Summary
Mus prostata organoider repræsenterer en lovende sammenhæng for at evaluere mekanismer, der regulerer differentiering. Dette papir beskriver en forbedret tilgang til at etablere prostata organoider, og introducerer metoder til (1) indsamle protein lysat fra organoider, og (2) Fix og plette organoider for hele Mount confokal mikroskopi.
Abstract
Prostata epitelet består overvejende af basal-og luminale celler. In vivo Lineage Tracing er blevet udnyttet til at definere differentierings kapaciteten af mus prostata basal og luminale celler under udvikling, væv-regenerering og transformation. Men, evaluere celle-iboende og ydre regulatorer af prostata epitelial differentiering kapacitet ved hjælp af en Lineage Tracing tilgang ofte kræver omfattende avl og kan være cost-prohibitive. I prostata organoid assay genererer basal og luminale celler prostataepitelet ex vivo. Vigtigere, primære epiteliale celler kan isoleres fra mus af enhver genetisk baggrund eller mus behandlet med et vilkårligt antal små molekyler før, eller efter, plating i tredimensionale (3D) kultur. Der genereres tilstrækkeligt materiale til evaluering af differentierings kapaciteten efter 7-10 dage. Indsamling af basal-afledte og luminalafledte organoider til (1) proteinanalyse ved Western blot og (2) immunohistokemisk analyse af intakte organoider ved en Konfokal mikroskopi i hele Mount giver forskerne mulighed for at evaluere ex vivo-differentieringen kapacitet af prostata epiteliale celler. Når de anvendes i kombination, disse to tilgange giver supplerende oplysninger om differentiering kapacitet af prostata basal og luminale celler som reaktion på genetisk eller farmakologisk manipulation.
Introduction
Basal og luminale celler udgør størstedelen af prostata epitelet1. Lineage Tracing undersøgelser har afsløret, at disse celletyper er overvejende selvpåført af særskilte afkom i Adult Mouse2; imidlertid er luminale differentiering fra basale Stam forfædre blevet observeret i flere sammenhænge, herunder udvikling3,4, vævsregenerering5, inflammation6,7 og prostataCancer initiering2,8. Desuden understøtter nye data eksistensen af Multipotente luminale progenitorer samt luminale-engagerede progenitorer9. I metastatisk prostatacancer, differentiering fra en AR-afhængige luminale afstamning til en AR-ligegyldig afstamning med basal og neuroendokrine funktioner repræsenterer en stadig mere værdsat mekanisme af resistens over for androgen pathway hæmmere10,11,12. Derfor, som differentiering er impliceret i normal fysiologi, kræft initiering og resistens over for terapi, belyse centrale molekylære regulatorer af prostata epitelial celledifferentiering er kritisk.
Musen prostata organoid model er dukket op som en elegant ex vivo kontekst at studere prostata epitelial Celledifferentiering9,13,14. I denne analyse er individuelle epiteliale celler belagt i en 3D-matrix, hvor de genererer glandulære strukturer, der indeholder både basal og luminale celler inden for 1 uge. Mens eksisterende tilgange til plating celler til organoid kultur kan bruges til effektivt at generere organoider, disse tilgange kræver yderligere optimering14. Bemærkelsesværdige udfordringer i forbindelse med dyrkning prostata organoider omfatter (1) eksklusive to-dimensionelle (2D) kolonier, der dannes under Matrigel (matrix gel) fra analyse, (2) opretholdelse af integriteten af matrix gel under medieændringer, og (3) tælle organoider nøjagtigt. Dette papir skitserer en tilgang til at generere organoider fra epiteliale celler isoleret fra mus prostata. Den beskrevne fremgangsmåde indebærer belægnings plader med poly (2-hydroxyethylmethacrylat) (Poly-HEMA) for at forhindre forekomsten af 2D-kolonier. Desuden er celler belagt i en matrix gel ring, snarere end en matrix gel skive, hvilket gør at ændre medierne og tælle organoider mindre udfordrende. Disse teknikker gør det muligt for forskerne lettere at undersøge, hvordan genetiske ændringer eller små molekyler, der introduceres før eller under dannelsen af organoid, ændrer nøgleprocesser såsom differentiering.
Høst af prostata organoider til Western blot eller immunohistokemisk analyse af hele Mount confokal mikroskopi kan give værdifuld mekanistisk indsigt i differentiering13, men der mangler veletablerede protokoller til at forberede organoider til sådanne teknikker. Dette manuskript beskriver tilgange til høst af organoider til (1) indsamling af proteinlysat, eller (2) fiksering og farvning til Konfokal mikroskopi. Det er vigtigt, at den fremgangsmåde, der er beskrevet for fastsættelse og farvning af prostata organoider, forbedres betydeligt i forhold til eksisterende metoder. Mens disse er afhængige af at skære organoider15, den metode, der er beskrevet i dette manuskript udnytter intakt organoider, som hjælper med at beskytte mod organoid skade under prøveforberedelse. Når det anvendes i kombination, Western blot og konfokal mikroskopi kan give værdifuld indsigt i de molekylære regulatorer af differentiering. Alternativt kan disse tilgange bruges til at modellere andre processer såsom udvikling og transformation.
Protocol
Alle metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af den institutionelle revisions bestyrelse på University of California, Los Angeles.
Bemærk: Figur 1viser en skematisk illustration af de fremgangsmåder, der er beskrevet i papiret.
1. isolerende mus basal og Luminal prostata epitelceller ved hjælp af fluorescens-aktiverede celle sortering (FACS)-TIMING: 30 min
Bemærk: Udfør trin 1.3-1.5 i mørket.
- Efter dissociation af celler fra Total muse prostata som beskrevet i Lawson et al.16, overføres cellerne til FACS-rør og opslæmmes 0,1-5 x 106 celler i 100 μl Dissociations medier (tabel 1).
- Tilsæt passende volumen af følgende direkte konjugerede primære antistoffer: CD45, CD31, ter-119, EpCAM og CD49f.
- Inkuber på is, beskyttet mod lys, i 20 min.
Bemærk: Det anbefales at anvende 10% af de samlede dissocierede celler til ufarvede og enkeltfarvede kontrolelementer. Disse kontroller er nødvendige for at indstille den korrekte kompensation og spænding til sortering. - Afkøle antistof-cocktail ved at tilsætte 1 mL dissociations medie til hver prøve. Pellet cellerne ved centrifugering ved 800 x g i 5 minutter ved stuetemperatur (RT) og Fjern supernatanten ved at aspirere.
- Cellerne opslæmmes i passende volumen (250 μL pr. 1 x 106 celler) af dissociations mediet, der indeholder 1 μg/ml 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (dapi). Fortsæt til FACS. Flow cytometri plots viser isolering af mus basal og luminale prostata epiteliale celler er illustreret i figur 2.
2. plating sorteret prostata Epiteliale celler i primær mus Organoid kultur-TIMING: 2-3 H (undtagen poly-HEMA-belagt plade præparat)
Bemærk: Plader er belagt med poly-HEMA for at forhindre 2D koloni dannelse på overfladen af brønden under matrix gel. Forbered poly-HEMA-belagte plader 1 dag før plating sorteret basal eller luminale prostata epiteliale celler i mus organoid kultur. Tø 1 mL aliquoter af reduceret vækstfaktor matrix gel, i det følgende benævnt matrix gel, på is 2 h før trin 2,1. Y-27632 (ROCK inhibitor) bør tilsættes til mus organoid medier umiddelbart før trin 2,1. Udfør trin 2.1-2,8 på is.
- Cellerne i 5 mL runde-bund-rør centrifugeres ved 800 x g i 5 minutter ved 4 °c og aspirerer supernatanten.
- Celle pellet vaskes i 500 μL mus organoid-medier (tabel 2)14.
- Cellerne centrifugeres ved centrifugering ved 800 x g i 5 minutter ved 4 °c, og supernatanten aspirerer.
- Resuspension i mus organoid-medier ved en celletæthed på 1.000 celler/μL.
- For at forberede Master blandinger, blandes epiteliale celler suspenderet i mus organoid medier med matrix gel til at generere en endelig blanding, der indeholder 25% celler/medier og 75% matrix gel. Basal celler er typisk belagt i en koncentration på 100-2000 celler/80 μL, hvorimod luminale celler typisk er belagt i en koncentration på 2000-10000 celler/80 μL. Tætheden af de belagte celler varierer afhængigt af dagen for den forventede materiale indsamling og den ønskede downstream-applikation.
Bemærk: Chill passende størrelse tube (s) for forventet Master Mix volumen 5 min før Master Mix forberedelse. For at sikre, at matrix gelen ikke hærder under håndteringen, er det afgørende at afkøle pipettespidsen ved at pipettere matrix gel 3-4 gange, før den overføres til et nyt rør. - Tilsæt 80 μL af matrix gel/celle blandingen pr. brønd af en 24-brønd plade. Pipettering en dråbe på den nedre halvdel af væggen af brønden, samtidig med at undgå direkte kontakt med poly-HEMA belægning anbefales. Efter tilsætning af matrix gel, Swirl pladen for at tillade matrix gel/celle blandingen at danne en ring omkring kanten af brønden.
- Placer 24-brønden i en 37 °C 5% CO2 inkubator højre side op i 10 min for at lade matrix gel hærde delvist.
Bemærk: Begynd med at varme muse organoid-medier ved 37 °C umiddelbart efter at have placeret 24-brønden i inkubator. - Efter inkubere i 10 min, vend 24-brønden på hovedet og Inkuber i yderligere 50 min, så matrix gelen kan hærde helt.
- Tilsæt 350 μl præ-varmet mus organoid Media dråbevis til midten af hver brønd.
Bemærk: For at opretholde integriteten af matrix gel, er det vigtigt at undgå matrix gel ring, mens du tilføjer medier. - Når du har tilføjet mediet, skal du returnere 24-brønd pladen til 37 °C 5% CO2 -inkubator.
3. genopfyldning mus Organoid medier-TIMING: 10-15 min pr 24-brønd plade
Bemærk: Eksisterende medier skal udskiftes med friske medier hver 48 h. Før hver medie ændring, præ-varme mus organoid medier. Det er ikke nødvendigt at tilføje ROCK-hæmmer til de medier, der anvendes til genopfyldning.
- VIP 24-brønden i en vinkel på 45 °, og fjern forsigtigt eksisterende medier fra midten af hver brønd ved hjælp af en P1000-pipette, mens du undgår matrix gel ringen.
- Tilsæt 350 μL præ-varmet mus organoid-medier som i trin 2,9. Det anbefales at tilføje en større mængde medier (op til 1 mL) til organoider, der dyrkes i længere tid end 5 dage, for at forhindre hurtig udtømning af vigtige næringsstoffer og vækstfaktorer.
4. udvinding protein Lysat fra prostata Organoider til Western blot analyse — TIMING: 2.5-4 H
Bemærk: Før indsamling af organoider til ekstraktion af proteinlysat, Forbered og præ-varme dispase-holdige medier (tabel 1).
- Fjern mediet fra hver brønd som i trin 3,1.
- For at indsamle organoider skal du gentagne gange sprænge matrix gelen ved at pipettere 1 mL dispase-holdige medier direkte på matrix gelens ring, indtil hele ringen er opløst, og overføre til et 1,5 mL mikrocentrifuge glas.
Bemærk: Det er afgørende at undgå direkte kontakt med de poly-HEMA-belagte brønde. Direkte kontakt kan forårsage kontaminering af det indsamlede materiale med poly-HEMA, som kan have en negativ indvirkning på cellens overlevelse. - 1,5 mL mikrocentrifuge røret (-erne) placeres i en 37 °C 5% CO2 -inkubator i 30 min til 1 time for at muliggøre fuldstændig fordøjelse af matrix-gelen ved dispase.
- Pellet organoider ved centrifugering ved 800 x g i 5 minutter ved RT og Fjern supernatanten ved hjælp af en mikropipette.
- Tilsæt fosfat-bufferet saltvand (PBS) til organoid pellet og resuspension af forsigtigt flicking.
Bemærk: Manglende tilstrækkelig resuspension af organoid pellet kan resultere i kontaminering af organoid materiale med rest dispase eller matrix gel. - Pellet organoider ved centrifugering ved 800 x g i 5 min ved RT og Fjern supernatanten ved hjælp af en mikropipette.
- Hurtigt fryse organoid pellets ved at placere hvert rør i en opløsning, der indeholder tøris og methanol. Røret (-erne) opbevares indtil fremtidig brug ved-80 °C. Alternativt ekstrahere protein lysat umiddelbart efter trin 4,6.
- Resuspension af organoid pellets i 100 μL protein lyse buffer (tabel 1) pr. 10 μl pakket celle volumen. Svip for at resuspendere.
Bemærk: Hvis du genoptager efter hurtig frysning, skal du sørge for, at protein lyse bufferen er optøet, før prøverne fjernes fra-80 °C, da lysis-bufferen straks tilsættes prøver for at forhindre fosfatase-og proteaseaktivitet. - Prøverne i protein lyse bufferen på isen inkubates i mindst 45 min.
Bemærk: Det anbefales at sonikere før inkubation på is for at øge effektiviteten af nuklear protein opsving; Men, sonikering er ikke påkrævet. Hvis der ikke udføres sonikering, skal du fortsætte til trin 4,10.- For at sonikatere, under flette rør i våd is og forsigtigt anvende spidsen af Sonic dismembrator til yder linjen af mikrocentrifuge røret. Sonicate for 40 s ved 20 kHz.
- Fortsæt til Western blot efter etablerede protokoller.
5. fiksering og farvning af prostata Organoider til immun Histokemisk analyse ved hele monterings Konfokal mikroskopi
-
Opsamling af prostata organoider fra 24-brønde plader — timing: 45-60 min
Bemærk: Når du indsamler prostata organoider til behandling for Konfokal mikroskopi, er det afgørende at håndtere dem med omhu for at opretholde deres struktur. Indsamlings protokollen nedenfor er designet til at reducere forstyrrelse af organoid struktur under isolation.- Fjern mediet fra hver brønd som i trin 3,1.
- Matrix gel fordamper ved inkubering med 500 μL dispase-holdige medier (tabel 1) i 30 min i en 37 °c 5% Co2 -inkubator.
- Opsaml fordøjet organoid suspension i et mikrocentrifuge glas og pellet organoiderne ved centrifugering ved 800 x g i 3 min ved rt. Fjern supernatanten.
-
Hel-Mount immunfluorescent farvning af prostata organoider — timing: 3-4 dage (1-5 timer/dag)
- Tilsæt 500 μL 4% PARAFORMALDEHYD i PBS og Inkuber i 2 timer ved RT med blid rystning.
- Pellet organoider ved centrifugering ved 800 x g i 3 min ved rt, Fjern supernatanten, og vask pellet med 1 ml PBS i 15 minutter med blid omrystning.
- Afvask pellet som i trin 5.2.2 for yderligere to gange.
- Pellet organoiderne ved centrifugering ved 800 x g i 3 minutter ved RT og Fjern supernatanten. Tilsæt 1 μg/mL DAPI i blokerende opløsning (tabel 1). Inkuber i 2 timer ved RT eller alternativt natten over ved 4 °C med blid omrystning.
- Pellet organoiderne ved centrifugering ved 800 x g i 3 minutter ved RT og Fjern supernatanten. Tilsæt primært antistof (kanin anti-p63, mus anti-cytokeratin 8) i blokerende opløsning og Inkuber natten over ved 4 °C med blid rystning.
- Pellet organoiderne ved centrifugering ved 800 x g i 3 minutter ved RT og Fjern supernatanten. Pelleten vaskes med 1 mL PBS i 15 minutter med blid omrystning.
- Vask pellet som i trin 5.2.6 for yderligere to gange.
- Pellet organoiderne ved centrifugering ved 800 x g i 3 minutter ved RT og Fjern supernatanten. Tilsæt sekundært antistof (ged anti-kanin IgG-Alexa fluor 594, ged anti-mus IgG-Alexa fluor 488) i blokerende opløsning og Inkuber natten over ved 4 °C med blid rystning.
- Pellet organoider ved centrifugering ved 800 x g i 3 min ved rt, Fjern supernatanten, og vask pellet med 1 ml PBS i 15 minutter med blid omrystning.
- Vask pellet som i trin 5.2.9 for yderligere to gange.
6. vævs rydning og montering af de farvede prostata Organoider til hele Mount Confokal mikroskopi — TIMING: 7 H
- Pellet organoiderne ved centrifugering ved 800 x g i 3 minutter ved RT og Fjern supernatanten.
- Tilsæt 1 mL 30% saccharose i PBS med 1% Triton X-100 og Inkuber i 2 timer ved RT med blid rystning.
- Pellet organoiderne ved centrifugering ved 800 x g i 3 minutter ved RT og Fjern supernatanten.
- Tilsæt 1 mL 45% saccharose i PBS med 1% Triton X-100 og Inkuber i 2 timer ved RT med blid rystning.
- Pellet organoiderne ved centrifugering ved 800 x g i 3 minutter ved RT og Fjern supernatanten.
- Tilsæt 1 mL 60% saccharose i PBS med 1% Triton X-100 og Inkuber i 2 timer ved RT med blid rystning.
- Pellet organoider ved centrifugering ved 800 x g i 3 min ved RT og fjerne 95% af supernatanten.
Bemærk: Pellet bliver løsere, da koncentrationen af saccharose bliver højere. Observation af DAPI-farvede organoider under UV-lys for at bekræfte, at de ikke var tabt under fjernelse af supernatanten anbefales. - Overfør en 10-20 μL dråbe af den resterende suspension til en Chambered Cover seddel, og Fortsæt til Konfokal mikroskopi.
Bemærk: Dækslip fragmenter kan anbringes på hver side af dråbe stykket, der skal bruges som afstandsstykker (figur 4c). Disse forhindrer organoider i at kollapse, når en dækseddel er placeret over dråbe.
Representative Results
Prostata epiteliale celler er belagt i mus organoid kultur, hvor de danner organoider, som høstes forud for forberedelse til downstream-analyse (figur 1).
Basal og luminale epiteliale celler isoleres ved hjælp af FACS. Efter udelukkelse af DAPI+ celler og nedbrydende Lin+ celler (CD45, CD31, Ter119), er basal og luminale celler skelnes baseret på differentiel ekspression af Epcam og CD49f (figur 2). Den tilgang, der er beskrevet til plade prostata basal og luminale celler i organoid kultur indebærer: (1) plating celler i matrix gel ringe, og (2) belægning brønde med poly-HEMA. Plating i ringe er tidligere beskrevet i Agarwal et al9. Udnytte denne tilgang (figur 3A) giver forskerne mulighed for lettere at undgå matrix gel mens genopfyldning af medierne (trin 3), og mere let tælle organoider ved at følge omkredsen af brønden. Belægning brønde med poly-HEMA har vist sig at forhindre 2D koloni dannelse i retinal organoids17; Men, denne fremgangsmåde er ikke blevet udnyttet i prostata organoid model. Vigtigere, belægning brønde med poly-HEMA (tabel 3) eliminerer forekomsten af 2D kolonier uden at forstyrre organoid dannelse (figur 3B). Disse modifikationer udvide kapaciteter af prostata organoid assay.
Basal-og luminale celler danner organoider med forskellige morfologier (figur 4A). Mens de fleste basal-afledte organoider har samme størrelse (100-300 μm diameter) efter 7 dage i kulturen udviser luminalafledte organoider signifikant heterogenitet (30-450 μm diameter). Desuden indeholder de fleste basal-afledte organoider lumen omgivet af flerlags epitel (figur 4A, top), hvorimod luminale-afledte organoider spænder i morfologi fra hule, med enkeltlags epitel til fast, med flerlags ledninger af celler, der ikke kanaliserer (figur 4A, bund). De fremgangsmåder, der er beskrevet ovenfor for at forberede organoider til downstream-analyse (trin 4, 5), blev anvendt til at undersøge, om disse fænotypiske forskelle afspejler forskelle i Lineage markør udtryk. Western blot analyse afslørede, at basal og luminale-afledte organoider bevarer funktioner forbundet med basal og luminale primærceller. Basal-afledte organoider udtrykker højere niveauer af basal markør cytokeratin 5 (K5), hvorimod luminalafledte organoider udtrykker højere niveauer af luminale markøren cytokeratin 8 (K8) (figur 4B). Både basal-og luminale markører blev påvist i basal-og luminalafledte organoider i bulkpopulationen, hvilket måske kunne tyde på differentiering (figur 4B).
Vi forsøgte at karakterisere Lineage markør udtryk i basal-afledte organoider og afgøre, om morfologisk adskilte luminale-afledte organoider udviser forskelle i markør udtryk ved farvning intakt organoider og udfører Konfokal mikroskopi (figur 4D). Basal-afledte organoider indeholdt flerlags epitel med ydre lag udtrykker høje niveauer af basal markør p63 og moderate niveauer af luminale markør k8 (p63Hi, K8Mid), og indre lag uden detekterbare niveauer af p63 og høje niveauer af k8 (p63Lo, K8Hi) (figur 4D, top). Mens alle celler i enkeltlags luminal-afledte organoider farvet positivt for K8, kun vælge celler indeholdt nukleare p63 (figur 4D, bund). Disse data validere tilgange til høst og forberede organoider til analyse af Western blot eller Konfokal mikroskopi og derved udvide kapaciteten af organoid assay til at studere centrale cellulære processer, herunder differentiering.
Figur 1: skematisk illustrerer workflow for at generere prostata organoider til indsamling og analyse. Total mus prostata er dissocieret og basal og luminale prostata epiteliale celler isoleres ved fluorescens-aktiverede celle sortering via etablerede protokoller18,19. Basal eller luminale celler suspenderet i en blanding af mus organoid medier og matrix gel er belagt i matrix gel ringe. Efter 5 til 7 dages kultur høstes organoider til analyse af Western blot eller Konfokal mikroskopi. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: isolering af mus basal og luminale prostata epiteliale celler ved hjælp af fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS). Dissocierede celler fra mus prostata er plettet med DAPI, at skelne levende fra døde celler, og overflade antistoffer, at skelne basal fra luminale celler, før FACS. Venstre = gated på DAPI-celler. FSC-A = fremad-scatter. Center = gated på Lin- celler (CD45Lo, CD31Lo, Ter119Lo). SSC-A = side-scatter. Højre = basal celler (bas) (EpCAMHi, CD49fHi), luminale celler (Lum) (epcamHi, CD49fMid). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: etablering af mus prostata organoider. (A) skematisk illustrerer tilgang til at generere en matrix gel ring i en brønd af en 24-brønd plade. (B) repræsentative fasekontrast billeder af Organoider (3D vækstplan) og to-dimensionelle kolonier (2D vækstplan) dannet 7 dage efter plating prostata epitelceller i un-coated (Poly-Hema (-)), eller overtrukket (Poly-Hema (+)) 24-brønd plader. Boxed regioner inden for 2D-vækstplan forstørres til højre. Skala stænger = 200 μm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: analyse af Lineage markør ekspression i prostata organoider af Western blot og hel-Mount confokal mikroskopi. (A) repræsentative fasekontrast billeder af basal-afledte (top) og luminale-afledte (bund) organoider efter 7 dages kultur. Scale bar = 100 μm.B) Western blot analyse af basal-afledte (bas) og Luminalafledte (Lum) organoider efter 5 dages kultur. Farvning for basal markør, cytokeratin 5 (K5) og luminale markør, cytokeratin 8 (K8) og en belastningskontrol, Histon H3 (HH3). (C) skematisk illustrerer Chambered Cover slip med Spacers. (D) repræsentativ differentialinterferens kontrast (dic) og immunfluorescent billeder af basal-afledte (top) og luminale-afledte (bund) organoider efter 7 dages kultur. Farvning for p63 (rød), k8 (grøn) og DAPI (blå) individuelt og fusioneret. Skala stænger = 100 μm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Opskrifter | |
| Dispase-holdige medier | 1 mg/mL dispase + 10 μM klippe hæmmer i avanceret DMEM F12. Filter steriliserer med 0,22 μm filter. |
| Dissociations medier | 10% FBS + 1x penicillin-streptomycin i RPMI 1640. Filter steriliserer med 0,22 μm filter. |
| Protein lyse buffer | RIPA buffer + fosfatasehæmmere + proteasehæmmere |
| Blokerende løsning | 10% FBS i PBS med 0,2% Triton X-100 |
Tabel 1: vejledning i udarbejdelse af nøgle løsninger.
| Komponent | Koncentration |
| B-27 | 1x (fortyndet fra 50x koncentrat) |
| GlutaMAX | 1x (fortyndet fra 100x koncentrat) |
| N-acetyl-L-Cystein | 1,25 mM |
| Normocin | 50 μg/mL |
| Rekombinant humant EGF, Dyrefri | 50 ng/mL |
| Rekombinant humant Noggin | 100 ng/mL |
| R-spondin 1-condition medier | 10% konditioneret medie |
| A83-01 | 200 nM |
| Dht | 1 nM |
| Y-27632 dihydrochlorid (klippe hæmmer) | 10 μM |
| Avanceret DMEM/F-12 | Base Media |
| R-spondin 1-konditioneret medie genereres som beskrevet i Drost, et al.13. Efter tilsætning af alle komponenter, filter sterilisere mus organoid medier ved hjælp af 0,22 μm filter. ROCK inhibitor tilsættes kun under etablering af kultur og passaging af organoider. | |
Tabel 2: instruktioner til fremstilling af mus organoid medier.
| Protokol til tilberedning af poly-HEMA-belagte plader | |
| 1 | Tilsæt 0,25 g poly-HEMA til 50 mL 98% EtOH. Poly-HEMA opløses ved 37 °C på en shaker. Denne proces tager mindst 4 h. |
| 2 | Filter sterilisere poly-HEMA ved hjælp af 0,22 μm filter. |
| 3 | Der tilsættes 200 μl poly-HEMA-opløsning pr. brønd af en 24-brønd plade (er). |
| 4 | Fjern låg (r) fra 24-brønd plade (r) efter tilsætning af poly-HEMA og lad opløsningen fordampe natten over. |
| 5 | Vask hver brønd to gange med PBS og sørg brønde er helt tørt før opbevaring efter sidste vask. Bemærk: afbrydelse af poly-HEMA belægning under vask kunne bidrage til 2-dimensionelle vækst på plating epitelceller i organoid kultur. For at forhindre beskadigelse af poly-HEMA-belagte brønde, undgå direkte kontakt med pipettespidsen under vask. Integriteten af de poly-HEMA-belagte brønde vil forblive intakt, medmindre poly-HEMA er skrabet af pipettespidsen. |
| 6 | Poly-HEMA-belagte plader kan opbevares ved 4 °C i op til to uger. Bemærk: indpaknings plader i parafilm før opbevaring vil reducere risikoen for kontaminering. |
Tabel 3: protokol for tilberedning af poly-HEMA-belagte plader.
Discussion
Prostata epitelial Celledifferentiering har været impliceret i både normal prostata biologi2,3,4,5,6,7 og sygdoms biologi8,10,11,12; de overordnede regulatorer af denne proces er dog ikke defineret. Identificering af nøgle regulatorer af prostata epitelial Celledifferentiering har været vanskelig til dels på grund af fraværet af veletablerede sammenhænge til at modellere det. Mens 2D enkeltlags kultur kan bruges til model differentiering11,12, denne sammenhæng undlader at rekapitulere den komplekse prostata mikromiljø. Desuden egner in vivo-sammenhænge til model differentiering sig ikke til Mekanistiske undersøgelser, da de er udfordrende at manipulere. Derfor er det afgørende at identificere en let at manipulere, men alligevel fysiologisk relevant sammenhæng for at studere differentiering.
Den prostata organoide model repræsenterer en elegant ex vivo kontekst, hvor basal til luminale differentiering er rapporteret at forekomme. Metoder til at etablere prostata organoider er veletablerede14; Men, yderligere optimering af disse metoder er nødvendig. Desuden er tilgange til høst og forberede prostata organoider til analyse ikke klart beskrevet. Dette papir beskriver en tilgang til plade prostata epiteliale celler isoleret fra mus prostata til organoid kultur. Denne fremgangsmåde gør det muligt for forskerne at (1) forhindre forekomsten af 2D-kolonier under organoid dannelse, (2) reducere risikoen for forstyrrelse af matrix gel under medie opfyldning og (3) tælle organoider mere effektivt. Hertil kommer, at dette manuskript skitserer tilgange til høst organoider til forberedelse til Western blot analyse, eller hele Mount confokal mikroskopi. Vigtigere, den tilgang, der anvendes til at forberede organoider til Konfokal mikroskopi bevarer den intakte struktur af organoider gennem sin varighed, hvilket reducerer organoid skade før billed erhvervelse. Samlet, de beskrevne tilgange udvide kapaciteter af prostata organoid assay.
Især kan den organoid-dannende kapacitet af basal og luminale celler ændres både ved metoder, der anvendes til at isolere de respektive populationer, og ved kulturforhold. De organoide dyrkningsbetingelser, der blev anvendt i denne analyse, blev først beskrevet af Karthaus et al.13. Der henviser til, at Karthaus et al. har rapporteret, at basal celler har en højere organoid-dannende kapacitet (15%) end luminale celler (1%)13, Chua et al., ved hjælp af særskilte isolations metoder og kulturforhold, har rapporteret, at luminale celler (0,2-0,3%) har en højere organoid-dannende kapacitet end basal celler (0,03%)20. Samlet set, metoder beskrevet af Karthaus et al. føre til højere organoid-danner satser for både basal og luminale celler, sandsynligvis afspejler forskelle i den metode, der anvendes til at isolere basal og luminale celler13, i modsætning til kulturforhold, der bias mod organoid dannelse fra luminale celler. Det er fortsat uklart, om den protokol, der er beskrevet i dette manuskript, favoriserer luminale organoid dannelse fra Multipotente luminale progenitorer eller engagerede-luminale forfædre9. Selv om rettidig og cost-prohibitiv, in vivo Lineage Tracing undersøgelser kan anvendes til at validere stamceller funktioner forbundet med særskilte prostata epiteliale nedstamningens belyst i organoid assay.
Processer som udvikling, differentiering og transformation er ikke kun relevante for prostata biologi, men også relevant for biologi af andre væv, herunder hjernen, lungerne, tarmen, bugspytkirtlen og leveren. De beskrevne metoder letter udnyttelsen af organoid model til at studere disse processer i ikke kun prostata, men også en bred vifte af væv.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
PDC og JMG understøttes af Ruth L. Kirschstein National Research Service Award GM007185. JAD er støttet af National Institute of General Medical Sciences af National Institutes of Health (R25GM055052) tildelt T. Hasson og Saul Martinez Scholarship. ASG er støttet af Spitzer-familiens fonds fond og Gill-Begavelsen. Dette arbejde blev støttet af American Cancer Society (RSG-17-068-01-TBG), Department of Defense (W81XWH-13-1-0470), Margaret E. Tidlig medicinsk forskning Trust, NIH/NIC (P50CA092131/UCLA SPORE i prostata cancer), Rose Hills Foundation, og støtte fra UCLA Jonsson omfattende Cancer Center, Broad stamcelle Research Center, klinisk og translational Science Institute, og Institute of Urologic Oncology.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Dish 35 mm, high | ibidi | 81156 | |
| 16% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-487 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | |
| APC/Cy7 anti-mouse CD326 (Ep-CAM) Antibody, 100 μg | BioLegend | 118218 | |
| B-27 Supplement (50x), Serum Free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | 11836145001 | |
| (DiHydro)testosterone (5α-Androstan-17β-ol-3-one) | Sigma | A-8380 | |
| Dispase II, Powder | Thermo Fisher Scientific | 17-105-041 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F8667 | |
| FITC anti-mouse CD31 Antibody (0.5 mg/mL, 50 μg) | BioLegend | 102405 | |
| FITC anti-mouse CD45 Antibody (0.5 mg/mL, 50 μg) | BioLegend | 103107 | |
| FITC anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody (0.5 mg/mL, 50 μg) | BioLegend | 116205 | |
| Goat anti-mouse IgG-Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A28175 | |
| Goat anti-rabbit IgG-Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11012 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Halt Phosphatase Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 78428 | |
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | CB-40230C | |
| Mouse anti-cytokeratin 8 | BioLegend | 904804 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | |
| Normocin | Thermo Fisher Scientific | ant-nr-1 | |
| PE anti-human/mouse CD49f Antibody | BioLegend | 313612 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (Poly-HEMA) | Sigma | P3932-25G | |
| Rabbit anti-p63 | BioLegend | 619002 | |
| Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) | Thermo Fisher Scientific | PI89901 | |
| Recombinant Human EGF, Animal-Free | PeproTech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| RPMI 1640 Medium, HEPES (cs of 10) | Thermo Fisher Scientific | 22400105 | |
| Sonic Dismembrator | Thermo Fisher Scientific | FB120 | |
| Sucrose | Sigma | S0389-500G | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-5ML | |
| Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) | Selleck Chemical | S1049-50MG |
References
- Kwon, O. J., Xin, L. Prostate epithelial stem and progenitor cells. American Journal of Clinical and Experimental Urology. 2 (3), 209-218 (2014).
- Choi, N., Zhang, B., Zhang, L., Ittmann, M., Xin, L. Adult Murine Prostate Basal and Luminal Cells Are Self-Sustained Lineages that Can Both Serve as Targets for Prostate Cancer Initiation. Cancer Cell. 21 (2), 253-265 (2012).
- Ousset, M., Van Keymeulen, A., et al. Multipotent and unipotent progenitors contribute to prostate postnatal development. Nature Cell Biology. 14 (11), 1131-1138 (2012).
- Wang, J., et al. Symmetrical and asymmetrical division analysis provides evidence for a hierarchy of prostate epithelial cell lineages. Nature Communications. 5, 1-13 (2014).
- Wang, Z. A., Mitrofanova, A., et al. Lineage analysis of basal epithelial cells reveals their unexpected plasticity and supports a cell-of-origin model for prostate cancer heterogeneity. Nature Cell Biology. 15 (3), 274-283 (2013).
- Kwon, O. J., Zhang, B., Zhang, L., Xin, L. High fat diet promotes prostatic basal-to-luminal differentiation and accelerates initiation of prostate epithelial hyperplasia originated from basal cells. Stem Cell Research. 16 (3), 682-691 (2016).
- Kwon, O. J., Zhang, L., Ittmann, M. M., Xin, L. Prostatic inflammation enhances basal-to-luminal differentiation and accelerates initiation of prostate cancer with a basal cell origin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 192 (3), 997-999 (2014).
- Stoyanova, T., et al. Prostate cancer originating in basal cells progresses to adenocarcinoma propagated by luminal-like cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (50), 20111-20116 (2013).
- Agarwal, S., Hynes, P. G., et al. Identification of Different Classes of Luminal Progenitor Cells within Prostate Tumors. Cell Reports. 13 (10), 2147-2158 (2015).
- Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
- Mu, P., et al. SOX2 promotes lineage plasticity and antiandrogen resistance in TP53- and RB1-deficient prostate cancer. Science. 355 (6320), 84-88 (2017).
- Bishop, J. L., et al. The Master Neural Transcription Factor BRN2 Is an Androgen Receptor-Suppressed Driver of Neuroendocrine Differentiation in Prostate Cancer. Cancer Discovery. 7 (1), 54-71 (2016).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Drost, J., Karthaus, W. R., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture. Journal of Visualized Experiments. (143), e59051 (2019).
- Lawson, D. A., Xin, L., Lukacs, R. U., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation and functional characterization of murine prostate stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 181-186 (2007).
- Chen, H. Y., Kaya, K. D., Dong, L., Swaroop, A. Three-dimensional retinal organoids from mouse pluripotent stem cells mimic in vivo development with enhanced stratification and rod photoreceptor differentiation. Molecular vision. 22, 1077-1094 (2016).
- Liu, X., et al. Low CD38 Identifies Progenitor-like Inflammation-Associated Luminal Cells that Can Initiate Human Prostate Cancer and Predict Poor Outcome. Cell Reports. 17 (10), 2596-2606 (2016).
- Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells. Nature protocols. 5 (4), 702-713 (2010).
- Chua, C. W., Shibata, M., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-961 (2014).
