Summary
في هذه الدراسة ، ونحن نقدم المثبط-والاستراتيجيات القائمة علي siRNA للتدخل في تدفق التلقائية في فيروس الهربس البسيط نوع-1 (HSV-1)-الخلايا الجذعية المصابة بالبويضات المشتقة.
Abstract
فيروس الهربس البسيط نوع-1 (HSV-1) يدفع اوتوهاغي في كل من الخلايا الجذعية غير الناضجة (البلدان الجزريه المتوسطة) وكذلك الخلايا الجذعية الناضجة (mDCs) ، في حين ان التدفق الذاتي لا يلاحظ الا في البلدان الجزريه المتوسطة. للحصول علي رؤى ميكانيكيه ، قمنا بتطوير استراتيجيات فعاله للتدخل في دوران التلقائية المستحثة من HSV-1. وتشكل الاستراتيجية القائمة علي المثبطات ، لتعديل HSV-1-التي يسببها اوتوهاغي ، الخيار الأول ، لأنها طريقه سهله وسريعة. للالتفاف علي الآثار المحتملة غير محدده خارج الهدف من هذه المركبات, وضعنا استراتيجية القائمة علي siRNA البديلة, لتعديل دوران اوتوهاغيك في البلدان الجزريه النامية علي عدوي HSV-1. وفي الواقع ، فان الكهرباء من البلدان الجزريه الFIP200ه مع sirna الخاصة قبل العدوى hsv-1 هو طريقه محدده جدا وناجحه لاستئصال FIP200 التعبير البروتين التالي لمنع تدفق التلقائية. وتؤدي كلتا الطريقتين المعروضتين إلى تثبيط فعال للدوران الذاتي المستحث HSV-1 في البلدان الجزريه الأخرى ، حيث تكون التقنية القائمة علي siRNA أكثر تحديدا للهدف. وقد وضع نهج إضافي قائم علي siRNA لإسكات التعبير عن البروتين بشكل انتقائي من KIF1B و KIF2A ، مما يسهل دوران التلقائية علي عدوي HSV-1 في mDCs. وفي الختام ، فان تقنيه siRNA الكهربية تمثل استراتيجية واعده ، لأزاله التعبير عن البروتينات المميزة بشكل انتقائي وتحليل تاثيرها علي عدوي HSV-1.
Introduction
يشكل جيل الخلايا الجذعية المشتقة من البويضات البشرية (DCs) نموذجا مناسبا في المختبر لدراسة وظائف وبيولوجيا هذا النوع من الخلايا المناعية الهامه. العزلة وكذلك التفريق بين الخلايا الاحاديه في النامية وقد ثبت جيدا في السنوات الاخيره1,2. العدوى من DCs مع α-herpesvirus فيروس الهربس البسيط نوع-1 (hsv-1) بمثابه نظام نموذجي لدراسة hsv-1-التحويرات بوساطة DC البيولوجيا2,3,4,5,6 . وهذا مهم بشكل خاص لتوضيح كيف الفيروسات المتعرجة تثبيط أو تمنع الاستجابات المناعية المضادة للفيروسات قويه ، لإنشاء الكمون في المنافذ المحصنة المتميزة داخل المضيف7،8. في هذا الصدد ، فيروسات الهربس هي مسببات الامراض الناجحة جدا التي تنتشر علي نطاق واسع في جميع انحاء السكان الوصول إلى انتشار مصلي يصل إلى 90 ٪ وفقا للمنطقة الجغرافية9. لفهم وربما منع هذا ، وهناك حاجه إلى مزيد من الرؤى في التحويرات بوساطة HSV-1 من الجهاز المناعي للمضيف ، وخاصه من الخلايا المناعية مثل DCs ، مطلوبه.
ونشرت مؤخرا شركه توران وآخرون10ملاحظه جديده تماما فيما يتعلق بالتفاعل بين المجالات النامية والتي هي من طراز hsv-1. واثبت المؤلفون ان إنجاز النسخ المتماثل HSV-1 يعتمد بشكل صارم علي حاله نضوج الأقاليم النامية. وفي البلدان الجزريه المستقلة ، يتم تيسير النسخ المتماثل الكامل ل HSV-1 بواسطة أليات تعتمد علي الانتقاء الذاتي. وفي حين ان HSV1 يدفع إلى الداخل في كل من البلدان الجزريه القليلة المانحة والصناديق الاستئمانية المستقرة ، يلاحظ التدفق الألى في البلدان الجزريه الوحيدة. وهذا بدوره يسهل الخروج النووي من الفيروسات الفيروسية عن طريق التحلل الألى للأمينات النووية في البلدان الجزريه النامية. للحصول علي رؤى ميكانيكيه في هذا المسار تدهور المستحثة HSV-1 في البلدان الجزريه المتوسطة مقابل mDCs ، استراتيجيات جديده وفعاله هي حاسمه للتحقيق في تدفق التلقائية.
ماكرواوتوهاغي (اوتوهاغي) هي عمليه متعددة الخطوات المحفوظة جيدا تستهدف البروتينات داخل الخلايا أو العضيات كامله لهضم الليسومال11. ببساطه ، يمكن تقسيم اوتوهاغي إلى ' 1 ' البدء ، ' 2 ' النواة الغشائية ، ' 3 ' توسيع الحويصلة ، و ' 4 ' اوتوسوسوم-lysosome الانصهار المرحلة12. اثناء البدء (i) ، فان مكونات مثل مجمع كيناز ULK1/2 المنشط ، والتي تحتوي علي بروتين التفاعل البؤري المتفاعل مع عائله كيناز من 200 دينار كويتي (FIP200) ، هي عناصر حاسمه لتنشيط مجمع beclin-1-Vps34-AMBRA1. في وقت لاحق ، والنواة غشاء (2) يبدا phagophore تشكيل13، والتي يجتاح الشحنات الخلوية التي تتميز جزيئات مثل p6214. خلال التوسع الحويصلة والتلقائية النضج (iii) ميكروتوبولي-المرتبطة سلسله ضوء البروتين 3 (LC3)-I يتم تحويلها إلى شكلها الليبيداتيد LC3 التي يتم ادراجها في الغشاء التلقائي. التالي ، فان معدلات التحويل LC3 إلى II هي مؤشر لاستقراء الانتقاء الذاتي عن طريق عكس تشكيل النضج الذاتي الناضج15،16. علي اوتوسوسوم-lysosome فيوجن (iv) ، وليس فقط البضائع اوتوهاغيك ولكن أيضا المرتبطة p62 والبروتينات LC3 الخضوع للتدهور (علي سبيل المثال ، عن طريق التحلل). وهكذا ، فان فقدان p62 و LC3 بمثابه علامات للتدفق الذاتي17. الانصهار من [اوتوسوسومس] مع [ليسسوميس], ولذلك يتبع دوران [اوتوهريك], جدا متدلية علي التعريب داخل الخلايا [ليسسومال]. هذا هو ، من بين أمور أخرى ، التي ينظمها افراد الاسره كينيسن KIF1B و KIF2A ، والتي أظهرت ان تؤثر سلبا اوتوسوسوم-lysosome فيوجن18. ومن المثير للاهتمام ، والتعبير عن البروتين من KIF1B و KIF2A هو المستحث علي نضوج العاصمة التالي مسؤوله عن تدفق التلقائية غير كفء في mDCs-1 المصابة ، الذي يعوق كامله HSV-1 النسخ المتماثل10.
وتشمل المحاولات التجريبية لتعديل اوتوهاغي استخدام المركبات المعروفةللحث علي أو تمنع هذا المساربالذات 19,20,21. في هذه الدراسة ، ونحن وصف اثنين من الاستراتيجيات القائمة علي المثبط لمنع دوران التلقائية في البلدان الجزريه التي تصيب الفيروسات المصابة. المركب الأول المستخدمة في تجاربنا هي محدده وقويه المثبط التلقائي-1 (spautin-1) ، والتي وصفت لتعزيز Vps34-AMBRA1 تدهور معقده خلال مرحله البدء من اوتوهاغي22. المركب الثاني المستخدم في هذه الدراسة هو بافيلوميسين-A1 (BA1) ، وهو مثبط الخامس-atpase الذي يمنع الاحداث التلقائية في وقت متاخر (اي، اوتوسوسوم-lysosome الانصهار فضلا عن تحمض التلقائي)23،24. استخدام اي من هذه المثبطات اثنين قبل العدوى iDC مع HSV-1 بشكل بونتلي يمنع اوتوهاغي ، ولكن لا يزعج التعبير الجيني الفيروسي فعاله. وهكذا ، فان هذه الاستراتيجية القائمة علي المثبطات قبل العدوى HSV-1 يوفر أداه قويه لكبح التدفق الذاتي المستحث HSV-1 التي يمكن بسهوله توسيعها لعدد كبير من أنواع الخلايا المختلفة والفيروسات ، والتي يحتمل أيضا ان تحفز اوتوهاغي.
وللتغلب علي الجانب السلبي الرئيسي للنهج القائم علي المثبطات(اي الآثار غير المحددة خارج الهدف) ، وضعنا أسلوبا يستند إلى sirna لمنع التدفق الذاتي في البلدان الجزريه النامية (hsv-1-المصابة). وتمثل تقنيه siRNA الكهربائية استراتيجية بديله قويه ، عن طريق الاجتثاث الانتقائي للتعبير عن البروتينات المتميزة (اي المكونات التلقائية). في تجاربنا البلدان الجزريه التي كانت كهربية مع siRNA FIP200 محدده باستخدام جهاز الكهرباء انا (انظر جدول المواد) وبروتوكول معدله وصفتها gerer وآخرون (2017) و Prechtel وآخرون (2007) ، لمنع اوتوهاغي خلال بدءالمرحلة 25 ،26. هذا الأسلوب يسمح لنا علي وجه التحديد الضربة القاضية FIP200 التعبير في البلدان الجزريه الامريكيه ، دون التدخل في بقاء الخلية والنمط الظاهري غير ناضجه يومين بعد الكهربية. جدير بالذكر, وقد أنشئت عدوي HSV-1 في هذه البلدان الجزريه الغنية بالكهرباء التي تعكسها التعبير عن البروتين الفيروسي فعاله. هذه التقنية المستندة إلى siRNA تقدم فائده فريدة من نوعها (اي ان مجموعه متنوعة من المكونات التلقائية المختلفة ، حتى في تركيبه) ، يمكن ان تستهدف علي وجه التحديد لاستئصال التعبير عنها.
في هذه الدراسة ، ونحن أيضا وصف طريقه المستندة إلى siRNA للحث علي تدفق اوتوسيريك أيضا في mDCs المصابة-1. وفي هذه الحالة ، كانت البلدان الجزريه القائمة بالكهرباء مع سيرنا تستهدف KIF1B و KIF2A قبل نضوج العاصمة باستخدام الجهاز الكهربي الثاني (انظر جدول المواد). منذ كلا البروتينات هي اوبريجولاتيد خلال نضوج العاصمة والمعروف انها تنظم بشكل سلبي الانصهار من اوتوسوسوميس مع التماثيل10،18، ضربه قاضيه بقوة المستحثة التدفق الذاتي في mdcs علي hsv-1 العدوى. التالي ، فان تقنيه المستندة إلى siRNA مكنتنا من الحث علي وجه التحديد دوران التلقائية عن طريق التدخل مع التعبير بروتين KIF في mDCs ، التالي يمكن ان تحاكي مستويات التعبير في البلدان الجزريه المتوسطة.
وباختصار ، نقدم طريقتين متميزتين لكبح التدفق الذاتي في البلدان الجزريه التي تصيبها العدوى. وفي حين ان النهج الأول القائم علي المثبطات يشكل وسيله سهله ورخيصه وسريعة للتدخل في تدهور التلقائية ، والتقنية الثانية القائمة علي siRNA هي أكثر تحديدا وطريقه مناسبه جدا لدعم والتحقق من نتائج المثبطة القائمة علي التجارب. الاضافه إلى ذلك ، فاننا وصف طريقه للحث علي التدفق الذاتي أيضا في mDCs المصابة HSV-1 ، عن طريق الضربة القاضية بوساطة siRNA من اثنين من البروتينات KIF.
Protocol
وقد تم توليد الخلايا النامية المشتقة من البويضات من منتجات المانحين الأصحاء. ولهذا الغرض ، تم الحصول علي تصويت إيجابي من لجنه الأخلاقيات المحلية (المرجع رقم 4556). وأجريت تجارب هذه الدراسة وفقا لتوصيات لجنه الأخلاقيات التابعة ل "فريدريش-الكسندر-جامعه ارلنجن-نورنبيرغ" (المرجع رقم 4556). ووافقت جميع الجهات المانحة علي موافقه خطيه مستنيرة ، بما في ذلك وفقا لإعلان هلسنكي.
1-توليد ومناوله الخلايا الجذعية غير الناضجة والخلايا الجذعية الناضجة (mDCs)
- عزل الخلايا أحاديه النواة الدم الطرفية البشرية (PBMCs) من غرف نظام الحد من الطلاوة (الايرلنديه) كما هو موضح سابقا27. تجنب بالتبريد من PBMCs واستخدامها مباشره عند العزلة للحصول علي عوائد اعلي DC.
- توليد الإنسان dc من pbmcs من مختلف المتبرعين صحية في القوارير الثقافة T175 الخلية كما سبق وصفها10,27. 0.4 100 100 1640 350-400 بعد 1 ساعة ، اغسل الجزء غير الملتصق باستخدام RPMI 1640. أضافه المتوسطة الجديدة DC تستكمل مع 800 U/mL GM-السائل الدماغي الشوكي و 250 U/mL IL-4 ، واحتضان لمده 3 أيام.
- في اليوم 3 آخر التزام ، أضافه 5 مل من متوسط DC الطازجة التي تحتوي علي GM-السائل الدماغي الشوكي و IL-4 مع تركيز النهائي من 400 U/mL و 250 U/mL لكل خليه ثقافة قارورة ، علي التوالي ، ل DC التمايز.
- لحصاد البلدان الجزريه الضعيفة ، شطف بلطف البلدان الجزريه الضعيفة الملتصقة بشكل فضفاض من الجزء السفلي من قارورة ثقافة الخلية ، في اليوم 4 بعد الانضمام. كرر هذه الخطوة 2 مرات. لتوليد mDCs ، أضافه كوكتيل النضج تتالف علي النحو التالي: GM-السائل الدماغي الشوكي (التركيز النهائي: 40 U/mL) ، آيل-4 (التركيز النهائي: 250 U/mL) ، آيل-6 (التركيز النهائي: 1000 U/mL) ، IL-1β (تركيز نهائي: 200 U/mL) mL) ، بروستPGE2 في E2 (التركيز النهائي: 1 ميكروغرام/مل).
- سته أيام بعد الانضمام (يومين بعد التحريض من النضج باستخدام كوكتيل السايسيسين) ، شطف mDCs من الجزء السفلي من قارورة ثقافة الخلية. كرر هذه الخطوة مرتين.
ملاحظه: يمكن إنشاء DCs غير ناضجه وناضجه بالتتابع من الجهات المانحة متطابقة في 1 قارورة ثقافة الخلية. وللقيام بذلك ، ' 1 ' الفصل بين العدد المناسب من البلدان الجزريه الأخرى و ' 2 ' الحث علي نضوج الخلايا المتبقية في القوارير باستخدام كوكتيل السايسيتين المدرج في الخطوة 1-2-2.
- نقل البلدان الجزريه المتوسطة الحجم أو mDCs في وسط ثقافة الخلية المعنية إلى أنابيب 50 mL. حصاد الخلايا عن طريق طرد في 300 x g لمده 5 دقائق.
- أعاده التعليق برفق (= غسل) DCs في 5-10 mL من RPMI 1640 لكل خليه ثقافة قارورة. الجمع بين التعليق DC الخاصة في أنبوب واحد.
- تحديد رقم الخلية باستخدام غرفه الجرد أو طريقه بديله. تجنب التغيرات في درجه الحرارة عند التعامل مع البلدان الجزريه الأكثر ، للحد من مخاطر التغييرات الظاهرية.
2. تحليلات التدفق الخلوي لرصد حاله نضوج النمط الظاهري
- نقل البلدان الجزريه الافريقيه أو mDCs (0.5 x 106) من الخطوة 1-3-1 إلى أنبوب 1.5 mL. حصاد الخلايا عن طريق طرد في 3390 x g ل 1.5 دقيقه غسل الخلايا مره واحده مع المخزن المؤقت facs (بالاضافه إلى بالاضافه إلى 2 ٪ الجنين الساق المصل (FCS)).
- أعاده التعليق الخلايا في 100 μL من محلول تلطيخ الأجسام المضادة (FACS العازلة) التي تحتوي علي الأجسام المضادة المسمية الفلوروكروم محدده ضد جزيئات سطح محدده.
- استخدم الأجسام المضادة التالية للتحقق من النقاء (CD3 ، CD14) وكذلك حاله نضوج DCs (CD80-PacBlue/-PE-Cy5 ، CD11c-PE-Cy5 ، CCR7-PE-Cy7 ، CD83-APC ، CD86-PE ، MHCII-APC-Cy7).
- اعداد عينه واحده غير ملطخه في 100 μL من المخزن المؤقت FACS كعنصر تحكم.
- وصمه عار الخلايا علي الجليد في الظلام لمده 30 دقيقه.
- يغسل في وقت لاحق الخلايا مرتين في 1 مل من العازلة FACS وأجهزه الطرد المركزي في 3390 x g ل 1.5 دقيقه.
- وأخيرا ، أعاده تعليق الخلايا في 200 μL من المخزن المؤقت FACS تستكمل مع 2 ٪ PFA وتحليل الخلايا عن طريق تدفق الخلوي. يمكن تخزين الخلايا الثابتة في 4 درجه مئوية في الظلام تصل إلى 2 أيام.
3. الاجراء العدوى من الDCs مع فيروس الهربس البسيط نوع-1 (HSV-1) والتدخل من HSV-1-الناجمة عن الجريان التلقائي عن طريق spautin-1 أو بافيلوميسين-A1
ملاحظه: تم الحصول علي سلاله HSV-1/17 +/CMV-EGFP/UL43 (HSV-1 EGFP) المستخدمة في هذه الدراسة من سلاله المختبر HSV-1 سلاله 17 +. وتعبر سلاله HSV-1 EGFP عن البروتين الفلوري الأخضر المعزز (EGFP) الذي تم ادراجه في موضع جين UL43 تحت سيطرة مروج CMV. EGFP بمثابه علامة للعدوى HSV-1. وعلاوة علي ذلك ، استخدمت سلاله HSV1-RFPVP26 للدراسات العدوى العاصمة (التي سبق وصفها في توران وآخرون ، 2019). هذا الفيروس يعبر عن بروتين سطح كابسيد VP26 تنصهر إلى البروتين الفلوري الأحمر مونومر (mRFP).
- نقل البلدان الجزريه الافريقيه أو mDCs (2 × 106) من الخطوة 1.3 إلى أنبوب 2 مل. في وقت لاحق ، الطرد المركزي الخلايا في 3390 x g ل 1.5 دقيقه وتجاهل supernatant.
- أعاده التعليق برفق الخلايا في المتوسطة العدوى (RPMI 1640 تكمله مع 20 مم HEPES).
- لكبح مسار التحلل الذاتي-الليسومال-معالجه الحالات السابقة للاصابه بالفيروسات النامية مع spautin-1 أو بافيلميسين-A1 1 ح قبل الاصابه. أضافه اما 10 μM spautin-1 أو 1 μM BA1 ، أو DMSO كعنصر تحكم غير المعالجة ، إلى متوسط العدوى. احتضان الخلايا في كتله التدفئة في 300 لفه في الدقيقة تهتز في 37 درجه مئوية لمده 1 ساعة.
- لدراسات العدوى ، تطعيم الخلايا مع virions HSV-1 في تعدد العدوى (موي) من 2. أضافه حجم الخاصة ب MNT العازلة (30 مم 2-(ن-مورفينو) حمض اثانيسولفونيك (MES) ، 100 mM NaCl ، 20 مم تريس) كعنصر تحكم وهميه. احتضان الخلايا في كتله التدفئة في 300 لفه في الدقيقة تهتز في 37 درجه مئوية لمده 1 ساعة.
- 250 40 1.5 3390 البذور المعالجة وهميه و HSV-1-الخلايا المصابة في تركيز النهائي من 1 × 106/مل في لوحه 6-حسنا.
- في 16-24 hpi ، حصاد الخلايا عن طريق الشطف (mDCs) أو باستخدام مكشطه الخلية (البلدان الجزريه المستدامة). نقل الخلايا إلى أنبوب قفل أمان 1.5 mL.
- جمع الخلايا عن طريق طرد في 3390 x ز لمده 1.5 دقيقه وغسل بيليه مره واحده عن طريق أضافه 1 مل من تلفزيوني.
- بقوة أعاده تعليق الخلايا في مزيج تحلل التي تحتوي علي 29 μL من 2x Roti-تحميل ، 1 μL 100 mM MgCl2 و 12.5 U/mL البنبوناز.
- لتحلل الخلية والحمض النووي الهضم باستخدام البنبوناز ، احتضان العينات في 37 درجه مئوية لمده 10 دقيقه. في وقت لاحق ، والبروتينات في 95 درجه مئوية لمده 10 دقيقه.
- قم باجراء تحليلات الصفحة الخاصة ب SDS والغربية للتحقق من مستويات البروتين من LC3BI/II ، p62 ، ICP0/5 ، و جابده.
4-تداخل التدفق الذاتي المستحث من طراز HSV-1 عن طريق الصعق الكهربائي للبلدان الجزريه التي تستخدم FIP200-siRNA
ملاحظه: تم تعديل البروتوكول الحالي لشركه سيرنا الكهربائية من Prechtel وآخرون (2007) و Gerer et al. (2017).
- نقل البلدان الجزريه الافريقيه (12 × 106) في يوم 3.5 آخر الانضمام إلى أنبوب 50 mL. في وقت لاحق ، الطرد المركزي الخلايا في 300 x g لمده 5 دقائق وتجاهل supernatant. بالتوازي ، قم باجراء تحليل التدفق الخلوي لمراقبه حاله النضوج كما هو موضح في الخطوة 2 (استخدام الحياة/البنفسج الميت بدلا من CD80).
- يغسل برفق البلدان الجزريه الثمانية في 5 مل من اوبتيفيم دون الفينول الأحمر والطرد المركزي الخلايا في 300 x g لمده 5 دقيقه. تجاهل ماده طافي وأعاده تعليق بلطف البلدان الجزريه الغنية في 200 μl من اوبتيميم دون الفينول الأحمر ، وضبط تركيز الخلية من 6 × 106/100 μl. لا تضع الخلايا علي الجليد وتجنب التعديلات في درجات الحرارة. التحرك بسرعة وتجنب فترات الحضانة طويلة من البلدان الجزريه السريعة في اوبتيفيم دون الفينول الأحمر.
- نقل اما 75 بمول من FIP200 الخاصة sirna أو 75 بمول من المشفرة sirna ، كعنصر تحكم ، في cuvettes الكهربائية 4 ملم وأضافه 100 μl (6x106 خلايا) من تعليق الخلية. نبض مباشره البلدان الجزريه التي تستخدم الجهاز الكهربائي الأول ، وتطبيق الإعدادات التالية: 500 V لمده 1 مللي ثانيه.
- قبل الاجراء التجريبي ، واعداد المعلقات sirna وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، قسامه وتخزينها في-20 درجه مئوية. ذوبان والاحتفاظ بها علي الجليد عند استخدام هذه siRNAs للكهرباء. قبل الكهربية العينات ، وأداء نبض اختبار.
- بعد كهربية ، نقل مباشره iDC إلى لوحات 6-حسنا مع الطازجة قبل الحرارة DC المتوسطة (تستكمل مع 40 U/mL من GM-السائل الدماغي الشوكي و 250 U/mL من IL-4). بذور الخلايا في تركيز النهائي من 1 × 106/مل ووضعها في حاضنه. لا شطف الخلايا من cuvette الكهربائية.
- بعد 48 h ، دراسة اولي لمورفولوجية البلدان الجزريه المجهرياه الكهربائية. ثم ، حصاد الخلايا باستخدام خليه الخردة ونقلها إلى أنابيب 15 مل. شطف الآبار مع 1 مل من تلفزيوني تستكمل مع 0.01 ٪ أدتا ونقل الحل في الأنابيب المعنية.
- وفي وقت لاحق ، تقسيم 6 × 106 البلدان المجاورة لكل حاله sirna كما هو موضح في الخطوات التالية.
- استخدم 0.5 x 106 خلايا لتقييم حاله النضج وصلاحيه الخلية كما هو موضح في الخطوة 2. استخدام الأجسام المضادة التالية: CD11c-Cy5 ، CCR7-PE-Cy7 ، CD83-APC ، MHCII-APC-Cy7 والحياة/البنفسج الميت.
- استخدام 1 × 106 خلايا للطخه الغربية تحليلات للتحقق من كفاءه FIP200 الضربة القاضية الخاصة. نقل وحصاد الخلايا إلى أنبوب قفل أمان 1.5 mL بواسطة طرد في 3390 x g ل 1.5 دقيقه اعداد الخلية لست] كما هو موضح في الخطوة 3.4 واجراء تحليلات لطخه الغربية.
- استخدام الخلايا المتبقية (4.5 x 106) لتجارب العدوى hsv-1. لكل حاله تجريبية ، نقل 2.25 x 106 البلدان الجزريه الHSV1ه في أنابيب 2 مل واما تصيب لهم بالنسبة لهم في الداخلية من 2 أو أضافه MNT العازلة كعنصر تحكم وهميه. تنفيذ العدوى كما هو موضح في الخطوة 3.3.
- في 20 hpi ، حصاد الخلايا باستخدام مكشطه الخلية واعداد الخلايا لست] لتحليلات لطخه الغربية كما هو موضح في الخطوة 3.4.
5. التحوير للمسار اوتوسوسوم-الليسومال في mDCs-1-المصابة باستخدام KIF1B/2A-سيرنا اليكتروبوريشن
- نقل البلدان الجزريه الافريقيه (24 × 106) في اليوم 4 بعد الانضمام إلى أنبوب 50 mL. في وقت لاحق ، الطرد المركزي الخلايا في 300 x g لمده 5 دقائق وتجاهل supernatant.
- أعاده التعليق برفق (= غسل) البلدان الجزريه الثمانية في 8 مل من تلفزيوني ، لضبط تركيز الخلية النهائية من 3 × 106/ml. نقل 3 × 106 خلايا في أنابيب 1.5 مل وحصاد الخلايا في 3390 x g ل 1.5 دقيقه.
- أعاده تعليق البلدان الجزريه المتوسطة في 100 μl من المخزن المؤقت P3 الذي يحتوي علي مزيج الملحق (وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ؛ الكهربائية طقم جهاز II) واما (ط) 75 بمول من KIF1B الخاصة sirna ، (2) 75 بمول من KIF2A الخاصة sirna ، أو (iii) علي حد سواء. استخدام ' 4 ' المبلغ المعني من siRNA تدافعت كعنصر تحكم. اعداد أنبوبين لكل حاله siRNA (6 x 106 الخلايا) ونقل المعلقات في cuvettes الكهربائية منفصلة. نبض مباشره البلدان الجزريه التي تطبق النبض "EH-100" باستخدام الجهاز الكهربائي II.
- قبل الاجراء التجريبي ، واعداد المعلقات sirna وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، قسامه وتخزينها في-20 درجه مئوية. ذوبان والاحتفاظ بها علي الجليد عند استخدام هذه siRNAs للكهرباء. لا تضع البلدان الجزريه الموجودة علي الجليد وتجنب التغيرات في درجات الحرارة. التحرك بسرعة وتجنب حضانة طويلة من البلدان الجزريه السريعة في المخزن المؤقت أو P3.
- مباشره بعد الكهربي ، أضافه 500 μL من قبل الحرارة RPMI 1640 إلى cuvettes الكهربائية. احتضان الخلايا في حاضنه لمده 5-10 دقيقه. نقل البلدان الجزريه المستقلة إلى 6 لوحات جيدا مع الطازجة المتوسطة الحرارة العاصمة (تستكمل مع 40 U/mL من GM-السائل الدماغي الشوكي و 250 U/mL من IL-4). الجمع بين ظروف كل منهما في بئر واحده ، والبذور الخلايا في تركيز النهائي من 1 · 106/مل ووضعها في حاضنه.
- 4 ساعات بعد الحضانة ، أضافه كوكتيل النضج الذي يحتوي علي السايتوكينات المدرجة في الخطوة 1-2-2.
ملاحظه: اعداد عينه واحده من DCs غير الكهربية (1 × 106) كعنصر تحكم لتحليلات التدفق الخلوي بعد يومين من الكهربية. علاج خلايا التحكم analogously العينات الكهربية. - يومين بعد الكهربائي ، والخلايا الحصاد عن طريق أعاده التعليق ونقلها إلى أنابيب 15 مل. شطف الآبار مع 1 مل من تلفزيوني ونقل المعلقات في الأنابيب ذات الصلة. سبليت 6 · 106 DCs لكل حاله sirna كما هو موضح في الخطوات التالية:
- استخدام 0.25 x 106 DCs (الكترورتيد وغير الكترورتيد) للتحقق من حاله النضج وبقاء الخلية كما هو موضح في الخطوة 2. استخدام الأجسام المضادة التالية: CD80-Cy5 ، CD83-APC ، CD86-PE ، MHCII-APC-Cy7 ، والحياة/البنفسج الميت.
- استخدام 0.75 x 106 خلايا للطخه الغربية تحليلات لتقييم KIF1B/2a-الكفاءة الضربة القاضية الخاصة. جمع الخلايا في أنبوب قفل أمان 1.5 mL بواسطة طرد في 3390 x g ل 1.5 دقيقه اعداد الخلية لست] كما هو موضح في الخطوة 3.4 واجراء تحليلات لطخه الغربية.
- استخدام الخلايا المتبقية (5 × 106) من كل حاله sirna واجراء تجارب العدوى hsv-1. لكل حاله تجريبية ، نقل 2.5 x 106 البلدان الجزريه المتوسطة إلى 2 مل أنابيب واما تصيب لهم hsv-1 في وزاره الداخلية من 2 أو أضافه MNT العازلة كعنصر تحكم وهميه. تنفيذ العدوى كما هو موضح في الخطوة 3.3.
- في 20 ساعة بعد الاصابه ، حصاد الخلايا عن طريق أعاده التعليق واعداد الخلية لست] لتحليلات لطخه الغربية للتحقق من التحريض علي دوران اوتوهاغيك الناجمة عن hsv-1 ، كما هو موضح أعلاه في الخطوة 3.4.
Representative Results
في هذه المخطوطة ، نقوم بوصف الطرق للتدخل مع HSV-1-المستحثة التلقائية في الخلايا الجذعية. وهذا يشمل توليد البلدان الجزريه البشرية المشتقة من الخلايا الوحيدة والتي تم تحليلها ظاهريا من خلال قياس التدفق الخلوي (الشكل 1). في اليوم 4 بعد الانضمام, Dc تظهر النمط الظاهري غير ناضجه تتميز التعبير ضعيفه من CD80, CCR7, و CD83 وكذلك عاليه CD11c والمتوسطة التعبير MHCCC. بما ان CD3 و CD14 إشارات مفقوده, [ت] خليه و [مونوموسيكل] تلوث يستطيع كنت استثنيت. في اليوم 6 بعد الانضمام (اي اليوم 2 الاستقراء بعد النضج) ، تظهر DCs النمط الظاهري ناضجه تنعكس بزيادة كبيره في CD80 ، CCR7 ، CD83 ، و MHC-II التعبير السطحي. وتؤدي العدوى بسلاله HSV-1 التي تعبر عن المرض (الشكل 2) إلى أصابه كامله تقريبا من البلدان الجزريه المستقلة(الشكل 2واللوحة العليا) أو mdcs(الشكل 2لوحه سفليه ، الشكل 2ب) ، استنادا إلى إشارات قويه GFP تحليلها من قبل المجهر مضان وكذلك تدفق الخلوي.
وكما هو موضح في تقريرنا الأخير ، فان HSV-1 يدفع الحركة الذاتية في البلدان الجزريه المتوسطة والمتوسطة الحجم ، ومع ذلك ، يحدث دوران الغيار التلقائية في البلدان الجزريه الوحيدة التي لا تتجاوز10. في النهج الأول ، عالجنا البلدان الجزريه المتوسطة الأجل و mDCs مع spautin-1 (الشكل 3A)-لمنع بدء الغيار التلقائية-أو بافيلميسين-A1 (BA1; الشكل 3ب)-لمنع الانصهار النهائية التلقائية-lysosome. وعند الاصابه بعدوي الفيروس HSV-1 في البلدان الجزريه التي لا توجد فيها spautin-1 و BA1 ، ينعكس التدفق التلقائي بسبب انخفاض التعبيرين p62 و LC3B علي التوالي. وعلي النقيض من ذلك ، فان عدوي HSV-1 من mDCs في غياب spautin-1 لا تؤثر علي التعبير p62 ، في حين ان spautin-1 و BA1 العلاج يحفز تراكم LC3B-II. وهذا يعكس التحريض علي الغيار التلقائية ولكن فشل دوران اوتوهاليك في mDCs. في البلدان الجزريه المتوسطة ، يعيد spautin-1 المعالجة المسبقة بقوة التحلل التلقائي لp62 علي عدوي HSV-1 ، وذلك بسبب تثبيط الغيار التلقائية اثناء مرحله البدء. عند مرحله ما قبل المعالجة مع BA1 ، وهميه-و HSV-1-المصابين بالفيروسات تظهر تراكم قوي من مستويات البروتين LC3B ، مما يدل علي تثبيط ناجحه لدوران اوتوهاغيك عن طريق حجب في وقت متاخر التلقائية-lysosome الانصهار. وتماشيا مع ذلك ، فان spautin-1 و BA1 المعالجة المسبقة لل mDCs ينتج أيضا p62 مستقره وزيادة مستويات البروتين LC3B-II ، علي التوالي.
وفي الطريقة الثانية لاضعاف التدفق الذاتي ، يتم فحص الكهربية التي تستهدف FIP200 فيما يتعلق بقدرتها علي منع تدفق الحمولة التلقائية في البلدان الجزريه الأخرى المصابة بفيروس نقص الطاقة الخلوية. وكما هو مبين في الشكل 4(ا) ، تم الكشف بقوة انخفاض مستويات البروتين FIP200 في البلدان الجزريه المنخفضة 48 h بعد الكهربية ، بالمقارنة مع السيطرة sirna. وفي هذه النقطة الزمنيه ، لا تظهر اي علامات علي موت الخلايا (الشكل 4ب) وتحافظ علي النمط الظاهري غير الناضج (الشكل 4ج). العدوى من البلدان الجزريه الFIP200ه التي تسكت مع HSV-1 يكشف عن انخفاض قوي في تدفق الغيار التلقائية مقارنه مع التحكم الخاصة بهم النظراء معالجه siRNA (الشكل 4د). ويرافق ذلك زيادة مستويات البروتين LC3B وكذلك p62 عندما يتم إسكات FIP200 في البلدان الجزريه التي تصيبها العدوى.
في محاولة عكسية ، درسنا ما إذا كان الاجتثاث بوساطة سيرنا من KIF1B والتعبير عن البروتين KIF2A تمكن الغيار الذاتية للدوران أيضا في mDCs المصابة HSV-1. وهكذا ، كانت البلدان الجزريه التي توجد فيها كهرباء باستخدام سيرناس محدده تستهدف اما واحدا من هذه البروتينات أو كليهما ، ونضجت الخلايا لاحقا (الشكل 5). 2 أيام بعد الكهربي ، mDCs تظهر انخفاضا قويا في KIF1B و/أو KIF2A البروتين التعبير ، عندما تم استخدام siRNAs محدده (الشكل 5ا). ولم تؤد هذه الطريقة أيضا إلى موت الخلايا البارز (الشكل 5ب) ولا إلى التغيرات في وضع النضج الظاهري (الشكل 5ج). ودعما لاهميه KIF1B و KIF2A اثناء التحلل الذاتي-الليسومال ، فان نضوبها قبل الاصابه بعدوي الفيروس HSV-1 يسهل التدفق الذاتي المتزايد في mDCs. وينعكس ذلك من انخفاض مستويات البروتين p62 المتبقية ، علي النقيض من حاله التحكم المعنية (الشكل 5د).
الشكل 1: توصيف النمط الظاهري للبلدان الجزريه الوحيدة التي تستمد الإنسان من الخلايا البشرية والبلدان المتوسطة الخلية باستخدام قياس التدفق الخلوي. تم إنشاء DCs وملطخه بأجسام مضاده محدده للتحقق من نقائها: (ا) CD3 لاستبعاد تلوث الخلايا التائية ، (ب) CD14 لاستبعاد التلوث بالخلايا الاحاديه ، و (ج) CD11c كعلامة للبلدان النامية. لتقييم حاله النضج الظاهري الخاصة بهم استخدمت الأجسام المضادة التالية: (د) CD80 ، (ه) CCR7 ، (و) CD83 ، و (ز). ويتم التعبير عن هذه الجزيئات بشكل كبير علي mDCs التالي السماح للتمييز بين النمط الظاهري غير ناضجه وناضجه DC. تم تحليل البيانات باستخدام FCS اكسبرس 5.0. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التحليلات المجهرية وكذلك التدفقات الخلوية للبلدان الجزريه التي تصيبها العدوى وأصيبت البلدان الجزريه المتوسطة الحجم والصناديق الاستئمانية المتوسطة بسلاله HSV-1 التي تعبر عن EGFP (HSV-1 EGFP) ، للسماح بالقياس الكمي لمعدل الاصابه استنادا إلى اشاره GFP. )ا(التحليلات المجهرية للمصابين بفيروس المناعة الذاتية الإيجابي المصابين بمرض التهاب الخلوي-1 والمصابين بالعدوى في وزاره الداخلية التي تبلغ 2 ، بالمقارنة مع نظرائهم غير المصابين ، في 24 hsv. لتصور الخلايا المصابة ، تم رصد الفلورية GFP. شريط مقياس يمثل 400 μm. (ب) قياس التدفق الخلوي لل mdcs المصابة بالنموذج أو hsv-1 اثناء حركيه العدوى. ألواح العلوية (السوداء اصطف الرسوم البيانية) تظهر حاله وهميه ، لوحات اقل (الأسود المدرجة المدرجة) تظهر HSV-1-الخلايا المصابة بعد النقاط الزمنيه المشار اليها بعد العدوى. تم تحليل البيانات باستخدام FCS اكسبرس 5.0. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: Spautin-1 و b afilomycin-A1 تعدل التدفق التلقائي في HSV-1-البلدان الجزريه التي أصيبت بالعدوى. (ا) spautin-1 أو (ب) بافيلميسين-A1 (BA1) لمده 1 ساعة قبل الاصابه.... وكانت الخلايا في وقت لاحق وهميه-أو HSV-1-المصابة (HSV1-RFPVP26) باستخدام وزاره الداخلية من 2. بعد 16-18 h ، تم حصاد الدول النامية وأخضعت البروتينات لبقع الغربية لتحديد التعبير عن p62 أو LC3B/-الثاني كعلامات اوتوهاليك ، ICP0 كعنصر تحكم العدوى ، و جابده كعنصر تحكم التحميل. وقد تم تحديد مستويات البروتين الLC3B والLC3B الثانية كميا وتطبيعها مع البروتين المرجعي جابDH باستخدام Bio1D (الكثافة البصرية). يتم عرض نسبه LC3B تطبيع إلى الإشارات LC3B الطبيعية. وقد تم تعديل هذا الرقم وتكييفه من © 2019 توران وآخرون التي نشرت أصلا في JCB. https://doi.org/10.1083/jcb.20180115110. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تحليل التدفق الذاتي في البلدان الجزريه الFIP200ه المصابة بالفيروس علي الكهرباء. وكانت البلدان الجزريه النامية بالكهرباء مع السيطرة siRNA أو FIP200 الخاصة siRNA باستخدام جهاز الصعق الكهربائي I. (ا) تم تحليل DCs فيما يتعلق بكفاءة FIP200 ضربه قاضيه 48 h الكهربائية آخر ، من خلال أداء تحليلات لطخه الغربية. (ب) سلامه الخلية وكذلك (ج) تم تحليل حاله النضج قبل الكهربي (الضوء الأزرق المدرج) و 48 h آخر (الأزرق الداكن والرمادية المدرجة) الكهربي بواسطة تدفق الخلوية. وترد القيم المتوسطة لثلاثه مانحين مختلفين. بعد التاكد من الضربة القاضية فعاله من FIP200 والنمط الظاهري غير ناضجه ، كانت الخلايا HSV-1-المصابة (HSV-1 EGFP) باستخدام موي من 2. تم تحليل البيانات باستخدام FCS اكسبرس 5.0. (د) في 20 ساعة بعد الاصابه ، تعرضت الخلايا لتحليلات لطخه غربيه لتحديد التعبير عن LC3B/-II و p62 كعلامات اوتوهاليك. تم الكشف عن ICP5 كعنصر تحكم العدوى ، و جابDH كعنصر تحكم التحميل. وقد عدلت اللوحتان الف ودال وجري تكييفها من © 2019 توران وآخرين التي نشرت أصلا في JCB. https://doi.org/10.1083/jcb.20180115110. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: الاجتثاث بوساطة سيرنا من KIF1B و/أو KIF2A ينظم دوران الغيار التلقائية في mDCs-1 المصابة. وقد صعقت البلدان الجزريه الام بالكهرباء مع KIF1B الخاصة و/أو KIF2A الخاصة ، فضلا عن السيطرة علي siRNA ، وذلك باستخدام الجهاز الكهربائي II. في 4 ساعة بعد الكهربية ، وكان المستحث النضج عن طريق أضافه كوكتيل النضج. في 48 h آخر الكهربائية ، تم تحليل الدول النامية فيما يتعلق ب (ا) كفاءه KIF ضربه قاضيه من خلال الغربية التنقيط ، (ب) بقاء الخلية وكذلك (ج) حاله نضوج النمط الظاهري باستخدام تحليلات التدفق الخلوي (اثنينمختلفه يتم عرض الجهات المانحة). "ث/س EP" يعني دون الكهربية ، ولكن بعد التحريض من النضج. "ما بعد السيطرة EP" يعني بعد الكهربي باستخدام التحكم siRNA; "آخر KIF1B ، KIF2A ، KIF1B/2A EP" يعني بعد الكهربي باستخدام KIF1B-و/أو siRNA KIF2A محدده. بعد التاكد من الضربة القاضية فعاله من KIF1B و/أو KIF2A والنمط الظاهري ناضجه ، كانت الخلايا HSV-1-المصابة (HSV-1 EGFP) باستخدام موي من 2. تم تحليل البيانات باستخدام FCS اكسبرس 5.0. (د) تعرضت الخلايا للطخه الغربية التحليلات 20 ساعة بعد الاصابه ، من أجل تقييم التعبير عن p62 كعلامة اوتوهاليك. تم استخدام ICP5 كعنصر تحكم العدوى ، و جابDH كعنصر تحكم التحميل. وقد تم تعديل الشكلين الف ودال وتكييفها من © 2019 توران وآخرين التي نشرت أصلا في JCB. https://doi.org/10.1083/jcb.20180115110. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Discussion
ويشمل نطاق هذا البروتوكول ' 1 ' مناوله البلدان الجزريه الوحيدة التي تستمد منها البويضات البشرية ، وكذلك الفيروسات المتوسطة الحجم ، و ' 2 ' اصابتها بالعدوى بالمركب HSV-1 ، و ' 3 ' معالجتها بمركبات معروف انها تمنع التفريغ الذاتي ، و ' 4 ' مختلف الاجهزه التقنية. وباستخدام هذا البروتوكول ، يمكن اما حظر التدفق الذاتي للعدوى في البلدان الجزريه الام المصابة بفيروس اتش اس-1 ، أو المستحث في الصناديق الاستئمانية المصابة بالفيروس HSV-1.
ونظرا لان البلدان النامية ، ولا سيما منها ، هي خلايا ضعيفه جدا ، فان العمل مع هذه الخلايا ينطوي علي خطوات حساسة إلى حد ما. للجيل العاصمة ، ونحن نوصي لاستخدام الطازجة المعزولة Pbmmmcmcmcmcmcmcm، وتجنب بالتبريد ، من أجل الحصول علي اعلي غله الخلية. وعلاوة علي ذلك ، عند مناوله البلدان الجزريه الضارة اثناء التجارب ، بما في ذلك زراعتها لاحقا ، منع التعديلات القاسية أو المطولة للحرارة. وبخلاف ذلك ، قد تخضع البلدان الجزريه الأخرى لتغيرات النمط الظاهري ، التالي فمن الضروري التحقق من النمط الظاهري غير الناضج عن طريق قياس التدفق الخلوي. وعلي النقيض من نظرائهم الناضجين ، تفتقر البلدان الجزريه المستقلة إلى علامات مميزه ، مثل CD80 ، CD83 ، و CD8628،29. والعدوى بين البلدان الجزريه القليلة المنشا و mdcs مع hsv-1 هي طريقه راسخة2،3،4،5،6،10. وأظهرنا نحن وغيرنا ان البلدان النامية شديده التعرض للاصابه بعدوي الفيروس HSV-1 ، عندما استخدمت وزاره الداخلية من 1 أو 2 (الشكل 2). في ايدينا ، والحفاظ علي حجم المتوسطة العدوى في مستويات منخفضه (1-3 x 106 خلايا في 250-350 μl) سوف يؤدي إلى تحسين كفاءه العدوى.
والنهج التقليدي للتدخل في مسار خلوي متميز معين هو استخدام مركبات محدده. مجموعه متنوعة من المغيرين مختلفه من اوتوهاغي ، اي المنشطات ، فضلا عن مثبطات ، وتتوفر حاليا30. وفيما يتعلق HSV-1-المستحثة اوتوهالهاي في البلدان النامية ، توران وآخرون ، (2019) أظهرت مؤخرا الآثار المثبطة من spautin-1 و بافيلوميسين-A1 (BA1) علي دوران اوتوهاغيك في الجزيرة المتوسطة10. هذا الأسلوب لتثبيط الغيار التلقائية هو مناسبه للجمع مع عدوي HSV-1 اللاحقة ، لأنه لا يوجد معدل الاصابه ولا حاله نضوج DCs (وخاصه البلدان الجزريه النامية) هو ضعف. وفي التطبيقات المستقبلية ، يمكن تطبيق هذا النهج القائم علي المثبطات أيضا بالاقتران مع العوامل المعدية الأخرى ، وظروف الإجهاد ، مثل المجاعة ، فضلا عن أنواع الخلايا المختلفة. ومع ذلك ، عند استخدام مثبطات ، تنشا القيود في تحديد التركيز المناسب لتثبيط التلقائية كفاءه ، دون التاثير بشده علي سلامه الخلية. ومع ذلك ، فان القيد الرئيسي عند استخدام مثبطات هو حدوث الآثار المحتملة خارج الهدف أو السلبية ، والتي يمكن ان تؤدي إلى نتائج مضلله31،32.
النهج الثاني للتدخل في اوتوهاغي ، التي يغطيها هذا البروتوكول ، هو ضربه قاضيه محدده باستخدام sirna33،34،35. من ناحية ، استخدمنا جهاز الكهرباء I لاستئصال علي وجه التحديد التعبير عن FIP200 ، التالي تثبيط hsv-1-المستحثة دوران اوتوهاغيك في البلدان الجزريه الأخرى. من ناحية أخرى ، ونحن إسكات اثنين من البروتينات KIF مختلفه (اي ، KIF1B و KIF2A) ، وذلك باستخدام الجهاز الكهربائي الثاني ، لتسهيل تدفق الغيار الذاتية في HSV-1-mDCs المصابة. وأسفرت كل من بروتوكولي الكهرباء عن استئصال كامل تقريبا لFIP200 في البلدان الجزريه المستقلة ، و KIF1B/KIF2A في mDCs ، التي تم التحقق منها عن طريق تحليلات لطخه غربيه (الشكل 4ا، الشكل 5ا). وعلي النقيض من الجهاز الكهربي الأول ، الذي لا يؤثر علي مقومات البقاء للبلدان النامية ، فان الكهرباء من mDCs باستخدام الجهاز الكهربي الثاني يؤدي إلى معدلات اعلي قليلا من الخلايا الميتة (الشكل 4ب، الشكل 5ب ). التالي ، في التطبيقات المستقبلية ، وجهاز الكهرباء وانا ينبغي ان تستخدم بشكل تفضيلي لكلا البلدان الجزريه القريبة القادمة و mDCs. وبشكل ملحوظ ، فان كلا من التقنيات المستندة إلى siRNA ، لتعديل التدفق الذاتي ، متوافقة مع عدوي HSV-1 اللاحقة من البلدان الجزريه المتوسطة أو mDCs. وعلاوة علي ذلك ، لا يتم تغيير النمط الظاهري غير ناضجه من البلدان الجزريه الأخرى ولا النمط الظاهري ناضجه من mDCs بعد كهربية.
الكهرباء من البلدان الجزريه المستقلة التي تستخدم siRNA FIP200 الخاصة هو وسيله فعاله ومحدده للغاية لضربه قاضيه الجينات ، فضلا عن تثبيط تدفق اوتوهاليك علي عدوي HSV-1. بالاضافه إلى إسكات محدده من FIP200 ، يمكن تكييف هذا البروتوكول لإسكات المكونات التلقائية الأخرى ، والمشاركة في خطوات مختلفه خلال تتالي اوتوهاليك. ومع ذلك ، فان تحديد الهدف المناسب لتثبيط الكفاءة الذاتية بوساطة سيرنا يشمل عده جوانب من القلق. أولا ، الكفاءة الضربة القاضية المتعلقة بالجينات المتصلة (ATG) لا ترتبط بالضرورة بشكل إيجابي مع تثبيط كفاءه الغيار الذاتية وتعتمد اعتمادا كبيرا علي البروتين ATG محدده التي يتم إسكات36. ثانيا ، وتشارك البروتينات atg متميزة بالاضافه إلى ذلك في مسارات متميزة من اوتوهاغي ، التالي يمكن ان يؤدي الاجتثاث أيضا إلى الآثار الجانبية السلبية37،38،39. ثالثا ، قد يكون ATGs مختلفه وظائف زائده عن الحاجة ، التالي الضربة القاضية من عنصر واحد قد لا تكون كافيه لمنع اوتوهاغي (علي سبيل المثال، beclin-1 و beclin-2)40.
الاضافه إلى ذلك ، فان الجهاز الكهربائي القائم علي بروتوكول الكهربائية التي تعتمد عليها Dc هو أيضا مناسبه ل mRNAs ، ويمكن استخدامها لمجموعه متنوعة من أنواع الخلايا الاساسيه اضافيه ، مثل Pbmcms25. التالي فان هذا النظام يوفر استراتيجية عامه لتقديم أنواع مختلفه من الحمض الريبي النيبالي إلى أنواع الخلايا الاوليه. وفي الختام ، فاننا نقدم بروتوكولين لمنع التدفق الذاتي ، اما باستخدام المثبط-أو نهج القائم علي siRNA مع عدوي HSV-1 اللاحقة من البلدان الجزريه المستقلة. وعلاوة علي ذلك ، فاننا وصف النهج الكهربي siRNA للحث علي تدفق التلقائية في mDCs علي عدوي HSV-1.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل مجلس البحوث ألماني (DFG) عن طريق المشروع STE 432/11-1 الممنوحة ل AS وبرنامج ELAN من كليه الطب (فريدريش-الكسندر-جامعه ارلنجن-نورنبيرغ) عبر المشروع 18-12-21-1 ، الممنوحة ل LG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4D-Nucleofector Core Unit (electroporation apparatus II) | Lonza (Basel, Switzerland) | AAF-1002B | |
| AB-Serum | Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | H4522 | Dendritic cell cultivation |
| ACD-A | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | 9007281 | |
| Amaxa P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (electroporation kit apparatus II) | Lonza (Basel, Switzerland) | V4XP-3024 | |
| Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE Healthcare (Solingen, Germany) | RPN2232 | Western Blot Detection |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | A3678 | |
| anti-mouse-IgG (mouse, polyclonal, HRP) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 7076 | Western Blot detection |
| anti-rabbit-IgG (goat, polyclonal, HRP) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 7074 | Western Blot detection |
| Bafilomycin A1 | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | tlrl-baf1 | inhibition of autophagy and lysosomal degradation |
| BD FACS Canto II Flow Cytometer | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 338962 | |
| Benzonase | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | E1014 | |
| Blotting Chamber Fastblot B44 | Biometra (Göttingen, Germany) | 846-015-100 | |
| CCR7 (mouse, Pe-Cy7) | BioLegend (Fell, Germany) | 557648 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: G043H7 |
| CD11c (mouse, Pe-Cy5) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 561692 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: B-ly6 |
| CD14 (mouse, PE) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 555398 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: M5E2 |
| CD3 (mouse, FITC) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 555332 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: UCHT1 |
| CD80 (mouse, V450) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 560442 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: L307.4 |
| CD83 (mouse, APC) | eBioscience Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Germany) | 17-0839-41 | Flow cytometry Dilution: 1:200 Clone: HB15e |
| CD86 (mouse, PE) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 553692 | Flow cytometry Dilution: 1:100 |
| EVOS FL Cell Imaging | System AMG/Life Technologies (Carlsbad, USA) | AMF4300 | |
| FIP200 (rabbit) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 12436 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: D10D11 |
| GAPDH (mouse) | Merck Millipore (Massachusetts, USA) | AB2302 | Western Blot detection Dilution: 1:5000 Clone: MAB374 |
| Gene Pulser II apparatus (electroporation apparatus I) | BioRad Laboratories GmbH (München, Germany) | 165-2112 | |
| GM-CSF (4x104 U/mL) | Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany) | 130-093-868 | |
| HLA?DR (mouse, APC-Cy7) | BioLegend (Fell, Germany) | 307618 | Flow cytometry Dilution: 1:200 Clone: L243 |
| HSV-1/17+/CMV-EGFP/UL43 | BioVex | DC infection |
|
| ICP0 (mouse) | Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) | sc-53070 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: 11060 |
| ICP5 (mouse) | Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) | sc-56989 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: 3B6 |
| IL-1β (0.1x106 U/mL) | Cell Genix GmbH (Freiburg, Germany) | 1411-050 | |
| IL-4 (1x106 U/mL) | Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany) | 130-093-924 | |
| IL-6 (1x106 U/mL) | Cell Genix GmbH (Freiburg, Germany) | 1404-050 | |
| ImageQuant LAS 4000 | GE Healthcare (Solingen, Germany) | 28955810 | |
| KIF1B (mouse) | Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) | sc-376246 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: E-12 |
| KIF2A (mouse) | Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) | sc-271471 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: D-7 |
| LC3B (rabbit) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 3868 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: D11 |
| L-glutamine | Lonza (Basel, Switzerland) | 17-605E | |
| LIVE/DEAD Fixable Violet dead cell stain kit | Life Technologies (Carlsbad, CA, USA) | L34964 | L/D staining in Flow cytometry |
| Lymphoprep | Alere Technologies AS (Oslo, Norway) | 04-03-9391/01 | |
| Magnesiumchloride | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | A537.1 | |
| Megafuge 2.0 RS | Heraeus (Hanau, Germany) | 75015505 | |
| N, N, N', N'-Tetramethylethylendiamine (TEMED) | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | T9281 | |
| Neubauer counting chamber | Brand (Wertheim, Germany) | 717805 | |
| Nunc Cell culture flasks (175.0 cm2) | Thermo Scientific (Rockford, USA) | 159910 | |
| p62 (rabbit) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 88588 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: D5L7G |
| PageRuler prestained protein ladder | Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Germany) | 26616 | |
| Paraformaldehyde, 16 % | Alfa Aesar, Haverhill, USA | 43368.9M | |
| PerfectSpin 24 Plus | Peqlab (Erlangen, Germany) | C2500-R-PL | |
| PGE2 (1 mg/mL) | Pfizer (Berlin, Germany) | BE130681 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Lonza (Basel, Switzerland) | 17-512F | |
| Protein gel system MiniProtean II | Bio-Rad Laboratories GmbH (München, Germany) | 1652960 | |
| RestoreTM Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific, Rockford, USA | 21059 | |
| Rocking Platform wt 15 | Biometra (Göttingen, Germany) | 042-590 | |
| RotiBlock | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | A151.4 | |
| Roti-Load 1 (4x) | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | K929.3 | |
| Rotiphorese Gel 30 (37.5:1) | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 3029.1 | |
| RPMI 1640 | Lonza (Basel, Switzerland) | 12-167F | |
| Sodium dodecyl Sulfate (SDS) | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 2326.2 | |
| Thermomixer comfort | Eppendorf (Hamburg, Germany) | 5355 000.011 | |
| TNF-α (10 μg/mL) | Peprotech (Hamburg, Germany) | 300-01A | |
| Tris | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 4855.3 | |
| Trypan blue solution (0.4 %) | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | T8154 | |
| Tween 20 | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 9127.1 | |
| Whatman 0.2 μm nitrocellulose membrane | GE Healthcare (Solingen, Germany) | 10600001 | |
| WhatmanTM Chromatography Paper 3 mm Chr | Fisher Scientific GmbH (Schwerte, Germany) | 3030917 |
References
- Chapuis, F., Rosenzwajg, M., Yagello, M., Ekman, M., Biberfeld, P., Gluckman, J. C. Differentiation of human dendritic cells from monocytes in vitro. European Journal of Immunology. 27 (2), 431-441 (1997).
- Kummer, M., et al. Herpes simplex virus type 1 induces CD83 degradation in mature dendritic cells with immediate-early kinetics via the cellular proteasome. Journal of Virology. 81 (12), 6326-6338 (2007).
- Kruse, M., et al. Mature dendritic cells infected with herpes simplex virus type 1 exhibit inhibited T-cell stimulatory capacity. Journal of Virology. 74 (15), 7127-7136 (2000).
- Salio, M., Cella, M., Suter, M., Lanzavecchia, A. Inhibition of dendritic cell maturation by herpes simplex virus. European Journal of Immunology. 29 (10), 3245-3253 (1999).
- Prechtel, A. T., et al. Infection of mature dendritic cells with herpes simplex virus type 1 dramatically reduces lymphoid chemokine-mediated migration. Journal of General Virology. 86, Pt 6 1645-1657 (2005).
- Theodoridis, A. A., Eich, C., Figdor, C. G., Steinkasserer, A. Infection of dendritic cells with herpes simplex virus type 1 induces rapid degradation of CYTIP, thereby modulating adhesion and migration. Blood. 118 (1), 107-115 (2011).
- Cohrs, R. J., Gilden, D. H. Human herpesvirus latency. Brain Pathology. 11 (4), 465-474 (2001).
- Grinde, B. Herpesviruses: latency and reactivation - viral strategies and host response. Journal of Oral Microbiology. 5, (2013).
- Whitley, R. J., Roizman, B. Herpes simplex virus infections. The Lancet. 357 (9267), 1513-1518 (2001).
- Turan, A., et al. Autophagic degradation of lamins facilitates the nuclear egress of herpes simplex virus type 1. The Journal of Cell Biology. 218 (2), 508-523 (2019).
- Takeshige, K., Baba, M., Tsuboi, S., Noda, T., Ohsumi, Y. Autophagy in yeast demonstrated with proteinase-deficient mutants and conditions for its induction. The Journal of Cell Biology. 119 (2), 301-311 (1992).
- Yin, Z., Pascual, C., Klionsky, D. J. Autophagy: machinery and regulation. Microbial Cell. 3 (12), 588-596 (2016).
- Bodemann, B. O., et al. RalB and the exocyst mediate the cellular starvation response by direct activation of autophagosome assembly. Cell. 144 (2), 253-267 (2011).
- Bjorkoy, G., et al. p62/SQSTM1 forms protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect on huntingtin-induced cell death. The Journal of Cell Biology. 171 (4), 603-614 (2005).
- Kabeya, Y., et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. The EMBO Journal. 19 (21), 5720-5728 (2000).
- Kabeya, Y., Mizushima, N., Yamamoto, A., Oshitani-Okamoto, S., Ohsumi, Y., Yoshimori, T. LC3, GABARAP and GATE16 localize to autophagosomal membrane depending on form-II formation. Journal of Cell Science. 117, Pt 13 2805-2812 (2004).
- Pankiv, S., et al. p62/SQSTM1 binds directly to Atg8/LC3 to facilitate degradation of ubiquitinated protein aggregates by autophagy. The Journal of Biological Chemistry. 282 (33), 24131-24145 (2007).
- Korolchuk, V. I., Rubinsztein, D. C. Regulation of autophagy by lysosomal positioning. Autophagy. 7 (8), 927-928 (2011).
- Li, Y., et al. A cell-based quantitative high-throughput image screening identified novel autophagy modulators. Pharmacological Research. 110, 35-49 (2016).
- Pampaloni, F., et al. A Novel Cellular Spheroid-Based Autophagy Screen Applying Live Fluorescence Microscopy Identifies Nonactin as a Strong Inducer of Autophagosomal Turnover. SLAS Discovery. 22 (5), 558-570 (2017).
- Deng, Y., Zhu, L., Cai, H., Wang, G., Liu, B. Autophagic compound database: A resource connecting autophagy-modulating compounds, their potential targets and relevant diseases. Cell Proliferation. 51 (3), 12403 (2018).
- Liu, J., et al. Beclin1 controls the levels of p53 by regulating the deubiquitination activity of USP10 and USP13. Cell. 147 (1), 223-234 (2011).
- Mauvezin, C., Neufeld, T. P. Bafilomycin A1 disrupts autophagic flux by inhibiting both V-ATPase-dependent acidification and Ca-P60A/SERCA-dependent autophagosome-lysosome fusion. Autophagy. 11 (8), 1437-1438 (2015).
- Yoshimori, T., Yamamoto, A., Moriyama, Y., Futai, M., Tashiro, Y. Bafilomycin A1, a specific inhibitor of vacuolar-type H(+)-ATPase, inhibits acidification and protein degradation in lysosomes of cultured cells. Journal of Biological Chemistry. 266 (26), 17707-17712 (1991).
- Gerer, K. F., Hoyer, S., Dorrie, J., Schaft, N. Electroporation of mRNA as Universal Technology Platform to Transfect a Variety of Primary Cells with Antigens and Functional Proteins. Methods in Molecular Biology. 1499, 165-178 (2017).
- Prechtel, A. T., Turza, N. M., Theodoridis, A. A., Steinkasserer, A. CD83 knockdown in monocyte-derived dendritic cells by small interfering RNA leads to a diminished T cell stimulation. The Journal of Immunology. 178 (9), 5454-5464 (2007).
- Pfeiffer, I. A., et al. Leukoreduction system chambers are an efficient, valid, and economic source of functional monocyte-derived dendritic cells and lymphocytes. Immunobiology. 218 (11), 1392-1401 (2013).
- Villadangos, J. A., Heath, W. R. Life cycle, migration and antigen presenting functions of spleen and lymph node dendritic cells: limitations of the Langerhans cells paradigm. Seminars in Immunology. 17 (4), 262-272 (2005).
- Lechmann, M., Berchtold, S., Hauber, J., Steinkasserer, A. CD83 on dendritic cells: more than just a marker for maturation. Trends in Immunology. 23 (6), 273-275 (2002).
- Yang, Y. P., et al. Application and interpretation of current autophagy inhibitors and activators. Acta Pharmacologica Sinica. 34 (5), 625-635 (2013).
- Redmann, M., et al. Inhibition of autophagy with bafilomycin and chloroquine decreases mitochondrial quality and bioenergetic function in primary neurons. Redox Biology. 11, 73-81 (2017).
- Yan, Y., et al. Bafilomycin A1 induces caspase-independent cell death in hepatocellular carcinoma cells via targeting of autophagy and MAPK pathways. Scientific Reports. 6, 37052 (2016).
- Hale, C. M., et al. Identification of modulators of autophagic flux in an image-based high content siRNA screen. Autophagy. 12 (4), 713-726 (2016).
- Lipinski, M. M., et al. A genome-wide siRNA screen reveals multiple mTORC1 independent signaling pathways regulating autophagy under normal nutritional conditions. Developmental Cell. 18 (6), 1041-1052 (2010).
- Orvedahl, A., et al. Image-based genome-wide siRNA screen identifies selective autophagy factors. Nature. 480 (7375), 113-117 (2011).
- Staskiewicz, L., Thorburn, J., Morgan, M. J., Thorburn, A. Inhibiting autophagy by shRNA knockdown: cautions and recommendations. Autophagy. 9 (10), 1449-1450 (2013).
- Lee, I. H., et al. Atg7 modulates p53 activity to regulate cell cycle and survival during metabolic stress. Science. 336 (6078), 225-228 (2012).
- Fremont, S., Gerard, A., Galloux, M., Janvier, K., Karess, R. E., Berlioz-Torrent, C. Beclin-1 is required for chromosome congression and proper outer kinetochore assembly. EMBO Reports. 14 (4), 364-372 (2013).
- Bestebroer, J., V'kovski, P., Mauthe, M., Reggiori, F. Hidden behind autophagy: the unconventional roles of ATG proteins. Traffic. 14 (10), 1029-1041 (2013).
- Galluzzi, L., Kroemer, G. Common and divergent functions of Beclin 1 and Beclin 2. Cell Research. 23 (12), 1341-1342 (2013).
