Summary
Denne protokollen skisserer etablering av en musemodell for å studere Malassezia-vert interaksjoner i huden. Den beskriver dyrking av Malassezia in vitro, infeksjonen av murine hud med Malassezia, og den påfølgende analyse av betennelsen og sopp belastningen i hud vevet.
Abstract
Animal modeller er avgjørende for smittsomme sykdommer forskning. De gir et viktig grunnlag for å analysere hele spekteret av interaksjoner som oppstår mellom mikrober og deres vert in vivo i en vev-spesifikk måte. Patogene sopp er i økende grad anerkjent som en alvorlig trussel for mennesker og utnytte slike infeksjons modeller har kraftig forbedret vår forståelse av fungal patogenitet. Arter av slekten Malassezia er de mest tallrike sopp av den menneskelige huden bakterieflora og de er også forbundet med utvikling av alvorlige inflammatoriske hudsykdommer som seboreisk dermatitt og atopisk dermatitt. Men en utløsende sammenheng mellom Malassezia og sykdom patogenesen forblir ukjent, et faktum som kan tilskrives den dårlige kunnskapen om den komplekse crosstalk av Malassezia med hudens immunsystem. Denne protokollen beskriver etablering av en eksperimentell mus modell som gjør det mulig å studere samspillet mellom Malassezia med pattedyr huden in vivo. Den skisserer metoden for dyrking Malassezia spp. under laboratorieforhold, hvordan å infisere murine huden med Malassezia spp. og hvordan å vurdere utfallet av infeksjonen ved hjelp av huden betennelser og sopp byrde analyser. Modellen er beskrevet her fungerer i fullt immunkompetente dyr og ikke stole på immun undertrykkende eller antibiotika forbehandling av dyrene. Det er dessuten tilpasningsdyktig til nesten alle genmodifiserte mus stammer og kan kombineres med andre hudsykdom modeller. Disse funksjonene gjør denne infeksjonen modellen et svært kraftig verktøy for å studere i detalj medfødt og adaptive immunrespons av verten mot Malassezia i huden in vivo.
Introduction
Huden er befolket av mange forskjellige mikrober. Den konstante eksponeringen av huden til bakterieflora bidrar til å forme og utdanne immunsystemet til verten. Sopp blir stadig mer anerkjent som en viktig del av bakterieflora og de oppfyller en viktig rolle for verts fysiologi og immunitet, ligner på bakterier og virus1. Arter av slekten Malassezia er den desidert mest tallrike sopp kolonisere huden av varm-blods virveldyr og de gjør opp for mer enn 90% av den menneskelige huden mycobiome2,3. Atten forskjellige arter av Malassezia har så langt blitt identifisert fra menneske og dyr hud4.
Ulike sykdommer i huden antas å oppstå, i hvert fall delvis, som et resultat av en dysbalanced bakterieflora sammensetning. Dysbiosis kan føre til overvekst av arter med patogene potensial som resulterer i opportunistiske infeksjoner og sykdom5. Konsekvent, det er en økende bevis for at Malassezia, foruten sin Commensal livsstil, bidrar til utvikling av ulike hudsykdommer, alt fra flass og pityriarsis versicolor til mer alvorlige inflammatoriske lidelser som seboreisk dermatitt og atopisk dermatitt4,6. Mens en utløsende ledd mellom Malassezia og pityriarsis versicolor er etablert, er patofysiologiske rolle soppen i mer alvorlige hudsykdommer fortsatt i stor grad ukjent.
Bestemme rollen til Malassezia i huden homeostase og sykdom krever mer inngående kunnskap om samspillet av soppen med hud og hud immunsystem. Av notatet, forskning på Malassezia er, sammenlignet med andre humane fungal patogener (f. eks, Candida albicans eller Aspergillus fumigatus), fortsatt i den nyopprettede scenen. Dette kan tilskrives vanskeligheten i dyrking av Malassezia under laboratorieforhold og mangelen på egnede eksperimentelle modeller for å studere soppen i kontakt med verten in vivo. Tidligere eksperimenter med isolerte celler i kulturen indikerte et bredt spekter av direkte og indirekte interaksjoner mellom Malassezia og ulike immun-og ikke-immune celler7. Men disse in vitro eksperimenter bare delvis recapitulate situasjonen av den komplekse hud miljø in vivo der mange cellulære og molekylære hendelser oppstår samtidig mellom soppen og ulike celletyper.
Her skisserer vi protokollen for en eksperimentell modell av Malassezia hud infeksjon i mus, som vi nylig har etablert, for å studere sopp-vert samhandling i vivo7. Dette inkluderer prosedyrer for (1) vellykket dyrking av Malassezia in vitro, (2) den epicutaneous anvendelsen av Malassezia på murine øre hud, og (3) de tekniske detaljene om hvordan å analysere Malassezia-indusert hud inflammasjon og sopp byrden av smittet hud. Viktigere, ikke denne modellen ikke stole på immunsuppresjon (f. eks av kortikosteroider) eller antibiotika behandling av mus før infeksjon, som det er praktisert i andre musemodeller av fungal infeksjon8,9. I sin tur, det kan studere hele spekteret av medfødte og adaptive immunrespons mot Malassezia i normal hud. Av notatet, innavlet vill type mus holdt under spesifikke patogen-fri (SPF) forholdene er ikke naturlig kolonisert med Malassezia og derfor deres eksponering for soppen ikke resulterer i vedvarende kolonisering, men er ryddet fra verten innen omtrent 1,5 uker. Men gjør modellen for å studere mekanismer av Antifungal vert respons initiering og regulering som i sin tur er grunnlaget for hvordan immun hukommelse er generert. Modellen er allsidig i at den lett kan brukes på en rekke genmodifiserte mus stammer og det kan kombineres med andre eksisterende hudsykdom modeller, for eksempel modeller av barriere mangel, for å studere virkningen av Malassezia under patologiske og inflammatoriske hud forhold7. Derfor, den beskrevne modellen av eksperimentell Malassezia hud infeksjon i mus gir en høy grad av fleksibilitet til å undersøke samspillet av soppen med hudens immunsystem i sammenheng med homeostase og sykdom.
Denne protokollen beskriver eksperimentell hud infeksjon av mus med Malassezia spp. på grunn av dens patogene potensial, Malassezia spp. er klassifisert som BSL2 patogener i noen land, inkludert Sveits. Vennligst undersøk de lokale retningslinjene og følg forskriftene fra de lokale myndighetene. BSL2-klassifiserte organismer skal håndteres av opplært personell under et BSL2-sertifisert biosafety kabinett (BSC). Biologisk avfall forurenset med BSL2-klassifiserte organismer, så vel som, skrotter fra mus smittet med slike organismer bør være autoklaveres før avhending. For eksperimenter med mus bør alle anstrengelser gjøres for å minimere lidelsen og sikre de høyeste etiske og humane standardene i henhold til 3R-prinsippene (erstatte, avgrense, redusere)10. Eksperimentene beskrevet i denne protokollen ble utført med m. pachydermatis (ATCC 14522), m. furfur (ATCC 14521) og m. sympodialis (ATCC 42132)7.
Protocol
Alle prosedyrer som er beskrevet i denne protokollen ble utført i samsvar med ordinansen om håndtering av organismer i inneholdt systemer av Federal Office for miljø, Sveits (www.bafu.admin.ch). Musa eksperimenter ble gjennomført i henhold til retningslinjene i sveitsiske dyr Protection Law og ble utført under protokollene godkjent av veterinær kontoret i Canton Zurich, Sveits (lisensnummer 168/2018).
1. dyrking av Malassezia under laboratorieforhold
Merk: Oppbevar alle reagensene og mediene som brukes for denne protokollen ved romtemperatur (RT, 20 – 25 ° c), med mindre annet er oppgitt, da den nedre temperaturen kan hemme soppvekst.
- Forbered væsken endret Dixon (mDixon) medium for Malassezia vekst. For å forberede 500 mL flytende mDixon medium, oppløse 18 g malt ekstrakt, 10 g desiccated okse-galle, 5 mL mellom-40, 3 g Peptone, 1 mL glyserol og 1 mL oljesyre syre i 500 mL destillert H2o (dH2o). Juster mediet til pH 6 med HCl og autoklav. Oppbevar mediet på RT.
- Forbered mDixon agar plater ved å legge 7,5 g agar til 500 mL mDixon medium før autoklavering. Langsomt kjøle ned mDixon agar etter autoklavering ved hjelp av en styre stang og en magnetisk varmeplate for å unngå delvis herding av mediet mens nedkjøling.
- Når agar er avkjølt til 50-60 ° c, dispensere væsken i Petri retter i en laminær Flow hette og la dem tørke på RT over natten.
Merk: agar platene kan lagres ved 4 ° c i flere uker når innpakket og holdt opp ned for å unngå fordampning. - Skaff Malassezia isolerer og gjenopplive lyofilisert bestander av Malassezia i henhold til instruksjonene innhentet av leverandøren.
- Vaksinere 10 mL flytende mDixon medium i en steril 100 mL Erlenmeyer kolbe med gjenopplivet Malassezia suspensjon i henhold til instruksjonene innhentet av leverandøren. Ruge kulturen i en risting inkubator ved 30 ° c og 180 RPM.
- Inspiser veksten av Malassezia kulturen regelmessig ved å se etter utseendet på krem farge og turbiditet. Vekst Kinetics avhenge av arten og belastningen av Malassezia og kan være spesielt treg når Malassezia er ferske gjenopplivet fra en lyofilisert lager. (Figur 1A).
- Forbered glyserol aksjer ved å blande 3 deler av den tett dyrket Malassezia kultur i mDixon medium med 1 del av sterile 99% glyserol. Alikvot Malassezia/glycerol blandingen i sterile skrulokk og oppbevar ved-80 ° c.
- For in vitro forplantning, plate Malassezia fra den flytende kulturen i mDixon eller fra den frosne glyserol lager på en mDixon agar plate (brakt til RT fra 4 ° c) ved hjelp av en inoculation loop.
Merk: Overfør mDixon agar plater til RT fra 4 ° c før bruk, siden kald mDixon agar hemmer soppvekst. - Ruge agar platen (e) med Malassezia opp-ned i en (ikke-risting) inkubator ved 30 ° c. Inspiser veksten av Malassezia koloniene regelmessig.
Merk: Malassezia kolonier på mDixon agar plater vises innen 3-5 dager og er krem-farget kjedelig, glatt med konveks høyde (figur 1B). - Store Malassezia kolonier på mDixon agar plater på RT i ~ 2 uker. Deretter forbereder en ny mDixon agar plate ved striper Malassezia fra frosne glyserol lager som beskrevet i 1,7.
2. utarbeidelse av inokulum for eksperimentell Malassezia infeksjon av mus
- Vaksinere 10 mL flytende mDixon medium i en steril 100 mL Erlenmeyer kolbe med 3-5 individuelle Malassezia kolonier fra en mDixon agar plate (se trinn 1, figur 1B).
- Ruge den Malassezia kulturen for ~ 48 til 96 h ved 30 ° c og 180 RPM til kulturen er krem-farget og grumsete (figur 1A).
Merk: tiden som er nødvendig for Malassezia vekst avhenger av Malassezia arter og belastning og mengden sopp som brukes for inoculation. - Overfør 2 mL av Malassezia kulturen til et sterilt 2 ml mikrosentrifugen rør og sentrifuger for 1 min ved 10, 000 x g.
- Kast supernatanten og vask pellet ved å suspendere den i 1 mL fosfat-bufret saltoppløsning (PBS). Sentrifuger igjen for 1 min på 10, 000 x g.
- Etter vask, suspendere pellet i 1 mL PBS ved energisk pipettering og måle den optiske tettheten av løsningen ved 600 NM (ODA600) ved hjelp av en spektrometer. Fortynne Malassezia suspensjon 20-50 x med PBS for OD måling for å sikre at lesingen er mellom 0,1 og 1.
Merk: tettheten av en 3-dagers kultur Malassezia vanligvis varierer mellom 15 og 30 ODA600, avhengig av Malassezia arter og belastning og på antall gjærceller som brukes for inoculation av kulturen (trinn 2,1). Malassezia tendens til å danne aggregater, derfor er energisk pipettering nødvendig for å sikre homogenitet av suspensjonen. - Alikvot et volum på Malassezia -FJÆRINGEN i PBS som tilsvarer en tetthet på 4 ODA600 i et sterilt 2 ml rør. Forbered 1 tube per dyr å bli smittet.
- Sentrifuger rørene inneholder Malassezia for 1 min på 10, 000 x g.
- Kast supernatanten og suspendere Malassezia pellet i 200 μL av innfødt olivenolje (tilsvarende 2 ODA600 gjærceller/100 μL olivenolje).
Merk: olivenolje ble funnet å være en god bil for epicutaneous infeksjon med Malassezia, som Malassezia er en lipofile og lipid-avhengige gjær. Olivenolje er bedre absorbert av huden enn PBS. Vær imidlertid oppmerksom på at det ikke er lett å suspendere Malassezia i olivenolje. Forbedre Malassezia/Olive olje fjæring ved virvlingen. Hold suspensjonen på RT til den brukes til infeksjon. - Forbered rør med olivenolje alene for å spotte smitte av kontroll dyr.
3. infiserer mus med Malassezia
- Bestill kvinnelige C57BL/6-mus i en alder av 6-8 uker og la dem akklimatisere seg i det eksperimentelle dyre anlegget i minst en uke. Beregn for 3-5-mus per gruppe, inkludert en kontrollgruppe som ikke er infisert.
- Forbered steril bedøvelse cocktail som inneholder 1,3 mg/mL Xylazine og 6,5 mg/mL ketamin i PBS. 5 mL anestesi cocktail er nok til å bedøve 20 dyr. Juster volumet på cocktail i henhold til antall dyr som skal anesthetized.
- Bedøve dyr ved å injisere 10 μL/g kroppsvekt av bedøvelse cocktail intraperitonealt (tilsvarende 65 mg ketamin og 13 mg Xylazine per kg kroppsvekt) og plassere anesthetized dyrene på en varmepute ved 37 ° c.
Merk: ved angitt dose, dyr vanligvis forblir anesthetized for ~ 30-60 min.
- Bedøve dyr ved å injisere 10 μL/g kroppsvekt av bedøvelse cocktail intraperitonealt (tilsvarende 65 mg ketamin og 13 mg Xylazine per kg kroppsvekt) og plassere anesthetized dyrene på en varmepute ved 37 ° c.
- Sjekk reflekser ved å klemme den bakre foten med tang for å sikre at dyrene er fullt anesthetized.
- Påfør en Eye Cream på øynene for å hindre dehydrering under anestesi.
- Alternativt kan du måle øre tykkelsen på begge ørene ved hjelp av en tykkelse (0-5 mm rekkevidde). Mål to forskjellige områder av hvert øre og Beregn gjennomsnittlig øre tykkelse per øre.
Merk: måling av øre tykkelse er valgfritt og avhenger av forsknings spørsmålet. Men hvis øre tykkelsen brukes som en avlesning for hud betennelse, er det nødvendig å måle den opprinnelige øre tykkelsen før infeksjonen. (se trinn 4). - Hvis du vil, kan du forstyrre epidermal barriere i rygg øre huden med mild tape stripping: Påfør et lite stykke tape på huden og fjern det igjen. Gjenta i 5 påfølgende runder med et nytt stykke tape for hver omg.
Merk: Malassezia induserer en mer uttalt hud betennelse i barriere-forstyrret hud sammenlignet med Uaffisert hud (figur 2a)7. - Bruk en steril pipette til å påføre 100 μL (2 ODA600) av Malassezia/Olive olje oppheng på rygg siden av hvert øre. Ta med en kontrollgruppe av dyr som bare behandles med olivenolje (kjøretøy behandlet kontrollgruppe).
Merk: Vortex den Malassezia/Olive olje fjæringen kraftig for å sikre en homogen Malassezia suspensjon umiddelbart før påføring. - La anesthetized dyrene på varmeputen for å unngå nedkjøling før de viser tegn til utvinning (whisker bevegelse, økt pustefrekvens, etc.).
- Injiser 200 μL av steril og forvarmet 2% glukoseoppløsning subkutant i den nuchal folden for å støtte metabolismen og rehydrering.
Merk: for å klargjøre en steril 2% glukoseoppløsning, oppløse 1 mg glukose i 50 mL PBS og filtrere den med et 0,2 μm filter. Oppløsningen kan oppbevares ved 4 ° c. - Overfør dyrene tilbake til buret sitt.
4. analyse av Malassezia-indusert hud betennelse
Merk: denne prosedyren beskriver analysen av Malassezia-indusert øret hevelse under infeksjon som fungerer som en parameter for hud betennelse. En forutsetning for å analysere sopp-indusert øret hevelse er å måle grunnlinjen øret tykkelse før tape-stripping og/eller infeksjon (trinn 3,5).
- Forbered isoflurane kammer for kort tids bedøvelse av Malassezia-infiserte og kontroll dyr.
- Overfør ett dyr om gangen til kammeret og vente på at dyret skal være fullt anesthetized.
Merk: tegn på riktig anestesi inkluderer komplett kropps avslapning samt langsom og tung (flanke) pusting. Nøye overvåke anestesi som utvidet eksponering for isoflurane kan være dødelig. - Fjern dyret fra kammeret og legg den på et vev.
- Mål tykkelsen på øret (e) ved hjelp av en tykkelse (område 0-5 mm). Mål to forskjellige områder av hvert øre og beregne gjennomsnittlig tykkelse per øre (se trinn 3,5).
- Overfør dyret tilbake til buret.
Merk: isoflurane anestesi er svært kortvarig, og dyrene gjenopprette innen ~ 30 s etter fjerning fra isoflurane kammeret. - Beregn økningen i øret tykkelse ved å trekke den gjennomsnittlige Baseline øre tykkelse, målt før båndet stripping og/eller infeksjon, fra den gjennomsnittlige øre tykkelsen målt på hvert tidspunkt etter smitte.
- Plott de beregnede verdiene som økningen i øre tykkelse eller, alternativt, som den totale øre tykkelsen over tid for hvert dyr eller gruppe av dyr (figur 2B).
5. analyse av sopp byrde i den infiserte huden
- Klargjør et sterilt 2 mL mikrosentrifugen rør for hvert øre som skal høstes, inneholdende 0,5 mL sterilt 0,05% NP40 i dH2O og en autoklaveres stål kule (5 mm diameter).
- Veie rørene ved hjelp av en presisjon balanse og skrive ned nøyaktig vekt.
- Euthanize musene ved CO2 kvelning.
- Fjern øret (ene) ved basen og Overfør til røret som inneholder 0,5 mL sterilt 0,05% NP40 i dH2O, som beskrevet i trinn 5,1-5,2.
- Veie røret som inneholder øre vevet og beregne den faktiske vekten av hver prøve ved å trekke vekten av røret uten organ fra vekten av røret med orgelet.
- Homogenisere øre vevet i 6 min ved 25 Hz ved bruk av en vevs homogenisator. Sørg for at vevet er godt homogenisert.
- Plate 100 μL av hver prøve (tilsvarende 1/5 av hver homogenate, fortynning faktor = 5) på mDixon agar plater og ruge platene opp ned i en 30 ° c inkubator.
Merk: mengden av homogenate belagt bør justeres i henhold til sopp belastningen som skal forventes. Sørg for å plate tilstrekkelig homogenate å få minst 10 og ikke mer enn 250 kolonier per plate for å tillate enkel opplisting. Alternativt, plate flere plater per prøve med ulike fortynninger av homogenate. - Inspiser veksten av Malassezia koloniene regelmessig.
Merk: koloniene blir vanligvis synlige etter 2-3 dager. Den tiden som er nødvendig for Malassezia koloniene å vokse avhenger av arten og belastningen av Malassezia. - Tell koloniene per tallerken.
- Beregn antall CFU/g-vev ved å bruke følgende formel:
CFU/g tissue = (antall kolonier/tallerken) x (fortynnings faktor)/(vekt av hud prøven i g).
Merk: omtrentlig minimal deteksjon grensen kan vurderes ved hjelp av følgende formel: minimal deteksjon grense = (1 koloni/plate) x (fortynnings faktor)/(gjennomsnittlig vekt av alle hud prøver i g). - Fungal belastninger er vanligvis plottet på en logaritmisk skala (figur 2C).
Representative Results
In vitro dyrking av Malassezia
Sammenlignet med andre mer brukte fungal modell patogener som C. albicans eller A. fumigatus, Malassezia er vanskeligere å kultur in vitro. Dette kan tilskrives det faktum at Malassezia er avhengig av eksogene lipid kilder for sin næringsverdi krav, på grunn av sin manglende evne til å syntetisere fettsyrer11. MDixon-mediet egner seg til dyrking av flere Malassezia -arter, inkludert m. pachydermatis, m. furfur, m . sympodialis, m. slooffiae, m. barlind og m. yamatoensis in vitro7 ,12. Figur 1 viser representative bilder for veksten av M. Sympodialis i flytende mDixon medium og på mDixon agar som beskrevet i trinn 1 og trinn 2.
Analyse av hud betennelse og sopp byrden av Malassezia hud betennelse
Eksponering av Malassezia til musen øret hud som var barriere forstyrret av tape-stripping før infeksjon resulterer i forverret betennelse i huden, karakterisert ved epidermal og dermal og utvikling av ødem7. Trinn 4 og 5 skissere metoder for å analysere Malassezia-indusert øret hevelse og sopp byrden av huden. Begge parametrene representerer viktige readouts for å overvåke forløpet av infeksjonen. Figur 2A illustrerer økningen i øre tykkelse som kan observeres etter M. furfur eksponering for hud som var barriere-FORSTYRRET SAMMENLIGNET med Uaffisert hud av WT C57BL/6 mus. Figur 2B viser en representativ sammendrags graf over økningen i øre tykkelsen over tid. Figur 2C viser sopp belastningen i øre huden på dag 2 etter infeksjon med M. pachydermatis.
Figur 1: in vitro dyrking av Malassezia.
(A) M. sympodialis stamme ATCC 42132 vokst i 3 dager ved 30 ° c og 180 RPM i flytende mDixon medium (venstre) ved siden av en kontroll Erlenmeyer kolbe inneholder mDixon medium som ikke var inokulert (til høyre). (B) kolonier av M. sympodialis stamme ATCC 42132 på mDixon agar etter 5 dager med Inkubasjons ved 30 ° c. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: analyse av Malassezia hud infeksjon på grunnlag av øre tykkelse og sopp byrde.
(A) histologi av øret seksjoner innhentet fra C57BL/6 mus som ble behandlet med olivenolje (kjøretøy, venstre) eller smittet med M. furfur stamme JPLK23 i 5 dager (midten og høyre). Til høyre, øret huden var tape-strippet før infeksjon. Seksjonene var farget med hematoksylin og eosin (H & E). (B) Sammendrag grafer som viser økningen i øret tykkelse over tid for C57BL/6 mus som ble utsatt for Malassezia eller venstre infisert som kontroller. Den absolutte tykkelsen av M. pachydermatis stamme ATCC 14522-eksponert eller kjøretøy-behandlet øret hud på hvert tidspunkt vises til venstre; økningen i øre tykkelsen ved de angitte tids punktene i forhold til grunnlinjen på dag 0 vises til høyre. (C) fungal byrde i huden av C57BL/6 mus som var smittet med M. pachydermatis stamme ATCC 14522 eller behandlet med olivenolje som en kontroll (kjøretøy). I begge tilfeller var huden tape-strippet. Hvert symbol i sammendraget grafer B og C representerer ett dyr. Den statistiske betydningen av forskjellene mellom gruppene ble beregnet ved hjelp av enveis ANOVA (B) eller student t-test (C). p < 0.001, * * * * p < 0.0001, D.L.: deteksjon Limit Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Denne protokollen beskriver infeksjon i huden av den brukte innavlet musen belastningen C57BL/6 av Malassezia spp. tilpasse denne protokollen til andre mus stammer med en annen genetisk bakgrunn (f. eks, Balb/c) eller til genmodifisert mus belastninger kan trenge justering av infeksjons dosen, tids punktet (e) av analysen, etc. For å sikre reproduserbarhet, bør grupper av mus alltid være av samme alder og kjønn. Kilden til mus bør holdes stabil, som selv små endringer i genetisk bakgrunn og forskjeller i bakterieflora, som eksisterer mellom leverandører og kan eksistere selv mellom ulike enheter av en enkelt avl anlegget, kan ha en uforutsigbar innvirkning på løpet av infeksjonen. Når du setter opp Malassezia infeksjon modellen som er beskrevet i denne protokollen, er det anbefalt å utføre en pilotstudie for å nøye overvåke løpet av infeksjonen, inkludert omfanget av kolonisering, Kinetics av fungal clearance og graden av betennelse og patologi som kan være indusert (f. eks, hvis øret huden er barriere-forstyrret før infeksjon) for å fastslå den optimale analysen forhold.
For å sikre reproduserbarhet og for å oppdage forskjellene mellom eksperimentelle grupper på en pålitelig måte, må antallet dyr som brukes per gruppe, beregnes basert på den statistiske analysen. Utvalgsstørrelsen beregnes basert på effekt størrelse, feil hastighet og kraft, som vurderer biologiske og eksperimentelle variasjoner (f.eks. på grunn av variasjon i immunsystemet). For etiske grunner unngå å bruke unødvendig høyt antall dyr. Når det gjelder Malassezia hud infeksjon, behandle bare ett øre med soppen og bruke det andre øret som en kontroll i samme mus, er ikke anbefalt fordi mus kan spre soppen til begge ørene når grooming. Men, ved hjelp 1/2 øre for ulike metodisk lese outs som fastsettelse av sopp byrde, isolering av immunceller eller histologiske analyse er ofte nok og resulterer i en betydelig reduksjon i dyre tall som brukes for eksperimenter.
18 forskjellige arter av Malassezia har blitt beskrevet oppdatert. Inter-og artsspesifikke variasjoner i slekten Malassezia kan påvirke samspillet med verten, som vi også har lært fra studier på andre menneskelige patogene sopp13. Ulike Malassezia arter og stammer varierer i deres opprinnelse (f. eks, m. pachydermatis er de hyppigste artene isolert fra dyr, mens m. restricta, m. barlind og m. sympodialis er de prominente medlemmer av sopp hud mikrobiomet hos mennesker med variabel fordeling av disse artene mellom ulike hudområder). Noen arter har blitt assosiert med commensalism, mens andre er antatt å være mer patogene, selv om detaljerte bevis forblir relativt svake. Viktigere, noen arter og stammer er iboende vanskeligere å vokse enn andre. Dermed beslutningen om hvilke arter/belastning å bruke for infeksjonen må være basert på spørsmålet om forskning.
Eksperimentell infeksjon i murine hud med noen mikrobielle organismer som Candida albicans eller Staphylococcus aureus krever avbrudd av epidermal barriere før infeksjon, for eksempel, med sandpapir14, 15,16. I kontrast er modellen av Malassezia infeksjon beskrevet her er like effektiv med og uten barriere avbrudd7. Graden av betennelse indusert av soppen er massivt forbedret hvis huden er tape strippet før infeksjon7. Derfor, om huden skal manipuleres før påføring av Malassezia avhenger av forskningsspørsmål. Ulike modeller av kronisk og akutt hud betennelse (f. eks, modeller for forsinket type overfølsomhet (DTH) og kontakt overfølsomhet (CHS)) og modeller av barriere mangel finnes som kan være av interesse for å undersøke bidraget av Commensal gjær til hudsykdommer.
Innavlet mus opprettholdt under spesifikke patogen gratis (SPF) forholdene er (til vår kunnskap) ikke naturlig kolonisert med Malassezia. Derfor, den eksperimentelle anvendelsen av Malassezia til musen øret huden representerer en primær eksponering for soppen som induserer en akutt respons i verten, som igjen fører til sopp klaring innen 1-2 uker7. Mens modellen beskrevet i denne protokollen derfor bare delvis reflekterer situasjonen i immunkompetente mennesker eller andre verter organismer som er permanent kolonisert med Malassezia, den eksperimentelle infeksjonen tillater en rikelig vindu av mulighet til å studere Antifungal immunitet og cellulære og molekylære mekanismer som ligger til grunn dette svaret. Det kan også undersøke variasjoner i responsen på ulike Malassezia arter og stammer under ulike eksperimentelle forhold (f. eks med og uten barriere forstyrrelse av huden).
Studiet av Malassezia -vert interaksjoner har vært begrenset i fortiden til in vitro eksperimenter med isolerte celletyper i kulturer (f. eks, Keratinocyte cellelinjer, pbmc). Selv om disse studiene har kaste lys over sopp og vert faktorer som former samspillet mellom Malassezia og verten17, de ikke tillater å få en helhetlig forståelse av sopp-vert samhandling i komplekse miljø av huden, som involverer flere celletyper som er i konstant kommunikasjon, for eksempel keratinocytter, fibroblaster og vev-Resident immunceller, men også leukocytter populasjoner som infiltrere vevet bare ved mikrobiell møte i Huden. Dette flercellede nettverket kan ikke gjengis fullt ut i in vitro-modellene, selv med de mest avanserte organoid systemene. Således, det eksperimentelle infeksjon av mus fremdeles representerer gullet målestokk inne immunologi og infeksjon sykdommen forskning, og anvendeligheten av modellen beskrevet her over representerer en gjennombruddet inne feltet av Malassezia forskning. Viktigere, denne modellen er avhengig av epicutaneous anvendelse av Malassezia på den ellers Uaffisert musen øret hud, og det ikke implisere inoculation av soppen ved injeksjon i vevet, f. eks subkutant eller intraperitonealt, som tidligere studier rapporterte18, som begge er fjernere fra situasjonen i naturlig kolonisert verter.
Muligheten til å kombinere modellen av Malassezia infeksjon beskrevet i denne protokollen med andre tilgjengelige musemodeller øker betraktelig omfanget og fleksibiliteten til programmet. Sistnevnte omfatter ulike modeller av spesifikke hud lidelser, slik som modell av barriere mangel som etterligner viktige funksjoner i atopisk dermatitt, en sykdom forbundet med Malassezia i både mennesker og hunder. Videre epicutaneous infeksjon i huden med Malassezia kan lett påføres mus med genetiske defekter i vert gener av interesse, eller mus der en celle type interesse er genetisk slettet eller kan farmakologisk utarmet (f. eks, ved hjelp av difteri gift administrasjon i difteri gift reseptor-uttrykker mus). Slike modeller representerer et uunngåelig verktøy for å dissekere verten respons på Commensal og patogene mikrober, inkludert Malassezia, og å vurdere hvilken rolle disse genene og celle type i soppen-vert interaksjon. Analysene av Malassezia-verten hud interaksjon kan utvides langt utover det som er beskrevet i denne protokollen. Disse inkluderer analyser av histologi (for eksempel for å fastslå graden av hud patologi eller epidermal tykkelse indusert av soppen), ved immunhistokjemi eller immunofluorescent farging av vevs deler ved hjelp av antistoffer rettet mot celle type spesifikke markører eller andre molekyler av interesse. Det kan også innebære isolering av celler (f. eks, vev bosatt eller vev-infiltrere leukocytter delsett) fra det infiserte hud vevet å studere polarisering, regulering, og dynamikk av immunrespons til Malassezia i stor dybde.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av universitetet i Zürich, Sveits.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | |
| Attane Isoflurane | Piramal Healthcare | - | |
| Biosaftey cabinet (BSC) Faster Ultra Safe | DASIT GROUP | TEC 5594 | BSL2 certified |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415D | compatible with 2ml Eppendorf tubes |
| Dessicated Ox-bile | Sigma-Aldrich | 70168-100G | |
| Eppendorf Tubes (2 ml) | Eppendorf | 0030 120.094 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 49159-5KG | |
| Gylcerol (99 %) | Honeywell | 10314830 | |
| Heating pad | Eickenmeyer | 648048 | |
| Incubator Hereaus B20 | Heraeus | 412047753 | BSL2 certified |
| Ketasol (100 mg) | Graeub AG | 6680416 | |
| Magentic heating plate MR Hei-Standard | Heidolph Instruments | 442-1355 | |
| Malassezia spp. | ATCC | 14522, 14521, 42132 | |
| Malt extract | Sigma-Aldrich | 70167-500G | |
| Multiply Biosphere Tubes (200 µl) | Sarstedt AG | 7084211 | Safelock |
| Native olive oil | - | - | commerc. available |
| Nonidet P40 | Axon Lab | A1694,0250 | |
| Oditest measurment devise | Kroeplin | S0247 | range 0-5 mm |
| Oleic Acid | Sigma-Aldrich | 75090-5ML | |
| Peptone | Oxoid | LP0037 | |
| Petri dishes | Sarstedt AG | 82.1473 | |
| Phosphat buffered salt solution (PBS, 1x) | Amimed/Bioconcept | 3-05F39 | |
| Rompun (2 %) | Bayer | KP0BFHR | |
| Shaking incubator Infors Minitron | Infors | - | BSL2 certified |
| Spectrometer | Jenway | 20308 | optical density measurement at 600nm |
| Spectrometer Cuvettes | Greiner Bio-One | 613101 | |
| Stainless Steel balls (5mm) | ABF | KU.5G80 1.3541 | |
| Syringes 1 ml Sub-Q | BD Bioscience | 305501 | |
| Tissue Lyzer II | Quiagen | 85300 | |
| Transpore Hypoallergic Tape | 3M | 1527-1 | |
| Tween 40 | Sigma-Aldrich | P1504-100ML | |
| Vitamin A Retinoli Palmitas Eye Cream | BAUSCH & LOMB | commerc. available |
References
- Iliev, I. D., Leonardi, I. Fungal dysbiosis: immunity and interactions at mucosal barriers. Nature Reviews Immunology. 17 (10), 635-646 (2017).
- Findley, K., et al. Topographic diversity of fungal and bacterial communities in human skin. Nature. 498 (7454), 367-370 (2013).
- Gemmer, C. M., DeAngelis, Y. M., Theelen, B., Boekhout, T., Dawson, T. L. Fast, noninvasive method for molecular detection and differentiation of Malassezia yeast species on human skin and application of the method to dandruff microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 40 (9), 3350-3357 (2002).
- Theelen, B., et al. Malassezia ecology, pathophysiology, and treatment. Medical Mycology. 56, suppl_1 10-25 (2018).
- Williams, M. R., Gallo, R. L. The role of the skin microbiome in atopic dermatitis. Current Allergy and Asthma Reports. 15 (11), 65 (2015).
- Malassezia and the Skin. , Springer. (2010).
- Sparber, F., et al. The Skin Commensal Yeast Malassezia Triggers a Type 17 Response that Coordinates Anti-fungal Immunity and Exacerbates Skin Inflammation. Cell Host Microbe. 25 (3), 389-403 (2019).
- Koh, A. Y. Murine models of Candida gastrointestinal colonization and dissemination. Eukaryotic Cell. 12 (11), 1416-1422 (2013).
- Solis, N. V., Filler, S. G.
- Russel, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , Methuen & Co. London. (1959).
- Wu, G., et al. Genus-Wide Comparative Genomics of Malassezia Delineates Its Phylogeny, Physiology, and Niche Adaptation on Human Skin. PLoS Genetics. 11 (11), 1005614 (2015).
- Leong, C., Buttafuoco, A., Glatz, M., Bosshard, P. P. Antifungal Susceptibility Testing of Malassezia spp. with an Optimized Colorimetric Broth Microdilution Method. Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1883-1893 (2017).
- Schonherr, F. A., et al. The intraspecies diversity of C. albicans triggers qualitatively and temporally distinct host responses that determine the balance between commensalism and pathogenicity. Mucosal Immunology. 10 (5), 1335-1350 (2017).
- Igyarto, B. Z., et al. Skin-resident murine dendritic cell subsets promote distinct and opposing antigen-specific T helper cell responses. Immunity. 35 (2), 260-272 (2011).
- Liu, H., et al. Staphylococcus aureus Epicutaneous Exposure Drives Skin Inflammation via IL-36-Mediated T Cell Responses. Cell Host Microbe. 22 (5), 653-666 (2017).
- Nakagawa, S., et al. Staphylococcus aureus Virulent PSMalpha Peptides Induce Keratinocyte Alarmin Release to Orchestrate IL-17-Dependent Skin Inflammation. Cell Host Microbe. 22 (5), 667-677 (2017).
- Sparber, F., LeibundGut-Landmann, S. Host Responses to Malassezia spp. in the Mammalian Skin. Frontiers in Immunology. 8, 1614 (2017).
- Yamasaki, S., et al. C-type lectin Mincle is an activating receptor for pathogenic fungus, Malassezia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (6), 1897-1902 (2009).
