fx subkutant eller intraperitonealt, da tidligere undersøgelser rapporterede18, som begge er mere fjernt fra situationen i naturligt koloniserede værter.
Muligheden for at kombinere den model af Malassezia infektion, der er beskrevet i denne protokol med andre tilgængelige musemodeller i høj grad øger omfanget og fleksibiliteten af ansøgningen. Sidstnævnte omfatter forskellige modeller af specifikke hudlidelser, såsom den model af barriere mangel, der efterligner vigtige funktioner i atopisk dermatitis, en sygdom forbundet med Malassezia i både mennesker og hunde. Desuden kan epiinfeksive infektioner i huden med Malassezia let anvendes på mus med genetiske defekter i værts gener af interesse, eller mus, hvor en celletype af interesse er genetisk slettet eller kan være farmakologisk forarmet (f. eks., ved hjælp af difteri-toksin administration i difteri-toksin receptor-udtrykte mus). Sådanne modeller repræsenterer et uundgåeligt redskab til at dissekere værten respons på kommensal og patogene mikrober, herunder Malassezia, og til at vurdere rollen af disse gener og celletype i svampen-vært interaktion. Analyserne af Malassezia-Host hud interaktion kan udvides langt ud over, hvad der er beskrevet i denne protokol. Disse omfatter analyser af histologi (fx for at bestemme graden af hudpatologi eller epidermal fortykkelse induceret af svampen), ved Immunohistokemi eller immunfluorescent farvning af vævs sektioner ved hjælp af antistoffer rettet mod celletype specifikke markører eller andre molekyler af interesse. Det kan også indebære isolering af celler (f. eks, vævs beboer eller vævs infiltrerende leukocyt-undergrupper) fra det inficerede hudvæv for at studere polariseringen, reguleringen og dynamikken i immunresponset over for Malassezia i stor dybde.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af universitetet i Zürich, Schweiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | |
| Attane Isoflurane | Piramal Healthcare | - | |
| Biosaftey cabinet (BSC) Faster Ultra Safe | DASIT GROUP | TEC 5594 | BSL2 certified |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415D | compatible with 2ml Eppendorf tubes |
| Dessicated Ox-bile | Sigma-Aldrich | 70168-100G | |
| Eppendorf Tubes (2 ml) | Eppendorf | 0030 120.094 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 49159-5KG | |
| Gylcerol (99 %) | Honeywell | 10314830 | |
| Heating pad | Eickenmeyer | 648048 | |
| Incubator Hereaus B20 | Heraeus | 412047753 | BSL2 certified |
| Ketasol (100 mg) | Graeub AG | 6680416 | |
| Magentic heating plate MR Hei-Standard | Heidolph Instruments | 442-1355 | |
| Malassezia spp. | ATCC | 14522, 14521, 42132 | |
| Malt extract | Sigma-Aldrich | 70167-500G | |
| Multiply Biosphere Tubes (200 µl) | Sarstedt AG | 7084211 | Safelock |
| Native olive oil | - | - | commerc. available |
| Nonidet P40 | Axon Lab | A1694,0250 | |
| Oditest measurment devise | Kroeplin | S0247 | range 0-5 mm |
| Oleic Acid | Sigma-Aldrich | 75090-5ML | |
| Peptone | Oxoid | LP0037 | |
| Petri dishes | Sarstedt AG | 82.1473 | |
| Phosphat buffered salt solution (PBS, 1x) | Amimed/Bioconcept | 3-05F39 | |
| Rompun (2 %) | Bayer | KP0BFHR | |
| Shaking incubator Infors Minitron | Infors | - | BSL2 certified |
| Spectrometer | Jenway | 20308 | optical density measurement at 600nm |
| Spectrometer Cuvettes | Greiner Bio-One | 613101 | |
| Stainless Steel balls (5mm) | ABF | KU.5G80 1.3541 | |
| Syringes 1 ml Sub-Q | BD Bioscience | 305501 | |
| Tissue Lyzer II | Quiagen | 85300 | |
| Transpore Hypoallergic Tape | 3M | 1527-1 | |
| Tween 40 | Sigma-Aldrich | P1504-100ML | |
| Vitamin A Retinoli Palmitas Eye Cream | BAUSCH & LOMB | commerc. available |
References
- Iliev, I. D., Leonardi, I. Fungal dysbiosis: immunity and interactions at mucosal barriers. Nature Reviews Immunology. 17 (10), 635-646 (2017).
- Findley, K., et al. Topographic diversity of fungal and bacterial communities in human skin. Nature. 498 (7454), 367-370 (2013).
- Gemmer, C. M., DeAngelis, Y. M., Theelen, B., Boekhout, T., Dawson, T. L. Fast, noninvasive method for molecular detection and differentiation of Malassezia yeast species on human skin and application of the method to dandruff microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 40 (9), 3350-3357 (2002).
- Theelen, B., et al. Malassezia ecology, pathophysiology, and treatment. Medical Mycology. 56, suppl_1 10-25 (2018).
- Williams, M. R., Gallo, R. L. The role of the skin microbiome in atopic dermatitis. Current Allergy and Asthma Reports. 15 (11), 65 (2015).
- Malassezia and the Skin. , Springer. (2010).
- Sparber, F., et al. The Skin Commensal Yeast Malassezia Triggers a Type 17 Response that Coordinates Anti-fungal Immunity and Exacerbates Skin Inflammation. Cell Host Microbe. 25 (3), 389-403 (2019).
- Koh, A. Y. Murine models of Candida gastrointestinal colonization and dissemination. Eukaryotic Cell. 12 (11), 1416-1422 (2013).
- Solis, N. V., Filler, S. G. Mouse model of oropharyngeal candidiasis. Nature Protocols. 7 (4), 637-642 (2012).
- Russel, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , Methuen & Co. London. (1959).
- Wu, G., et al. Genus-Wide Comparative Genomics of Malassezia Delineates Its Phylogeny, Physiology, and Niche Adaptation on Human Skin. PLoS Genetics. 11 (11), 1005614 (2015).
- Leong, C., Buttafuoco, A., Glatz, M., Bosshard, P. P. Antifungal Susceptibility Testing of Malassezia spp. with an Optimized Colorimetric Broth Microdilution Method. Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1883-1893 (2017).
- Schonherr, F. A., et al. The intraspecies diversity of C. albicans triggers qualitatively and temporally distinct host responses that determine the balance between commensalism and pathogenicity. Mucosal Immunology. 10 (5), 1335-1350 (2017).
- Igyarto, B. Z., et al. Skin-resident murine dendritic cell subsets promote distinct and opposing antigen-specific T helper cell responses. Immunity. 35 (2), 260-272 (2011).
- Liu, H., et al. Staphylococcus aureus Epicutaneous Exposure Drives Skin Inflammation via IL-36-Mediated T Cell Responses. Cell Host Microbe. 22 (5), 653-666 (2017).
- Nakagawa, S., et al. Staphylococcus aureus Virulent PSMalpha Peptides Induce Keratinocyte Alarmin Release to Orchestrate IL-17-Dependent Skin Inflammation. Cell Host Microbe. 22 (5), 667-677 (2017).
- Sparber, F., LeibundGut-Landmann, S. Host Responses to Malassezia spp. in the Mammalian Skin. Frontiers in Immunology. 8, 1614 (2017).
- Yamasaki, S., et al. C-type lectin Mincle is an activating receptor for pathogenic fungus, Malassezia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (6), 1897-1902 (2009).
