Summary
Dit rapport beschrijft een microfluïdische chip-gebaseerde methode voor het opzetten van een eencelkweek experiment waarbij hoogrenderende koppeling en microscopische analyse van meerdere afzonderlijke cellen kunnen worden bereikt.
Abstract
Celco-cultuur assays zijn op grote schaal gebruikt voor het bestuderen van celcelinteracties tussen verschillende celtypen om beter te begrijpen van de biologie van ziekten met inbegrip van Cancer. Het is echter een uitdaging om het complexe mechanisme van intercellulaire interacties in zeer heterogene celpopulaties te verduidelijken met behulp van conventionele co-cultuur systemen, omdat de heterogeniteit van de celsubpopulatie wordt bedekt door de gemiddelde waarden; de conventionele co-cultuur systemen kunnen alleen worden gebruikt om het bevolkings signaal te beschrijven, maar zijn niet in staat om het gedrag van individuele cellen te volgen. Bovendien hebben conventionele eencellige experimentele methoden een lage efficiëntie bij het manipuleren van cellen vanwege de Poisson-verdeling. Micro fabricaat-apparaten zijn een opkomende technologie voor eencellige studies omdat ze afzonderlijke cellen nauwkeurig kunnen manipuleren bij hoge doorvoer en het monster-en reagens verbruik kunnen verminderen. Hier beschrijven we het concept en de toepassing van een microfluïdische chip voor meerdere eencellige co-culturen. De chip kan efficiënt meerdere soorten afzonderlijke cellen in een cultuur kamer vastleggen (~ 46%) en heeft een voldoende cultuur ruimte die nuttig is om het gedrag van de cellen te bestuderen (bijv. migratie, proliferatie, enz.) onder celcelinteractie op het eencellige niveau. Lymfatische endotheliale cellen en oraal plaveiselcelcarcinoom werden gebruikt om een eencellige co-cultuur experiment uit te voeren op het microfluïdische platform voor Live meervoudige interactiestudies met één cel.
Introduction
Efficiënte inname van verschillende soorten afzonderlijke cellen en het verstrekken van voldoende cultuur ruimte zijn nodig voor co-cultuur experimenten met één cel van meerdere typen enkelvoudige cellen1. Beperkende verdunning is de meest gebruikte methode om de afzonderlijke cellen voor dergelijke experimenten voor te bereiden, vanwege de lage kosten van de benodigde apparatuur. Vanwege de Poisson-verdelings beperking is de maximale kans op een enkelvoudige celverwerving echter slechts 37%, waardoor de experimentele operatie moeizaam en tijdrovend is2. Daarentegen kan het gebruik van fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) de Poisson-verdelings begrenzing overwinnen tot hoog-efficiënt enkelvoudige cellen voorbereiden3. FACS is echter mogelijk niet toegankelijk voor sommige laboratoria vanwege dure instrumentatie-en onderhoudskosten. Micro fabricaat-apparaten zijn onlangs ontwikkeld voor single cell-overvulling4, eencellige pairing5en toepassingen voor één celcultuur. Deze apparaten zijn voordelig op basis van hun vermogen om nauwkeurig individuele cellen te manipuleren6, uitvoeren van experimenten met hoge doorvoer, of verminderen van monster en reagens verbruik. Het uitvoeren van eencellige co-cultuur experimenten met meerdere celtypen met de huidige microfluïdische apparaten is echter nog steeds een uitdaging vanwege de beperking van Poisson-distributie1,7,8of het onvermogen van de apparaten om meer dan twee soorten afzonderlijke cellen vast te leggen4,5,6,9,10.
Bijvoorbeeld, Yoon et al. rapporteerde een microfluïdisch apparaat voor cel-cel interactiestudie11. Dit apparaat gebruikt de probabilistische-methode om cellen in één kamer te koppelen. Het kan echter alleen de koppeling van twee verschillende celtypen bereiken vanwege geometrische beperkingen in de apparaatstructuur. Een ander verslag van Lee et al. demonstreerde een deterministische methode om enkelvoudige cellen vast te leggen en te koppelen12. Dit apparaat verhoogt de koppel efficiëntie door de deterministische methode, maar het wordt beperkt door de verlengde bewerkingstijd die nodig is om cellen te koppelen. Specifiek, de tweede cel Capture kan alleen worden uitgevoerd nadat de eerste vastgelegde cel is bevestigd aan het oppervlak na 24 h. Zhao et al. rapporteerde een op droplet gebaseerd microfluïdisch apparaat om twee typen van één cel13vast te leggen. We kunnen vinden dat het op druppel gebaseerde microfluïdische apparaat nog steeds beperkt is tot de Poisson-verdeling en alleen kan worden gebruikt op niet-aangehechte cellen, en het is niet mogelijk om de cultuur oplossing tijdens het teeltproces te veranderen.
Eerder hebben we een microfluïdische "hydrodynamische pendelen chip" ontwikkeld die deterministische hydrodynamische krachten gebruikt om meerdere soorten eencellige in de cultuur kamer vast te leggen en vervolgens celco-cultuur experiment kan uitvoeren om te analyseren individuele Celmigratie gedrag onder celcelinteracties14. De hydrodynamische pendelen chip bestaat uit een reeks eenheden die elk een serpentine by-pass kanaal, een Capture-site en een cultuur kamer bevat. Door gebruik te maken van het verschil in stromingsweerstand tussen het serpentine by-pass kanaal en de kweekkamer, en een speciaal ontworpen operatie procedure, kunnen verschillende soorten enkelvoudige cellen herhaaldelijk in de kweekkamer worden gevangen. Met name de ruime ruimte van de cultuur kamer kan niet alleen voorkomen dat de cel wordt gespoeld tijdens het vastleggen van de cel, maar biedt ook voldoende ruimte voor de cellen om te verspreiden, te vermenigvuldigen en te migreren, waardoor het observeren van Live eencellige interacties mogelijk is. In dit artikel richten we ons op de productie van dit apparaat en gedetailleerde protocol stappen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fabricage van een wafer Mold door zachte lithografie
Opmerking: masker patroon gegevens zijn beschikbaar in onze vorige publicatie14.
- Dehydraat een 4-inch silicium wafer in een oven van 120 °C gedurende 15 minuten.
- Spin Coat 4 g van Su-8 2 Negative fotoresist op een 4-inch silicium wafer bij 1.000 rpm voor 30 s om een 5 μm dikke laag te maken (Layer #1).
- Soft Bake Layer #1 op een 65 °C-kookplaat gedurende 1 minuut en breng vervolgens de laag #1 over naar een kookplaat van 95 °C gedurende 3 minuten.
- Koele laag #1 op kamertemperatuur, plaats deze op de houder van de semi-automatische masker aligner en lijn deze uit met de laag #1 verchroomde photomask (Capture-sitelaag).
- Stel laag #1 bloot met 365 nm UV-licht in een dosis van 150 mJ/cm2.
- Verwijder laag #1 van de aligner en na het bakken op een 65 °C-kookplaat gedurende 1 min. overdrachts laag #1 naar een kookplaat van 95 °C gedurende 1 minuut.
- Koele laag #1 op kamertemperatuur. Dompel onder in een propyleenglycol monomethylether acetaat oplossing om de niet-crosslinked fotoresist gedurende 2 min. zachtjes te drogen met stikstofgas om een laag #1 uitlijnings markering te onthullen.
- Bedek de laag #1 uitlijnings markering door een plakband, spin Coat 4 g van Su-8 10 Negative fotoresist op de laag #1 bij 1.230 rpm voor 30 s om een 25 μm dikke laag te creëren #2.
- Verwijder de tape, zachte bak laag #2 op een 65 °C-kookplaat gedurende 3 minuten en breng vervolgens de laag #2 over naar een kookplaat van 95 °C gedurende 7 minuten.
- Koele laag #2 op kamertemperatuur, plaats de laag #2 op de houder van de semi-automatische masker aligner en lijn de laag #2 verchroomde photomask (bypass Channel Layer) uit op de laag #1 uitlijnings markering.
- Stel laag #2 bloot met 365 nm UV-licht in een dosis van 200 mJ/cm2.
- Verwijder laag #2 van de aligner en na het bakken op een 65 °C-kookplaat gedurende 1 minuut en breng laag #2 over naar een kookplaat van 95 °C gedurende 3 minuten.
- Koele laag #2 op kamertemperatuur, en dek de laag #1 uitlijning markering door plakband. Spin jas 4 g van Su-8 2050 negatieve fotoresist op laag #2 bij 1.630 rpm voor 30 s om een 100 μm dikke laag te maken #3.
- Verwijder de tape, de zachte bak laag #3 op een 65 °C-kookplaat gedurende 5 minuten en breng de laag #3 vervolgens over naar een kookplaat van 95 °C gedurende 20 minuten.
- Koele laag #3 op kamertemperatuur, plaats de laag #3 op de houder van de semi-automatische masker aligner en lijn de laag #3 verchroomde photomask (kweekkamer Layer) uit op de laag #1 uitlijnings markering.
- Stel laag #3 bloot met 365 nm UV-licht in een dosis van 240 mJ/cm2.
- Verwijder laag #3 van de aligner en na het bakken op een 65 °C-kookplaat gedurende 5 min. overdrachts laag #3 naar een kookplaat van 95 °C gedurende 10 minuten.
- Koele laag #3 op kamertemperatuur. Dompel onder in een propyleenglycol monomethylether acetaat oplossing om de niet-crosslinked fotoresist gedurende 10 minuten weg te spoelen en zachtjes te drogen met stikstofgas.
2. PDMS apparaat voorbereiding voor meerdere single cell Capture
- Plaats de wafer Mold en de weegschaal met 100 μL trichloorsilaan in een exsiccator (alleen voor silanisatie) en breng gedurende 15 minuten een vacuüm aan (-85 kPa).
Opmerking: Silanize het oppervlak met trichloorsilaan om hydrofobische oppervlakte eigenschappen te creëren vóór PDMS castingso, zodat het moeiteloos kan worden geschild van de mal van de wafer PDMS. - Stop het vacuüm en silanize de wafer Mold in de exsiccator (alleen voor silanisatie) bij 37 °C gedurende ten minste 1 uur.
- Meng PDMS base en PDMS Uithardings middel in een verhouding van 10:1. Giet in totaal 20 g gemengde PDM'S op de wafer Mold in een 15 cm schaal.
- Plaats de 15 cm schaal in een exsiccator en breng een vacuüm aan (-85 kPa) voor 1,5 min. Verwijder dan de 15 cm schaal van de desiccator. Houd gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder ten slotte resterende luchtbellen in PDM'S met stikstofgas.
- Plaats de 15 cm schaal in een oven bij 65 °C gedurende 2-4 uur om PDM'S te genezen.
- Verwijder de PDMS-replica van de wafer Mold en Punch vervolgens een 1,5 mm inlaat en een 0,5 mm uitlaat op de PDMS met een binnendiameter van 1,5 mm en een Puncher met een binnendiameter van 0,5 mm (Figuur 1C).
- Reinig de PDMS replica en het schuif oppervlak met verwijderbare tape en behandel het oppervlak met zuurstof plasma (100 W voor 14 s).
- De PDMS-replica's handmatig uitlijnen met de dia en ze in contact brengen met elkaar.
- Plaats de PDMS Slide 1 dag in een 65 °C oven.
Opmerking: permanente binding tussen de dia en de PDMS replica wordt bereikt om het apparaat te vormen. - Dompel het PDMS-apparaat onder in een container gevuld met fosfaatgebufferde zoutoplossing en plaats deze in een exsiccator. Breng vervolgens een vacuüm aan (-85 kPa) gedurende 15 minuten om luchtbellen te verwijderen.
- Plaats het PDMS-apparaat in een celcultuurkap en steriliseer het apparaat met UV-licht (licht golflengte: 254 nm) gedurende 30 minuten.
- Vervang de apparaatbuffer van PDMS door middel van medium (DMEM-F12 Basaal medium met 1% antibioticum en 10% foetaal runderserum) en inincuberen het PDMS-apparaat bij 4 °C gedurende 1 dag. Dit voorkomt dat cellen zich aan het PDMS-oppervlak hechten.
3. bereiding van een eencellige suspensie
Opmerking: celtypen omvatten menselijke lymfatische endotheliale cellen (LECs), humane OSCC TW 2.6-cellen die WNT5B-specifieke shRNA (WNT5B SH4) en vector Control (pLKO-GFP) uitdrukken die werden verkregen uit onze vorige studie15. Raadpleeg onze vorige publicatie voor gedetailleerde teelt stappen.
- Verwijder het kweekmedium wanneer de cellen 70-80% samenloop bereiken. Vervolgens driemaal de cellen voorzichtig wassen met 5 mL steriele PBS.
- Voeg 1 mL DMEM-F12 medium met 1 μM fluorescerende kleurstof toe aan WNT5B SH4 en pLKO-GFP cellen (gebruik MV2 medium voor LECs) en inincuberen de cellen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
Opmerking: LECs waren gekleurd met groene chlooromethylfluorescein DIACETAAT (CMFDA) kleurstof, WNT5B SH4 cellen werden bevlekt met blauwe 7-amino-4-chloromethylcoumarin (CMAC) kleurstof en pLKO-GFP cellen werden gekleurd met rode DIL fluorescerende kleurstof. - Spoel de cellen drie keer zachtjes met 5 mL steriele PBS.
- Verwijder de PBS en voeg 2 mL 0,25% trypsine-EDTA (0,05% trypsine-EDTA voor LECs) toe.
- Inincuberen de cellen gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur en tik vervolgens zachtjes op de weefselkweek schaal om de loslating van cellen te bevorderen.
- Voeg 4 mL DMEM-F12 medium toe om WNT5B SH4 en pLKO-GFP cellen te dispergeren (voor LECs gebruikt u 3 mL MV2 medium en 1 mL trypsine neutralisatieoplossing). Breng de cellen vervolgens over in een buis van 15 mL en centrifugeer bij 300 x g gedurende 3 minuten.
- Verwijder de supernatant en rebreng de celpellet voorzichtig in 1 mL DMEM-F12 medium. Tel het aantal levende cellen in een hemocytometer met behulp van de standaard Trypan Blue uitsluitings methode16. Bereid 1 mL celsuspensie bij 3 x 105 cellen/ml concentratie in DMEM-F12 medium, en houd vervolgens cellen op ijs om celaggregatie te voorkomen.
Let op: om de single-cell Capture-efficiëntie te verbeteren, is een zorgvuldige voorbereiding van de eencellige suspensie met goed-dissociated vereist.
4. meerdere single-cell Capture en Triple eencellige cultuur
- Sluit een poly-tetrafluoretheen (PTFE) buis aan tussen de uitlaat van het apparaat en de spuitpomp. Verwijder het medium en voeg 1 μL celsuspensie toe bij een concentratie van 3 x 105 cellen/ml in de inlaat van het PDMS-apparaat.
- Laad de celsuspensie in het apparaat door een spuitpomp met een debiet van 0,3 μL/min (Figuur 2a). Stroomrichting is van de inlaat naar de uitlaat.
Opmerking: laad onmiddellijk na het toevoegen van de celsuspensie in de inlaat om celsedimentatie te voorkomen. - Voeg na stap 4.2 1 μL DMEM-F12-medium toe aan de inlaat van het PDMS-apparaat. Laad het medium op de DMEM-F12 in het apparaat door een spuitpomp met een debiet van 0,3 μL/min (Figuur 2B). Stroomrichting van de inlaat naar het stopcontact stroomt.
- Laad 0,3 μL DMEM-F12 medium in het apparaat door middel van een spuitpomp met een debiet van 10 μL/min (Figuur 2C). Stroomrichting stroomt van de uitlaat naar de inlaat.
- Herhaal de stappen 4,1 tot 4,4 om andere celtypen in het apparaat te laden.
- Na het voltooien van de celopname, gebruik een microscoop met 4x lens om elke cultuur kamer te beelden.
NB: de fluorescentie-uitstoot van de cellen werd gebruikt om het aantal individuele cellen in elke kweekkamer te identificeren en te tellen. - Verwijder de PTFE-buis en verzegel de inlaat en de uitlaat met Polyolefine tape om een gesloten cultuur systeem te creëren.
- Verplaats het PDMS-apparaat naar een kweek schaal van 10 cm en voeg 10 mL steriele PBS rond het PDMS-apparaat toe om de verdamping van het medium van het apparaat te voorkomen.
- Breng de kweek schaal over naar een incubator (37 ° C, 5% CO2 en 95% vochtigheid) voor drievoudige eencellige kweek.
- Microscopisch observeren en fotograferen celgroei elke 12 h.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het apparaat heeft een drie lagenstructuur zoals aangegeven door de doorsnede foto van een cut PDMS-apparaat (Figuur 1a). De eerste laag bevat een Capture-site (6,0 μm in breedte en 4,6 μm in hoogte) die de cultuur kamer en het by-pass kanaal verbindt. Het verschil in stromingsweerstand tussen de kweekkamer en het by-pass kanaal zorgt ervoor dat de cellen in de veroverings positie stromen en de ingang van het kleine pad vullen. Nadat een cel is vastgelegd op de opname positie, wordt de stromingsweerstand van het kleine pad verhoogd, waardoor de volgende inkomende cel naar en via het by-pass kanaal naar de volgende stroomafwaartse Capture-site gaat. Het serpentine ontwerp van het by-pass kanaal (25,0 μm in breedte en 26,4 μm in hoogte) van de tweede laag wordt gebruikt om de stromingsweerstand te verhogen. De afmetingen van de kweekkamer in de derde laag (500,3 μm in diameter en 111,3 μm in hoogte) zijn ontworpen om voldoende ruimte te bieden voor het celkweek experiment en om de stroomsnelheid in de kamer te verminderen om te voorkomen dat de cellen uit de kamer worden gespoeld.
De gereedschappen die nodig zijn voor de bedieningsprocedure (Figuur 2) zijn gebruikelijk in algemene laboratoria, waaronder Microscoop, spuitpomp, glazen spuit, centrifugebuis, slang en pipet. Het apparaat is ongeveer 1/5 van een dekslip met een dikte van 2 mm en is geschikt voor het observeren onder een microscoop met 4x tot 20x lens. Met deze methode kan één type voor afzonderlijke cellen worden vastgelegd in de cultuur kamers onder 7 min, dus de totale gebruikstijd voor drievoudige enkelvoudige cellen was minder dan 21 minuten. Het vastleggen van de enkelvoudige cel van de Gedemonstreerde drie cellen bedroeg respectievelijk 70,83% ± 15,42% (LECs), 73,96% ± 14,09% (WNT5B SH4) en 78,13% ± 3,13% (pLKO-GFP). De drievoudige opname-efficiëntie met één cel bedroeg 47,92% ± 7,86% (Figuur 3B). De reflux operatie stap wordt gebruikt om de cellen van de veroverings plaatsen tegelijkertijd vrij te geven en de cellen in de kweekkamers te laten stromen (Figuur 2C). Tijdens dit proces, als een cel niet wordt vrijgegeven van de Capture-site, de vrijgekomen cel op de downstream Capture-site zal niet in de cultuur kamer als gevolg van de by-pass kanaal met een lagere stromingsweerstand dan de cultuur kamer. Dit is de belangrijkste reden waarom het HSC een drievoudige afvang efficiëntie van één cel heeft van slechts 47,92 ± 7,86%, wat nog steeds significant groter is dan de waarschijnlijkheid van een Poisson-verdeling (~ 5%).
De celcultuurresultaten toonden aan dat meerdere eencellige co-culturen van lymfatische endotheliale cellen en plaveiselcel kankercellen kunnen worden uitgevoerd voor 24 uur, en de proliferatie en morfologie van cellen kunnen worden waargenomen onder Microscoop (Figuur 4, Aanvullende Video's 1-3). In aanwezigheid van pLKO-GFP-cellen vertoonden WNT5B SH4 cellen en LECs een beter proliferatief vermogen en toonden ze aan dat de morfologie lamellipodia benaderde. Deze resultaten tonen het vermogen van dit apparaat om op hoog-efficiënte wijze meerdere soorten afzonderlijke cellen in een cultuur kamer vast te leggen en een voldoende cultuur ruimte te bieden die nuttig is voor het bestuderen van meerdere interacties met één celtype.
Figuur 1: foto-en Microscoop beelden van hydrodynamische pendelen chip. A) Microscoop beeld van de PDMS-sectionele weergave. B) een eenheid voor het overvullen van één cel met vergrote weergave. C) het uiterlijk van de chip met 48 eenheden. Schaalbalk: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: hydrodynamische pendelen chip operatie procedure. (A) als gevolg van de hoge hydrodynamische weerstand van het by-pass-kanaal wordt een enkele cel in de vang plaats gevangen. (B) nadat de eerste cel is gevangen en de Capture-site is afgesloten, vloeien de volgende cellen naar het door-doorlaat kanaal door de verhoogde stromingsweerstand. Gebruik medium om resterende cellen in het kanaal te wassen. C) de cel in de kweekkamer terugdoen. Schaalbalk: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: single cell Capture efficiency van LECS, WNT5B SH4 en plko-GFP in de hydrodynamische pendelen chip. A) Microscoop beeld van vastgelegde drievoudige enkelvoudige cellen in de kweekkamer. B) de groene, blauwe en rode balken vertegenwoordigen respectievelijk de opname-efficiëntie van afzonderlijke cellen en de gele staven vertegenwoordigen de opname-efficiëntie van Triple eencellige. Schaalbalk: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: co-cultuur van gepaarde eencellige en drievoudige eencellige co-cultuur in de hydrodynamische pendelen chip voor 24 uur. A) Microscoop beeld van co-cultuur met drievoudige enkelvoudige cellen voor 0, 12 en 24 h. (B) Microscoop beeld van plko-GFP en WNT5B SH4 cellen co-cultuur voor 0, 12 en 24 h. LECS waren gekleurd met groene cmfda kleurstof, WNT5B SH4 cellen werden BEVLEKT met blauwe CMAC kleurstof en pLKO-GFP cellen werden gekleurd met rode DiI fluorescerende kleurstof. Schaalbalk: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullende video 1: laden van cellen. Klik hier om deze video te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Aanvullende video 2: Cell Refluxing. Klik hier om deze video te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Aanvullende video 3: tweede celtype reflux in de cultuur kamer. Klik hier om deze video te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De intercellulaire interacties van verschillende cellen in de tumor micro omgeving spelen een belangrijke rol in de progressie van de tumor17. Om het mechanisme van celcelinteracties te begrijpen, worden co-cultuur systemen gebruikt als een gemeenschappelijke analytische methode. Echter, meerdere celtypen en de heterogeniteit van de cellen zelf hebben geleid tot experimentele complexiteit en analytische moeilijkheden.
De hydrodynamische pendelen chip laat meerdere eencellige belasting in de kweekkamer door een deterministische methode, zonder te worden beperkt door de Poisson-verdelings beperking in de verdunnings methode en het micro well-platform. Door een hoge drievoudige opname-efficiëntie van één cel te bieden (groter dan 45%, is de Poisson-verdelingsmethode 5%) en aantonen dat in de cultuur kamer ruimte voldoende is voor celgroei en proliferatie (Figuur 4). Vanwege zijn vermogen om efficiënt meerdere eencellige opnames en live-celcultuur waarnemingen uit te voeren met eenvoudige installatie en protocol, stellen we deze microfluïdische apparaten voor als nuttige hulpmiddelen voor een uitgebreid scala aan toepassingen, waaronder Cell-Cell interacties tussen meerdere cellen18, drug screening19, en Cancer biologie20. Aan de andere kant, de structuur van het apparaat is vervormbaar, en de structuur en de grootte van de Capture-site kan worden gewijzigd en toegepast op andere gebieden, zoals micro-organismen en plantencellen. In theorie is onze methode ook aanpasbaar om microbiële co-culturen (bijv. bacteriën, gisten, enz.) vast te stellen en te volgen.
De belangrijkste beperking van deze benadering is dat het precisieniveau dat nodig is voor de fabricage van het apparaat hoog is. Dit is vooral omdat de stroom weerstaan van het kleinste kanaal drastisch kan worden veranderd als de gefabriceerde afmetingen enigszins zijn gecompenseerd. De controle van weerstanden van de microkanalen zijn cruciaal voor de zeer efficiënte eencellige opname van het apparaat. Aan de andere kant is er tijdens de celcultuur geen sluiting tussen de kamers. Daarom kan paracrine secretie van cellen in de kamer zich in andere kamers verspreiden om andere cellen te beïnvloeden. Ten slotte moet aandacht worden besteed aan de netheid van het kanaal en de slangen tijdens de bereiding van het apparaat. Het kweekmedium en elke buffer die in het experiment wordt gebruikt, moeten worden gefilterd om te voorkomen dat deeltjes en vuil het kanaal blokkeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door een subsidie van het ministerie van Wetenschappen en technologie (105-2628-E-400-001-MY2), en het Ph.D. programma in weefsel engineering en regeneratieve geneeskunde, nationale Chung Hsing University en National Health Research instituten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3M Advanced Polyolefin Diagnostic Microfluidic Medical Tape | 3M Company | 9795R | |
| Antibiotics | Biowest | L0014-100 | Glutamine-Penicillin-Streptomycin |
| AutoCAD software | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | Part No. 057C1-74A111-1001 |
| CellTracke Blue CMAC Dye | Invitrogen | C2110 | |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Invitrogen | C7025 | |
| Conventional oven | YEONG-SHIN company | ovp45 | |
| Desiccator | Bel-Art Products | F42020-0000 | Space saver vacuum desiccator 190 mm white base |
| DiIC12(3) cell membrane dye | BD Biosciences | 354218 | Used as a cell tracker |
| DMEM-F12 medium | Gibco | 11320-082 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV 2 | PromoCell | C-22022 | |
| Fetal bovine serum Hyclone | Thermo | SH30071.03HI | |
| Hamilton 700 series Glass syringe ( 0.1 ml ) | Hamilton | 80630 | 100 µL, Model 710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 2 |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15075 | with 1.5mm inner-diameter |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15071 | with 0.5mm inner-diameter |
| Hotplate | YOTEC company | YS-300S | |
| Msak aligner | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
| Oxygen plasma | NORDSON MARCH | AP-300 | |
| Plasma cleaner | Nordson | AP-300 | Bench-Top Plasma Treatment System |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | Dow corning | Sylgard 184 | |
| Poly-tetrafluoroethene (PTFE) | Ever Sharp Technology, Inc. | TFT-23T | inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm |
| Removable tape | 3M Company | Scotch Removable Tape 811 | |
| Silicon wafer | Eltech corperation | SPE0039 | |
| Spin coater | Synrex Co., Ltd. | SC-HMI 2" ~ 6" | |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | Leica E24 | |
| SU-8 10 negative photoresist | MicroChem | Y131259 | |
| SU-8 2 negative photoresist | MicroChem | Y131240 | |
| SU-8 2050 negative photoresist | MicroChem | Y111072 | |
| SU-8 developer | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | Propylene glycol monomethyl ether acetate |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 703007 | |
| Trichlorosilane | Gelest, Inc | SIT8174.0 | Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water. |
| Trypsin Neutralizer Solution | Gibco | R-002-100 |
References
- Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. Journal of the Royal Society, Interface. 11 (96), 20140065 (2014).
- Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. Q., Ai, Y. The Poisson distribution and beyond: methods for microfluidic droplet production and single cell encapsulation. Lab on a Chip. 15 (17), 3439-3459 (2015).
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single adult stem cell. Nature. 456, 804 (2008).
- Roman, G. T., Chen, Y., Viberg, P., Culbertson, A. H., Culbertson, C. T. Single-cell manipulation and analysis using microfluidic devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (1), 9-12 (2007).
- Frimat, J. P., et al. A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture. Lab on a Chip. 11 (2), 231-237 (2011).
- Rettig, J. R., Folch, A. Large-Scale Single-Cell Trapping And Imaging Using Microwell Arrays. Analytical Chemistry. 77 (17), 5628-5634 (2005).
- Gracz, A. D., et al. A high-throughput platform for stem cell niche co-cultures and downstream gene expression analysis. Nature Cell Biology. 17 (3), 340 (2015).
- Tumarkin, E., et al. High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics. Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).
- Hong, S., Pan, Q., Lee, L. P. Single-cell level co-culture platform for intercellular communication. Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).
- Chung, M. T., Núñez, D., Cai, D., Kurabayashi, K. Deterministic droplet-based co-encapsulation and pairing of microparticles via active sorting and downstream merging. Lab on a Chip. 17 (21), 3664-3671 (2017).
- Chen, Y. C., et al. Paired single cell co-culture microenvironments isolated by two-phase flow with continuous nutrient renewal. Lab on a Chip. 14 (16), 2941-2947 (2014).
- Hong, S., Lee, L. P., Pan, Q. Single-cell level co-culture platform for intercellular communication. Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).
- Segaliny, A. I., et al. Functional TCR T cell screening using single-cell droplet microfluidics. Lab on a Chip. 18 (24), 3733-3749 (2018).
- He, C. K., Chen, Y. W., Wang, S. H., Hsu, C. H. Hydrodynamic shuttling for deterministic high-efficiency multiple single-cell capture in a microfluidic chip. Lab on a Chip. 19 (8), 1370-1377 (2019).
- Wang, S. H., et al. Tumour cell-derived WNT5B modulates in vitro lymphangiogenesis via induction of partial endothelial-mesenchymal transition of lymphatic endothelial cells. Oncogene. 36, 1503 (2016).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111 (1), A3.B.1-A3.B.3 (2015).
- Kim, J. B., Stein, R., O'hare, M. J. Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-a review. Breast Cancer Research and Treatment. 85 (3), 281-291 (2004).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nature Protocols. 7 (7), 1247-1259 (2012).
- Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. Microfluidic cell culture systems for drug research. Lab on a Chip. 10 (8), 939-956 (2010).
- Hong, J. W., Song, S., Shin, J. H. A novel microfluidic co-culture system for investigation of bacterial cancer targeting. Lab on a Chip. 13 (15), 3033-3040 (2013).
