Summary
Bu protokol, malassezia-konak etkileşimleri cilt tebisi incelemek için bir fare modeli nin kurulmasını özetler. Bu vitro Malassezia ekimi açıklar, Malasseziaile murine cilt enfeksiyonu , ve iltihap ve deri dokusunda mantar yükü sonraki analizi.
Abstract
Hayvan modelleri bulaşıcı hastalık araştırmaları için çok önemlidir. Onlar dokuya özgü bir şekilde mikroplar ve in vivo onların ev sahibi arasında meydana gelen etkileşimlerin tam spektrum analiz etmek için önemli bir temel sağlar. Patojenik mantarlar giderek insanlar için ciddi bir tehdit olarak kabul edilmektedir ve bu tür enfeksiyon modellerinin sömürülmesi mantar patojenite anlayışımızı büyük ölçüde geliştirmiştir. Malassezia cinsi türleri insan deri mikrobiyotasının en bol mantarlarıdır ve aynı zamanda seboreik dermatit ve atopik dermatit gibi ciddi inflamatuar deri hastalıklarının gelişimi ile ilişkilidir. Ancak, Malassezia ve hastalık patogenezi arasında bir nedensel bağlantı bilinmemektedir, cilt bağışıklık sistemi ile Malassezia karmaşık crosstalk kötü bilgi atfedilebilir bir gerçektir. Bu protokol, Malassezia'nın in vivo memeli derisi ile etkileşimini incelemeyi sağlayan deneysel bir fare modelinin kurulmasını açıklamaktadır. Bu laboratuvar koşulları altında Malassezia spp yetiştirmek için yöntem özetliyor, nasıl Malassezia spp ile murine cilt enfekte ve nasıl deri iltihabı ve mantar yükü analizleri yoluyla enfeksiyon sonucunu değerlendirmek için. Burada açıklanan model tam immünyonist hayvanlarda çalışır ve hayvanların bağışıklık baskılayıcı veya antibiyotik ön tedavi güvenmez. Ayrıca hemen hemen tüm genetiği değiştirilmiş fare suşları için uyarlanabilir ve diğer cilt hastalığı modelleri ile kombine edilebilir. Bu özellikler bu enfeksiyon modeli ayrıntılı olarak in vivo deride Malassezia karşı ev sahibinin doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık yanıtı incelemek için çok güçlü bir araç olun.
Introduction
Deri birçok farklı mikroplar tarafından doldurulur. Mikrobiyota cildin sürekli maruz kalma şekillendirme ve konak bağışıklık sisteminin eğitilmesine katkıda bulunur. Mantarlar giderek mikrobiyota hayati bir parçası olarak kabul edilmektedir ve onlar konak fizyolojisi ve bağışıklık için önemli bir rol yerine getirmek, bakteri ve virüsler benzer1. Cins Malassezia türleri çok sıcak kanlı omurgalıların deri kolonize en bol mantarlar ve insan derisi mycobiomefazla%90 telafi 2,3. Malassezia on sekiz farklı tür şimdiye kadar insan ve hayvan derisi4tespit edilmiştir.
Cildin çeşitli patolojiler ortaya çıkar düşünülmektedir, en azından kısmen, bir disbalanced mikrobiyota bileşimi sonucu. Dysbiosis fırsatçı enfeksiyonlar vehastalık5 sonuçlanan patojenik potansiyeli olan türlerin aşırı büyümesine yol açabilir . Sürekli olarak, Malassezia,kommensal yaşam tarzının yanı sıra, kepek ve pityriarsis versicolor gibi daha ciddi inflamatuar bozukluklar arasında değişen çeşitli cilt patolojilerinin gelişimine katkıda giderek artan bir kanıt vardır seboreik dermatit ve atopik dermatitolarak 4,6. Malassezia ve pityriarsis versicolor arasında nedensel bir bağlantı kurulmuş olsa da, daha ciddi deri patolojilerinde mantarın patofizyolojik rolü büyük ölçüde bilinmemektedir.
Cilt homeostazı ve hastalık Malassezia rolünün belirlenmesi deri ve kutanöz bağışıklık sistemi ile mantar etkileşimi hakkında daha derinlemesine bilgi gerektirir. Not, Malassezia araştırma, diğer insan mantar patojenleri ile karşılaştırıldığında (örneğin, Candida albicans veya Aspergillus fumigatus), hala acemi aşamasında. Bu laboratuvar koşulları altında Malassezia ekimi zorluk ve in vivo konak ile temas mantar incelemek için uygun deneysel modellerin eksikliği atfedilebilir. Kültür izole hücreleri ile önceki deneyler Malassezia ve çeşitli bağışıklık ve bağışıklık dışı hücreler arasında doğrudan ve dolaylı etkileşimler geniş bir yelpazede gösterdi7. Ancak, bu in vitro deneyler sadece kısmen çok sayıda hücresel ve moleküler olayların mantar ve çeşitli hücre türleri arasında birlikte meydana gelen vivo karmaşık cilt ortamının durumunu özetlemek.
Burada, biz farelerde Malassezia deri enfeksiyonu deneysel bir model için protokol anahat, hangi son zamanlarda kurulan, vivomantar-konaketkileşimi incelemek için 7 . Bu (1) malassezia in vitro başarılı ekimi için prosedürleri içerir, (2) murine kulak derisi üzerine Malassezia epitanepikans uygulaması, ve (3) Malasseziaanaliz etmek için nasıl teknik detayları -indüklenen cilt iltihap ve enfekte cildin mantar yükü. Daha da önemlisi, bu model immünsupresyon dayanmaz (örneğin, kortikosteroidler tarafından) veya enfeksiyon öncesi farelerin antibiyotik tedavisi, mantar enfeksiyonu diğer fare modellerinde uygulandığı gibi8,9. Buna karşılık, normal deride Malassezia karşı doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık yanıtı tam spektrum uyup çalışmasını sağlar. Dikkat, belirli patojen içermeyen (SPF) koşullar altında tutulan inbred yabani tip fareler doğal Malassezia ile kolonize değildir ve bu nedenle, mantar maruz kalıcı kolonizasyon neden olmaz ama içinde konak temizlenir yaklaşık 1,5 hafta. Ancak, model antifungal konak yanıt başlatma ve düzenleme mekanizmaları incelenmesi için izin verir, sırayla, bağışıklık belleği oluşturulur nasıl temelidir. Model kolayca genetiği değiştirilmiş fare suşları geniş bir yelpazede uygulanabilir ve diğer mevcut deri hastalığı modelleri ile kombine edilebilir çok yönlüdür, bariyer eksikliği modelleri gibi, altında Malassezia etkisini incelemek için patolojik ve inflamatuar cilt hastalıkları7. Bu nedenle, farelerde deneysel Malassezia deri enfeksiyonu açıklanan modeli homeostaz ve hastalık bağlamında cilt bağışıklık sistemi ile mantar etkileşimini araştırmak için esneklik yüksek derecede sağlar.
Bu protokol, Malassezia spp. ile farelerin deneysel deri enfeksiyonu açıklar patojenik potansiyeli nedeniyle, Malassezia spp. İsviçre de dahil olmak üzere bazı ülkelerde BSL2 patojenleri olarak sınıflandırılır. Lütfen yerel yönergeleri kontrol edin ve yerel makamlar tarafından yönetmeliklere uyun. BSL2 sınıflandırılmış organizmalar BSL2 sertifikalı biyogüvenlik kabinesi (BSC) altında eğitimli personel tarafından ele alınmalıdır. BSL2 sınıflandırılmış organizmalarla kontamine olan biyolojik atıkların yanı sıra, bu tür organizmalarla enfekte olmuş farelerden alınan leşler imha edilmeden önce otoklavlanmalıdır. Farelerle yapılan deneylerde, acıçekmeyi en aza indirmek ve 3R ilkelerine göre en yüksek etik ve insancıl standartları sağlamak için tüm çabalar gösterilmelidir (değiştirin, rafine edin, azaltın)10. Bu protokolde açıklanan deneyler M. pachydermatis (ATCC 14522), M. furfur (ATCC 14521) ve M. sympodialis (ATCC 42132)7ile gerçekleştirilmiştir.
Protocol
Bu protokolde tanımlanan tüm prosedürler, İsviçre Federal Çevre Dairesi'nin (www.bafu.admin.ch) içerdiği sistemlerde organizmaların taşınmasına ilişkin yönetmelik uyarınca gerçekleştirilmiştir. Fare deneyleri İsviçre Hayvanları Koruma Kanunu'nun kurallarına uygun olarak yapılmış ve İsviçre'nin Zürih Kantin I.Ş. Veteriner Lik Ofisi tarafından onaylanan protokoller uyarınca yapılmıştır (lisans numarası 168/2018).
1. Laboratuvar koşullarında Malassezia ekimi
NOT: Düşük sıcaklık mantar büyümesini engelleyebilir gibi, aksi belirtilmedikçe oda sıcaklığında (RT, 20 - 25 °C) bu protokol için kullanılan tüm reaktifleri ve ortamları saklayın.
- Malassezia büyüme için sıvı modifiye Dixon (mDixon) orta hazırlayın. Sıvı mDixon orta 500 mL hazırlamak için, 18 g Malt ekstresi, 10 g kurutulmuş Öküz-safra, 5 mL Tween-40, 3 g Peptone, 1 mL Gliserol ve 1 mL Oleik Asit 500 mL distile H2O (dH2O) çözünür. HCl ve otoklav ile pH 6 orta ayarlayın. Ortamı RT'de saklayın.
- Otoklavlama dan önce 500 mL mDixon ortamına 7,5 g agar ekleyerek mDixon agar plakalarını hazırlayın. Soğuma sırasında ortamın kısmi katılaşmasını önlemek için bir direksiyon çubuğu ve manyetik ısıtma plakası kullanarak otoklavladıktan sonra mDixon agarını yavaşça soğutun.
- Agar 50 -60 °C'ye kadar soğuduktan sonra, sıvıyı laminar akış kaputunda Petri yemeklerine dağıtın ve bir gecede RT'de kurumasını bekleyin.
NOT: Agar plakaları buharlaşmayı önlemek için 4 °C'de paketlenerek baş aşağı tutularak birkaç hafta saklanabilir. - Malassezia'yı elde edin ve sağlayıcı tarafından alınan talimatlara göre Malassezia'nın lyophilized stoklarını canlandırın.
- 10 mL likit mDixon ortasını steril 100 mL Erlenmeyer şişesinde, sağlayıcının aldığı talimatlara göre yeniden canlandırılan Malassezia süspansiyonu ile aşılayın. Kültürü 30 °C ve 180 rpm'de sallayarak bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın.
- Krem rengi ve bulanıklık görünümünü kontrol ederek düzenli olarak Malassezia kültürünün büyüme inceleyin. Büyüme kinetik türleri ve Malassezia suşu bağlıdır ve Malassezia taze bir lyophilized stok canlandırılır zaman özellikle yavaş olabilir. (Şekil 1A).
- Steril 1 parçası ile mDixon orta yoğun yetiştirilen Malassezia kültürünün 3 parçaları karıştırarak gliserol stokları hazırlayın 99% gliserol. Aliquot Malassezia/ gliserol karışımı steril vida-kapak tüpler imal ve saklamak -80 °C.
- In vitro proporsiyon için, mDixon sıvı kültüründen veya dondurulmuş gliserol stokundan bir mDixon agar plakasına (4 °C'den RT'ye getirilen) bir aşılama döngüsü kullanarak Malassezia plakası.
NOT: Soğuk mDixon agar mantar büyümesini engellediğinden, mDixon agar plakalarını kullanımdan önce 4 °C'den RT'ye aktarın. - Agar plakasını (ler) Malassezia ile baş aşağı 30 °C'de (sallamayan) bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın. Düzenli olarak Malassezia kolonilerinin büyümesini inceleyin.
NOT: mDixon agar plakaları üzerindeki Malassezia kolonileri 3 - 5 gün içinde görünür ve krem renkli donuk, konveks yüksekliği ile pürüzsüzdür(Şekil 1B). - Yaklaşık 2 hafta boyunca RT mDixon agar plakaları üzerinde Mağaza Malassezia kolonileri. Bundan sonra, 1.7 açıklandığı gibi dondurulmuş gliserol stok Malassezia çizgili tarafından yeni bir mDixon agar plaka hazırlamak.
2. Farelerin deneysel Malassezia enfeksiyonu için inokül hazırlanması
- Steril 100 mL Erlenmeyer şişesinde 10 mL sıvı mDixon orta inoküle 3 - 5 bireysel Malassezia kolonileri bir mDixon agar plaka (bkz. adım 1, Şekil 1B).
- Malassezia kültürünü 30 °C'de ~ 48-96 h ve 180 rpm için kuluçkaya yatırın, ta ki kültür krem renkli ve bulanık olana kadar(Şekil 1A).
NOT: Malassezia büyümesi için gerekli zaman Malassezia türleri ve suşu ve aşılama için kullanılan mantar miktarına bağlıdır. - Malassezia kültürünün 2 mL'sini steril 2 mL mikrosantrifüj tüpe ve santrifüje 1 dk 10, 000 x g'de aktarın.
- Supernatant atın ve fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) 1 mL askıya alarak pelet yıkayın. Santrifüj tekrar 1 dk 10, 000 x g.
- Yıkamadan sonra peleti 1 mL PBS'de güçlü pipetleme ile askıya alın ve çözeltinin optik yoğunluğunu 600 nm 'de (ODA600)bir spektrometre kullanarak ölçün. Okuma0.1 ve 1 arasında olduğundan emin olmak için OD ölçümü için PBS ile Malassezia süspansiyon 20 - 50 x seyreltin.
NOT: Malassezia'nın 3 günlük kültürünün yoğunluğu genellikle Malassezia türlerine ve zorlanmalarına ve kültürün aşılanmasında kullanılan maya hücrelerinin sayısına bağlı olarak 15 ila 30 ODA600arasında değişmektedir (adım 2.1). Malassezia agregalar oluşturmak eğilimindedir, bu nedenle, güçlü pipetleme süspansiyon homojenliğini sağlamak için gereklidir. - Aliquot steril bir 2 mL tüp içine 4 ODA600 yoğunluğuna karşılık gelen PBS Malassezia süspansiyon hacmi. Enfekte olmak için hayvan başına 1 tüp hazırlayın.
- 10, 000 x g 1 dakika Malassezia içeren tüpler santrifüj.
- Supernatant atın ve yerli zeytinyağı 200 μL (2 ODA600 maya hücreleri/100 μl zeytinyağı karşılık gelen) Malassezia peletaskıya.
NOT: Zeytinyağı Malasseziaile epiutaneöz enfeksiyon için iyi bir araç olduğu bulunmuştur , Malassezia bir lipophilic ve lipid bağımlı maya olduğu gibi. Zeytinyağı pbs daha iyi cilt tarafından emilir. Ancak, zeytinyağı Malassezia askıya almak kolay olmadığını unutmayın. Girdap tarafından Malassezia/ zeytinyağı süspansiyon geliştirin. Enfeksiyon için kullanılana kadar süspansiyonu RT'de tutun. - Kontrol hayvanlarının sahte enfeksiyonu için tüpleri tek başına zeytinyağı ile hazırlayın.
3. Malassezia ile farelerin enfekte
- Sipariş kadın C57BL/6 fareler yaş 6 - 8 hafta ve onları en az bir hafta için deneysel hayvan tesisinde alışmak için izin. Enfekte olmayan bir kontrol grubu da dahil olmak üzere grup başına 3 - 5 fare hesaplayın.
- PBS'de 1.3 mg/mL Ksilazin ve 6.5 mg/mL Ketamin içeren steril anestezik kokteyl hazırlayın. Anestezikokteylinin 5 mL'si 20 hayvanı anestezik etmek için yeterlidir. Anestezi edilecek hayvan sayısına göre kokteylin hacmini ayarlayın.
- Anestezik kokteylin 10 μL/g vücut ağırlığını intraperitoneal olarak enjekte ederek hayvanları anestezi edin (vücut ağırlığı başına 65 mg Ketamin ve 13 mg Xylazine'ye karşılık gelir) ve anestezi altındaki hayvanları 37 °C'de bir ısıtma yastığına yerleştirin.
NOT: Belirtilen dozda hayvanlar genellikle ~ 30 - 60 dk için anestezi kalır.
- Anestezik kokteylin 10 μL/g vücut ağırlığını intraperitoneal olarak enjekte ederek hayvanları anestezi edin (vücut ağırlığı başına 65 mg Ketamin ve 13 mg Xylazine'ye karşılık gelir) ve anestezi altındaki hayvanları 37 °C'de bir ısıtma yastığına yerleştirin.
- Hayvanların tamamen anestezi olduğundan emin olmak için arka ayağı forceps ile çimdikleyerek refleksleri kontrol edin.
- Anestezi sırasında dehidratasyon önlemek için gözlerüzerine bir göz kremi uygulayın.
- İsteğe bağlı olarak, kaliper (0 - 5 mm aralık) kullanarak her iki kulağın da kulak kalınlığını ölçün. Her kulağın iki farklı alanını ölçün ve kulak başına ortalama kulak kalınlığını hesaplayın.
NOT: Kulak kalınlığının ölçülmesi isteğe bağlıdır ve araştırma sorusuna bağlıdır. Ancak, kulak kalınlığı cilt iltihabı için bir okuma olarak kullanılırsa, enfeksiyon önce temel kulak kalınlığı ölçmek için gereklidir. (bkz. Adım 4). - İsteğe bağlı olarak, hafif bant sıyırma ile sırt kulağı derisinin epidermal bariyerini bozun: el ile cilde bant küçük bir parça uygulayın ve tekrar kaldırın. Her tur için yeni bir bant parçası kullanarak art arda 5 tur için tekrarlayın.
NOT: Malassezia engelsiz cilde göre bariyer bozulmuş deride daha belirgin bir deri iltihabına neden olur (Şekil 2A)7. - Topikal bir steril pipet kullanarak her kulağın dorsal tarafına Malassezia/ zeytinyağı süspansiyon 100 μL (2 ODA600)uygulayın. Sadece zeytinyağı ile tedavi edilen bir kontrol grubu (araç la tedavi edilen kontrol grubu) ekleyin.
NOT: Vortex Malassezia/ zeytinyağı süspansiyon şiddetle uygulamadan hemen önce homojen malassezia süspansiyon sağlamak için. - Onlar iyileşme belirtileri gösterene kadar hipotermi önlemek için ısıtma yastığı üzerinde anestezi hayvanları bırakın (bıyık hareketi, artan solunum hızı, vb).
- Metabolizmalarını ve rehidrasyonlarını desteklemek için 200 μL steril ve önceden ısıtılmış %2'lik glikoz çözeltisini nuchal kıvrımına deri altı enjekte edin.
NOT: Steril %2 glikoz çözeltisi hazırlamak için 50 mL PBS'de 1 mg glikozu eritin ve 0,2 μm filtre kullanarak filtreleyin. Çözelti 4 °C'de saklanabilir. - Hayvanları kafeslerine geri transfer edin.
4. Malasseziaanalizi -indüklenen deri iltihabı
NOT: Bu işlem, deri iltihabı bir parametre olarak hizmet veren enfeksiyon sırasında Malasseziakaynaklı kulak şişmesi analizi açıklar. Mantarkaynaklı kulak şişmesini analiz etmek için ön koşul, bant sıyırma ve/veya enfeksiyondan önce temel kulak kalınlığını ölçmektir (Adım 3.5).
- Malassezia-enfekte ve kontrol hayvanların kısa süreli anestezi için isoflurane odası hazırlayın.
- Bir hayvanı odaya aktarın ve hayvanın tamamen anestezi sini bekleyin.
NOT: Uygun anestezi belirtileri tam vücut gevşemeyanı yanı sıra yavaş ve ağır (yan) nefes içerir. Isoflurana uzun süreli maruz kalma ölümcül olabileceğinden anesteziyi dikkatle izleyin. - Hayvanı odadan çıkarın ve bir doku üzerine yerleştirin.
- Kulak(lar) kalınlığını bir kaliper (dağılım 0 - 5 mm) kullanarak ölçün. Her kulağın iki farklı alanını ölçün ve kulak başına ortalama kalınlığı hesaplayın (bkz. adım 3.5).
- Hayvanı kafese geri aktar.
NOT: Isoflurane anestezi çok kısa ömürlüdür ve hayvanlar isofluran odasından çıkarıldıktan sonra ~ 30 s içinde iyileşirler. - Bant sıyırma ve/veya enfeksiyondan önce ölçülen ortalama taban çizgisi kulak kalınlığını, enfeksiyon sonrası her zaman noktasında ölçülen ortalama kulak kalınlığından çıkararak kulak kalınlığındaki artışı hesaplayın.
- Hesaplanan değerleri, kulak kalınlığındaki artış olarak veya alternatif olarak, her hayvan veya hayvan grubu için zaman içinde toplam kulak kalınlığı olarak çizin(Şekil 2B).
5. Enfekte ciltteki mantar yükünün analizi
- Hasat edilecek her kulak için 0,5 mL steril %0,05 NP40 içeren steril2mL mikrosantrifüj tüp ve otoklavlı çelik top (5 mm çapında) hazırlayın.
- Hassas bir denge kullanarak tüpleri tartın ve hassas ağırlığı yazın.
- Co2 boğulma ile fareler ötenazi.
- 5.1 - 5.2 adımlarında açıklandığı gibi, tabandaki kulağı çıkarın ve dH2O'da %0,05 NP40 steril 0,5 mL içeren tüpe aktarın.
- Kulak dokusunu içeren tüpü tartın ve organla birlikte tüpün ağırlığından organ olmadan tüpün ağırlığını çıkararak her bir örneğin gerçek ağırlığını hesaplayın.
- Bir doku homogenizer kullanarak 25 Hz 6 dakika için kulak dokusu homojenize. Dokunun iyi homojenolduğundan emin olun.
- Her numunenin 100 μL plakası (her homojenin 1/5'ine karşılık gelen, seyreltme faktörü = 5) mDixon agar plakalarına ve plakaları baş aşağı 30°C'lik bir kuluçka makinesine kuluçkaya yatırın.
NOT: Homojen kaplama miktarı beklendiği mantar yüküne göre ayarlanmalıdır. Kolay numaralandırma sağlamak için plaka başına en az 10 ve en fazla 250 koloni elde etmek için yeterli homojen plaka emin olun. İsteğe bağlı olarak, homojen farklı seyreltmeler ile örnek başına plaka birden fazla plaka. - Düzenli olarak Malassezia kolonilerinin büyümesini inceleyin.
NOT: Koloniler genellikle 2 - 3 gün sonra görünür hale gelir. Malassezia kolonileri için gerekli zaman malasseziatürü ve suşu bağlıdır. - Plaka başına kolonileri say.
- Aşağıdaki formülü kullanarak CFU/g doku sayısını hesaplayın:
CFU/g doku = (koloni sayısı/plaka) x (seyreltme faktörü) / (g deri örneğinin ağırlığı).
NOT: Yaklaşık minimum algılama sınırı aşağıdaki formül kullanılarak değerlendirilebilir: minimum algılama limiti = (1 koloni/plaka) x (seyreltme faktörü) / (g'deki tüm deri örneklerinin ortalama ağırlığı). - Mantar yükleri genellikle logaritmik ölçekte çizilir (Şekil 2C).
Representative Results
Malassezia in vitro ekimi
C. albicans veya A. fumigatusgibi diğer daha yaygın olarak kullanılan mantar modeli patojenler ile karşılaştırıldığında, Malassezia in vitro kültür daha zordur. Bu Malassezia onun besleyici gereksinimleri için ekzojen lipid kaynaklarına dayanıyor gerçeğine atfedilebilir, yağ asitleri sentezlemek için yetersizlik nedeniyle11. MDixon orta M. pachydermatis, M. furfur, M. sympodialis, M. slooffiae, M. globosa ve M. yamatoensis in vitro 7 dahil olmak üzere çeşitli Malassezia türleri kültür için uygundur ,12. Şekil 1, mDixon orta ve mDixon agar üzerinde m. sympodialis büyüme için temsili görüntüler gösterir adım 1 ve adım 2 açıklandığı gibi.
Malassezia cilt iltihabı deri iltihabı ve mantar yükü analizi
Epidermal ve dermal hiperplazi veödemgelişimi ile karakterize, enfeksiyon öncesinde bant sıyırma tarafından bozulmuş bariyer fare kulak derisine Malassezia maruz kalma, cildin şiddetlenmesi ile sonuçlanır . Adım 4 ve 5 Malassezia-indüklenen kulak şişmesi ve cildin mantar yükünü analiz etmek için yöntemler anahat. Her iki parametre de enfeksiyonun seyrini izlemek için anahtar okumaları temsil eder. Şekil 2A, WT C57BL/6 farelerinin tedirgin derisine kıyasla bariyer bozan cilde M. furfur maruziyetinden sonra gözlenebilir kulak kalınlığındaki artışı göstermektedir. Şekil 2B, zaman içinde kulak kalınlığındaki artışın temsili bir özet grafiğini gösterir. Şekil 2C, M. pachydermatisenfeksiyonundan sonra 2.
Şekil 1: Malassezia in vitro ekimi.
(A) M. sympodialis suş ATCC 42132 3 gün boyunca 30 °C ve 180 rpm sıvı mDixon orta (solda) bir kontrol Erlenmeyer şişesi yanında aşılanmamış mDixon orta içeren (sağ). (B) M. sympodialis kolonileri 30 °C'de 5 günlük kuluçkadan sonra mDixon agar'da ATCC 42132'yi zorlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Malassezia deri enfeksiyonunun kulak kalınlığı ve mantar yükü temelinde analizi.
(A) Zeytinyağı ile tedavi edilen C57BL/6 farelerinden elde edilen kulak bölümlerihistolojisi (araç, sol) veya M. furfur suş JPLK23 ile enfekte 5 gün (orta ve sağ). Sağtarafta, kulak derisi enfeksiyondan önce bantla sıyrılmış. Kesitler hematoksilin ve eozin (H&E) ile boyandı. (B) Malassezia'ya maruz kalan veya kontrol olarak enfekte olmayan C57BL/6 fareleriçin zaman içinde kulak kalınlığındaki artışı gösteren özet grafikler. M. pachydermatis zorlanma ATCC 14522 maruz veya araç tedavi kulak derisinin mutlak kalınlığı her zaman noktada solda görüntülenir; 0. gündeki taban çizgisine göre belirtilen zaman noktalarında kulak kalınlığındaki artış sağda gösterilmiştir. (C) M. pachydermatis zorlanma ATCC 14522 ile enfekte veya bir kontrol (araç) olarak zeytinyağı ile tedavi C57BL/6 farelerin derimantar yükü. Her iki durumda da, deri bant-soyulmuş oldu. Özet grafiklerdeki her sembol B ve C bir hayvanı temsil eder. Gruplar arasındaki farkların istatistiksel önemi tek yönlü ANOVA (B) veya Student's t-test (C) kullanılarak hesaplanmıştır. p <0.001, ****p <0.0001, D.L.: Algılama Sınırı Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Discussion
Bu protokol, malassezia spp tarafından yaygın olarak kullanılan inbred fare suşu C57BL/6 deri enfeksiyonu açıklar. suşları enfeksiyon dozu ayarlama gerekebilir, analiz zaman noktası (lar) vb. Tekrarlanabilirliği sağlamak için, fare grupları her zaman aynı yaşta ve cinsiyette olmalıdır. Farelerin kaynağı, genetik arka plandaki küçük değişiklikler ve satıcılar arasında var olan ve tek bir üreme tesisinin farklı birimleri arasında bile var olabilecek mikrobiyotadaki farklılıklar ın bile, enfeksiyon ders. Bu protokolde açıklanan Malassezia enfeksiyon modelini kurarken, kolonizasyonun kapsamı, mantar temizliğinin kinetikleri ve en uygun istibe koşullarını belirlemek için indüklenen iltihap ve patoloji (örn. kulak derisi enfeksiyondan önce bariyer bozulursa).
Tekrarlanabilirliği sağlamak ve deney grupları arasındaki farklılıkları güvenilir bir şekilde saptamak için, grup başına kullanılan hayvan sayısı istatistiksel analize göre hesaplanmalıdır. Örneklem büyüklüğü, biyolojik ve deneysel varyasyonları (örneğin, bağışıklık sistemindeki değişim nedeniyle) dikkate alan etki boyutu, hata hızı ve güce göre hesaplanır. Etik nedenlerden dolayı gereksiz yere çok sayıda hayvan kullanmaktan kaçının. Malassezia cilt enfeksiyonu ile ilgili olarak, mantar ile sadece bir kulak tedavi ve aynı fare içinde bir kontrol olarak diğer kulak kullanarak, fareler tımar zaman her iki kulak mantar yayılabilir çünkü tavsiye edilmez. Ancak, mantar yükünün belirlenmesi, bağışıklık hücrelerinin izolasyonu veya histolojik analiz gibi farklı metodolojik okumalar için 1/2 kulak kullanmak genellikle yeterlidir ve deneylerde kullanılan hayvan sayılarında önemli bir azalma ile sonuçlanır.
Bugüne kadar 18 farklı Malassezia türü tanımlanmıştır. Malassezia cinsi içindeki türler arası ve türler arası değişimler konakla etkileşimi etkileyebilir, çünkü diğer insan patojenik mantarlar üzerinde yaptığımız çalışmalardan da öğrendik13. Farklı Malassezia türleri ve suşları kökeni farklıdır (örneğin, M. pachydermatis hayvanlardan izole en sık görülen türdür, M. restrictaise, M. globosa ve M. sympodialis en farklı cilt alanları arasında bu türlerin değişken dağılımı ile insanlarda mantar deri mikrobiyom önemli üyeleri). Bazı türler kommensalizm ile ilişkilendirilirken, diğerleri daha patojen olarak düşünülse de, ayrıntılı kanıtlar nispeten zayıf kalmıştır. Daha da önemlisi, bazı türler ve suşlar doğal olarak diğerlerinden daha büyümek zordur. Bu nedenle, enfeksiyon için hangi tür/zorlanmanın kullanılacağına karar araştırma sorusuna dayanmalıdır.
Candida albicans veya Staphylococcus aureus gibi bazı mikrobiyal organizmalar ile murine cilt deneysel enfeksiyon enfeksiyon önce epidermal bariyer bozulması gerektirir, örneğin, kum kağıdı ile14, 15,16. Buna karşılık, Burada açıklanan Malassezia enfeksiyonu modeli ile ve bariyer bozulması olmadan eşit derecede verimli7. Deri enfeksiyon7önce sıyrılmış bant ise mantar tarafından indüklenen inflamasyon derecesi büyük ölçüde artar. Bu nedenle, cilt Malassezia uygulamadan önce manipüle edilmelidir olup olmadığını araştırma soruya bağlıdır. Kronik ve akut deri iltihabıçeşitli modeller (örneğin, gecikmiş tip aşırı duyarlılık modelleri (DTH) ve kontak taşırı duyarlılık modelleri (CHS)) ve bariyer eksikliği modelleri kommensal maya katkısını araştırmak için ilgi olabilir cilt patolojilerine.
Belirli patojen içermeyen (SPF) koşullar altında tutulan inbred fareler (bilgimiz için) doğal Malasseziaile kolonize değildir. Bu nedenle, fare kulak derisine Malassezia deneysel uygulama sırayla 1 - 2 hafta7içinde mantar temizliği yol açan konak, akut bir yanıt neden mantar birincil maruz imal temsil eder. Bu protokolde açıklanan model bu nedenle sadece kısmen immünobeceriksiz insanlar veya kalıcı Malasseziaile kolonize diğer konak organizmalarda durumu yansıtır iken, deneysel enfeksiyon geniş bir pencere sağlar antifungal bağışıklık ve bu yanıtın altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmaları inceleme fırsatı. Ayrıca farklı Malassezia türlerine ve suşlarına farklı deneysel koşullar altında (örneğin, cildin bariyer bozulması ile ve olmadan) yanıt varyasyonları araştırılmasına olanak sağlar.
Malassezia çalışma - konak etkileşimleri kültürlerde izole hücre tipleri ile in vitro deneyler geçmişte sınırlı olmuştur (örneğin, keratinosit hücre hatları, PBMCs). Bu çalışmalar Malassezia ve ev sahibi17arasındaki etkileşimi şekillendiren mantar ve konak belirleyicilerine ışık tutsa da, mantarın kapsamlı bir şekilde anlaşılmasına izin vermezler - kompleksteki konak etkileşimi keratinositler, fibroblastlar ve dokuda yerleşik bağışıklık hücreleri gibi sürekli iletişim halinde olan birden fazla hücre tipini içeren cildin çevresi, aynı zamanda dokuya sadece mikrobiyal karşılaşma sırasında sızan lökosit popülasyonları Cilt. Bu çok hücreli ağ in vitro modellerde, en gelişmiş organoid sistemlerde bile tam olarak çoğaltılamaz. Böylece, farelerin deneysel enfeksiyon hala immünoloji ve bulaşıcı hastalık araştırmaaltın standart temsil eder, ve burada açıklanan modelin durumu Malassezia araştırma alanında bir atılım temsil eder. Daha da önemlisi, bu model malassezia'nın aksi takdirde tedirgin olmayan fare kulak derisine epitanöz uygulamasına dayanır ve mantarın dokuya enjekte edilerek aşılanmasına neden olmaz, örneğin, deri altı veya intraperitoneal olarak, öncekiçalışmalarda rapor 18, her ikisi de doğal olarak kolonize konaklarda durumdan daha uzakolan.
Bu protokolde açıklanan Malassezia enfeksiyonu modelini diğer kullanılabilir fare modelleri ile birleştirme olasılığı, uygulamanın kapsamını ve esnekliğini büyük ölçüde artırır. İkincisi belirli cilt bozukluklarının çeşitli modeller içerir, atopik dermatit önemli özelliklerini taklit bariyer eksikliği modeli gibi, insanlar ve köpeklerde Malassezia ile ilişkili bir hastalık. Ayrıca, Malassezia ile cildin epitaneous enfeksiyonu kolayca ilgi konak genlerde genetik kusurları olan fareler uygulanabilir, ya da ilgi bir hücre tipi genetik silinir fareler veya farmakolojik olarak tükenmiş olabilir (örneğin, anlamına gelir difteri toksin reseptör ifade farelerde difteri toksin uygulanması). Bu tür modeller kommensal ve patojenik mikroplara konak yanıt diseksiyon için kaçınılmaz bir araç temsil, Malasseziadahil , ve mantar-konak etkileşimbu genlerin ve hücre tipinin rolünü değerlendirmek için. Malassezia-konak cilt etkileşimi analizleri bu protokolde açıklananın çok ötesine genişletilebilir. Bunlar arasında histoloji (örn. deri patolojisinin derecesini belirlemek veya mantarın neden olduğu epidermal kalınlaşma) immünohistokimya veya hücre tipine yönelik antikorlar kullanılarak doku bölümlerinin immünofloresan boyanması yer almaktadır. özel belirteçler veya diğer ilgi molekülleri. Ayrıca, enfekte deri dokusundan hücrelerin izolasyonunu (örneğin, doku yerleşik veya doku-infiltrasyon lökosit alt kümeleri) içerebilir polarizasyon, düzenleme ve Malassezia bağışıklık yanıtının dinamikleri büyük bir derinlikte çalışma.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma İsviçre'deki Zürih Üniversitesi tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | |
| Attane Isoflurane | Piramal Healthcare | - | |
| Biosaftey cabinet (BSC) Faster Ultra Safe | DASIT GROUP | TEC 5594 | BSL2 certified |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415D | compatible with 2ml Eppendorf tubes |
| Dessicated Ox-bile | Sigma-Aldrich | 70168-100G | |
| Eppendorf Tubes (2 ml) | Eppendorf | 0030 120.094 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 49159-5KG | |
| Gylcerol (99 %) | Honeywell | 10314830 | |
| Heating pad | Eickenmeyer | 648048 | |
| Incubator Hereaus B20 | Heraeus | 412047753 | BSL2 certified |
| Ketasol (100 mg) | Graeub AG | 6680416 | |
| Magentic heating plate MR Hei-Standard | Heidolph Instruments | 442-1355 | |
| Malassezia spp. | ATCC | 14522, 14521, 42132 | |
| Malt extract | Sigma-Aldrich | 70167-500G | |
| Multiply Biosphere Tubes (200 µl) | Sarstedt AG | 7084211 | Safelock |
| Native olive oil | - | - | commerc. available |
| Nonidet P40 | Axon Lab | A1694,0250 | |
| Oditest measurment devise | Kroeplin | S0247 | range 0-5 mm |
| Oleic Acid | Sigma-Aldrich | 75090-5ML | |
| Peptone | Oxoid | LP0037 | |
| Petri dishes | Sarstedt AG | 82.1473 | |
| Phosphat buffered salt solution (PBS, 1x) | Amimed/Bioconcept | 3-05F39 | |
| Rompun (2 %) | Bayer | KP0BFHR | |
| Shaking incubator Infors Minitron | Infors | - | BSL2 certified |
| Spectrometer | Jenway | 20308 | optical density measurement at 600nm |
| Spectrometer Cuvettes | Greiner Bio-One | 613101 | |
| Stainless Steel balls (5mm) | ABF | KU.5G80 1.3541 | |
| Syringes 1 ml Sub-Q | BD Bioscience | 305501 | |
| Tissue Lyzer II | Quiagen | 85300 | |
| Transpore Hypoallergic Tape | 3M | 1527-1 | |
| Tween 40 | Sigma-Aldrich | P1504-100ML | |
| Vitamin A Retinoli Palmitas Eye Cream | BAUSCH & LOMB | commerc. available |
References
- Iliev, I. D., Leonardi, I. Fungal dysbiosis: immunity and interactions at mucosal barriers. Nature Reviews Immunology. 17 (10), 635-646 (2017).
- Findley, K., et al. Topographic diversity of fungal and bacterial communities in human skin. Nature. 498 (7454), 367-370 (2013).
- Gemmer, C. M., DeAngelis, Y. M., Theelen, B., Boekhout, T., Dawson, T. L. Fast, noninvasive method for molecular detection and differentiation of Malassezia yeast species on human skin and application of the method to dandruff microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 40 (9), 3350-3357 (2002).
- Theelen, B., et al. Malassezia ecology, pathophysiology, and treatment. Medical Mycology. 56, suppl_1 10-25 (2018).
- Williams, M. R., Gallo, R. L. The role of the skin microbiome in atopic dermatitis. Current Allergy and Asthma Reports. 15 (11), 65 (2015).
- Malassezia and the Skin. , Springer. (2010).
- Sparber, F., et al. The Skin Commensal Yeast Malassezia Triggers a Type 17 Response that Coordinates Anti-fungal Immunity and Exacerbates Skin Inflammation. Cell Host Microbe. 25 (3), 389-403 (2019).
- Koh, A. Y. Murine models of Candida gastrointestinal colonization and dissemination. Eukaryotic Cell. 12 (11), 1416-1422 (2013).
- Solis, N. V., Filler, S. G.
- Russel, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , Methuen & Co. London. (1959).
- Wu, G., et al. Genus-Wide Comparative Genomics of Malassezia Delineates Its Phylogeny, Physiology, and Niche Adaptation on Human Skin. PLoS Genetics. 11 (11), 1005614 (2015).
- Leong, C., Buttafuoco, A., Glatz, M., Bosshard, P. P. Antifungal Susceptibility Testing of Malassezia spp. with an Optimized Colorimetric Broth Microdilution Method. Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1883-1893 (2017).
- Schonherr, F. A., et al. The intraspecies diversity of C. albicans triggers qualitatively and temporally distinct host responses that determine the balance between commensalism and pathogenicity. Mucosal Immunology. 10 (5), 1335-1350 (2017).
- Igyarto, B. Z., et al. Skin-resident murine dendritic cell subsets promote distinct and opposing antigen-specific T helper cell responses. Immunity. 35 (2), 260-272 (2011).
- Liu, H., et al. Staphylococcus aureus Epicutaneous Exposure Drives Skin Inflammation via IL-36-Mediated T Cell Responses. Cell Host Microbe. 22 (5), 653-666 (2017).
- Nakagawa, S., et al. Staphylococcus aureus Virulent PSMalpha Peptides Induce Keratinocyte Alarmin Release to Orchestrate IL-17-Dependent Skin Inflammation. Cell Host Microbe. 22 (5), 667-677 (2017).
- Sparber, F., LeibundGut-Landmann, S. Host Responses to Malassezia spp. in the Mammalian Skin. Frontiers in Immunology. 8, 1614 (2017).
- Yamasaki, S., et al. C-type lectin Mincle is an activating receptor for pathogenic fungus, Malassezia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (6), 1897-1902 (2009).
