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Genetics

कार्डियोटॉक्सिन चोट और विवो में स्व-वितरण siRNA के इंजेक्शन द्वारा कंकाल स्नायु पुनर्जनन के दौरान सैटेलाइट सेल समारोह का विश्लेषण

Published: September 18, 2019 doi: 10.3791/60194
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Leibniz-Institute on Aging - Fritz-Lipmann-Institute
* These authors contributed equally

Summary

हम कंकाल की मांसपेशियों की कार्डियोटॉक्सिन मध्यस्थता चोट और एक आत्म देने siRNA के इंजेक्शन का उपयोग करके उपग्रह कोशिकाओं में एक विशिष्ट जीन के कार्यात्मक नुकसान की जांच करने के लिए एक विवो विधि में वर्णन.

Abstract

कंकाल की मांसपेशी चोट के बाद पुनर्जीवित करने के लिए एक विशाल क्षमता के पास. इस प्रक्रिया को मुख्य रूप से मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं द्वारा संचालित है, यह भी उपग्रह कोशिकाओं कहा जाता है. सैटेलाइट कोशिकाओं प्रतिलेखन कारक Pax7 की अभिव्यक्ति और आराम कंकाल की मांसपेशी में बेसल पटल के नीचे उनके स्थान की विशेषता है. चोट पर, उपग्रह कोशिकाओं को सक्रिय हो, स्वयं नवीनीकरण या भेदभाव से गुजरना या तो नए मायोफाइबर फार्म या क्षतिग्रस्त लोगों के साथ फ्यूज करने के लिए. विवो में उपग्रह कोशिकाओं की कार्यक्षमता कंकाल की मांसपेशियों के एक cardiotoxin आधारित चोट मॉडल का उपयोग कर जांच की जा सकती है. कंकाल की मांसपेशी के पुनर्जनन के दौरान एक जीन के समारोह का अध्ययन करने के लिए, ट्रांसजेनिक माउस मॉडल ज्यादातर उपयोग किया जाता है. यहाँ, हम ट्रांसजेनिक चूहों के लिए एक वैकल्पिक विधि प्रस्तुत, पुनर्जनन के दौरान उपग्रह कोशिकाओं में जीन समारोह की जांच करने के लिए, उदा, मामलों में जहां ट्रांसजेनिक चूहों उपलब्ध नहीं हैं. हम एक विशिष्ट कंकाल की मांसपेशियों के carditoxin मध्यस्थता चोट regenerating मांसपेशी जो तो अन्य कोशिकाओं के बीच उपग्रह कोशिकाओं द्वारा लिया जाता है में एक आत्म देने siRNA के इंजेक्शन के साथ गठबंधन. इस तरह, हम ट्रांसजेनिक चूहों की आवश्यकता के बिना शारीरिक स्थितियों के तहत पुनर्जनन के दौरान उपग्रह कोशिकाओं में जीन समारोह का विश्लेषण करने के लिए एक विधि प्रदान करते हैं।

Introduction

कंकाल की मांसपेशी शरीर का सबसे बड़ा ऊतक है जो स्वैच्छिक चलन को सक्षम करने वाले कुल शरीर के वजन का लगभग 40% का प्रतिनिधित्व करता है। कंकाल की मांसपेशी के ऊतक वास्तुकला मुख्य रूप से postmitotic से बना है, टर्मिनल विभेदित, multinucleated myofibers के रूप में के रूप में अच्छी तरह से परिधीय तंत्रिका तंत्र से विभिन्न अन्य कोशिकाओं, संवहनी प्रणाली, और अंतरालीय कोशिकाओं1. महत्वपूर्ण बात, कंकाल की मांसपेशी को पुनर्जीवित करने और चोट या क्षति2पर समारोह बहाल करने के लिए एक जबरदस्त क्षमता है। यह प्रक्रिया ऊतक निवासी मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं पर निर्भर करती है जिसे उपग्रह कोशिकाएं3,4 भी कहा जाताहै. उपग्रह कोशिकाओं मायोफाइबर और बेसल पटल के बीच स्थित हैं और प्रतिलेखन कारक Pax75,6,7की अभिव्यक्ति की विशेषता है . होमोस्टेटिक परिस्थितियों के तहत, उपग्रह कोशिकाएं शांत होती हैं लेकिन दर्दनाक चोट के कारण सक्रिय हो जाती हैं, जैसे, सनकी व्यायाम के माध्यम से या प्रायोगिक रूप से सांप विष कार्डियोटॉक्सिन6,8के इंजेक्शन के माध्यम से। एक बार सक्रिय, Pax7 सकारात्मक उपग्रह कोशिकाओं सह एक्सप्रेस MyoD और Myf5, जो स्टेम कोशिकाओं myogenic भेदभाव करने के लिए प्रतिबद्ध है. सैटेलाइट सेल जो प्रतिबद्धता कारकों के विनियमन का विरोध करते हैं, वे अपनी स्टेमनेस क्षमता को बनाए रखेंगे और भविष्य की मांगों के लिए स्टेम सेल पूल को भरने के लिए शांत हो जाएंगे। myogenic जनक पूल के विस्तार के बाद, ट्रांसक्रिप्शनल नेटवर्क Myogenin जैसे भेदभाव कारकों द्वारा सक्रिय कर रहे हैं सेल चक्र से बाहर निकलें और टर्मिनल भेदभाव आरंभ करने के लिए. ये मायोप्रोजेनिटर्स तो एक दूसरे के लिए फ्यूज या मौजूदा myofibers myonuclei योगदान करने के लिए मायोन्यूक्लियर डोमेन के आकार को बनाए रखने के लिए. मायोफाइबर्स मायोसिन हैवी चेन जैसे टर्मिनल मांसपेशी विभेद जीन ों को व्यक्त करते हैं। अंत में, नवगठित मायोफाइबर बढ़ते हैं और कंकाल की मांसपेशी9,10की कार्यात्मक इकाइयों का निर्माण करने के लिए परिपक्व होते हैं।

कंकाल की मांसपेशी के पुनर्जनन मांसपेशियों की बीमारियों या उम्र बढ़ने सहित विभिन्न स्थितियों से प्रभावित किया जा सकताहै 11,12, हल्के हानि से जीवन की धमकी की स्थिति को लेकर, जैसे, Duchenne मांसपेशियों dystrophy13 में , 14. इसलिए , पुनर्योजी चिकित्सा का उद्देश्य उपग्रह सेल फंक्शन15,16को लक्षित करके अपनी अंतर्निहित पुनर्योजी शक्ति का उपयोग करके क्षतिग्रस्त या खराब कंकाल ीय ऊतकों को बहाल करना है . अपनी पूरी क्षमता का उपयोग करने के लिए कंकाल की मांसपेशी के पुनर्जनन के दौरान उनके अंतर्जात आला में उपग्रह कोशिकाओं की एक व्यापक समझ की आवश्यकता है. हालांकि प्रयोगात्मक दृष्टिकोण उनके मायोफाइबर17के निकट उपग्रह कोशिकाओं को अलग करने के लिए मौजूद हैं, उनके पर्यावरण के साथ उपग्रह कोशिकाओं के सेलुलर और प्रणालीगत बातचीत की पूरी जटिलता केवल विवो में recapitulated किया जा सकता है. इस संबंध में, कंकाल की मांसपेशी पुनर्जनन के बारे में महान ज्ञान माउस चोट मॉडल2,18का उपयोग कर प्राप्त किया गया है.

यहाँ हम एक विशिष्ट प्रयोगात्मक माउस चोट मॉडल परिचय के लिए कार्डियोटॉक्सिन के स्टेम सेल मध्यस्थता पुनर्जनन का अध्ययन करने के लिए प्रेरित tibialis पूर्वकाल मांसपेशी vivo में. कार्डियोटॉक्सिन, एक सांप व्युत्पन्न साइटोलिटिक विष जो मायोफाइबर depolarization और नेक्रोसिस का कारण बनता है, tibialis पूर्वकाल मांसपेशी में इंजेक्ट किया जाता है, जो बदले में ऊतक अध: पतन के बाद ट्रिगर करेगा। तीव्र पुनर्जनन के दौरान जीन के समारोह का विश्लेषण करने के लिए, आत्म वितरण siRNAs चोट के बाद 3 दिन में इंजेक्शन हैं, उपग्रह सेल विस्तार के शिखर पर. प्रायोगिक जानवरों को विभिन्न समय बिंदुओं पर बलिदान किया जाता है और टिबियालिस पूर्वकाल की मांसपेशियों को एकत्र किया जाता है। विच्छेदित पेशियां जमे हुए हैं और आगे क्रायो-सेक्शनिंग के लिए संसाधित की जाती हैं। इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग फिर पुनर्जनन के मार्करों का विश्लेषण करने के लिए किया जाता है। इस विधि जंगली प्रकार चूहों का उपयोग कर कंकाल की मांसपेशियों के उपग्रह सेल संचालित पुनर्जनन के दौरान एक जीन के समारोह की जांच के लिए अनुमति देता है.

Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं थ्रिंगर Landesamt f]r Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz के पशु कल्याण विभाग द्वारा अनुमोदित किया गया (03-048/ TLV; बुरा Langensalza, जर्मनी).

1. कार्डियोटॉक्सिन प्रेरित मांसपेशी चोट

नोट: राष्ट्रीय पशु कल्याण अधिनियम के अनुसार और उपयुक्त एसेप्टिक परिस्थितियों के तहत जीवित चूहों से जुड़े सभी प्रयोगों का प्रदर्शन करें। इसके अलावा, पशुओं का त्याग राष्ट्रीय पशु कल्याण अधिनियम के अनुसार किया जाना चाहिए।

  1. इनहेलेशन संज्ञाहरण और 70% इथेनॉल के साथ सर्जरी क्षेत्र के लिए इस्तेमाल किया इनहेलेशन बॉक्स को संक्रमित। हीटिंग पैड जहां सर्जरी जगह ले जाएगा पर एक बाँझ शल्य चिकित्सा कपड़े रखें।
  2. हीटिंग पैड को 37 डिग्री सेल्सियस पर चालू करें।
  3. सर्जरी शुरू करने से 15 मिनट पहले एनाल्जेसिक (उदा., 1 मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन को कम करने के लिए) 15 मिनट का समय दिया जाता है।
    नोट: एक विशिष्ट प्रयोग के लिए, चूहों जो कम से कम 6 सप्ताह पुराने हैं का उपयोग करें, सेक्स मिलान और एक अच्छा सामान्य शारीरिक हालत में.
  4. कार्डियोटॉक्सिन समाधान (20 डिग्री सेल्सियस में 0ण्9 % NaCl) तैयार करें, समाधान को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. कार्डियोटॉक्सिन समाधान को कमरे के तापमान (आरटी) तक पहुंचने की अनुमति दें।
  6. माउस को इनहेलेशन बॉक्स में स्थानांतरित करें और आइसोलुरेन के साथ संज्ञाहरण को प्रेरित करें (शुद्ध ऑक्सीजन में 3.5 - 5 % की शुरुआत)। एक अंगुली चुटकी के लिए प्रतिक्रिया की कमी के साथ संज्ञाहरण की गहराई की जाँच करें.
  7. माउस को एक साफ कागज तौलिया पर रखें और नाक मास्क के साथ संज्ञाहरण बनाए रखें (1.5 - शुद्ध ऑक्सीजन में 3 % आइसोफ्लुरेन)। कपाल निचले पैर के इंजेक्शन क्षेत्र दाढ़ी (नको से पंजा करने के लिए, चित्र 1A). सभी अत्यधिक ढीले बालों को हटा दें।
    नोट: कमरे में शेविंग और इंजेक्शन क्षेत्र को शारीरिक रूप से अलग करने से इंजेक्शन के लिए अधिक बाँझ स्थितियां प्रदान होंगी।
  8. एक बाँझ शल्य चिकित्सा कपड़े के साथ कवर हीटिंग पैड पर पार्श्व recumbent स्थिति में माउस प्लेस और एक नाक मुखौटा के साथ संज्ञाहरण बनाए रखने (1.5 - 3% शुद्ध ऑक्सीजन में आइसोफ्लुरेन).
  9. 70% इथेनॉल के साथ कपाल निचले पैर (घुटने से पंजा करने के लिए) के इंजेक्शन क्षेत्र को संक्रमित।
  10. संज्ञाहरण की एक पर्याप्त गहराई सुनिश्चित करने के लिए इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन शुरू करने से पहले एक टो चुटकी प्रदर्शन करें।
  11. एक 29 गेज सुई के साथ एक इंसुलिन सिरिंज का उपयोग कर tibialis पूर्वकाल मांसपेशियों में 50 डिग्री एल कार्डियोटॉक्सिन (20 डिग्री एम 0.9% NaCl में) इंजेक्शन। सबसे पहले, त्वचा सिर्फ घुटने के distal छेद.
  12. मांसपेशियों में सुई को पूरी तरह से सम्मिलित करें (टिबिया हड्डी के लिए मायोफाइबर अभिविन्यास/समानांतर में) और धीरे-धीरे कार्डियोटॉक्सिन इंजेक्ट करें (10-20 s) मांसपेशियों की पूरी लंबाई के साथ, जबकि सुई आगे और पीछे ले जा तेरहने के लिए कार्डियोटॉक्सिन का एक भी वितरण की अनुमति देने के लिए पूरे tibialis पूर्वकाल मांसपेशियों को घायल (चित्र 1बी, सी) .
    नोट: केवल एक पैर से tibialis पूर्वकाल मांसपेशी घायल, contralateral tibialis पूर्वकाल मांसपेशी एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए निर्धारित कर सकते हैं कि कंकाल की मांसपेशियों रोग कार्डियोटॉक्सिन चोट से पहले प्रभावित नहीं थे.
  13. माउस को एक हीटिंग पैड पर रखा पिंजरे में वापस स्थानांतरण और वसूली की प्रक्रिया की निगरानी जब तक जानवर होश में है और ambulatory हो जाता है.
    नोट: चूहों केवल एक मामूली लंगड़ा दिखाएगा. यदि चूहे भारी लंगड़ा कर रहे हैं और पैर पर बिल्कुल भी वजन नहीं डाल, माउस बलिदान.
  14. निम्नलिखित 2 दिनों के दौरान एनाल्जेसिक प्रशासन (उदा., 1 मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन meloxicam subcutaneously, हर 24 ज) और उन्हें एक साप्ताहिक आधार पर निगरानी.

2. Regenerating Tibialis पूर्व मांसपेशी में स्वयं देने siRNA का इंजेक्शन (दिन में 3 पोस्ट कार्डियोटॉक्सिन चोट)

  1. निर्माता के निर्देश के अनुसार 0.9% NaCl (अंतिम सांद्रता 2 डिग्री सेल्सियस) में siRNA (उदा., siRNA स्मार्ट पूल) ressson द्वारा siRNA समाधान तैयार करें।
    नोट: siRNA रासायनिक कोशिकाओं द्वारा निष्क्रिय तेज की सुविधा और यह nuclease गिरावट से बचाने के लिए संशोधित किया गया है. कोई transfection अभिकर्मकों की जरूरत है, जिससे विषाक्तता को कम करने. एक ही जीन को लक्षित चार स्वतंत्र siRNA दृश्यों के एक स्मार्ट पूल का उपयोग कर नीचे दस्तक दक्षता बढ़ जाती है.
  2. -20 डिग्री सेल्सियस पर siRNA स्टोर और सर्जरी के कमरे में बर्फ पर स्थानांतरित।
  3. इनहेलेशन संज्ञाहरण और 70% इथेनॉल के साथ सर्जरी क्षेत्र के लिए इस्तेमाल किया इनहेलेशन बॉक्स को संक्रमित। हीटिंग पैड जहां सर्जरी जगह ले जाएगा पर एक बाँझ शल्य चिकित्सा कपड़े रखें।
  4. हीटिंग पैड को 37 डिग्री सेल्सियस पर चालू करें।
  5. इनहेलेशन बॉक्स में माउस स्थानांतरण और isoflurane के साथ संज्ञाहरण प्रेरित (प्रारंभ 3.5 - शुद्ध ऑक्सीजन में 5%). एक अंगुली चुटकी के लिए प्रतिक्रिया की कमी के साथ संज्ञाहरण की गहराई की जाँच करें.
  6. एक बाँझ शल्य चिकित्सा कपड़े के साथ कवर हीटिंग पैड पर पार्श्व recumbent स्थिति में माउस प्लेस और एक नाक मुखौटा के साथ संज्ञाहरण बनाए रखने (1.5 - 3% शुद्ध ऑक्सीजन में आइसोफ्लुरेन).
  7. कपाल निचले पैर के इंजेक्शन क्षेत्र को संक्रमित करें ( घुटने से पंजा तक)।
  8. संज्ञाहरण की एक पर्याप्त गहराई सुनिश्चित करने के लिए इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन शुरू करने से पहले एक टो चुटकी प्रदर्शन करें।
  9. 50 डिग्री सेल्सियस सिराना समाधान (0.9% NaCl में 100 डिग्री ग्राम कुल तक; लक्ष्य जीन के खिलाफ निर्देशित; घायल tibialis पूर्वकाल मांसपेशी में एक 29 जी सुई के साथ इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करके तले हुए siRNA का उपयोग करें)। सबसे पहले, त्वचा को घुटने के बस डिस्टल में छेद करें, फिर सुई को टिब्बीलिस पूर्वकाल की मांसपेशियों में डालें।
  10. मांसपेशियों में सुई पूरी तरह से डालें (टिबिया हड्डी के लिए मायोफाइबर अभिविन्यास/समानांतर में) और सुई को आगे-पीछे ले जाते समय मांसपेशियों की पूरी लंबाई के साथ धीरे-धीरे (10 - 20 s) इंजेक्ट करें ताकि सुई को आगे-पीछे ले जाया जा सके ताकि साथ-साथ siRNA का भी वितरण किया जा सके पूरे tibialis पूर्वकाल मांसपेशी.
  11. माउस को एक हीटिंग पैड पर रखा पिंजरे में वापस स्थानांतरण और वसूली की प्रक्रिया की निगरानी जब तक जानवर होश में है और ambulatory हो जाता है.
    नोट: Analgesia जरूरी siRNA के इंजेक्शन के बाद नहीं है.

3. Tibialis पूर्व मांसपेशी का विच्छेदन

  1. ठंड समाधान तैयार (2 भागों OCT यौगिक और 1 भाग 30% deionized पानी में sucrose) कम से कम 12 ज उपयोग से पहले हवा के बुलबुले से बचने के लिए.
  2. एक पेंसिल के चारों ओर एक एल्यूमीनियम पन्नी लपेटकर ठंड मोल्ड तैयार करें और इसे टेप के साथ सील करें। यह महत्वपूर्ण है कि मोल्ड के नीचे एक भी, बंद सतह प्रदान करता है.
    नोट: छोटे ठंड मोल्डों ठंड कलाकृतियों से बचने मांसपेशियों की तेजी से ठंड की अनुमति देते हैं।
  3. माउस बलिदान, उदा, सीओ2 साँस लेना द्वारा, पुनर्जनन के संबंधित समय बिंदु पर और 70% इथेनॉल के साथ पूरे माउस और विच्छेदन उपकरण स्प्रे.
    नोट: ग्रीवा अव्यवस्था लागू किया जा सकता है, इसके अलावा, पैर में अत्यधिक रक्तस्राव से बचने के लिए जब tibialis पूर्वकाल मांसपेशियों को अलग.
  4. अतिरिक्त ठीक तेज कैंची के साथ टखने पर त्वचा को काटने से घायल Hindlimb से फर और त्वचा निकालें (कटिंग बढ़त: 13 मिमी) और forceps का उपयोग कर घुटने की ओर त्वचा खींच.
  5. टखने पर tibialis पूर्वकाल कण्डरा का पर्दाफाश करने के लिए, पैर की ओर शेष त्वचा खींच या तेज कैंची के साथ काट दिया.
    नोट: माउस बेहतर निर्धारण की अनुमति देने के लिए एक समर्थन बोर्ड पर पिन किया जा सकता है।
  6. टिबियालिस पूर्वकाल की मांसपेशी को काटने से पहले, फासिया को ठीक संदंश (डमोंट 5 या 7, सीधे या घुमावदार) का उपयोग करके निकालें। घायल पैर के टखने पर टिबिया हड्डी के बगल में फासिया के माध्यम से बंद संदंश को चुटकी लें (चित्र 2क) . घुटने की ओर बल को ले जाएँ जिससे फासिया फाड़और टिब्बिलिस पूर्वकाल की मांसपेशी को उजागर करें (चित्र 2ख) .
  7. tibialis पूर्वकाल मांसपेशियों को अलग करने के लिए, distal कण्डरा का पर्दाफाश और यह ठीक संदंश के साथ हड़पने (Dumont 7, घुमावदार). वसंत कैंची का उपयोग कर कण्डरा कट (कट धार: 5 मिमी, टिप व्यास: 0.35 मिमी) और मांसपेशियों को खींच (यह कण्डरा पर पकड़) घुटने की ओर.
  8. tibialis पूर्वकाल मांसपेशियों फसल के लिए, तेज कैंची का उपयोग कर के रूप में संभव के रूप में घुटने के करीब के रूप में कटौती।
  9. ठंड से पहले, सीधे कैंची के साथ मांसपेशियों के मध्य पेट क्षेत्र में tibialis पूर्वकाल मांसपेशियों को बराबर आकार के दो हिस्सों में काट के लिए मध्य पेट क्षेत्र के विश्लेषण की अनुमति है (चित्र 2ब्, डी).
  10. ठंड घोल के साथ ठंड मोल्ड को आधे रास्ते में भर लें।
  11. मध्य पेट क्षेत्र मोल्ड के नीचे का सामना करना पड़ के साथ ठंड मोल्ड में tibialis पूर्वकाल मांसपेशियों के दो हिस्सों डालें (चित्र 2E) . सुनिश्चित करें कि tibialis पूर्वकाल आधा मांसपेशियों की tipping से बचने के लिए ठंड मोल्ड की दीवार के खिलाफ झुकाव एक ईमानदार स्थिति में डाला जाता है।
    नोट: अधिक ठंड समाधान मोल्ड में है, अब ठंड ले जाएगा, इस प्रकार cryo-कलाकृतियों का खतरा बढ़.
  12. बलप्स का उपयोग करके हिमसंच को पकड़कर इसे अर्धमार्गी नाइट्रोजन में स्थानांतरित कर दें (चित्र 2 च )। सुनिश्चित करें कि कोई तरल नाइट्रोजन ठंड की प्रक्रिया के दौरान ठंड मोल्ड में प्रवेश कर रहा है.
  13. ठंड की प्रक्रिया का निरीक्षण करें, ठंड मध्यम पारदर्शी से सफेद करने के लिए रंग बदलता है और ठोस हो जाता है। कुछ सेकंड के लिए तरल नाइट्रोजन में ठंड मोल्ड पनडुब्बी और एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर के लिए या भविष्य के प्रसंस्करण के लिए बर्फ सूखी करने के लिए ठंड मोल्ड हस्तांतरण।
  14. आगे के उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर ठंड मोल्ड में जमे हुए मांसपेशियों को स्टोर करें।
    नोट: ठंड मोल्ड 24-वेल प्लेटों या 1.5 एमएल प्रतिक्रिया ट्यूबों में लेबलिंग और संगठित भंडारण की अनुमति में अच्छी तरह से फिट होते हैं।
  15. आगे के उपयोग के लिए ठंड मोल्ड में मांसपेशियों को संभाल हमेशा सूखी बर्फ पर.

4. Regenerating Tibialis पूर्व मांसपेशी के Cryosectioning

  1. अनुभाग शुरू करने से पहले, क्रायोस्टैट के कक्ष के तापमान को -21 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें, ऑब्जेक्ट का तापमान -20 डिग्री सेल्सियस और काटने की मोटाई 10, 12 या 14 डिग्री (भविष्य के अनुप्रयोगों के आधार पर)(चित्र 3A) पर सेट करें।
  2. cryostat में ठंड मोल्ड में मांसपेशियों के नमूने स्थानांतरण और यह कई मिनट के लिए तापमान को समायोजित करते हैं। इस समय के दौरान, माइक्रोस्कोप स्लाइड लेबल.
  3. cryostat के अंदर precooled संदंश का उपयोग कर एम्बेडेड मांसपेशियों के आसपास पन्नी निकालें. नमूने को छूने से बचें क्योंकि क्रायोमीडियम आसानी से थपथपाना शुरू कर देते हैं।
  4. tibialis पूर्वकाल मांसपेशियों के मध्य पेट क्षेत्र के साथ नमूना माउंट cryostat के धातु नमूना धारक पर ऊपर की ओर निर्देशित cryomedium का उपयोग कर. यह सुनिश्चित करता है कि मांसपेशियों के काटने साइट (मोल्ड के नीचे) प्रयोगकर्ता का सामना करना पड़ रहा है.
  5. अनुभागिंग तंत्र में घुड़सवार नमूना के साथ नमूना धारक डालें।
    नोट: नमूना की उचित अनुभागिंग सुनिश्चित करने के लिए, शुरू करने से पहले एक नया ब्लेड का उपयोग करें।
  6. सबसे पहले, नमूना ब्लॉक ट्रिम (30 डिग्री मी) एक भी अनुभागीय विमान पाने के लिए और मांसपेशियों के संबंधित क्षेत्र तक पहुँचने के लिए (चित्र 3B)।
  7. trimming के बाद, संबंधित मोटाई के लगातार वर्गों में कटौती (उदा., 14 डिग्री मी).
  8. अनुभाग पर नीचे स्लाइड चेहरा पकड़े हुए माइक्रोस्कोप ग्लास स्लाइड पर वर्गों लीजिए। अनुभाग स्लाइड में संलग्न है (चित्र 3C).
  9. आगे का उपयोग करें या सीधे इम्यूनोफ्लोरेसी या इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए उपयोग करने तक -80 डिग्री सेल्सियस या -20 डिग्री सेल्सियस पर वर्गों को स्टोर करें।

5. पुनर्जनन के मार्करों के लिए इम्यूनोस्टेनिंग

  1. एक आर्द्र कक्ष में सभी आगे कदम प्रदर्शन.
  2. संक्षेप में, कमरे के तापमान पर वर्गों को बराबर कर तेरी।
  3. आरटी पर 5 मिनट के लिए 2% पीएफए (पीबीएस, पीएच 7.4) प्रति स्लाइड के 1 एमएल के साथ वर्गों को ठीक करें।
  4. संबंधित अपशिष्ट कंटेनर में डालने से 2% पीएफए समाधान निकालें।
  5. आरटी में 5 मिनट के लिए पीबीएस (पीएच 7.4) के 1 एमएल (पीएच 7.4) के साथ 3 बार धोएं।
  6. इसे अपशिष्ट कंटेनर में डालने से पीबीएस निकालें।
  7. प्रति स्लाइड, 10 मिनट के लिए permebilization समाधान (0.1% Triton X-100, 0.1 M Glycine PBS पीएच 7.4) के लिए 1 लाख टन जोड़ें।
  8. इसे अपशिष्ट कंटेनर में डालने से permebilization समाधान निकालें.
  9. प्रति स्लाइड पर ब्लॉकिंग समाधान (M.O.M. 1:40 में PBS pH 7.4) के 150 $L जोड़ें और कवरस्लिप के साथ कवर करें। आरटी में 1 एच के लिए इनक्यूबेट।
  10. कवरस्लिप और अवरुद्ध समाधान निकालें, प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान [PAX7, DSHB, माउस IgG1, undiluted या devMHC, DSHB, undiluted, माउस IgG1and लेमिन (रैबिट, 1:1,000) प्रति स्लाइड के 100 डिग्री सेल्सियस लागू होते हैं। कवरस्लिप के साथ कवर करें। इनक्यूबेट ओ/एन (रात भर) 4 डिग्री सेल्सियस पर।
    नोट: प्राथमिक एंटीबॉडी को छोड़ कर एक नियंत्रण धुंधला प्रदर्शन, बजाय समाधान अवरुद्ध के साथ अनुभाग incubate.
  11. आरटी में 5 मिनट के लिए पीबीएस (पीएच 7.4) के 1 एमएल (पीएच 7.4) के साथ 3 बार धोएं।
  12. इसे अपशिष्ट कंटेनर में डालने से पीबीएस निकालें।
  13. माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के 100 $L जोड़ें (एलेक्सा फ्लोर 546 बकरी विरोधी माउस IgG1 और Alexa Fluor 488 गधा विरोधी rabbit IgG समाधान अवरुद्ध में, 1: 1,000) प्रति स्लाइड और कवर पर्ची के साथ कवर. आरटी में 1 एच के लिए इनक्यूबेट।
  14. अंधेरे में स्लाइड्स को इनक्यूबेट करें, उदाहरण के लिए, एक एल्यूमीनियम पन्नी का उपयोग करने के लिए कवर या एक काले humidified कक्ष का उपयोग करें.
    नोट: अब से सभी चरणों पर कम प्रकाश की स्थिति में प्रदर्शन किया जाना चाहिए क्योंकि कुछ माध्यमिक एंटीबॉडी प्रकाश संवेदनशील हैं.
  15. कवरस्लिप और सेकेंडरी एंटीबॉडी समाधान निकालें।
  16. आरटी में 5 मिनट के लिए पीबीएस (पीएच 7.4) के 1 एमएल (पीएच 7.4) के साथ 3 बार धोएं।
  17. इसे अपशिष्ट कंटेनर में डालने से पीबीएस निकालें।
  18. RT में 5 मिनट के लिए 10 g/mL की अंतिम सांद्रता के लिए स्लाइड प्रति समाधान के 1 एमएल जोड़कर DAPI धुंधला करें।
  19. इसे अपशिष्ट कंटेनर में डालने से DAPI धुंधला समाधान निकालें।
  20. आरटी में 5 मिनट के लिए 1 एमएल पीबीएस (पीएच 7.4) के साथ 3 बार धोएं।
  21. पूरी तरह से धोने के लिए इस्तेमाल किया पीबीएस हटा दें।
  22. लागू करें 2 - जलीय बढ़ते मध्यम की 3 बूँदें और सीधे एक नया coverslip के साथ स्लाइड को कवर.
  23. अंधेरे में आरटी पर 1 एच के लिए स्लाइड सूखी करते हैं।
  24. एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर आगे विश्लेषण जब तक अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर दाग वर्गों स्टोर.

6. हेमैटोक्सिलिन और ईओसिन दाग

  1. एक आर्द्र कक्ष में सभी आगे कदम प्रदर्शन.
  2. आरटी पर 5 मिनट के लिए 2% पीएफए (पीबीएस, पीएच 7.4) प्रति स्लाइड के 1 एमएल के साथ वर्गों को ठीक करें।
  3. संबंधित अपशिष्ट कंटेनर में डालने से 2% पीएफए समाधान निकालें।
  4. एक Coplin जार में स्लाइड स्थानांतरण.
  5. नल के पानी के साथ स्लाइड को धीरे से कुल्ला करें।
    नोट: नल पर बहुत अधिक बारी नहीं है क्योंकि कि वर्गों को नुकसान हो सकता है.
  6. स्लाइड्स को आर्द्रीकृत कक्ष में स्थानांतरित करें। तरल निकालें.
  7. 2 मिनट के लिए हेमेटॉक्सिलिन धुंधला समाधान (गिल नंबर 3) के 1 एमएल लागू करें।
  8. एक Coplin जार में स्लाइड स्थानांतरण.
  9. नल के पानी से स्लाइडकोन को तब तक धोएं जब तक कि नाभिक नीला न हो जाए।
    नोट: नल पर बहुत अधिक बारी नहीं है क्योंकि कि अपने वर्गों को नुकसान हो सकता है.
  10. स्लाइड्स को आर्द्रीकृत कक्ष में स्थानांतरित करें। तरल निकालें.
  11. Eosin Y समाधान के 1 एमएल लागू करें और 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  12. एक Coplin जार में स्लाइड स्थानांतरण.
  13. स्लाइड से आने वाले नल के पानी को जब तक स्पष्ट नहीं किया जाता है, तब तक स्लाइडको नल के पानी से धो लें।
  14. सभी तरल निकालें और स्लाइड 2 मिनट के लिए सूखी.
  15. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए उपयुक्त बढ़ते माध्यम में माउंट।

Representative Results

कार्डियोटॉक्सिन मध्यस्थता चोट से पहले और बाद में एक tibialis पूर्वकाल मांसपेशियों के एक hematoxylin और eosin (एच एंड ई) दाग का एक विशिष्ट परिणाम चित्रा 4ए, बीमें प्रस्तुत किया जाता है। नियंत्रण की मांसपेशियों में, मांसपेशियों की वास्तुकला अक्षुण्ण है जैसा कि मायोफाइबर की परिधि में नाभिक के स्थानीयकरण और मध्याश्तीय अंतरिक्ष में मोनोन्यूक्लिएड कोशिकाओं के संचय की कमी द्वारा देखा जाता है (चित्र 4क)। कार्डियोटॉक्सिन के मध्यक चोट लगने के 7 दिन बाद नए मायोफाइबर ्साार्णो का निर्माण केन्द्रत: स्थित नाभिक द्वारा चिह्नित किया जाता है (चित्र 4ठ) इसके अलावा, मोनोन्यूक्लिएड कोशिकाओं का संचय देखा जा सकता है, जिसमें ज्यादातर उपग्रह कोशिकाओं से मिलकर, लेकिन प्रतिरक्षा कोशिकाओं की तरह गैर-मायोजेनिक कोशिकाओं से भी मिलकर। पूरी मांसपेशी सभी myonuclei के केंद्रीय स्थान और पूरे मांसपेशी अनुभाग पर mononucleated कोशिकाओं के संचय की विशेषता घायल किया जाना चाहिए.

प्रगति और पुनर्जनन प्रक्रिया की सफलता की विशेषता के लिए, कई इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला पुनर्जनन के मार्करों का उपयोग किया जा सकता है। उपग्रह कोशिकाओं की संख्या का मूल्यांकन पैक्स7 के लिए धुंधला करके किया जा सकता है, उपग्रह कोशिकाओं के लिए विहित मार्कर (चित्र 4ब्, डी)। चोट लगने के तीन दिन बाद उपग्रह कोशिकाओं की संख्या बढ़ जाती है (चित्र 4D), उपग्रह कोशिकाओं को अब बेसल लेमिना के अंतर्गत स्थित नहीं हैं. पुनर्जनन प्रक्रिया का और विश्लेषण करने के लिए, नवगठित मायोफाइबर को विकासमासिन के लिए निर्देशित एंटीबॉडी के साथ दागा जा सकता है (चित्र 4E)। नवगठित मायोफाइबर केंद्र में स्थित नाभिक और विकासमासिन की एक मजबूत अभिव्यक्ति प्रदर्शित करते हैं। के रूप में मायोफाइबर परिपक्व, विकास मायोसिन की अभिव्यक्ति कम हो जाती है, मायोफाइबर का व्यास बढ़ जाती है, जबकि नाभिक मायोफाइबर की परिधि में पलायन कर रहे हैं।

पुनर्जनन की प्रक्रिया पर एक जीन के प्रभाव transgenic चूहों का उपयोग कर जांच की जा सकती है या के रूप में एक आत्म देने siRNA के इंजेक्शन द्वारा यहाँ दिखाया गया. Fluorescently लेबल आत्म वितरण तले हुए नियंत्रण siRNA चोट के बाद 3 दिन में regenerating tibialis पूर्वकाल मांसपेशी में इंजेक्ट किया गया था, समय बिंदु जब उपग्रह कोशिकाओं चोटियों के प्रसार. सिराना उपग्रह कोशिकाओं के इंजेक्शन के दो दिन बाद फ्लोरोसेंटलेबल सिराना की उपस्थिति के लिए विश्लेषण किया गया (चित्र 4 एफ) . हमने विश्लेषण किया कि कितने उपग्रह कोशिकाओं ने पुनरुत्पादक पेशी में इंजेक्शन लगाने के दो दिन बाद फ्लोरोसेंट लेबल वाले सिराना को लिया था(चित्र 5)। regenerating मांसपेशियों में सभी उपग्रह कोशिकाओं के बारे में 75% फ्लोरोसेंट siRNA लेबल के लिए सकारात्मक थे. इसके अलावा, हम निर्धारित किया है कि सभी regenerating myofibers के बारे में 74% फ्लोरोसेंट लेबल siRNA सुझाव है कि या तो regenerating myofibers के 74% siRNA ले लिया था या कि siRNA सकारात्मक उपग्रह कोशिकाओं या तो के साथ जुड़े थे के लिए सकारात्मक थे एक दूसरे को नए मायोफाइबर बनाने के लिए या पहले से ही मौजूदा regenerating myofibers के साथ कि संलयन हुआ (चित्र 5) . यह पता चलता है कि उपग्रह कोशिकाओं को स्वयं देने siRNA ले और कि siRNA कम से कम दो दिनों के लिए उपग्रह कोशिकाओं में बनी रहती है.

Figure 1
चित्रा 1: टिबियालिस पूर्वकाल की मांसपेशियों में कार्डियोटॉक्सिन का इंजेक्शन। (ए) चूहे को इस्लान द्वारा एनेस्थेटाइज किया जाता है और निचले अंग मुंडा होते हैं। (बी) एक 29 जी सुई टिबियालिस पूर्वकाल की मांसपेशी (सी) में इंजेक्ट की जाती है और कार्डियोटॉक्सिन समाधान के इंजेक्शन के दौरान टिबिया हड्डी के साथ चली जाती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: घायल tibialis पूर्वकाल मांसपेशियों के विच्छेदन और ठंड में शामिल कदम. (क) पिछले अंग की मांसपेशियों को उजागर कर रहे हैं (बी) और tibialis पूर्वकाल मांसपेशियों के आसपास फासिया मांसपेशियों को बेनकाब करने के लिए फट जाता है. (ग) पेशी को हटाने के बाद , यह मध्य पेट क्षेत्र में तेज सीधी कैंची (डी) का उपयोग करके समान आकार के दो हिस्सों में काट दिया जाता है . (ई) विच्छेदित पेशी के अर्ध भाग को एल्यूमीनियम पन्नी मोल्ड में समाविष्ट किया जाता है जो हिमविलयन से भरा होता है और तरल नाइट्रोजन (एफ) में जमे हुए होते हैं . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: उपकरण और कदम tibialis पूर्वकाल की मांसपेशियों के cryosectioning में शामिल. (अ)क्रायओस्टैट का कक्ष ताप -21 डिग्री सेल्सियस पर सेट है। (बी) ठंड समाधान में tibialis पूर्वकाल मांसपेशी नमूना धारक पर रखा जाता है. (ग) 14 डिग्री मीटर मोटाई की धाराओं को कांच की सूक्ष्मदर्शी स्लाइडों से जोड़ा जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: regenerating tibialis पूर्वकाल की मांसपेशियों के प्रतिनिधि छवियों. कार्डियोटॉक्सिन चोट (बी) से पहले (ए) और 7 दिनों के बाद टिबिएलिस पूर्वकाल की मांसपेशियों का एच एंड ई धुंधला । (ग)अननिषेक पेशी पैक्स7 पॉजीटिव (लाल में) उपग्रह कोशिकाओं में लेमिनिन (हरे रंग में) द्वारा चिह्नित बेसल लेमिनके के नीचे स्थित हैं। Nuclei DAPI (नीले रंग में) के साथ मुकाबला कर रहे हैं. Pax7 सकारात्मक कोशिकाओं को एक तीर से चिह्नित कर रहे हैं. (घ)पुनर्जनन के 10 दिनों के बाद, मायोफाइबर को केंद्रीय रूप से स्थित नाभिक (नीले रंग में) की विशेषता होती है, पैक्स7 को लाल, लाल में लाल, लाल में लैमिनिन को हरे रंग में दर्शाया जाता है। Pax7 सकारात्मक कोशिकाओं को एक तीर से चिह्नित कर रहे हैं. (ई) नवगठित मायोफाइबर्स विकासमा (लाल रंग में), हरे रंग में लेमिनि, नाभिक डीएपीआई (नीले रंग में) के साथ प्रतिक हैं। (च)फ्लोरीसेंसली लेबल्ड स्व-वितरण siRNA (siRED, लाल रंग में चित्रित) अभी भी उपग्रह कोशिकाओं में पाया जाता है (Pax7 सकारात्मक, हरे रंग में, इनसेट में एक तीर द्वारा चिह्नित) आत्म वितरण siRNA के इंजेक्शन के बाद 2 दिन tibialis पूर्वकाल में regenerating मांसपेशियों (कार्डियोटॉक्सिन मध्यस्थता चोट के बाद दिन 3 में इंजेक्शन)। Laminin सफेद में दिखाया गया है, नाभिक DAPI के साथ counterstained हैं (नीले रंग में). स्केल बार - 100 डिग्री (ए और बी), 50 डिग्री मीटर (सी-ई), 25 डिग्री मी (एफ)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: फ्लोरोसेंटी लेबल siRNA के तेज की मात्रा. (ए)उपग्रह कोशिकाओं (Pax7+ कोशिकाओं) द्वारा siRNA तेज की मात्रा और regenerating myofibers 2 दिन regenerating कंकाल की मांसपेशियों में इंजेक्शन के बाद. कार्डियोटॉक्सिन की चोट के बाद दिन 3 में इंजेक्शन लगाया गया था। द 3, त्रुटि बार SEM दिखाते हैं.(B) परिमाणीकरण में चित्रित ग्राफ (ए) अंतर्निहित है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यहाँ हम ट्रांसजेनिक जानवरों की आवश्यकता के बिना कंकाल की मांसपेशियों के पुनर्जनन के दौरान एक विशिष्ट जीन के समारोह की जांच करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। यह चोट के बाद दिन 3 में regenerating कंकाल की मांसपेशी में एक आत्म देने siRNA के इंजेक्शन के साथ carditoxin प्रेरित मांसपेशियों की चोट के संयोजन से पूरा किया है. हम विस्तार से carditoxin द्वारा मांसपेशियों की चोट की प्रक्रियाओं का वर्णन किया है, स्वयं देने siRNA और पुनर्जनन की प्रगति का विश्लेषण करने के लिए काटा मांसपेशियों के प्रसंस्करण के इंजेक्शन. हम प्रदर्शित करते हैं कि कंकाल की मांसपेशी में सांप विष कार्डियोटॉक्सिन का इंजेक्शन प्रभावी ढंग से पूरी मांसपेशियों को घायल करता है और यह कि आत्म-वितरण siRNAs अन्य सेल प्रकार के बीच सभी उपग्रह कोशिकाओं के लगभग 75% में पाए जाते हैं दो दिन के बाद उनके इंजेक्शन में पुन: उत्पन्न कंकाल की मांसपेशी (चित्र 4, चित्र 5) ।

विशेष ध्यान tibialis पूर्वकाल मांसपेशियों की एक सजातीय चोट पर ध्यान केंद्रित किया जाना चाहिए के बाद से चोट के विभिन्न डिग्री पुनर्जनन परिणाम को प्रभावित और इस तरह भी siRNA के प्रभाव को प्रभावित किया जा सकता है. इसके अलावा, यह गंभीर रूप से महत्वपूर्ण है कि पूरे regenerating क्षेत्र स्वयं देने siRNA के साथ इंजेक्शन है. पुनर्जनन प्रक्रिया के विश्लेषण के लिए, यह हमेशा regenerating कंकाल की मांसपेशी के समान क्षेत्रों की तुलना करने के लिए सिफारिश की है, इसलिए, tibialis पूर्वकाल मांसपेशी हमेशा मांसपेशियों के मध्य बेली क्षेत्र की तुलना करने के लिए आधे में कटौती की जानी चाहिए. मांसपेशियों का विश्लेषण करते समय, पूरे cryosection का विश्लेषण किया जाना चाहिए क्योंकि मायोफाइबर संरचना tibialis पूर्वकाल की मांसपेशियों में अलग है और इसलिए अलग ढंग से पुनर्जीवित हो सकता है।

उपग्रह कोशिकाओं के समारोह आसन्न अलग एकल myofibers17पर उनकी संस्कृति सहित विभिन्न प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं द्वारा जांच की जा सकती है , प्रत्यारोपण द्वारा और प्रेरित चोट के बाद कंकाल की मांसपेशियों के पुनर्जनन का विश्लेषण करके 18,19. एक में vivo प्रेरित चोट मॉडल का उपयोग करके उपग्रह कोशिकाओं के समारोह की जांच, जैसे, carditoxin के इंजेक्शन, ऐसे मैक्रोफेज के रूप में अन्य सेल प्रकार के साथ उनकी बातचीत के मामले में भी उपग्रह सेल समारोह का विश्लेषण करने की क्षमता प्रदान करता है और प्रणालीगत कारकों के प्रभाव की जांच2. कंकाल की मांसपेशी की चोट विभिन्न साधनों से पूरा किया जा सकता है, जैसे, सनकी व्यायाम, फ्रीज चोट, BaCl2 का इंजेक्शन या इस तरह के कार्डियोटॉक्सिन या नोटेक्सिन18के रूप में सांप के जहर का इंजेक्शन। जबकि सनकी व्यायाम शायद सबसे शारीरिक चोट विधि है, एक विशेष मांसपेशियों को चोट केवल सीमितहै 20. फ्रीज चोटों लागू किया जा सकता है जब चोट की साइट की ओर उपग्रह कोशिकाओं के प्रवास के अध्ययन का उद्देश्य है या मांसपेशियों का केवल एक विशिष्ट हिस्सा घायल होना चाहिए. प्रायोगिक रूप से फ्रीज चोटों का नुकसान खुली सर्जरी है जो precooled धातु जांच लागू करने के लिए किया जाना चाहिए है। BaCl2 या सांप के जहर का इंजेक्शन चोट का सबसे नाटकीय तरीका है, जिससे उपग्रह सेल समारोह को चुनौती देने के सबसे अधिक है. इसके अलावा, इंजेक्शन न्यूनतम इनवेसिव है, सर्जरी समय, सामान्य रूप में, कम से कम पांच मिनट है और suturing शामिल नहीं है, आदि जिससे संक्रमण के जोखिम को कम से कम.

मांसपेशियों की चोट का उपयोग ज्यादातर जीन कार्यों के नुकसान के कार्यात्मक परिणामों की जांच करने के लिए किया जाता है, उदा, पैक्स77,21की हानि । खासकर अगर वृद्ध चूहों वैज्ञानिक सवाल का ध्यान केंद्रित कर रहे हैं, पीढ़ी या ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग अक्सर संभव नहीं है. एक विशिष्ट जीन को लक्षित स्वयं वितरण siRNAs का इंजेक्शन उन मामलों में एक व्यवहार्य विकल्प है और सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है22. संक्षेप में, चूहों की tibialis पूर्वकाल मांसपेशी कार्डियोटॉक्सिन और स्वयं देने siRNAs के इंजेक्शन से घायल हो गया था फाइब्रोनेक्टिन के खिलाफ निर्देशित (FN) चोट के बाद दिन 3 में इंजेक्शन थे. मांसपेशियों का विश्लेषण किया गया 10 दिन चोट के बाद और उपग्रह सेल संख्या में एक महत्वपूर्ण कमी siFN बनाम तले हुए siRNA नियंत्रण की स्थिति में मनाया गया. नॉकडाउन दक्षता मात्रात्मक रियल टाइम पीसीआर द्वारा पूरे मांसपेशी lysates में निर्धारित किया गया था 2 दिन siRNA इंजेक्शन के बाद, 58% की अभिव्यक्ति के स्तर में कमी का सुझाव है कि वितरण और knockdown दक्षता कार्यात्मक के लिए पर्याप्त हैं प्राप्त किया गया था विश्लेषण22| नॉकडाउन दक्षता के परीक्षण के लिए विकल्प या तो इम्यूनोब्लॉट या इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण कर रहे हैं, जिसमें लक्ष्य जीन के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी के साथ। दक्षता और सिआरएनए के लिए इस्तेमाल किया vivo इंजेक्शन में के लिए इस्तेमाल किया चूहों में इंजेक्शन से पहले निर्धारित किया जाना चाहिए, उदाहरण के लिए, अलग उपग्रह कोशिकाओं या प्राथमिक मायोब्लास्ट में दक्षता का परीक्षण करके. एक एकल siRNA बनाम 4 अलग siRNAs से मिलकर एक स्मार्ट पूल का उपयोग knockdown की दक्षता बढ़ जाती है, लेकिन यह भी unspecific लक्ष्यीकरण का खतरा बढ़ जाता है. सभी siRNA दृश्यों की विशिष्टता सेल संस्कृति में परीक्षण किया जाना चाहिए बंद लक्ष्य प्रभाव से बचने के लिए. एक नियंत्रण के रूप में, एक गैर-लक्ष्यतले siRNA उपयोग किया जाना चाहिए क्योंकि से प्रति एक siRNA के इंजेक्शन इंजेक्शन के कारण पुनर्जनन प्रक्रिया को प्रभावित कर सकता है और, इस तरह, मांसपेशियों की अतिरिक्त क्षति. SiRNA इंजेक्शन का समय बिंदु वैज्ञानिक सवाल पर और लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल पर निर्भर करता है. आम तौर पर, कार्डियोटॉक्सिन चोट के बाद दिन 3 में आत्म-वितरण siRNA का एक इंजेक्शन चोट के बाद 3 दिन के आसपास उपग्रह सेल प्रसार चोटियों के बाद उपग्रह सेल प्रसार के लिए महत्वपूर्ण सबसे जीन लक्ष्य। पहले सिराना इंजेक्शन के लिए समय बिंदु कार्डियोटॉक्सिन चोट के बाद कम से कम 48 एच नहीं होना चाहिए क्योंकि कार्डियोटॉक्सिन की इंजेक्शन मात्रा काफी अधिक है और मांसपेशियों में अतिरिक्त समाधान इंजेक्शन लगाने से पहले तरल का पुन: अवशोषण होना चाहिए। सामान्य में, siRNAs या विभिन्न siRNAs का एक संयोजन के कई इंजेक्शन संभव है, हालांकि एक पर विचार करना चाहिए कि regenerating मांसपेशियों में प्रत्येक इंजेक्शन अतिरिक्त नुकसान पैदा कर रहा है.

वर्णित विधि की एक सीमा तथ्य यह है, कि प्रभाव मनाया जरूरी केवल उपग्रह कोशिकाओं में लक्ष्य जीन के knockdown के आधार पर नहीं है, लेकिन प्रतिरक्षा कोशिकाओं या फाइब्रो-एडिपजेनिक जनक कोशिकाओं के रूप में अन्य प्रकार के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है. इसलिए, यह उपग्रह कोशिकाओं की एक शुद्ध आबादी की जांच प्रयोगों के साथ उन प्रयोगों गठबंधन करने के लिए आवश्यक है. एक या तो अस्थायी मायोफाइबर संस्कृतियों का उपयोग करके प्रयोग कर सकता है, जहां उपग्रह कोशिकाओं को उनके आसन्न मायोफाइबर पर सुसंस्कृत किया जाता है या अलग उपग्रह कोशिकाओं का उपयोग करके प्रत्यारोपण प्रयोग कर सकतेहैं।

स्वयं देने siRNAs के इंजेक्शन के लिए एक विकल्प छोटे अणु inhibitors या रिकॉमबिनेंट प्रोटीन जो प्रदर्शन किया जा सकता है, वैज्ञानिक प्रश्न के आधार पर इंजेक्शन है. उदाहरण के लिए, अतिरिक्त कोशिकीय मैट्रिक्स प्रोटीन फाइब्रोनेक्टिन या JAK/STAT संकेतन के छोटे अणु अवरोधकों का इंजेक्शन सफलतापूर्वक आयु वर्ग के चूहों में किया गया है15,16. कंकाल की मांसपेशी के पुनर्जनन के दौरान एक विशिष्ट कोशिका प्रकार में एक विशेष जीन समारोह का विश्लेषण, उदा., उपग्रह कोशिकाओं में, एक induible आनुवंशिक माउस मॉडल के उपयोग के माध्यम से ही संभव है. आत्म वितरण siRNAs के इंजेक्शन, रिकॉमबिनेंट प्रोटीन या छोटे अणु inhibitors regenerating कंकाल की मांसपेशी में कई सेल प्रकार को प्रभावित कर सकता है.

Disclosures

हम siRNA transfection दक्षता के निर्धारण के साथ मदद के लिए उत्कृष्ट तकनीकी सहायता और Saskia Steiner के लिए क्रिस्टीन बीनने और क्रिस्टीन Poser शुक्रिया अदा करना चाहते हैं। हम महान तकनीकी सहायता के लिए कोर सेवा ऊतक विज्ञान, विशेष रूप से सबीन Landmann और लिंडा Rothenburger धन्यवाद. हम भी उत्कृष्ट समर्थन के लिए FLI पर पशु सुविधा माउस धन्यवाद. इस काम को ड्यूश Forschungsgemeinschaft (MA-3975/2-1) और ड्यूश Krebshilfe (DKH-JvM-861005) से J.v.M. को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Acknowledgments

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा करते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Henry Schein Isothesia inhalation narcotics
Hot Plate 062 Labotect 13854
Anesthesia System (Tec 7) with inhalation box + nose masks Tem Sega Minihub
Shaver for rodents isis GT420
Cardiotoxin Latoxan L8102 snake venom needed for muscle injury
Accell siRNA smart pool Dharmacon depending on your target gene self delivering siRNA
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG Thermo Fisher A-21206 secondary antibody
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG1 Thermo Fisher A-21123 secondary antibody
Coverslips VWR 631-1574
CV Mount Leica 14046430011 mounting medium for immunohistochemistry
DAPI Sigma Aldrich D9542 nuclear staining
devMHC antibody DHSB F.1652
Eosin Y Thermo Fisher 73104
Haematoxylin Gill No3 Sigma-Aldrich GHS316-500ML
Insulin syringe (29 g) Terumo 3SS05M2813 syringue used for muscle injections
Laminin antibody Sigma Aldrich L9393
M.O.M blocking reagent Vector labs MKB-2213 blocking for immunofluorescent staining
Meloxicam Boehringer Ingelheim Metacam analgesics
OCT Thermo Fisher 6502 tissue embedding
Pax7 antibody DSHB PAX7 satellite cell specific antibody
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Fisher P36934 aequos mounting medium
Sucrose Carl Roth 4621.1 tissue embedding
Superfrost plus Thermo Scientific J1830AMNZ microscope slides
TritonX-100 Amresco 0694-1L permeabilization reagent
Dissection tools
Dumont 5, straight Fine Science Tools 11295-10
Dumont 7, curved Fine Science Tools 11272-40
Extra fine Bonn scissors (cutting edge: 13 mm) Fine Science Tools 14084-08
Narrow pattern forceps Fine Science Tools 11002-16
Spring scissors (cutting edge: 5 mm, tip diameter: 0.35 mm) Fine Science Tools 91500-09

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References

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जेनेटिक्स अंक 151 कंकाल की मांसपेशी चोट कार्डियोटॉक्सिन आत्म वितरण siRNA पुनर्जनन मांसपेशी स्टेम सेल उपग्रह सेल इम्यूनोस्टेनिंग मायोफाइबर माउस हिंदलिंब चोट
कार्डियोटॉक्सिन चोट और विवो में स्व-वितरण siRNA के इंजेक्शन द्वारा कंकाल स्नायु पुनर्जनन के दौरान सैटेलाइट सेल समारोह का विश्लेषण
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Ahrens, H. E., Henze, H., Schüler, S. C., Schmidt, M., Hüttner, S. S., von Maltzahn, J. Analyzing Satellite Cell Function During Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injury and Injection of Self-delivering siRNA In Vivo. J. Vis. Exp. (151), e60194, doi:10.3791/60194 (2019).

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