Summary
В этом докладе описывается микрофлюидный чип-метод для создания эксперимента на одной культуре клеток, в котором может быть достигнут высокоэффективный спаривание и микроскопический анализ нескольких одиночных клеток.
Abstract
Клеточная ко-культура анализы были широко использованы для изучения клеточных взаимодействий между различными типами клеток, чтобы лучше понять биологию заболеваний, включая рак. Однако прояснить сложный механизм межклеточного взаимодействия в высокоразногенных популяциях клеток с помощью обычных систем совместной культуры сложно, поскольку неоднородность клеточной субпопуляции затушевывается средними значениями; обычные системы совместной культуры могут использоваться только для описания сигнала популяции, но неспособны отслеживать поведение отдельных клеток. Кроме того, обычные одноклеточные экспериментальные методы имеют низкую эффективность в манипуляции ячейками из-за распределения Пуассона. Микрофабрикаты устройства являются новой технологией для одноклеточных исследований, потому что они могут точно манипулировать одиночными клетками с высокой пропускной мощностью и могут уменьшить потребление образцов и реагентов. Здесь мы описываем концепцию и применение микрофлюидного чипа для нескольких одноклеточных кокультур. Чип может эффективно захватывать несколько типов одиночных ячеек в культурной камере (46%) и имеет достаточное пространство культуры, полезное для изучения поведения клеток (например, миграция, пролиферация и т.д.) при взаимодействии клеток на одноклеточном уровне. Лимфатические эндотелиальные клетки и оральные плоскоклеточные карциномы были использованы для выполнения одноклеточного эксперимента совместной культуры на микрофлюидной платформе для живых нескольких одноклеточных исследований взаимодействия.
Introduction
Эффективный захват различных типов одиночных ячеек и обеспечение достаточного пространства культуры необходимы для экспериментов одноклеточной совместной культуры нескольких типов одиночных ячеек1. Ограничение разбавления является наиболее часто используемым методом подготовки одиночных ячеек для таких экспериментов, из-за низкой стоимости необходимого оборудования. Однако, из-за ограничения распределения Poisson, максимальная вероятность приобретения одной ячейки составляет всего 37%, что делает экспериментальную операцию трудоемкой и трудоемкой2. В отличие от этого, с помощью флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS) может преодолеть ограничение распределения Пуассона для высокоэффективной подготовки одиночных ячеек3. Однако FACS может быть недоступен для некоторых лабораторий из-за дорогостоящих затрат на оборудование и техническое обслуживание. Микрофабрикаты устройства были недавно разработаны для одной ячейки захвата4, одноклеточных сопряжения5, и одноклеточных приложений культуры. Эти устройства являются выгодными на основе их способности точно манипулировать одиночными ячейками6,выполнять высокопроизводительные эксперименты, или уменьшить потребление образцов и реагентов. Тем не менее, выполнение одноклеточных экспериментов совместной культуры с несколькими типами клеток с текущими микрофлюидными устройствами по-прежнему является сложной задачей из-за ограничения распределения Пуассон1,7,8, или неспособность устройства для захвата более двух типов одиночных ячеек4,5,6,9,10.
Например, Yoon et al. сообщили о микрофлюидном устройстве для исследования взаимодействия клеток11. Это устройство использует вероятностный метод для сопряжения ячеек в одной камере. Тем не менее, он может достичь только сопряжения двух различных типов клеток из-за геометрических ограничений в структуре устройства. Другой доклад От Ли и др. продемонстрировали детерминированный метод захвата и сопряжения одиночных ячеек12. Это устройство повышает эффективность сопряжения с помощью детерминированного метода, но оно ограничено длительным временем работы, требуемым для сопряжения клеток. В частности, второй захват ячейки может быть выполнен только после того, как первая захваченная ячейка прикреплена к поверхности после 24 ч. Чжао и др. сообщили о микрофлепированном устройстве на основе капель для захвата двух типов одной ячейки13. Мы можем обнаружить, что микрофлюидное устройство на основе капель по-прежнему ограничено распределением Пуассона и может использоваться только на неподключенных клетках, и изменить культурное решение в процессе выращивания невозможно.
Ранее мы разработали микрофлюидный "гидродинамический челночный чип", который использует детерминированные гидродинамические силы для захвата нескольких типов одноклеточных в камеру культуры и может впоследствии выполнять эксперимент клеточной кокультуры для анализа поведение миграции отдельных клеток при взаимодействии клеток14. Гидродинамический челночный чип состоит из массивных наборов юнитов, каждый из которых содержит серпантинный объездной канал, место захвата и культурную камеру. Используя разницу в сопротивлении потока между серпантинным объездным каналом и культурной камерой, и специально разработанную процедуру работы, различные типы одиночных ячеек могут быть повторно захвачены в камеру культуры. Примечательно, что достаточное пространство камеры культуры может не только предотвратить промывку клетки во время захвата клеток, но и обеспечить достаточное пространство для клеток, чтобы распространяться, размножаться и мигрировать, что позволяет наблюдать живые одноклеточные взаимодействия. В этой статье мы сосредоточимся на производстве этого устройства и подробных протокольных шагах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Изготовление вафельной формы с помощью мягкой литографии
ПРИМЕЧАНИЕ: Данные шаблона маски доступны в нашей предыдущей публикации14.
- Обезвоживать 4-дюймовую кремниевую пластину в духовке 120 градусов по Цельсию в течение 15 минут.
- Спин пальто 4 г SU-8 2 отрицательный photoresist на 4-дюймовый кремниевой пластины на 1000 об/мин в течение 30 с, чтобы создать 5 мкм толщиной слоя (слой #1).
- Мягкий слой выпечки #1 на горячей пластине 65 градусов по Цельсию в течение 1 мин, а затем передать слой #1 до 95 градусов по Цельсию в течение 3 мин.
- Прохладный слой #1 комнатной температуры, поместите его на держатель полуавтоматической маски выравниватель, и выровнять с слоем #1 хромированные фотомаски (захват-сайт слой).
- Экспозиция слоя #1 с 365 нм УФ-излучения в дозе 150 мДж/см2.
- Удалите слой #1 с выравнивателя и пост-испечь на 65 градусов по Цельсию hotplate в течение 1 мин. Передача слоя #1 до 95 градусов по Цельсию hotplate в течение 1 мин.
- Прохладный слой #1 до комнатной температуры. Погрузитесь в пропиленгликоль монометилэфирный эфирный раствор, чтобы смыть неперекрестный фотоустойчивость в течение 2 мин. Мягко высушите азотным газом, чтобы выявить слой #1 знак выравнивания.
- Обложка слой #1 выравнивание знак клейкой лентой, спина пальто 4 г SU-8 10 отрицательных фотоустойчивость на слой #1 на 1230 об /мин в течение 30 с, чтобы создать 25 мкм толщиной слоя #2.
- Снимите ленту, мягкий слой выпекать #2 на 65 градусов по Цельсию hotplate в течение 3 мин, а затем передать слой #2 на 95 градусов по Цельсию hotplate в течение 7 мин.
- Прохладный слой #2 до комнатной температуры, поместите слой #2 на держатель полуавтоматического выравнивателя маски и выровняем слой #2 хромированной фотомаской (объездным слоем канала) к #1 знаку выравнивания слоя.
- Экспозиция слоя #2 с 365 нм УФ-излучения в дозе 200 мДж/см2.
- Удалите слой #2 с выравнивателя и пост-испечь на 65 градусов по Цельсию hotplate в течение 1 мин и передачи слоя #2 на 95 градусов по Цельсию hotplate в течение 3 мин.
- Прохладный слой #2 до комнатной температуры и покрывают слой #1 знак выравнивания клейкой лентой. Спинпальто 4 г SU-8 2050 отрицательного фотосопротивления на слой #2 при 1630 об/мин на 30 с, чтобы создать слой толщиной 100 мкм #3.
- Снимите ленту, мягкий слой выпекать #3 на 65 градусов по Цельсию в течение 5 минут, а затем передать слой #3 на 95 градусов по Цельсию в течение 20 минут.
- Прохладный слой #3 комнатной температуры, поместите слой #3 на держатель полуавтоматической маски выравниватель, и выровнять слой #3 хромированные фотомаски (культурный слой камеры) слой #1 знак выравнивания.
- Экспозиция слоя #3 с 365 нм УФ-излучения в дозе 240 мДж/см2.
- Удалите слой #3 с выравнивателя и пост-испечь на 65 градусов по Цельсию hotplate в течение 5 мин. Передача слоя #3 до 95 градусов по Цельсию hotplate в течение 10 мин.
- Прохладный слой #3 комнатной температуры. Погрузитесь в пропиленгликоль монометилэфирный этер ацетат, чтобы смыть неперекрестный фотоустойчивость в течение 10 мин и осторожно высушить с помощью азотного газа.
2. PDMS подготовки устройства для нескольких одноклеточных захвата
- Поместите форму вафельии и тарелку для взвешивания, содержащую 100 л трихлорозилана в дешикатор (только для силанизации) и нанесите вакуум (-85 кПа) на 15 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Silanize поверхности с трихлорозилан для создания гидрофобных свойств поверхности до PDMS литья, что он может легко быть очищены от формы пластины PDMS. - Остановить вакуум, а затем силанизировать вафельную форму в ошикаторе (только для силанизации) при 37 градусах По Цельсию, по крайней мере 1 ч.
- Смешайте базу PDMS и лечебный агент PDMS в соотношении 10:1. Налейте в общей сложности 20 г смешанных PDMS на вафельную форму в 15 см блюдо.
- Поместите 15 см блюдо в обезвищной и нанесите вакуум (-85 кПа) в течение 1,5 мин. Затем снимите 15-сантиметровую тарелку с обезвоженого. Храните в течение 20 минут при комнатной температуре. Наконец, удалите остаточные пузырьки воздуха в PDMS с помощью азотного газа.
- Поместите 15 см блюдо в духовке при температуре 65 градусов по Цельсию в течение 2-4 ч для лечения PDMS.
- Удалите реплику PDMS из формы пластины, а затем пробить 1,5 мм входе и 0,5 мм розетки на PDMS с помощью 1,5 мм внутреннего диаметра и 0,5 мм внутреннего диаметра перфоратор(рисунок 1C).
- Очистите реплику PDMS и поверхность слайда съемной лентой, а затем обработать поверхность кислородной плазмой (100 Вт на 14 с).
- Вручную выровнять реплики PDMS со слайдом и привести их в контакт друг с другом.
- Поместите слайд PDMS в духовке 65 градусов по Цельсию в течение 1 дня.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для формирования устройства достигается постоянная связь между слайдом и репликой PDMS. - Погрузите устройство PDMS в контейнер, наполненный фосфатным буферным сольнием, и поместите его в обезвсом. Затем нанесите вакуум (-85 кПа) в течение 15 минут, чтобы удалить пузырьки воздуха.
- Поместите устройство PDMS в капот клеточной культуры и стерилизуем устройство с помощью УФ-излучения (длина волны света: 254 нм) в течение 30 мин.
- Замените буфер устройства PDMS на средний (базальная среда DMEM-F12, содержащая 1% антибиотиков и 10% сыворотки для крупного рогатого скота плода) и инкубация устройства PDMS при 4 градусах Цельсия в течение 1 дня. Это предотвращает примыкание клеток к поверхности PDMS.
3. Подготовка одноклеточной подвески
ПРИМЕЧАНИЕ: Типы клеток включают лимфатические эндотелиальные клетки человека (LECs), клетки OSCC TW2.6, выражающие WNT5B-специфическую шРНК (WNT5B sh4) и контроль переносчиков (pLKO-GFP), которые были получены из нашего предыдущего исследования15. Пожалуйста, обратитесь к нашей предыдущей публикации для детальных шагов по выращиванию.
- Удалите культурную среду, когда клетки достигают 70-80% слияния. Затем аккуратно промыть клетки с 5 мл стерильных PBS три раза.
- Добавьте 1 мл среды DMEM-F12, содержащей 1 флуоресцентный краситель, в клетки WNT5B sh4 и pLKO-GFP (используйте среду MV2 для ЛЭК), а затем инкубировать клетки в течение 30 мин при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: LECs были окрашены зеленым chloromethylfluorescein диацетат (CMFDA) краситель, WNT5B sh4 клетки были окрашены синим 7-амино-4-хлорметилкумарин (CMAC) краситель и pLKO-GFP клетки были окрашены красным дил флуоресцентный краситель. - Аккуратно промыть клетки с 5 мл стерильных PBS три раза.
- Удалить PBS и добавить 2 мл 0,25% Трипсин-EDTA (0,05% Трипсин-EDTA для ЛЭК).
- Инкубировать клетки в течение 4 минут при комнатной температуре, а затем осторожно нажмите на блюдо культуры ткани для содействия отслоение клеток.
- Добавьте 4 мл среднего значения DMEM-F12 для разгона клеток WNT5B sh4 и pLKO-GFP (для ЛЭК используется 3 мл среднего mV2 и 1 мл раствора трипсина нейтрализатора). Затем перенесите клетки в трубку 15 мл, и центрифугу при 300 х г в течение 3 мин.
- Удалите супернатант и аккуратно приостановите действие клеточной гранулы в 1 мл средней среды DMEM-F12. Подсчитайте количество живых клеток в гемоцитометре с помощью стандартного метода исключения Trypan Blue16. Приготовьте 1 мл клеточной суспензии при концентрации 3 х 105 клеток/мл в среде DMEM-F12, а затем держите клетки на льду, чтобы предотвратить агрегацию клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для повышения эффективности одноклеточного захвата требуется тщательная подготовка одноклеточной подвески с хорошо разобщенной.
4. Несколько одноклеточных захвата и тройной одноклеточной культуры
- Соедините трубку поли-тетгриппуроэтина (PTFE) между розеткой устройства и шприц насосом. Удалите среду и добавьте 1 кл/л клеточной суспензии при концентрации 3 х 105 ячеек/мл в впускной части устройства PDMS.
- Загрузите подвеску ячейки в устройство шприц насосом со скоростью потока 0,3 л/мин(рисунок 2А). Направление потока от входе к розетке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Загрузите сразу после добавления суспензии клетки в входе, чтобы предотвратить отложение клеток. - Добавьте 1 qL среды DMEM-F12 в впускной аппарат устройства PDMS после шага 4.2.Load средний DMEM-F12 в устройство шприц насосом со скоростью потока 0,3 л/мин(Рисунок 2B). Направление потока текла от входе к розетке.
- Загрузите в устройство насосом для шприцев 0,3 л /м/(рисунок 2С). Направление потока текла от розетки к входе.
- Повторите шаги 4.1 до 4.4 для загрузки других типов клеток в устройство.
- После завершения захвата ячейки, используйте микроскоп с 4x объективом для изображения каждой камеры культуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресценция выбросов клеток был использован для выявления и подсчета числа отдельных клеток в каждой камере культуры. - Удалите трубку PTFE и запечатать входе и розетку с полиолефинлентной лентой для создания закрытой системы культуры.
- Переместите устройство PDMS в тарелку культуры 10 см и добавьте 10 мл стерильных PBS вокруг устройства PDMS, чтобы избежать испарения среды от устройства.
- Перенос блюда из культуры в инкубатор (37 градусов по Цельсию, 5% CO2 и 95% влажности) для тройной одноклеточной культуры.
- Микроскопически наблюдать и фотографировать рост клеток каждые 12 ч.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Устройство имеет трехслойную структуру, о чем свидетельствует поперечная фотография разреза устройства PDMS(рисунок 1A). Первый слой содержит узел захвата (6,0 мкм в ширину и 4,6 мкм в высоту), который соединяет культурную камеру и канал объезда. Разница в сопротивлении потока между культурной камерой и каналом обхода приводит к тому, что клетки впадают в положение захвата и заполняют вход в небольшой путь. После захвата ячейки в положении захвата, сопротивление потока небольшого пути увеличивается, в результате чего следующая входящие ячейки идти в направлении и через канал обхода к следующему вниз по течению захвата-сайт. Серпантин дизайн объездного канала (25,0 мкм в ширину и 26,4 мкм в высоту) второго слоя используется для повышения его сопротивления потока. Размеры камеры культуры в третьем слое (500,3 мкм в диаметре и 111,3 мкм в высоту) предназначены для обеспечения достаточного пространства для эксперимента клеточной культуры, а также для уменьшения скорости потока в камере, чтобы клетки не промыты из камеры.
Инструменты, необходимые для операции процедуры(Рисунок 2) являются общими в общих лабораториях, в том числе микроскоп, шприц насос, стеклянный шприц, центрифуга трубки, трубки, трубки, и пипетка. Устройство имеет примерно 1/5 крышки с толщиной 2 мм и подходит для наблюдения под микроскопом с объективом 4x to 20x. С помощью этого метода, один тип для одиночных клеток может быть захвачен в культурных камерах под 7 мин, так что общее время работы для тройных одиночных клеток было меньше, чем 21 мин. Эффективность захвата одной ячейки продемонстрированных трех ячеек составила 70,83% и 15,42% (LECs), 73,96% и 14,09% (WNT5B sh4) и 78,13% и 3,13% (pLKO-GFP), соответственно. Эффективность захвата тройных одноклеточных элементов составила 47,92% и 7,86%(рисунок 3B). Шаг операции рефлюкса используется для освобождения клеток из мест захвата одновременно и потока клеток в камеры культуры(Рисунок 2C). Во время этого процесса, если ячейка не освобождается от места захвата, освобожденная ячейка на ее месте захвата ниже по течению не войдет в культурную камеру из-за обходного канала, имеющего более низкое сопротивление потока, чем культурная камера. Это основная причина, почему HSC имеет тройную эффективность захвата одной ячейки только 47,92 и 7,86%, что все еще значительно больше, чем вероятность распределения Пуассона (5%).
Результаты клеточной культуры показали, что несколько одноклеточных кокультур лимфатических эндотелиальных клеток и плоскоклеточных раковых клеток могут быть выполнены в течение 24 ч, а пролиферация и морфология клеток можно наблюдать под микроскопом (Рисунок 4, Дополнительное видео 1-3). В присутствии клеток pLKO-GFP, WNT5B sh4 клетки и LECs показали лучшую пролиферативную способность и показали, что морфология приблизилась к ламеллиподии. Эти результаты демонстрируют способность этого устройства высокоэффективно захватывать несколько типов одиночных ячеек в культурной камере и обеспечивают достаточное пространство культуры, полезное для изучения нескольких взаимодействий одного типа клеток.
Рисунок 1: Фотографии и микроскопизображения гидродинамического челночного чипа. (A) Микроскоп изображение секционного представления PDMS. (B) Одноклеточная единица захвата увеличенного вида. (C) Появление чипа, содержащего 48 единиц. Шкала бар: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Процедура работы гидродинамического челночного чипа. (A) Из-за высокого гидродинамического сопротивления объездного канала, одна ячейка в ловушке в захвате-сайт. (B) После того, как первая клетка оказалась в ловушке и захлаживала захват-сайт, следующие клетки текут к каналу объезда из-за повышенного сопротивления потока. Используйте среду для мытья оставшихся клеток в канале. (C) Рефлюкс клетки в камеру культуры. Шкала бар: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Эффективность захвата одноклеточных элементов LECs, WNT5B sh4 и pLKO-GFP в гидродинамическом чипе челнока. (A) Микроскоп изображение захватили тройной одной клетки в камере культуры. (B) Зеленый, синий и красный полосы представляют эффективность захвата отдельных клеток, соответственно, и желтые полосы представляют эффективность захвата тройной одноклеточной. Шкала бар: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Парная одноклеточная ко-культура и тройная одноклеточная ко-культура в гидродинамическом чипе челнока для 24 ч. ()Микроскоп изображение тройных одиночных клеток со-культуры для 0, 12 и 24 ч. (B) Микроскоп изображение pLKO-GFP и WNT5B sh4 co-культуры для 0, 12 и 24 h. LECs были окрашены зеленым цветом CMFDA краситель, WNT5B sh4 клетки были окрашены синим CMAC Dye Клетки pLKO-GFP были окрашены красным флуоресцентным красителем DiI. Шкала бар: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительное видео 1: Загрузка клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео (Право нажмите, чтобы скачать).
Дополнительное видео 2: Рефлюксирование клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео (Право нажмите, чтобы скачать).
Дополнительное видео 3: Второй рефлюкс типа клетки в камеру культуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео (Право нажмите, чтобы скачать).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Межклеточные взаимодействия различных клеток в микроокружении опухоли играют важную роль в прогрессировании опухоли17. Для того, чтобы понять механизм взаимодействия клеток, системы сокультуры используются в качестве общего аналитического метода. Однако несколько типов клеток и неоднородность самих клеток привели к экспериментальной сложности и аналитическим трудностям.
Гидродинамический челночный чип позволяет многократную одноклеточную загрузку в камере культуры детерминированным методом, не ограничиваясь ограничением распределения Пуассона в методе разбавления и платформе microwell. Обеспечивая высокую эффективность захвата одной ячейки тройной одной ячейки (более 45%, метод распределения Пуассона составляет 5%) и демонстрируя, что в камере культуры достаточно места для роста и пролиферации клеток(рисунок 4). Благодаря своей способности эффективно выполнять несколько одноклеточных захватов и живых наблюдений культуры клеток с простой установки и протокола, мы представляем эти микрофлюидные устройства в качестве полезных инструментов для широкого спектра приложений, в том числе ячейки ячейки взаимодействия между несколькими клетками18, скрининг наркотиков19, и биологии рака20. С другой стороны, структура устройства вылеплена, а структура и размер места захвата могут быть изменены и применены к другим областям, таким как микроорганизмы и растительные клетки. Теоретически, наш метод также адаптируется для установления и отслеживания микробных кокультур (например, бактерий, дрожжей и т.д.).
Основным ограничением этого подхода является то, что уровень точности, необходимый для изготовления устройства, высок. Это главным образом потому, что поток сопротивление наименьшего канала может быть резко изменен, если его сфабрикованные размеры слегка смещены. Контроль сопротивления микроканалов имеет решающее значение для высокоэффективного одноклеточного захвата устройства. С другой стороны, во время клеточной культуры между камерами нет закрытия. Таким образом, паракриновое секреции клеток в камере может распространиться на другие камеры, чтобы повлиять на другие клетки. Наконец, при подготовке устройства необходимо обратить внимание на чистоту канала и труб. Среде культуры и любому буферу, используемому в эксперименте, необходимо отфильтровать, чтобы частицы и мусор не блокировали канал.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом Министерства науки и техники (105-2628-E-400-001-MY2), а также докторской программой в области тканевой инженерии и регенеративной медицины, Национальным университетом Чунг-Синг и Национальными научно-исследовательскими институтами здравоохранения.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3M Advanced Polyolefin Diagnostic Microfluidic Medical Tape | 3M Company | 9795R | |
| Antibiotics | Biowest | L0014-100 | Glutamine-Penicillin-Streptomycin |
| AutoCAD software | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | Part No. 057C1-74A111-1001 |
| CellTracke Blue CMAC Dye | Invitrogen | C2110 | |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Invitrogen | C7025 | |
| Conventional oven | YEONG-SHIN company | ovp45 | |
| Desiccator | Bel-Art Products | F42020-0000 | Space saver vacuum desiccator 190 mm white base |
| DiIC12(3) cell membrane dye | BD Biosciences | 354218 | Used as a cell tracker |
| DMEM-F12 medium | Gibco | 11320-082 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV 2 | PromoCell | C-22022 | |
| Fetal bovine serum Hyclone | Thermo | SH30071.03HI | |
| Hamilton 700 series Glass syringe ( 0.1 ml ) | Hamilton | 80630 | 100 µL, Model 710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 2 |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15075 | with 1.5mm inner-diameter |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15071 | with 0.5mm inner-diameter |
| Hotplate | YOTEC company | YS-300S | |
| Msak aligner | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
| Oxygen plasma | NORDSON MARCH | AP-300 | |
| Plasma cleaner | Nordson | AP-300 | Bench-Top Plasma Treatment System |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | Dow corning | Sylgard 184 | |
| Poly-tetrafluoroethene (PTFE) | Ever Sharp Technology, Inc. | TFT-23T | inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm |
| Removable tape | 3M Company | Scotch Removable Tape 811 | |
| Silicon wafer | Eltech corperation | SPE0039 | |
| Spin coater | Synrex Co., Ltd. | SC-HMI 2" ~ 6" | |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | Leica E24 | |
| SU-8 10 negative photoresist | MicroChem | Y131259 | |
| SU-8 2 negative photoresist | MicroChem | Y131240 | |
| SU-8 2050 negative photoresist | MicroChem | Y111072 | |
| SU-8 developer | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | Propylene glycol monomethyl ether acetate |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 703007 | |
| Trichlorosilane | Gelest, Inc | SIT8174.0 | Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water. |
| Trypsin Neutralizer Solution | Gibco | R-002-100 |
References
- Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. Journal of the Royal Society, Interface. 11 (96), 20140065 (2014).
- Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. Q., Ai, Y. The Poisson distribution and beyond: methods for microfluidic droplet production and single cell encapsulation. Lab on a Chip. 15 (17), 3439-3459 (2015).
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single adult stem cell. Nature. 456, 804 (2008).
- Roman, G. T., Chen, Y., Viberg, P., Culbertson, A. H., Culbertson, C. T. Single-cell manipulation and analysis using microfluidic devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (1), 9-12 (2007).
- Frimat, J. P., et al. A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture. Lab on a Chip. 11 (2), 231-237 (2011).
- Rettig, J. R., Folch, A. Large-Scale Single-Cell Trapping And Imaging Using Microwell Arrays. Analytical Chemistry. 77 (17), 5628-5634 (2005).
- Gracz, A. D., et al. A high-throughput platform for stem cell niche co-cultures and downstream gene expression analysis. Nature Cell Biology. 17 (3), 340 (2015).
- Tumarkin, E., et al. High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics. Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).
- Hong, S., Pan, Q., Lee, L. P. Single-cell level co-culture platform for intercellular communication. Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).
- Chung, M. T., Núñez, D., Cai, D., Kurabayashi, K. Deterministic droplet-based co-encapsulation and pairing of microparticles via active sorting and downstream merging. Lab on a Chip. 17 (21), 3664-3671 (2017).
- Chen, Y. C., et al. Paired single cell co-culture microenvironments isolated by two-phase flow with continuous nutrient renewal. Lab on a Chip. 14 (16), 2941-2947 (2014).
- Hong, S., Lee, L. P., Pan, Q. Single-cell level co-culture platform for intercellular communication. Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).
- Segaliny, A. I., et al. Functional TCR T cell screening using single-cell droplet microfluidics. Lab on a Chip. 18 (24), 3733-3749 (2018).
- He, C. K., Chen, Y. W., Wang, S. H., Hsu, C. H. Hydrodynamic shuttling for deterministic high-efficiency multiple single-cell capture in a microfluidic chip. Lab on a Chip. 19 (8), 1370-1377 (2019).
- Wang, S. H., et al. Tumour cell-derived WNT5B modulates in vitro lymphangiogenesis via induction of partial endothelial-mesenchymal transition of lymphatic endothelial cells. Oncogene. 36, 1503 (2016).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111 (1), A3.B.1-A3.B.3 (2015).
- Kim, J. B., Stein, R., O'hare, M. J. Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-a review. Breast Cancer Research and Treatment. 85 (3), 281-291 (2004).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nature Protocols. 7 (7), 1247-1259 (2012).
- Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. Microfluidic cell culture systems for drug research. Lab on a Chip. 10 (8), 939-956 (2010).
- Hong, J. W., Song, S., Shin, J. H. A novel microfluidic co-culture system for investigation of bacterial cancer targeting. Lab on a Chip. 13 (15), 3033-3040 (2013).
