Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

सिरियाना इलेक्ट्रोपोरिओशन हरपीज सिंप्लेक्स वायरस प्रकार 1-संक्रमित मोनोसाइट-रिडेरिड डेन्ड्रिटिक सेल में ऑटोफैगी को मॉडूलेट करने के लिए

Published: October 28, 2019 doi: 10.3791/60190
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Immune Modulation, Universitätsklinikum Erlangen

Summary

इस अध्ययन में, हम दाद सिंप्लेक्स वायरस प्रकार-1 (एचएसवी-1) संक्रमित मोनोसाइट व्युत्पन्न डेन्ड्रिटिक कोशिकाओं में ऑटोफैगिक फ्रलक्स के साथ हस्तक्षेप करने के लिए अवरोधक- और siRNA आधारित रणनीतियों प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

हरपीज सिंप्लेक्स वायरस टाइप-1 (एचएसवी-1) दोनों में ऑटोफैगी प्रेरित करता है, अपरिपक्व डेन्ड्रिटिक कोशिकाओं (आईडीसी) के साथ-साथ परिपक्व डेन्ड्रिटिक कोशिकाओं (एमडीसी), जबकि ऑटोफैगिक फ्रलक्स केवल आईडीसी में मनाया जाता है। मशीनी अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए, हमने एचएसवी-1-प्रेरित ऑटोफैगिक टर्नओवर के साथ हस्तक्षेप करने के लिए कुशल रणनीति विकसित की है। एक अवरोधक आधारित रणनीति, एचएसवी -1 प्रेरित autophagy को व्यवस्थित करने के लिए, यह एक आसान और तेजी से विधि है, क्योंकि पहली पसंद का गठन किया। ऐसे यौगिकों के संभावित विशिष्ट ऑफ-लक्ष्य प्रभावों को दरकिनार करने के लिए, हमने एचएसवी-1 संक्रमण पर आईडीसी में ऑटोफैगिक टर्नओवर को मोडाने के लिए एक वैकल्पिक siRNA-आधारित रणनीति विकसित की है। दरअसल, एचएसवी-1 संक्रमण से पहले FIP200-विशिष्ट siRNA के साथ आईडीसी के इलेक्ट्रोपोट्रेशन FIP200 प्रोटीन अभिव्यक्ति को समाप्त करने के लिए एक बहुत ही विशिष्ट और सफल तरीका है और इस तरह autophagic प्रवाह को बाधित करने के लिए। दोनों प्रस्तुत तरीकों iDCs में एचएसवी -1 प्रेरित autophagic कारोबार के कुशल निषेध में परिणाम है, जिससे siRNA आधारित तकनीक अधिक लक्ष्य विशिष्ट है. एक अतिरिक्त siRNA आधारित दृष्टिकोण चुनिंदा KIF1B और KIF2A के प्रोटीन अभिव्यक्ति मौन करने के लिए विकसित किया गया था, mDCs में एचएसवी-1 संक्रमण पर autophagic कारोबार की सुविधा. अंत में, siRNA इलेक्ट्रोपोर्शन की तकनीक एक आशाजनक रणनीति का प्रतिनिधित्व करता है, चुनिंदा अलग प्रोटीन की अभिव्यक्ति ablate करने के लिए और एक एचएसवी -1 संक्रमण पर उनके प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए.

Introduction

मानव मोनोसाइट व्युत्पन्न डेन्ड्रिटिक कोशिकाओं (डीसी) की पीढ़ी इस महत्वपूर्ण प्रतिरक्षा कोशिका प्रकार के कार्यों और जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो मॉडल में एक उपयुक्त का गठन करती है। हाल केवर्षोंमें 1,2में अलग - अलग और डीसी में मोनोसाइट्स का विभेद अच्छी तरह से स्थापित किया गया है . जेड-हर्पीवायरस हर्पस सिंप्लेक्स वायरस टाइप-1 (एचएसवी-1) के साथ डीसी का संक्रमण डीसी जीव विज्ञान2,3,4,5,6 के एचएसवी-1-मध्यस्थ मॉडुलन का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में कार्य करता है . यह विशेष रूप से स्पष्ट करने के लिए महत्वपूर्ण है कि दादवायरस कैसे नम या शक्तिशाली एंटीवायरल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को बाधित करते हैं, मेजबान7,8 के अंदर प्रतिरक्षा-सुविधा प्राप्त niches में विलंबता स्थापित करनेकेलिए । इस संबंध में, हर्पीवायरस बहुत सफल रोगजनक हैं जो भौगोलिक क्षेत्र9के अनुसार 90 प्रतिशत तक की सीरो-एरो-एरोसिस तक पहुंचने वाली आबादी में व्यापक रूप से फैले हुए हैं। समझने के लिए और संभवतः इस को रोकने के लिए, मेजबान की प्रतिरक्षा प्रणाली के एचएसवी-1-मध्यस्थ मॉडुलन में अधिक अंतर्दृष्टि, और विशेष रूप से प्रतिरक्षा कोशिकाओं जैसे डीसी की आवश्यकता है।

एचएसवी-1 के साथ डीसी की परस्पर क्रिया के बारे में एक पूरी तरह से नया अवलोकन हाल ही में ट्यूरन एट अल10द्वारा प्रकाशित किया गया था। लेखकों का प्रदर्शन किया है कि एचएसवी-1 प्रतिकृति की उपलब्धि सख्ती से डीसी की परिपक्वता स्थिति पर निर्भर है. आईडीसी में, एचएसवी -1 की पूरी प्रतिकृति ऑटोफैगी-निर्भर तंत्र द्वारा सुविधा प्रदान की जाती है। जबकि एचएसवी 1 दोनों, आईडीसी और एमडीसी में ऑटोफैगता पैदा करता है, ऑटोफैगिक फ्रलक्स केवल आईडीसी में मनाया जाता है। यह बदले में iDCs में परमाणु lamins के autophagic गिरावट के माध्यम से वायरल capsids के परमाणु उत्सर्जन की सुविधा. आईडीसी बनाम एमडीसी में इस एचएसवी-1-प्रेरित गिरावट मार्ग में मशीनी अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए, ऑटोफैगिक फ्लक्स की जांच करने के लिए नई और कुशल रणनीतियों महत्वपूर्ण हैं।

मैक्रोऑटोफैगी (ऑटोफैगी) एक अच्छी तरह से संरक्षित बहुचरण प्रक्रिया है जो लाइसोसोमल पाचन11के लिए इंट्रासेल्यूलर प्रोटीन या पूरे ऑर्गेनाइन्स को लक्षित करती है। सिम्पलिस्टिक रूप से, स्वभोजिता को (i) दीक्षा, (पप) झिल्ली नाभिक, (पपप) आशय विस्तार, और (iv) स्व-भोजन-lysosome संलयन चरण12में विभाजित किया जा सकता है। दीक्षा के दौरान (i), सक्रिय ULK1/2 kinase परिसर के रूप में घटक, 200 केडी (FIP200) के फोकल आसंजन kinase परिवार बातचीत प्रोटीन युक्त, beclin-1-Vps34-AMBRA1 परिसर को सक्रिय करने के लिए महत्वपूर्ण हैं. इसके बाद, झिल्ली नाभिक (पप) फागोफोर गठन13की शुरुआत करती है जो कोशिकाद्रव्यी कार्गोओं को घेर लेती है जो च6214जैसे अणुओं से चिह्नित होती हैं। आशय विस्तार और ऑटोफैगोफोर परिपक्वता के दौरान (iii) microtubule-संबद्ध प्रोटीन प्रकाश श्रृंखला 3 (LC3)-मैं अपने lipidated रूप LC3-II है कि autophagosomal झिल्ली में डाला जाता है में परिवर्तित कर दिया जाता है. इस प्रकार, एलसी 3-I से -II रूपांतरण दर परिपक्व स्वाक्षरी के गठन को प्रतिबिंबित करके स्वभोजी प्रेरण के लिए एक संकेतक है15,16. ऑटोफागोसम-लाइसोम संलयन (iv) पर, न केवल ऑटोफैगिक कार्गो बल्कि जुड़े p62 और LC3-II प्रोटीन भी निम्नीकरण से गुजरना (जैसे, हाइड्रोलिसिस द्वारा)। इस प्रकार च62 तथा एलसी 3-II की हानि स्वाक्षाभी फ्रलक्स17के लिए मार्कर के रूप में कार्य करती है। लाइसोसोम के साथ ऑटोफैगोसोम का संलयन, और इस प्रकार स्वाक्षाभ कारोबार के बाद, इंट्रासेल्यूलर लाइसोसोमल स्थानीयकरण पर अत्यधिक निर्भर है। यह है, दूसरों के अलावा, kinesin परिवार के सदस्यों KIF1B और KIF2A द्वारा विनियमित, जो नकारात्मक autophagosome-lysosome संलयन18को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया था. दिलचस्प है, KIF1B और KIF2A के प्रोटीन अभिव्यक्ति डीसी परिपक्वता पर प्रेरित है और इस तरह एचएसवी -1 संक्रमित mDCs में अक्षम autophagic प्रवाह के लिए जिम्मेदार है, जो पूरा एचएसवी -1 प्रतिकृति10बाधा.

स्वत: भोजन को रोकने के प्रायोगिक प्रयासों में इस विशेष मार्ग को प्रेरित करने या बाधित करने के लिए जाने जाने वाले यौगिकों का उपयोग19,20,21शामिल है . इस अध्ययन में, हम एचएसवी-1-संक्रमित आईडीसी में ऑटोफैगिक कारोबार को रोकने के लिए दो अवरोधक-आधारित रणनीतियों का वर्णन करते हैं। हमारे प्रयोगों में प्रयुक्त पहला यौगिक विशिष्ट और शक्तिशाली autophagy अवरोध करनेवाला-1 (spautin-1) है, जो beclin-1-Vps34-AMBRA1 जटिल गिरावट को बढ़ावा देने के लिए वर्णित किया गया था autophagy22के दीक्षा चरण के दौरान . वर्तमान अध्ययन में प्रयुक्त दूसरा यौगिक bafilomycin-A1 (BA1), एक वी-ATPase अवरोध करनेवाला है कि देर autophagic घटनाओं ब्लॉक(यानी, autophagosome-lysosome संलयन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से autolysosome अम्लीकरण)23,24. एचएसवी -1 के साथ आईडीसी संक्रमण से पहले इन दोनों अवरोधकों में से किसी का उपयोग पर्याप्त रूप से ऑटोफैगी को रोकता है, लेकिन कुशल वायरल जीन अभिव्यक्ति को परेशान नहीं करता है। इस प्रकार, एचएसवी-1 संक्रमण से पहले यह अवरोधक-आधारित रणनीति एचएसवी -1-प्रेरित ऑटोफैगिक फ्लक्स को बाधित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करती है जिसे आसानी से विभिन्न सेल प्रकारों और वायरस के ढेर सारे के लिए विस्तारित किया जा सकता है, जो संभावित रूप से ऑटोफैगी को भी प्रेरित करता है।

एक अवरोधक आधारित दृष्टिकोण (यानी, विशिष्ट ऑफ-लक्ष्य प्रभाव) के एक प्रमुख नकारात्मक पक्ष को दूर करने केलिए, हमने एक siRNA-आधारित विधि विकसित की है ताकि ऑटोफैगिक फ्रलक्स को अवरुद्ध किया जा सके (एचएसवी-1-संक्रमित) iDCs. SiRNA इलेक्ट्रोपोरिकेशन की तकनीक एक शक्तिशाली वैकल्पिक रणनीति का प्रतिनिधित्व करता है, अलग प्रोटीन की अभिव्यक्ति के चयनात्मक ablation के माध्यम से (यानी, autophagic घटकों). हमारे प्रयोगों में iDCs FIP200-विशिष्ट siRNA के साथ विद्युतीकृत किया गया इलेक्ट्रोपोरेशन उपकरण I का उपयोग कर (सामग्री की तालिकादेखें) और एक संशोधित प्रोटोकॉल Gerer एट अल द्वारा वर्णित (2017) और Prechtel एट अल (2007), के दौरान autophagy को बाधित करने के लिए दीक्षा चरण25,26. इस तकनीक हमें विशेष रूप से iDCs में FIP200 अभिव्यक्ति दस्तक करने के लिए अनुमति दी, सेल व्यवहार्यता और उनके अपरिपक्व phenotype दो दिन के बाद electroporation के साथ हस्तक्षेप के बिना. ध्यान देने योग्य, एचएसवी-1 संक्रमण इन इलेक्ट्रोपोरेटेड आईडीडीसी में स्थापित किया गया था जो कुशल वायरल प्रोटीन अभिव्यक्ति से प्रतिबिंबित होता है। इस siRNA आधारित तकनीक एक अद्वितीय लाभ प्रदान करता है (यानी, कि विभिन्न autophagic घटकों की एक किस्म, यहां तक कि संयोजन में), विशेष रूप से उनकी अभिव्यक्ति के ablation के लिए लक्षित किया जा सकता है.

इस अध्ययन में, हम आगे एचएसवी-1 संक्रमित mDCs में भी autophagic प्रवाह प्रेरित करने के लिए एक siRNA आधारित विधि का वर्णन. इस मामले में, iDCs को इलेक्ट्रोपोरेशन II का उपयोग करके डीसी परिपक्वता से पहले KIF1B और KIF2A के विरुद्ध लक्षित siRNA के साथ विद्युतीकृत किया गया था (सामग्री की तालिकादेखें)। चूंकि दोनों प्रोटीन डीसी परिपक्वता के दौरान विनियमित होते हैं और lysosomes10,18के साथ autophagosomes के संलयन को नकारात्मक रूप से विनियमित करने के लिए जाना जाता है , उनके knockdown दृढ़ता से प्रेरित HSV-1 संक्रमण पर mDCs में autophagic प्रवाह. इस प्रकार, siRNA आधारित तकनीक हमें विशेष रूप से mDCs में KIF प्रोटीन अभिव्यक्ति के साथ हस्तक्षेप के माध्यम से autophagic कारोबार प्रेरित करने के लिए सक्षम है, और इस तरह iDCs में अपनी अभिव्यक्ति के स्तर की नकल कर सकता है.

संक्षेप में, हम एचएसवी-1-संक्रमित आईडीसी में ऑटोफैगिक फ्रलक्स को बाधित करने के लिए दो अलग-अलग तरीके प्रस्तुत करते हैं। जबकि पहले अवरोधक आधारित दृष्टिकोण autophagic गिरावट के साथ हस्तक्षेप करने के लिए एक आसान, सस्ते और तेजी से तरीका का गठन, दूसरी siRNA आधारित तकनीक अधिक विशिष्ट और समर्थन और अवरोधकरनेवाला के परिणामों को सत्यापित करने के लिए एक बहुत ही उपयुक्त तरीका है आधारित प्रयोगों. इसके अलावा, हम दो KIF प्रोटीन के siRNA-मध्यस्थ दस्तक के माध्यम से, एचएसवी-1 संक्रमित mDCs में भी autophagic प्रवाह प्रेरित करने के लिए एक विधि का वर्णन.

Protocol

मोनोसाइट व्युत्पन्न डीसी स्वस्थ दाताओं के ल्यूकाफेरेसिस उत्पादों से उत्पन्न किए गए थे। इसके लिए, स्थानीय आचार समिति से एक सकारात्मक वोट प्राप्त किया गया है (संदर्भ संख्या 4556)। वर्तमान अध्ययन के प्रयोगों को "फ्राइडेरिक-एलेक्सैंडर-यूनिवर्सिट-ट एरलैंगन-नर्नबर्ग" (संदर्भ संख्या 4556) की आचार समिति की सिफारिशों के अनुसार किया गया। सभी दाताओं हेलसिंकी की घोषणा के अनुसार सहित एक लिखित सूचित सहमति को मंजूरी दे दी.

1. अपरिपक्व डेन्ड्रिटिक कोशिकाओं (आईडीसी) और परिपक्व डेन्ड्रिटिक कोशिकाओं (एमडीसी) की पीढ़ी और हैंडलिंग

  1. ल्यूकोरिओरिबिलेशन सिस्टम चैम्बर्स (एलआरएससी) से मानव परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) को अलग करें जैसा कि पहलेवर्णित 27. पीबीएमसी के क्रायोप्रेक्षण से बचें और उच्च डीसी पैदावार प्राप्त करने के लिए उन्हें सीधे अलगाव पर उपयोग करें।
  2. टी175 सेल कल्चर फ्लास्क में विभिन्न स्वस्थ दाताओं के पीबीएमसी से मानव डीसी उत्पन्न करें जैसा कि पहले10,27का वर्णन किया गया था . संक्षेप में, डीसी मध्यम के 30 एमएल में 350-400 लाखों PBMCs का उपयोग करें (RPMI 1640 एल-ग्लूटामाइन के बिना, 1% (v/v) एबी-सेरम, 100 U/mL पेनिसिलिन, 100 mg/mL streptomycin, 0.4 mM L-glutamine, 10mMES ESE. 1 ज के बाद, RPMI 1640 का उपयोग कर के गैर adherent अंश धो लें। 800 U/mL GM-CSF और 250 U/mL आईएल-4 के साथ पूरक ताजा डीसी माध्यम जोड़ें, और 3 दिनों के लिए इनक्यूबेट करें।
    1. तीसरे दिन 3 के बाद पालन, जीएम-सीएसएफ और आईएल-4 युक्त ताजा डीसी माध्यम के 5 एमएल जोड़ें, डीसी भेदभाव के लिए क्रमशः 400 यू/एमएल और 250 यू/एमएल प्रति सेल कल्चर फ्लास्क की अंतिम एकाग्रता के साथ।
    2. IDCs फसल के लिए, धीरे सेल संस्कृति फ्लास्क के नीचे से ढीला-लग्न iDCs कुल्ला, दिन 4 के बाद पालन पर. इस चरण को 2 बार दोहराएँ. एमडीसी के उत्पादन के लिए, परिपक्वता कॉकटेल इस प्रकार से बना जोड़ें: जीएम-सीएसएफ (अंतिम एकाग्रता: 40 U/mL), आईएल-4 (अंतिम एकाग्रता: 250 U/mL), आईएल-6 (अंतिम एकाग्रता: 1000 U/mL), आईएल-1$(अंतिम एकाग्रता: 200 U/mL), TNF-जेड (अंतिम एकाग्रता: 10 एनजी/ एमएल), प्रोस्टाग्लैंडिन E2 (PGE2; अंतिम एकाग्रता: 1 g/
    3. छह दिन के बाद पालन (दो दिन एक साइटोकिन कॉकटेल का उपयोग कर परिपक्वता के बाद प्रेरण), सेल संस्कृति फ्लास्क के नीचे से mDCs कुल्ला. इस चरण को दो बार दोहराएँ.
      नोट: अपरिपक्व और परिपक्व डीसी क्रमिक रूप से 1 सेल संस्कृति फ्लास्क में समान दाताओं से उत्पन्न किया जा सकता है. ऐसा करने के लिए, (i) आईडीसी की उचित संख्या को अलग करें और (ii) चरण 1.2.2 में सूचीबद्ध साइटोकिन कॉकटेल का उपयोग करके फ्लास्क में शेष कोशिकाओं की परिपक्वता को प्रेरित करती हैं।
  3. संबंधित सेल कल्चर मीडियम में आईडीसी या एमडीसी को 50 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित करें। 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूगेशन के माध्यम से कोशिकाओं फसल।
    1. आरपीएमआई 1640 प्रति सेल कल्चर फ्लास्क के 5-10 एमएल में धीरे से (जेडवॉश) डीसी का पुनर्गठन करें। एक ट्यूब में संबंधित डीसी निलंबन का मिश्रण.
    2. किसी गणना कक्ष या वैकल्पिक विधि का उपयोग करके कक्ष क्रमांक निर्धारित करें. आईडीसी को संभालने के दौरान तापमान परिवर्तन से बचें, phenotypic परिवर्तन के जोखिम को कम करने के लिए।

2. प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण phenotypic परिपक्वता स्थिति की निगरानी करने के लिए

  1. एक 1.5 एमएल ट्यूब में चरण 1.3.1 से IDCs या mDCs (0.5 x 106) को स्थानांतरित करें। 1.5 मिनट के लिए 3390 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूगेशन के माध्यम से कोशिकाओं को फसल। एफएसीएस बफर (पीबीएस 2% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें।
  2. परिभाषित सतह अणुओं के खिलाफ विशिष्ट फ्लोरोक्रोम लेबल एंटीबॉडी युक्त एंटीबॉडी धुंधला समाधान (FACS बफर) के 100 डिग्री एल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित।
    1. शुद्धता (CD3-FITC, CD14-PE) के साथ ही डीसी 80-PacBlue/-PE-Cy5, CD11c-PE-Cy5, CCR7-PE-Cy7, CD83-APC, CD86-PE, MHCII-APC-Cy7) की परिपक्वता स्थिति को सत्यापित करने के लिए निम्न एंटीबॉडी का उपयोग करें।
    2. एक नियंत्रण के रूप में FACS बफर के 100 $L में एक unstained नमूना तैयार करें.
    3. 30 मिनट के लिए अंधेरे में बर्फ पर कोशिकाओं को दाग.
  3. बाद में 1 लाख रुपये बफर और अपकेंद्रित्र में 1.5 मिनट के लिए 3390 x ग्राम पर दो बार कोशिकाओं को धो लें।
  4. अंत में, 200 में कोशिकाओं को फिर से निलंबित FACS बफर के 2% पीएफए के साथ पूरक और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा कोशिकाओं का विश्लेषण. फिक्स्ड कोशिकाओं को 2 दिनों तक अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

3. हरपीज सिंप्लेक्स वायरस टाइप-1 (एचएसवी-1) के साथ डीसी की संक्रमण प्रक्रिया और स्पायूटिन-1 या बैफिलोमाइसिन-ए 1 के माध्यम से एचएसवी-1-प्रेरित ऑटोफैगिक फ्लक्स के हस्तक्षेप

नोट: तनाव HSV-1/17 +/CMV-EGFP/UL43 (HSV-1 EGFP) इस अध्ययन में इस्तेमाल प्रयोगशाला तनाव एचएसवी -1 तनाव 17 + से प्राप्त किया गया था. एचएसवी -1 ईजीएफपी तनाव बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईजीएफपी) जो सीएमवी प्रमोटर के नियंत्रण में UL43 जीन टिड्डी में डाला गया है व्यक्त करता है। EGFP एचएसवी -1 संक्रमण के लिए एक मार्कर के रूप में कार्य करता है। इसके अलावा, तनाव HSV1-RFPVP26 डीसी संक्रमण अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया था (पहले Turan एट अल में वर्णित., 2019). यह वायरस कैप्सिड सतह प्रोटीन VP26 मोनोमर लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (mRFP) के लिए जुड़े व्यक्त करता है।

  1. एक 2 एमएल ट्यूब में चरण 1.3 से iDCs या mDCs (2 x 106) को स्थानांतरित करें। इसके बाद, कोशिकाओं को 1.5 मिनट के लिए 3390 x ग्राम पर अपकेंद्रण करें और सुपरनेंट को त्याग दें।
  2. धीरे से संक्रमण के माध्यम में कोशिकाओं को फिर से निलंबित (RPMI 1640 20 एम एम HEPES के साथ पूरक).
    1. ऑटोफागोसोमल-लाइसोसोमल अवक्रमण मार्ग को बाधित करने के लिए, संक्रमण से पहले स्पैटिन-1 या बैफिलोमाइसिन-ए 1 1 एच के साथ पूर्व-उपचार डीसी। संक्रमण माध्यम के लिए या तो 10 $M spautin-1 या 1 $M BA1, या DMSO अनुपचारित नियंत्रण के रूप में जोड़ें। एक हीटिंग ब्लॉक में कोशिकाओं को 300 आरपीएम पर 1 ज के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए इनक्यूबेट करें।
    2. संक्रमण के अध्ययन के लिए, 2 के संक्रमण (एमओआई) की बहुलता में एचएसवी -1 virions के साथ कोशिकाओं टीका। एमएनटी बफर (30 एमएम 2-(एन-मॉर्फोलिनो) एथेनेसल्फोनिक एसिड (एमईएस), 100 एमएम नैक्ल, 20 एमएम ट्राइस) को मॉक कंट्रोल के रूप में जोड़ें। एक हीटिंग ब्लॉक में कोशिकाओं को 300 आरपीएम पर 1 ज के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए इनक्यूबेट करें।
  3. 1 ज पोस्ट संक्रमण (एचपीआई), 1.5 मिनट के लिए 3390 x ग्राम पर कोशिकाओं को इकट्ठा करें और डीसी माध्यम में कोशिकाओं को धीरे से पुन: निलंबित करें जिसमें जीएम-सीएसएफ के 40 यू/एमएल, आईएल-4 के 250 यू/एमएल और या तो 10 एम स्पाईटिन-1, 1 डिग्री एम बीए 1, या डी एमएसओ नियंत्रण के रूप में नियंत्रण है। बीज नकली इलाज और एचएसवी -1 संक्रमित कोशिकाओं एक 6 अच्छी तरह से थाली में 1 x 106/
  4. 16-24 hpi पर, rinsing (mDCs) या एक सेल खुरचनी (iDCs) का उपयोग करके कोशिकाओं फसल. कोशिकाओं को 1.5 एमएल सेफलॉक ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    1. 1.5 मिनट के लिए 3390 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूगेशन के माध्यम से कोशिकाओं को एकत्र करें और पीबीएस के 1 एमएल जोड़कर एक बार गोली धो लें।
    2. lysis मिश्रण में कोशिकाओं को जोरदार ढंग से पुन: निलंबित करें जिसमें 2x रोटी-लोड का 29 डिग्री सेल्सियस, 1 डिग्री एल 100 एमजीसीएल2 और 12.5 यू/एमएल बेंजोनेस होता है।
    3. बेंजोनेज का उपयोग करके सेल lysis और डीएनए पाचन के लिए, 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को इनक्यूबेट करें। इसके बाद, 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर प्रोटीन को विकृत करें।
    4. LC3BI/II, p62, ICP0/5, और GAPDH के प्रोटीन स्तर को सत्यापित करने के लिए एसडीएस-पेज और पश्चिमी ब्लॉट विश्लेषण करें।

4. एफआईपी 200-सिआरएनए का उपयोग करके आईडीसी के इलेक्ट्रोपोट्रेशन के माध्यम से एचएसवी-1-प्रेरित ऑटोफैगिक फ्रलक्स का हस्तक्षेप

नोट: siRNA इलेक्ट्रोपोरिओशन के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल Prechtel एट अल से संशोधित किया गया था (2007) और Gerer एट अल (2017).

  1. स्थानांतरण iDCs (12 x 106) दिन में 3.5 एक 50 एमएल ट्यूब में पालन के बाद. इसके बाद, कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रण करें और सुपरनेंट को त्याग दें। समानांतर में, चरण 2 में वर्णित परिपक्वता स्थिति की निगरानी करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण करें (CD80-PacBlue के बजाय जीवन/मृत बैंगनी का उपयोग करें)।
  2. फीनॉल लाल के बिना ऑप्टिएम के 5 एमएल में iDCs को धीरे से धोएं और कोशिकाओं को 300 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए छोड़ ें। सुपरनेंट को त्यागें और धीरे से फिनोल लाल के बिना ऑप्टीएम के 200 डिग्री एल में iDCs को पुन: निलंबित करें, 6 x 106/100 $L की कोशिका सांद्रता का समायोजन करें। कोशिकाओं को बर्फ पर न रखें और तापमान परिवर्तन से बचें। जल्दी से आगे बढ़ें और फिनोल लाल बिना ऑप्टीमेम में आईडीसी की लंबी ऊष्मायन अवधि से बचें।
  3. FIP200-विशिष्ट siRNA के 75 pmol या तले हुए siRNA के 75 pmol स्थानांतरण, एक नियंत्रण के रूप में, 4 मिमी इलेक्ट्रो cuvettes में और सेल निलंबन के 100 डिग्री सेल्सियस (6x106 कोशिकाओं) जोड़ें. प्रत्यक्ष पल्स iDCs इलेक्ट्रोपोर्शन उपकरण I का उपयोग कर, निम्न सेटिंग्स लागू: 500 V के लिए 1 एमएस.
    1. प्रयोगात्मक प्रक्रिया से पहले, निर्माता के निर्देश के अनुसार siRNA निलंबन तैयार करते हैं, alicot और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर। Thaw और उन्हें बर्फ पर रखने के लिए जब विद्युत पूजा के लिए इन siRNAs का उपयोग कर. नमूनों को विद्युतीकरण करने से पहले, एक परीक्षण पल्स प्रदर्शन करते हैं।
  4. इलेक्ट्रोपोट्रेशन के बाद, सीधे iDC को ताजा पूर्व-गर्म डीसी माध्यम के साथ 6-वेल प्लेट्स में स्थानांतरित करें (जीएम-सीएसएफ के 40 यू/एमएल और आईएल-4 के 250 यू/एमएल के साथ पूरक)। कोशिकाओं को 1 x 106/mL की अंतिम सांद्रता पर बीज दें और उन्हें एक इन्क्यूबेटर में रखें। कोशिकाओं को इलेक्ट्रो क्यूवेट से बाहर न कुल्लाएं।
  5. 48 ज के बाद, पहले इलेक्ट्रोपोरेटेड आईडीसी की आकृति विज्ञान की सूक्ष्म रूप से जांच करें। फिर, एक सेल खुरचनी का उपयोग कर कोशिकाओं फसल और उन्हें 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित. पीबीएस के 1 एमएल के साथ कुओं कुल्ला 0.01% EDTA के साथ पूरक और संबंधित ट्यूबों में समाधान हस्तांतरण.
  6. बाद में, अगले चरणों में वर्णित के रूप में siRNA स्थिति प्रति 6 x 106 iDCs विभाजित करें।
    1. 0.5 x 106 कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए परिपक्वता की स्थिति और सेल व्यवहार्यता चरण 2 में वर्णित के रूप में का आकलन. निम्नलिखित एंटीबॉडी का उपयोग करें: CD11c-PE-Cy5, CCR7-PE-Cy7, CD83-APC, MHCII-APC-Cy7 और जीवन /
    2. FIP200-विशिष्ट नॉकडाउन दक्षता सत्यापित करने के लिए पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए 1 x 106 कोशिकाओं का उपयोग करें। कोशिकाओं को 1.5 मि. चरण 3.4 में वर्णित सेल lysates तैयार करें और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण करें। 3390 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा कोशिकाओं को 1.5 एमएल सेफलॉक ट्यूब में स्थानांतरित करें और उसे काटा।
    3. शेष कोशिकाओं का प्रयोग करें (4.5 x 106) HSV-1 संक्रमण प्रयोगों के लिए. प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति के लिए, 2 एमएल ट्यूबों में 2.25 x 106 iDCs हस्तांतरण और या तो उन्हें 2 की एक MOI में HSV1 के साथ संक्रमित या एक नकली नियंत्रण के रूप में MNT बफर जोड़ें. चरण 3.3 में वर्णित के रूप में संक्रमण निष्पादित करें।
    4. 20 एचपीआई में कोशिकाओं को सेल खुरचनी से भर दें और चरण 3-4 में वर्णित पश्चिमी दाग विश्लेषणों के लिए सेल lysates तैयार करें।

5. एचएसवी-1 संक्रमित एमडीसी में ऑटोफागोसम-लाइसोमल मार्ग का मॉडुलन KIF1B/2A-siRNA इलेक्ट्रोपोरेशन का उपयोग कर

  1. स्थानांतरण iDCs (24 x 106) दिन में 4 पोस्ट पालन एक 50 एमएल ट्यूब में. इसके बाद, कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रण करें और सुपरनेंट को त्याग दें।
  2. Pबीएस के 8 एमएल में धीरे से resuspend (जेड धोने) iDCs, 3 x 106/mL के एक अंतिम सेल एकाग्रता को समायोजित करने के लिए। स्थानांतरण 3 x 106 कोशिकाओं 1.5 एमएल ट्यूब में और 1.5 मिनट के लिए 3390 x ग्राम पर कोशिकाओं फसल.
  3. पूरक मिश्रण युक्त बफर पी 3 के 100 डिग्री एल में iDCs को पुन: निलंबित करें (निर्माता के निर्देशों के अनुसार; इलेक्ट्रोपोर्केशन किट उपकरण II) और या तो (i) KIF1B-विशिष्ट siRNA के 75 pmol, (ii) KIF2A-विशिष्ट siRNA के 75 pmol, या (iii) दोनों. (पअ) नियंत्रण के रूप में तले हुए siRNA की संबंधित राशि का उपयोग करें। प्रत्येक siRNA हालत (6 x 106 कोशिकाओं) के लिए दो ट्यूब तैयार करें और अलग विद्युत cuvettes में निलंबन हस्तांतरण. प्रत्यक्ष पल्स iDCs पल्स लागू करने "EH-100" विद्युत उपकरण द्वितीय का उपयोग कर.
    1. प्रयोगात्मक प्रक्रिया से पहले, निर्माता के निर्देश के अनुसार siRNA निलंबन तैयार करते हैं, alicot और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर। Thaw और उन्हें बर्फ पर रखने के लिए जब विद्युत पूजा के लिए इन siRNAs का उपयोग कर. बर्फ पर iDCs जगह नहीं है और तापमान परिवर्तन से बचें। जल्दी से ले जाएँ और पीबीएस या बफर P3 में iDCs की लंबी ऊष्मायन से बचें।
  4. इलेक्ट्रोपोट्रेशन के बाद सीधे, इलेक्ट्रो क्यूवेट में प्री-वार्म्ड आरपीएमआई 1640 के 500 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। 5-10 मिनट के लिए एक इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें, ताजा प्री-वार्म्ड डीसी माध्यम के साथ 6-वेल प्लेट्स में आईडीसी को स्थानांतरित करें (जीएम-सीएसएफ के 40 यू/एमएल और आईएल-4 के 250 यू/एमएल के साथ पूरक)। संबंधित शर्तों को एक अच्छी तरह से मिलाएं, कोशिकाओं को 1 "106/एमएल के अंतिम एकाग्रता में बीज दें और उन्हें एक इन्क्यूबेटर में रखें।
  5. 4 ज ऊष्मायन के बाद, चरण 1.2.2 में सूचीबद्ध साइटोकिन्स युक्त परिपक्वता कॉकटेल जोड़ें।
    नोट: प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए नियंत्रण के रूप में गैर विद्युतीकृत डीसी (1 x 106) से एक नमूना तैयार 2 दिन के बाद विद्युत ीय ताक. इलेक्ट्रोपोरेटेड नमूनों के अनुरूप नियंत्रण कोशिकाओं का इलाज करें।
  6. दो दिन के बाद विद्युत चोरी, पुन: निलंबन और 15 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरण द्वारा फसल कोशिकाओं. पीबीएस के 1 एमएल के साथ कुओं कुल्ला और संबंधित ट्यूबों में निलंबन हस्तांतरण. निम्न चरणों में वर्णित के रूप में siRNA स्थिति प्रति 6 $106 डीसी विभाजित करें:
    1. 0.25 x 106 टीसी (इलेक्ट्रोपोरेटेड और गैर-इलेक्ट्रोपोरेटेड) का उपयोग करें ताकि चरण 2 में वर्णित परिपक्वता स्थिति और सेल व्यवहार्यता की जांच की जा सके। निम्नलिखित एंटीबॉडी का उपयोग करें: CD80-PE-Cy5, CD83-APC, CD86-PE, MHCII-APC-Cy7, और जीवन /
    2. KIF1B/2A-विशिष्ट नॉकडाउन दक्षता का आकलन करने के लिए पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए 0.75 x 106 कोशिकाओं का उपयोग करें। कोशिकाओं को 1.5 एमएल सेफलॉक ट्यूब में 3390 x g पर 1.5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा एकत्र करें। सेल lysates तैयार करें जैसा कि चरण 3-4 में वर्णित है और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण करें।
    3. शेष कोशिकाओं का उपयोग करें (5 x 106) प्रत्येक siRNA हालत से और एचएसवी -1 संक्रमण प्रयोगों प्रदर्शन. प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति के लिए, 2 एमएल ट्यूबों में 2.5 x 106 iDCs हस्तांतरण और या तो उन्हें 2 की एक MOI में एचएसवी-1 के साथ संक्रमित या एक नकली नियंत्रण के रूप में MNT बफर जोड़ें। चरण 3.3 में वर्णित के रूप में संक्रमण निष्पादित करें।
    4. 20 एच पोस्ट संक्रमण पर, resuspension द्वारा कोशिकाओं फसल और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए सेल lysates तैयार करने के लिए HSV-1 प्रेरित autophagic कारोबार के प्रेरण को सत्यापित करने के लिए, के रूप में चरण 3.4 में ऊपर वर्णित.

Representative Results

इस पांडुलिपि में, हम डेन्ड्रिटिक कोशिकाओं में एचएसवी-1-प्रेरित ऑटोफैगी के साथ हस्तक्षेप करने के तरीकों का वर्णन करते हैं। इसमें मानव मोनोसाइट व्युत्पन्न आईडीसी और एमडीसी की पीढ़ी शामिल है, जिनका प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा सामान्य रूप से विश्लेषण किया गया था (चित्र 1)। 4 दिन के बाद पालन, डीसी एक अपरिपक्व phenotype CD80, CCR7, और CD83 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उच्च CD11c और मध्यवर्ती MHCII अभिव्यक्ति की कमजोर अभिव्यक्ति की विशेषता दिखा. चूंकि CD3 और CD14 सिग्नल अनुपलब्ध हैं, इसलिए टी सेल और मोनोसाइट संदूषण को शामिल नहीं किया जा सकता है। दिन 6 पोस्ट पालन (यानी, दिन 2 परिपक्वता के बाद प्रेरण), डीसी एक परिपक्व phenotype CD80, CCR7, CD83, और MHC-II सतह अभिव्यक्ति में एक महत्वपूर्ण वृद्धि से परिलक्षित दिखा. एक eGFP-expressing HSV-1 तनाव के साथ संक्रमण (चित्र 2) या तो iDCs के लगभग पूर्ण संक्रमण में परिणाम (चित्र 2एक ऊपरी पैनल) या mDCs (चित्र 2एक कम पैनल, चित्र 2बी), पर आधारित मजबूत GFP संकेत ों ोकार माइक्रोस्कोपी के साथ ही प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया.

जैसा कि हमारी हाल की रिपोर्ट में दिखाया गया है, एचएसवी -1 आईडीसी और एमडीसी दोनों में ऑटोफैगता पैदा करता है, हालांकि, ऑटोफैगिक कारोबार केवल10आईडीसी में होता है। पहले दृष्टिकोण में, हमने iDCs और mDCs को स्पाउटिन-1 (चित्र 3A) के साथ व्यवहार किया - ऑटोफैगी दीक्षा को ब्लॉक करने के लिए - या bafilomycin-A1 (BA1; चित्र 3ख) - अंतिम स्व-आस्था-लाइसोम संलयन को बाधित करने के लिए। स्पाटिन-1 और बीए 1 की अनुपस्थिति में आईडीसी के एचएसवी-1 संक्रमण पर, ऑटोफैगिक फ्रलक्स क्रमशः p62 और LC3B अभिव्यक्ति की गिरावट से प्रतिबिंबित होता है। इसके विपरीत, spautin-1 के अभाव में एमसीडी के एचएसवी -1 संक्रमण p62 अभिव्यक्ति को प्रभावित नहीं करता है, जबकि spautin-1 और बीए 1 उपचार LC3B-II के एक संचय प्रेरित. यह ऑटोफैगी को शामिल करने को दर्शाता है, लेकिन एमडीसी में ऑटोफैगिक कारोबार की विफलता है। IDCs में, स्पायूटिन-1 पूर्व-उपचार दृढ़ता से एचएसवी-1 संक्रमण पर p62 की ऑटोफैगिक गिरावट को पुनर्स्थापित करता है, दीक्षा चरण के दौरान ऑटोफैगी के निषेध के कारण। बीए 1 के साथ पूर्व उपचार पर, नकली- और एचएसवी-1-संक्रमित आईडीसी LC3B-II प्रोटीन स्तर का एक मजबूत संचय दिखाते हैं, जो देर से ऑटोफागोसोम-लाइसोसोम संलयन को अवरुद्ध करके ऑटोफैगिक कारोबार के सफल निषेध का संकेत देता है। इस के अनुरूप, spautin-1 और BA1 पूर्व उपचार के साथ भी स्थिर p62 में परिणाम और वृद्धि हुई LC3B-II प्रोटीन का स्तर, क्रमशः.

autophagic फ्रलक्स ख़राब करने के लिए एक दूसरी विधि में, SIRNA इलेक्ट्रोपोरेशन लक्ष्य FIP200 एचएसवी-1 संक्रमित iDCs में autophagic प्रवाह को ब्लॉक करने की क्षमता के बारे में जांच की है. जैसा कि चित्र 4कमें दिखाया गया है, iDCs 48 h पोस्ट इलेक्ट्रोपोरेशन में iDCs 48 एच पोस्ट इलेक्ट्रोपोरेशन में दृढ़ता से कम FIP200 प्रोटीन का स्तर पाया गया, नियंत्रण siRNA की तुलना में. इस समय, आईडीसी कोशिका मृत्यु के कोई लक्षण नहीं दिखाते (चित्र 4ठ) तथा उनके अपरिपक्व फीनोटाइप (चित्र 4ब्) को बनाए रखते हैं । एचएसवी -1 के साथ एफआई200-साइलेंस्ड आईडीसी के संक्रमण से उनके नियंत्रण siRNA-उपचारित समकक्षों की तुलना में ऑटोफैगिक फ्रलक्स में एक मजबूत कमी का पता चलता है (चित्र 4डी)। यह LC3B के रूप में अच्छी तरह से p62 के प्रोटीन के स्तर में वृद्धि के साथ है जब FIP200 HSV-1 संक्रमित iDCs में मौन है.

एक रिवर्स प्रयास में, हम अध्ययन किया है कि क्या siRNA-मध्यस्थ KIF1B और KIF2A प्रोटीन अभिव्यक्ति के ablation सक्षम बनाता है autophagomal-lysomal कारोबार भी HSV-1 संक्रमित mDCs में. इस प्रकार, आईडीसी को विशिष्ट siRNAs का उपयोग करके विद्युतीकृत किया गया जो इन प्रोटीनों में से एक या दोनों को लक्षित करता है, और कोशिकाओं को बाद में परिपक्व किया गया(चित्र 5)। 2 दिन के बाद इलेक्ट्रोपोट्रेशन, mDCs KIF1B और/या KIF2A प्रोटीन अभिव्यक्ति में एक मजबूत कमी दिखाने के लिए, जब विशिष्ट siRNAs इस्तेमाल किया गया (चित्र 5ए). इस विधि से न तो कोशिका मृत्यु (चित्र 5ठ) की ओर ले जाया गया और न ही उनकी लक्षणाय परिपक्वता स्थिति में परिवर्तन हुआ (चित्र 5ब्) ऑटोफैगोसोमल-lysosomal गिरावट के दौरान KIF1B और KIF2A के महत्व का समर्थन, एचएसवी -1 संक्रमण से पहले उनकी कमी mDCs में एक वृद्धि हुई autophagic प्रवाह की सुविधा. यह संबंधित नियंत्रण स्थिति के विपरीत, कम अवशिष्ट च62 प्रोटीन स्तरों से परिलक्षित होता है (चित्र 5छ)।

Figure 1
चित्र 1: प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके मानव मोनोसाइट व्युत्पन्न आईडीसी और एमडीसी का फेनोटाइपिक लक्षणीकरण। डीसी उत्पन्न और विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ दाग उनकी शुद्धता की पुष्टि करने के लिए: ((A) CD3 टी सेल संदूषण को बाहर करने के लिए, (बी) CD14 monocytes के साथ संदूषण को बाहर करने के लिए, और (सी) CD11c डीसी के लिए एक मार्कर के रूप में. उनकी फीनोटाइपिक परिपक्वता स्थिति का आकलन करने के लिए निम्नलिखित एंटीबॉडी का उपयोग किया गया: (डी) सीडी80, (ई) सीसीआर 7, (एफ) सीडी83, और (जी) MHCII. इन अणुओं अत्यधिक mDCs पर व्यक्त कर रहे हैं और इस प्रकार अपरिपक्व और परिपक्व डीसी phenotype के बीच भेदभाव की अनुमति. एफसीएस एक्सप्रेस 5.0 का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण किया गया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: सूक्ष्म के साथ-साथ एचएसवी-1 संक्रमित आईडीसी और एमडीसी का प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण। आईडीसी और एमडीसी एक एचएसवी-1 तनाव से संक्रमित थे जो ईजीएफपी (एचएसवी-1 ईजीएफपी) को व्यक्त करते हैं, ताकि जीएफपी सिग्नल के आधार पर संक्रमण दर के परिमाणीकरण की अनुमति दी जा सके। (क)जीएफपी-सकारात्मक एचएसवी-1-संक्रमित आईडीसी और एमडीसी का सूक्ष्म विश्लेषण 2 के एमओआई में संक्रमित, उनके संक्रमित समकक्षों की तुलना में 24 एचपीआई पर। संक्रमित कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए, GFP फ्लोरोसेंट की निगरानी की गई थी। स्केल बार संक्रमण गतिकी केदौरान नकली- या एचएसवी-1 संक्रमित एमडीसी के प्रवाह साइटोमेट्रिक माप का प्रतिनिधित्व करता है। ऊपरी पैनलों (काले लाइन में खड़ा हिस्टोग्राम) नकली हालत दिखाने के लिए, कम पैनलों (काले भरे हिस्टोग्राम) संकेत समय अंक पोस्ट संक्रमण के बाद एचएसवी -1 संक्रमित कोशिकाओं को दिखाने के। एफसीएस एक्सप्रेस 5.0 का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण किया गया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: Spautin-1 और बी afilomycin-A1 एचएसवी-1 संक्रमित iDCs में autophagic प्रवाह modulate. आईडीसी और एमडीसी के साथ इलाज किया गया (ए) स्पाउटिन-1 या (बी) बैफिलोमाइसिन-ए1 (बीए 1) संक्रमण से पहले 1 एच के लिए। कोशिकाओं को बाद में नकली थे- या एचएसवी -1 संक्रमित (HSV1-RFPVP26) 2 के एक MOI का उपयोग कर. 16-18 एच के बाद, डीसी काटा गया और प्रोटीन lysates p62 या LC3B-I/II autophagic मार्करों के रूप में की अभिव्यक्ति का निर्धारण करने के लिए पश्चिमी blotting के अधीन थे, संक्रमण नियंत्रण के रूप में ICP0, और लोडिंग नियंत्रण के रूप में GAPDH. LC3B-I और LC3B-II प्रोटीन का स्तर मात्रा निर्धारित और संदर्भ प्रोटीन GAPDH Bio1D (ऑप्टिकल घनत्व) का उपयोग करने के लिए सामान्यीकृत किया गया. सामान्यीकृत LC3B-II का अनुपात सामान्यीकृत LC3B-I संकेतों के लिए दिखाया गया है. यह आंकड़ा संशोधित किया गया है और ©2019 Turan एट अल मूल रूप से जेसीबी में प्रकाशित से अनुकूलित. https://doi.org/10.1083/jcb.20180115110| कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र ााा्वः एच एस वी-१-संक्रमित आईडीसी में एफआईपी२००-सिराना इलेक्ट्रोपोरेशन पर स्वाक्षाभीय फ्रलक्स का विश्लेषण। आईडीसी को इलेक्ट्रोपोट्रेशन उपकरण I . (ए) डीसी का उपयोग करके नियंत्रण siRNA या FIP200-विशिष्ट siRNA के साथ इलेक्ट्रोपोरेट किया गया था, पश्चिमी धब्बा विश्लेषण करके FIP200 knockdown 48 h पोस्ट इलेक्ट्रोपोरेशन की दक्षता के बारे में विश्लेषण किया गया। (बी) सेल व्यवहार्यता के साथ-साथ (ब्) परिपक्वता स्थिति का विश्लेषण इलेक्ट्रोपोरेशन (हल्के नीले हिस्टोग्राम) और 48 एच पोस्ट (गहरे नीले और भूरे रंग के हिस्टोग्राम) विद्युत-तापमिति द्वारा किया गया था। तीन अलग-अलग दाताओं के लिए माध्य मान दिखाए गए हैं। FIP200 और अपरिपक्व phenotype के कुशल knockdown की पुष्टि के बाद, कोशिकाओं HSV-1 संक्रमित थे (HSV-1 EGFP) 2 के एक MOI का उपयोग कर. एफसीएस एक्सप्रेस 5.0 का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण किया गया। (घ)20 एच पोस्ट संक्रमण पर, कोशिकाओं को एलसी3बी-I/II और p62 को ऑटोफैगिक मार्कर के रूप में अभिव्यक्ति निर्धारित करने के लिए पश्चिमी दाग विश्लेषण के अधीन किया गया था। ICP5 संक्रमण नियंत्रण के रूप में पाया गया था, और GAPDH लोड हो रहा है नियंत्रण के रूप में. पैनलों ए और डी संशोधित किया गया है और ©2019 Turan एट अल मूल रूप से जेसीबी में प्रकाशित से अनुकूलित. https://doi.org/10.1083/jcb.20180115110| कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: SiRNA-मध्य KIF1B और/या KIF2A के ablation HSV-1 संक्रमित mDCs में autophagic कारोबार modulates. iDCs KIF1B-विशिष्ट और/या KIF2A-विशिष्ट siRNA के साथ विद्युतीकृत किया गया था, साथ ही नियंत्रण siRNA, विद्युत उपकरण द्वितीय का उपयोग कर. 4 एच पोस्ट इलेक्ट्रोपोट्रेशन में, परिपक्वता एक परिपक्वता कॉकटेल के अलावा के माध्यम से प्रेरित किया गया था। 48 एच पोस्ट इलेक्ट्रोपोरेशन पर, डीसी के बारे में विश्लेषण किया गया (ए) पश्चिमी ब्लॉटिंग के माध्यम से KIF दस्तक की दक्षता, (बी) सेल व्यवहार्यता के साथ ही उनके (सी) phenotypic परिपक्वता स्थिति प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण का उपयोग कर (दो अलग दाताओं दिखाया जाता है). "w/o EP" का अर्थ इलेक्ट्रोपोक्शन के बिना है, लेकिन परिपक्वता के बाद प्रेरण; "पोस्ट नियंत्रण ईपी" का अर्थ है नियंत्रण siRNA का उपयोग करके विद्युत पोस्ट; "पोस्ट KIF1B, KIF2A, KIF1B/2A EP" का अर्थ है KIF1B- और/या KIF2A-विशिष्ट siRNA का उपयोग करके विद्युत पोर्शन। KIF1B और /या KIF2A और परिपक्व phenotype के कुशल knockdown की पुष्टि के बाद, कोशिकाओं HSV-1 संक्रमित थे (HSV-1 EGFP) 2 के एक MOI का उपयोग कर. एफसीएस एक्सप्रेस 5.0 का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण किया गया। (घ)कोशिकाओं को पश्चिमी दाग विश्लेषण के अधीन किया गया 20 एच पोस्ट संक्रमण, एक autophagic मार्कर के रूप में p62 की अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए. ICP5 एक संक्रमण नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था, और GAPDH लोड हो रहा है नियंत्रण के रूप में. आंकड़े ए और डी संशोधित किया गया है और ©2019 Turan एट अल से अनुकूलित मूल रूप से जेसीबी में प्रकाशित. https://doi.org/10.1083/jcb.20180115110| कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

वर्तमान प्रोटोकॉल के दायरे में (i) मानव मोनोसाइट व्युत्पन्न आईडीसी के साथ-साथ एमडीसी की हैंडलिंग, (ii) एचएसवी-1 के साथ उनका संक्रमण, (iii) ऑटोफैगी को बाधित करने के लिए ज्ञात यौगिकों के साथ उनका उपचार, और (iv) दो का उपयोग करके सरना के साथ उनके इलेक्ट्रोपोट्रेशन विभिन्न तकनीकी setups. वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग करना, autophagic प्रवाह या तो HSV-1 संक्रमित iDCs में अवरुद्ध किया जा सकता है या एचएसवी -1 संक्रमित एमडीसी में प्रेरित.

चूंकि डीसी, और विशेष रूप से iDCs, बहुत कमजोर कोशिकाओं रहे हैं, इन कोशिकाओं के साथ काम करने के बजाय नाजुक कदम शामिल है. डीसी पीढ़ी के लिए, हम ताजा अलग PBMCs का उपयोग करने के लिए अनुशंसा करते हैं, और उनके cryopservation से बचने के लिए, उच्च सेल पैदावार प्राप्त करने के लिए. इसके अलावा, जब उनके बाद की खेती सहित प्रयोगों के दौरान iDCs हैंडलिंग, कठोर या लंबे समय तक तापमान परिवर्तन को रोकने के. अन्यथा, iDCs phenotypic परिवर्तन से गुजरना हो सकता है और इस प्रकार यह प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा उनके अपरिपक्व phenotype सत्यापित करने के लिए आवश्यक है. नोट करें, अपने परिपक्व समकक्षों के विपरीत, iDCs में अलग-अलग मार्कर की कमी होती है, जैसे CD80, CD83 और CD8628,29. एचएसवी -1 के साथ आईडीसी और एमडीसी का संक्रमण एक सुस्थापित विधि2,3,4,5,6,10है . हम और दूसरों से पता चला है कि डीसी एचएसवी -1 संक्रमण के लिए अत्यधिक संवेदनशील हैं, जब 1 या 2 के एक MOI इस्तेमाल किया गया है (चित्र 2) . हमारे हाथों में, कम स्तर पर संक्रमण माध्यम की मात्रा रखने (1-3 x 106 कोशिकाओं में 250-350 $L) बेहतर संक्रमण क्षमता के लिए नेतृत्व करेंगे.

एक दिया अलग सेलुलर मार्ग के साथ हस्तक्षेप करने के लिए एक शास्त्रीय दृष्टिकोण विशिष्ट यौगिकों का उपयोग है. ऑटोफैगी के विभिन्न न्यूनाधिक की एक किस्म, यानी उत्प्रेरक के रूप में के रूप में अच्छी तरह से inhibitors, वर्तमान में उपलब्ध हैं30. के बारे में एचएसवी-1 प्रेरित autophagy में डीसी, Turan एट अल., (2019) हाल ही में iDCs10में autophagic कारोबार पर spautin-1 और bafilomycin-A1 (BA1) के निरोधात्मक प्रभाव से पता चला. autophagy निषेध के लिए इस तकनीक के बाद एचएसवी -1 संक्रमण के साथ संयोजन के लिए उपयुक्त है, के बाद से न तो संक्रमण की दर और न ही डीसी (विशेष रूप से iDCs) की परिपक्वता स्थिति बिगड़ा है. भविष्य के अनुप्रयोगों में, इस अवरोधक आधारित दृष्टिकोण भी अन्य संक्रामक एजेंटों के साथ संयोजन में लागू किया जा सकता है, तनाव की स्थिति, जैसे भुखमरी के रूप में, साथ ही विभिन्न सेल प्रकार के लिए. हालांकि, inhibitors का उपयोग करते समय, सीमाओं सेल व्यवहार्यता को गंभीर रूप से प्रभावित किए बिना, कुशल autophagy अवरोध के लिए उपयुक्त एकाग्रता का निर्धारण करने में उत्पन्न होते हैं। तथापि, अवरोधकों का उपयोग करते समय प्रमुख सीमा संभावित ऑफ-लक्ष्य या प्रतिकूल प्रभावों की घटना है, जिसके परिणामस्वरूप भ्रामक परिणाम31,32हो सकते हैं.

वर्तमान प्रोटोकॉल में शामिल ऑटोफैगी में हस्तक्षेप करने का दूसरा दृष्टिकोण, सिराना33,34,35का उपयोग करते हुए विशिष्ट नॉकडाउन है . एक तरफ, हम इलेक्ट्रोपोरेशन उपकरण मैं विशेष रूप से FIP200 की अभिव्यक्ति ablate करने के लिए इस्तेमाल किया, जिससे iDCs में एचएसवी-1 प्रेरित autophagic कारोबार को बाधित. दूसरी ओर, हम दो अलग KIF प्रोटीन मौन (यानी, KIF1B और KIF2A), विद्युत उपकरण द्वितीय का उपयोग कर, एचएसवी-1 संक्रमित mDCs में autophagic प्रवाह की सुविधा के लिए. दोनों इलेक्ट्रोपोट्रेशन प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप आईडीसी में FIP200 का लगभग पूर्ण अपाहिज हो गया, और एमडीसी में KIF1B/KIF2A, जिसे पश्चिमी धब्बा विश्लेषण ों के माध्यम से सत्यापित किया गया था (चित्र 4ए, चित्र 5ए)। इलेक्ट्रोपोट्रेशन उपकरण I के विपरीत, जो डीसी की व्यवहार्यता को प्रभावित नहीं करता है, विद्युत उपकरण II का उपयोग करके एमडीसी के इलेक्ट्रोपोट्रेशन का परिणाम मृत कोशिकाओं की थोड़ी अधिक दरों में होता है(चित्र 4ठ, चित्र 5ठ ). इसलिए, भविष्य के अनुप्रयोगों में, इलेक्ट्रोपोर्शन उपकरण मैं वरीयता दोनों के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए, iDCs और mDCs. उल्लेखनीय है, दोनों siRNA आधारित तकनीक, autophagic प्रवाह को मॉड्युलेट करने के लिए, या तो आईडीसी या mDCs के बाद एचएसवी -1 संक्रमण के साथ संगत कर रहे हैं. इसके अलावा, न तो आईडीसी के अपरिपक्व phenotype और न ही एमडीसी के परिपक्व phenotype पोस्ट इलेक्ट्रोपोट्रेशन बदल दिया है.

FIP200-विशिष्ट siRNA का उपयोग कर iDCs के विद्युतीकरण जीन knockdown के लिए एक कुशल और अत्यधिक विशिष्ट विधि के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एचएसवी-1 संक्रमण पर autophagic प्रवाह के निषेध है. FIP200 के विशिष्ट silencing के अलावा, इस प्रोटोकॉल autophagic झरना के दौरान विभिन्न चरणों में भाग लेने, अन्य autophagic घटकों मौन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. तथापि, ऑटोफैगी के कुशल siRNA-मध्यस्थ निषेध के लिए उपयुक्त लक्ष्य की पहचान करने में चिंता के कई पहलू शामिल हैं। सबसे पहले, autophagy से संबंधित जीन (ATG) की दस्तक दक्षता जरूरी autophagy के कुशल निषेध के साथ सकारात्मक सहसंबंधित नहीं है और विशिष्ट ATG प्रोटीन है कि मौन36है पर अत्यधिक निर्भर है. दूसरे , अलग ATG प्रोटीन अतिरिक्त autophagy से अलग रास्ते में शामिल कर रहे हैं, इस प्रकार उनके ablation भी प्रतिकूल दुष्प्रभाव हो सकता है37,38,39. तीसरे, विभिन्न ATGs अनावश्यक कार्य हो सकता है, इस प्रकार एक घटक की दस्तक autophagy को बाधित करने के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता है(उदा., beclin-1 और beclin-2)40.

इसके अलावा, इलेक्ट्रोपोरिओशन तंत्र मैं आधारित इलेक्ट्रोपोरेशन प्रोटोकॉल डीसी के mRNAs के लिए भी उपयुक्त है, और अतिरिक्त प्राथमिक सेल प्रकार की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जैसे PBMCs25. इस प्रकार यह प्रणाली अलग-अलग प्राथमिक कोशिकाओं में भिन्न आरएनए प्रजातियों को वितरित करने के लिए एक सामान्य कार्यनीति प्रदान करती है। अंत में, हम autophagic प्रवाह को बाधित करने के लिए दो प्रोटोकॉल मौजूद, या तो एक अवरोध करनेवाला का उपयोग करके- या iRNA आधारित iDCs के बाद एचएसवी -1 संक्रमण के साथ संयुक्त दृष्टिकोण. इसके अलावा, हम एचएसवी-1 संक्रमण पर एमडीसी में ऑटोफैगिक फ्रलक्स पैदा करने के लिए एक siRNA इलेक्ट्रोपोट्रेशन दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं।

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस काम को जर्मन अनुसंधान परिषद (DFG) द्वारा परियोजना STE 432/11-1 के माध्यम से सहायता प्रदान की गई थी एएस को और चिकित्सा संकाय से ELAN कार्यक्रम द्वारा प्रदान किया गया (Friedich-Alexander-Universit-t Erlangen-Nrnberg) परियोजना के माध्यम से 18-12-21-1, एलजी को दी.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4D-Nucleofector Core Unit (electroporation apparatus II) Lonza (Basel, Switzerland) AAF-1002B
AB-Serum Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) H4522 Dendritic cell cultivation
ACD-A Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) 9007281
Amaxa P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (electroporation kit apparatus II) Lonza (Basel, Switzerland) V4XP-3024
Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent GE Healthcare (Solingen, Germany) RPN2232 Western Blot Detection
Ammonium persulfate (APS) Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) A3678
anti-mouse-IgG (mouse, polyclonal, HRP) Cell Signaling (Leiden, Netherlands) 7076 Western Blot detection
anti-rabbit-IgG (goat, polyclonal, HRP) Cell Signaling (Leiden, Netherlands) 7074 Western Blot detection
Bafilomycin A1 Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) tlrl-baf1 inhibition of autophagy and lysosomal degradation
BD FACS Canto II Flow Cytometer BD Biosciences (Heidelberg, Germany) 338962
Benzonase Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) E1014
Blotting Chamber Fastblot B44 Biometra (Göttingen, Germany) 846-015-100
CCR7 (mouse, Pe-Cy7) BioLegend (Fell, Germany) 557648 Flow cytometry
Dilution: 1:100
Clone: G043H7
CD11c (mouse, Pe-Cy5) BD Biosciences (Heidelberg, Germany) 561692 Flow cytometry
Dilution: 1:100
Clone: B-ly6
CD14 (mouse, PE) BD Biosciences (Heidelberg, Germany) 555398 Flow cytometry
Dilution: 1:100
Clone: M5E2
CD3 (mouse, FITC) BD Biosciences (Heidelberg, Germany) 555332 Flow cytometry
Dilution: 1:100
Clone: UCHT1
CD80 (mouse, V450) BD Biosciences (Heidelberg, Germany) 560442 Flow cytometry
Dilution: 1:100
Clone: L307.4
CD83 (mouse, APC) eBioscience Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Germany) 17-0839-41 Flow cytometry
Dilution: 1:200
Clone: HB15e
CD86 (mouse, PE) BD Biosciences (Heidelberg, Germany) 553692 Flow cytometry
Dilution: 1:100
EVOS FL Cell Imaging System AMG/Life Technologies (Carlsbad, USA) AMF4300
FIP200 (rabbit) Cell Signaling (Leiden, Netherlands) 12436 Western Blot detection
Dilution: 1:1000
Clone: D10D11
GAPDH (mouse) Merck Millipore (Massachusetts, USA) AB2302 Western Blot detection
Dilution: 1:5000
Clone: MAB374
Gene Pulser II apparatus (electroporation apparatus I) BioRad Laboratories GmbH (München, Germany) 165-2112
GM-CSF (4x104 U/mL) Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany) 130-093-868
HLA?DR (mouse, APC-Cy7) BioLegend (Fell, Germany) 307618 Flow cytometry
Dilution: 1:200
Clone: L243
HSV-1/17+/CMV-EGFP/UL43 BioVex DC infection
 
ICP0 (mouse) Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) sc-53070 Western Blot detection
Dilution: 1:1000
Clone: 11060
ICP5 (mouse) Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) sc-56989 Western Blot detection
Dilution: 1:1000
Clone: 3B6
IL-1β (0.1x106 U/mL) Cell Genix GmbH (Freiburg, Germany) 1411-050
IL-4 (1x106 U/mL) Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany) 130-093-924
IL-6 (1x106 U/mL) Cell Genix GmbH (Freiburg, Germany) 1404-050
ImageQuant LAS 4000 GE Healthcare (Solingen, Germany) 28955810
KIF1B (mouse) Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) sc-376246 Western Blot detection
Dilution: 1:1000
Clone: E-12
KIF2A (mouse) Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) sc-271471 Western Blot detection
Dilution: 1:1000
Clone: D-7
LC3B (rabbit) Cell Signaling (Leiden, Netherlands) 3868 Western Blot detection
Dilution: 1:1000
Clone: D11
L-glutamine Lonza (Basel, Switzerland) 17-605E
LIVE/DEAD Fixable Violet dead cell stain kit Life Technologies (Carlsbad, CA, USA) L34964 L/D staining in Flow cytometry
Lymphoprep Alere Technologies AS (Oslo, Norway) 04-03-9391/01
Magnesiumchloride Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) A537.1
Megafuge 2.0 RS Heraeus (Hanau, Germany) 75015505
N, N, N', N'-Tetramethylethylendiamine (TEMED) Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) T9281
Neubauer counting chamber Brand (Wertheim, Germany) 717805
Nunc Cell culture flasks (175.0 cm2) Thermo Scientific (Rockford, USA) 159910
p62 (rabbit) Cell Signaling (Leiden, Netherlands) 88588 Western Blot detection
Dilution: 1:1000
Clone: D5L7G
PageRuler prestained protein ladder Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Germany) 26616
Paraformaldehyde, 16 % Alfa Aesar, Haverhill, USA 43368.9M
PerfectSpin 24 Plus Peqlab (Erlangen, Germany) C2500-R-PL
PGE2 (1 mg/mL) Pfizer (Berlin, Germany) BE130681
Phosphate buffered saline (PBS) Lonza (Basel, Switzerland) 17-512F
Protein gel system MiniProtean II Bio-Rad Laboratories GmbH (München, Germany) 1652960
RestoreTM Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientific, Rockford, USA 21059
Rocking Platform wt 15 Biometra (Göttingen, Germany) 042-590
RotiBlock Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) A151.4
Roti-Load 1 (4x) Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) K929.3
Rotiphorese Gel 30 (37.5:1) Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) 3029.1
RPMI 1640 Lonza (Basel, Switzerland) 12-167F
Sodium dodecyl Sulfate (SDS) Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) 2326.2
Thermomixer comfort Eppendorf (Hamburg, Germany) 5355 000.011
TNF-α (10 μg/mL) Peprotech (Hamburg, Germany) 300-01A
Tris Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) 4855.3
Trypan blue solution (0.4 %) Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) T8154
Tween 20 Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) 9127.1
Whatman 0.2 μm nitrocellulose membrane GE Healthcare (Solingen, Germany) 10600001
WhatmanTM Chromatography Paper 3 mm Chr Fisher Scientific GmbH (Schwerte, Germany) 3030917

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chapuis, F., Rosenzwajg, M., Yagello, M., Ekman, M., Biberfeld, P., Gluckman, J. C. Differentiation of human dendritic cells from monocytes in vitro. European Journal of Immunology. 27 (2), 431-441 (1997).
  2. Kummer, M., et al. Herpes simplex virus type 1 induces CD83 degradation in mature dendritic cells with immediate-early kinetics via the cellular proteasome. Journal of Virology. 81 (12), 6326-6338 (2007).
  3. Kruse, M., et al. Mature dendritic cells infected with herpes simplex virus type 1 exhibit inhibited T-cell stimulatory capacity. Journal of Virology. 74 (15), 7127-7136 (2000).
  4. Salio, M., Cella, M., Suter, M., Lanzavecchia, A. Inhibition of dendritic cell maturation by herpes simplex virus. European Journal of Immunology. 29 (10), 3245-3253 (1999).
  5. Prechtel, A. T., et al. Infection of mature dendritic cells with herpes simplex virus type 1 dramatically reduces lymphoid chemokine-mediated migration. Journal of General Virology. 86, Pt 6 1645-1657 (2005).
  6. Theodoridis, A. A., Eich, C., Figdor, C. G., Steinkasserer, A. Infection of dendritic cells with herpes simplex virus type 1 induces rapid degradation of CYTIP, thereby modulating adhesion and migration. Blood. 118 (1), 107-115 (2011).
  7. Cohrs, R. J., Gilden, D. H. Human herpesvirus latency. Brain Pathology. 11 (4), 465-474 (2001).
  8. Grinde, B. Herpesviruses: latency and reactivation - viral strategies and host response. Journal of Oral Microbiology. 5, (2013).
  9. Whitley, R. J., Roizman, B. Herpes simplex virus infections. The Lancet. 357 (9267), 1513-1518 (2001).
  10. Turan, A., et al. Autophagic degradation of lamins facilitates the nuclear egress of herpes simplex virus type 1. The Journal of Cell Biology. 218 (2), 508-523 (2019).
  11. Takeshige, K., Baba, M., Tsuboi, S., Noda, T., Ohsumi, Y. Autophagy in yeast demonstrated with proteinase-deficient mutants and conditions for its induction. The Journal of Cell Biology. 119 (2), 301-311 (1992).
  12. Yin, Z., Pascual, C., Klionsky, D. J. Autophagy: machinery and regulation. Microbial Cell. 3 (12), 588-596 (2016).
  13. Bodemann, B. O., et al. RalB and the exocyst mediate the cellular starvation response by direct activation of autophagosome assembly. Cell. 144 (2), 253-267 (2011).
  14. Bjorkoy, G., et al. p62/SQSTM1 forms protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect on huntingtin-induced cell death. The Journal of Cell Biology. 171 (4), 603-614 (2005).
  15. Kabeya, Y., et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. The EMBO Journal. 19 (21), 5720-5728 (2000).
  16. Kabeya, Y., Mizushima, N., Yamamoto, A., Oshitani-Okamoto, S., Ohsumi, Y., Yoshimori, T. LC3, GABARAP and GATE16 localize to autophagosomal membrane depending on form-II formation. Journal of Cell Science. 117, Pt 13 2805-2812 (2004).
  17. Pankiv, S., et al. p62/SQSTM1 binds directly to Atg8/LC3 to facilitate degradation of ubiquitinated protein aggregates by autophagy. The Journal of Biological Chemistry. 282 (33), 24131-24145 (2007).
  18. Korolchuk, V. I., Rubinsztein, D. C. Regulation of autophagy by lysosomal positioning. Autophagy. 7 (8), 927-928 (2011).
  19. Li, Y., et al. A cell-based quantitative high-throughput image screening identified novel autophagy modulators. Pharmacological Research. 110, 35-49 (2016).
  20. Pampaloni, F., et al. A Novel Cellular Spheroid-Based Autophagy Screen Applying Live Fluorescence Microscopy Identifies Nonactin as a Strong Inducer of Autophagosomal Turnover. SLAS Discovery. 22 (5), 558-570 (2017).
  21. Deng, Y., Zhu, L., Cai, H., Wang, G., Liu, B. Autophagic compound database: A resource connecting autophagy-modulating compounds, their potential targets and relevant diseases. Cell Proliferation. 51 (3), 12403 (2018).
  22. Liu, J., et al. Beclin1 controls the levels of p53 by regulating the deubiquitination activity of USP10 and USP13. Cell. 147 (1), 223-234 (2011).
  23. Mauvezin, C., Neufeld, T. P. Bafilomycin A1 disrupts autophagic flux by inhibiting both V-ATPase-dependent acidification and Ca-P60A/SERCA-dependent autophagosome-lysosome fusion. Autophagy. 11 (8), 1437-1438 (2015).
  24. Yoshimori, T., Yamamoto, A., Moriyama, Y., Futai, M., Tashiro, Y. Bafilomycin A1, a specific inhibitor of vacuolar-type H(+)-ATPase, inhibits acidification and protein degradation in lysosomes of cultured cells. Journal of Biological Chemistry. 266 (26), 17707-17712 (1991).
  25. Gerer, K. F., Hoyer, S., Dorrie, J., Schaft, N. Electroporation of mRNA as Universal Technology Platform to Transfect a Variety of Primary Cells with Antigens and Functional Proteins. Methods in Molecular Biology. 1499, 165-178 (2017).
  26. Prechtel, A. T., Turza, N. M., Theodoridis, A. A., Steinkasserer, A. CD83 knockdown in monocyte-derived dendritic cells by small interfering RNA leads to a diminished T cell stimulation. The Journal of Immunology. 178 (9), 5454-5464 (2007).
  27. Pfeiffer, I. A., et al. Leukoreduction system chambers are an efficient, valid, and economic source of functional monocyte-derived dendritic cells and lymphocytes. Immunobiology. 218 (11), 1392-1401 (2013).
  28. Villadangos, J. A., Heath, W. R. Life cycle, migration and antigen presenting functions of spleen and lymph node dendritic cells: limitations of the Langerhans cells paradigm. Seminars in Immunology. 17 (4), 262-272 (2005).
  29. Lechmann, M., Berchtold, S., Hauber, J., Steinkasserer, A. CD83 on dendritic cells: more than just a marker for maturation. Trends in Immunology. 23 (6), 273-275 (2002).
  30. Yang, Y. P., et al. Application and interpretation of current autophagy inhibitors and activators. Acta Pharmacologica Sinica. 34 (5), 625-635 (2013).
  31. Redmann, M., et al. Inhibition of autophagy with bafilomycin and chloroquine decreases mitochondrial quality and bioenergetic function in primary neurons. Redox Biology. 11, 73-81 (2017).
  32. Yan, Y., et al. Bafilomycin A1 induces caspase-independent cell death in hepatocellular carcinoma cells via targeting of autophagy and MAPK pathways. Scientific Reports. 6, 37052 (2016).
  33. Hale, C. M., et al. Identification of modulators of autophagic flux in an image-based high content siRNA screen. Autophagy. 12 (4), 713-726 (2016).
  34. Lipinski, M. M., et al. A genome-wide siRNA screen reveals multiple mTORC1 independent signaling pathways regulating autophagy under normal nutritional conditions. Developmental Cell. 18 (6), 1041-1052 (2010).
  35. Orvedahl, A., et al. Image-based genome-wide siRNA screen identifies selective autophagy factors. Nature. 480 (7375), 113-117 (2011).
  36. Staskiewicz, L., Thorburn, J., Morgan, M. J., Thorburn, A. Inhibiting autophagy by shRNA knockdown: cautions and recommendations. Autophagy. 9 (10), 1449-1450 (2013).
  37. Lee, I. H., et al. Atg7 modulates p53 activity to regulate cell cycle and survival during metabolic stress. Science. 336 (6078), 225-228 (2012).
  38. Fremont, S., Gerard, A., Galloux, M., Janvier, K., Karess, R. E., Berlioz-Torrent, C. Beclin-1 is required for chromosome congression and proper outer kinetochore assembly. EMBO Reports. 14 (4), 364-372 (2013).
  39. Bestebroer, J., V'kovski, P., Mauthe, M., Reggiori, F. Hidden behind autophagy: the unconventional roles of ATG proteins. Traffic. 14 (10), 1029-1041 (2013).
  40. Galluzzi, L., Kroemer, G. Common and divergent functions of Beclin 1 and Beclin 2. Cell Research. 23 (12), 1341-1342 (2013).

Tags

इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 152 इलेक्ट्रोपोर्शन siRNA डेन्ड्रिटिक कोशिकाओं दस्तक autophagy हरपीज सिंप्लेक्स वायरस प्रकार-1
सिरियाना इलेक्ट्रोपोरिओशन हरपीज सिंप्लेक्स वायरस प्रकार 1-संक्रमित मोनोसाइट-रिडेरिड डेन्ड्रिटिक सेल में ऑटोफैगी को मॉडूलेट करने के लिए
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Düthorn, A., Turan, A.,… More

Düthorn, A., Turan, A., Draßner, C., Mühl-Zürbes, P., Heilingloh, C. S., Steinkasserer, A., Grosche, L. siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (152), e60190, doi:10.3791/60190 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter