Summary
Hematopoietiska Stem progenitorceller (HSPCs) övergång från en quiescent tillstånd till en differentiering stat på grund av deras metaboliska plasticitet under blodbildningen. Här presenterar vi en optimerad metod för att mäta mitokondriell andning och glykolys av HSPCs.
Abstract
Hematopoietiska Stem progenitorceller (HSPCs) har distinkta metabolisk plasticitet, som tillåter dem att övergå från deras quiescent tillstånd till en differentiering tillstånd att upprätthålla kraven på blodbildningen. Emellertid, det har varit svårt att analysera den metabola status (mitokondriell andning och glykolys) av HSPCs på grund av deras begränsade antal och brist på optimerade protokoll för icke-anhängare, bräckliga HSPCs. Här ger vi en uppsättning tydliga, steg-för-steg-instruktioner för att mäta metabolisk andning (syreförbrukning hastighet; OCR) och glykolys (extracellulär syrnings hastighet; ECAR) av murina benmärg-LineagenegSca1+c-kit+ (LSK) hspcs. Detta protokoll ger en högre mängd LSK HSPCs från murina benmärg, förbättrar livskraften hos HSPCs under inkubering, underlättar extracellulära Flux analyser av icke-anhängare HSPCs, och ger optimerade injektion protokoll (koncentration och tid) för läkemedel riktade mot oxidativ fosforylering och glykolytiska vägar. Denna metod möjliggör förutsägelse av metabolisk status och hälsa HSPCs under blod utveckling och sjukdomar.
Introduction
Eftersom livslängden på de flesta mogna blodkroppar är kort, homeostas av blod förlitar sig på självförnyelse och differentiering av en långlivat men sällsynt population av hematopoietiska stamceller (HSPCs)1. HSPCs är quiescent, men de är snabba att förgöra och genomgå differentiering vid stimulering för att upprätthålla kraven i blodsystemet. Eftersom varje HSPC cellulära tillstånd kräver en unik bioenergetisk efterfrågan, de metabola förändringarna är viktiga drivkrafter för HSPC öde beslut. Därför, förlusten av metabolisk plasticitet, genom att förändra balansen mellan quiescence, självförnyelse, och differentiering av HSPCs, leder ofta till myelo-eller Lympho-proliferativa sjukdomar. Tillsammans är förståelsen av metabolisk reglering av HSPC utveckling avgörande för att avslöja mekanismerna bakom hematologiska maligniteter2,3,4,5.
Mitokondriell andning och glykolys generera ATP att driva intracellulära reaktioner och producera de byggstenar som behövs för makromolekyl syntes. Eftersom hspcs har låg mitokondriell massa jämfört med differentierade celler6 och de upprätthåller vilo i hypoxisk benmärgs nischer, hspcs främst förlita sig på glykolys. Aktivering av hspcs ökar deras mitokondriella metabolism som leder till förlust av vilo och deras efterföljande inträde i cellcykeln. Sådan metabolisk plasticitet av hspcs gör det möjligt att upprätthålla HSPC pool hela vuxenlivet6,7,8,9,10,11,12. Därför är det viktigt att undersöka deras metaboliska aktiviteter, såsom syre förbruknings graden (OCR, index för oxidativ fosforylering) och den extracellulära försurnings graden (ECAR; index för glykolys) för att analysera aktiveringen av HSPC och hälsostatusen. Både OCR och ECAR kan mätas samtidigt, i realtid, med hjälp av en extracellulär Flux Analyzer. Den aktuella metoden kräver dock ett stort antal celler och är optimerad för anhängare av celler13. Eftersom HSPCs inte kan isoleras i stora mängder från möss14, kräver sortering för att få en ren population, är icke-anhängare celler15, och kan inte odlas över natten utan att undvika differentiering16, har det varit svårt att mäta OCR och ECAR av hspcs. Här ger vi en uppsättning tydliga, steg-för-steg-instruktioner för att följa video-baserade tutorials om hur man mäter metabolisk andning och glykolys av några tusen murina benmärg-LineagenegSca1+c-kit+ (LSK) hspcs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll godkändes av rikstäckande barnsjukhuset djuromsorg och användning kommitté (IACUC).
Anmärkning: Protokollet beskrivs i kronologisk ordning som sträcker sig över perioden på två dagar. Använd färska reagens enligt beskrivningen i nedanstående protokoll.
1. beredning av reagenser på dagen före analysen
-
Återfukta sensor patronen.
- Inkubera 5 mL av kalibranten (tabell över material) i en inkubator som inte är CO2 37 ° c över en natt.
- Öppna Flux-analyssatsen (tabell över material) och separera sensor patronen (grön; topp) från verktygs plattan (transparent; botten). Placera sedan sensor patronen upp och ned och intill verktygs plattan.
- Använd sterilt vatten och fyll brunnarna i bruks plattan (200 μL) och kamrarna runt brunnarna (400 μL).
- Sänk in sensor patronen i verktygs plattan och se till att sensorerna är helt täckta av vatten. Tryck på 3x för att undvika att bubblor bildas.
- Placera patronen nedsänkt i verktygs plattan i en icke-CO2 37 ° c inkubator över natten. För att förhindra avdunstning av vattnet, se till att inkubatorn är ordentligt Befuktad. Placera en öppen bägare som innehåller H2O som en extra försiktighetsåtgärd bredvid patron-nyttoplattan, särskilt om du använder en vanlig ugn.
-
Förbered analys plattan.
- Sterilisera biosäkerhets skåpets yta klass 2 med 70% etanol. Öppna testplattan under huven.
- Tillsätt 40 μL kommersiellt tillgänglig 0,01% (w/v) Poly-L-lysin (PLL) lösning till varje brunn av analys plattan under huven.
- Täck analys plattan med locket som finns i satsen. Inkubera den stängda analys plattan i rumstemperatur (RT) under huven i 1 h.
Anmärkning: Målet med inkubationen är att låta PLL belägga ytan av analys plattan för att underlätta vidhäftning av upphängnings celler till ytan av analys plattan. - Efter 1 h inkubation av analys plattan, ta bort överflödig lösning med en steril vakuum-baserade rökrörs och lufttorka brunnen under huven.
Anmärkning: Det tar ~ 30 − 60 min att lufttorka brunnarna i testplattan efter överdriven PLL avlägsnande med aspiratorn.
2. dag för analysen
- Förbered patronen.
- Lyft upp sensor patronen. Placera den upp och ner i vävnaden Culture Hood och kassera vattnet från bruks plattan.
- Fyll verktygs plåtens brunnar med 200 μL av den förvärmda kalibranten.
- Fyll kamrarna runt brunnarna med 400 μL av kalibranten.
- Sänk in sensor patronen i verktygs plattan och se till att sensorerna är helt täckta av kalibranten. Tryck på 3x för att undvika att bubblor bildas.
- Equilibrate sensor patronen nedsänkt i bruks plattan i en icke-CO2 37 ° c inkubator för 45 − 60 min.
- Skörda murina benmärg-härledda LSK HSPCs.
- För att rymma tillräckliga biologiska replikat, planerar att använda HSPCs härrör från en mus per brunn av analys plattan.
Anmärkning: Denna benmärgs-skörd metod ger ~ 50000 − 80000 LSK HSPCs från varje mus. Detta protokoll för att mäta extracellulära Flux är optimerad för ~ 70 000 LSK HSPCs per brunn av en 96 väl-plattan. - Euthanize möss som använder CO2 överdosering och cervikal dislokation, efter lokala IACUC godkända metoder.
- Sterilisera ytan av dissekera verktyg och bänken med 70% etanol.
- För varje mus, pre-Fill en petriskål med 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) som innehåller 2% Värmeinaktiverade fetalt bovint serum (FBS) vid RT.
Anmärkning: Använd inte förkyld PBS eftersom det kommer att skapa klumpar i följande steg. - Spraya 70% etanol (v/v) på hela den euthanized musen. Isolera alla ben, inklusive övre och nedre extremiteterna, höft ben, bröstbenet, bröstkorg och ryggrad, från musen17,18. Dra ut vit materia från ryggmärgen av musen eftersom det kan förora LSK celler. Placera alla ben i 1x PBS (+ 2% FBS), eftersom de samlas, i en petriskål tills vidare användning.
- Invertera ett 50 ml koniskt rör (nytt varje gång) och Använd det till hackad ben nedsänkt i 1x PBS (+ 2% FBS) i petriskål.
- Med en 10 ml serologiska pipett, Pipettera upp och ner (~ 10X) för att jämnt spola ut celler från ben, efter krossning ben.
- Placera en 40 μm cell SIL på ett 50 mL koniskt rör. Pre-våt ytan av SIL genom att passera 1 mL 1x PBS (+ 2% FBS).
- Skörda benmärg-derived cellsuspension från steg 2.2.7 och passera den genom pre-våta ytan av cellen SIL att ta bort ben skräp.
- Upprepa steg 2.2.6 till 2.2.9 tills alla benmaterial blir vita som en markör som de flesta benmärgsceller samlas i 50 mL koniskt rör.
Anmärkning: Det tar ofta 2 50 mL koniska rör per mus för att samla in alla benmärg-härledda celler. - Centrifugera 50 mL koniska rör som innehåller benmärgshärledda celler i 5 min vid 500 x g och RT.
- Ta bort supernatanten. Omsuspendera benmärgshärledda celler (kombinera innehållet i båda 50 mL-rören) i 5 mL 1x PBS (+ 2% FBS) som en slutlig volym och behåll celler vid RT.
- För att rymma tillräckliga biologiska replikat, planerar att använda HSPCs härrör från en mus per brunn av analys plattan.
- Skörda mononukleerade murina benmärgsceller.
- Tillsätt 5 mL densitetsgradientmedium (dvs. Ficoll) till ett 15 mL koniskt rör. Tillsätt sedan långsamt 5 mL av benmärgs cellsuspensionen. Se till att cellerna förblir som ett lager över densitetsgradienten medium.
- Centrifugera i 30 min vid 500 x g och RT. Använd inte en broms i centrifugen. Se till att centrifugen är vid lägsta möjliga acceleration (t. ex. 1 acceleration och 0 retardation).
- Skörda det mellersta gränssnittet av mononukleerade celler (vit färg) efter centrifugering i ett nytt 15 mL koniskt rör.
- Tvätta celler, skördade från densitet gradient medium, med 5 mL 1x PBS (+ 2% FBS). Centrifugera i 5 min vid 500 x g och 4 ° c. Ta bort supernatanten.
- Upprepa steg 2.3.4.
- Omsuspendera cellinnehållet i röret i 300 μL 1x PBS (+ 2% FBS). Alikvot 10 μL cellsuspension för ofärgade eller enfärgade kontroller i ett FACS-rör.
- Skörda LSK HSPCs från mononukleerade murina benmärgsceller.
- Gör en cocktail av biotin-antikroppar genom att blanda 3 μL per prov av följande antikroppar: Gr1, Cd8a, Cd5, B220, Ter119. Tillsätt 15 μL av en cocktail av biotin-antikropp till 300 μL mononukleerade benmärgsceller.
Anmärkning: Varje antikropp används vid 1:100 spädning. - Inkubera celler med biotin-antikroppscocktail i 30 min vid 4 ° c med agitation för att undvika att celler klumpar sig i botten av röret.
- Tillsätt 10 mL förkyld 1x PBS (+ 2% FBS) till celler blandat med biotin-antikroppscocktail.
- Centrifugera röret i 5 min vid 500 x g och 4 ° c. Kassera supernatanten och Omsuspendera cellpelleten i 400 μL 1x PBS (+ 2% FBS). Alikvot 10 μL för streptavidin-enkel färgkontroll.
- Kort Vortex anti-biotin mikrokulor (tabell över material) före användning. Tillsätt 80 μL mikropärlor till varje cellprov (av 400 μL). Blanda väl och inkubera i ytterligare 20 min vid 4 ° c, med agitation.
- Tillsätt 10 mL förkyld 1x PBS (+ 2% FBS) till celler. Centrifugera röret i 5 min vid 500 x g och 4 ° c.
- Kassera supernatanten och Omsuspendera cellpelleten i 1 mL 1x PBS (+ 2% FBS). Förvaras vid 4 ° c vid inställning av magnetisk separations enhet.
- Placera en kolonn (tabell över material) i magnetfältet på 4 ° c i magnet hjälp cell sortering (Macs) separator. Bered kolonnen för magnetisk separation genom att skölja den med 3 mL 1x PBS (+ 2% FBS) under gravitations flödet vid 4 ° c.
- Tillsätt cellsuspensionen från steg 2.4.7 till den före våta kolonnen vid 4 ° c. Låt cellerna passera genom kolonnen vid 4 ° c och samla upp spillvatten i ett 15 mL koniskt rör.
Anmärkning: Fraktionen med omärkta celler i sådant utflöde representerar de berikade härstamning negativa cellerna. - Tvätta kolonnen med 3 mL 1x PBS (+ 2% FBS) vid 4 ° c. Upprepa 3x. Samla in genomflödet och behåll det vid 4 ° c. Räkna eluerade livskraftiga celler genom trypan blå uteslutning med hjälp av en hemocytometer.
- Centrifugera det 15 mL koniska röret som innehåller genomflödet i 5 min vid 500 x g och 4 ° c. Kassera supernatanten. Omsuspendera cellerna i 0,5 mL 1x PBS (+ 2% FBS) och överför innehållet till ett FACS-rör.
- Tillsätt 24 μL av LSK antikropps cocktail till varje 107 celler. Antikropps cocktail innehåller lika koncentration av 450-streptavidin antikropp, PE-CY7-Sca1 antikropp, och APC-c-kit antikropp.
- Inkubera i 1 h vid 4 ° c med agitation under mörker (täckt med plåtfolie).
- Tillsätt 3 mL 1x PBS (+ 2% FBS) till FACS-röret. Centrifugera i 5 min vid 500 x g och 4 ° c. Kassera supernatanten.
- Omsuspendera antikroppsmärkta celler i 1 mL 1x PBS (+ 2% FBS). Tillsätt 1 μL av 1 mg/mL propidiumjodid jodid till cellsuspension strax före sortering.
- Filtrera innehållet i FACS-röret med en 40 μm SIL precis innan du sorterar LSK-celler.
- Samla LSK celler, via FACS sortering, i 1,5 mL rör som innehåller 0,5 mL komplett Media kompletterat med 2 mM glutamin, 3 mg/mL glukos, 1 mM pyruvat, 1x trombopoietin (TPO), 1x stamcells faktor (SCF), 0.5 x penicillin/streptomycin (P/S), pH 7,4 (tabell 1).
- Gör en cocktail av biotin-antikroppar genom att blanda 3 μL per prov av följande antikroppar: Gr1, Cd8a, Cd5, B220, Ter119. Tillsätt 15 μL av en cocktail av biotin-antikropp till 300 μL mononukleerade benmärgsceller.
3. mitokondriell andning och Glykolysis-analyser av LSK HSPCs
-
LSK-sådd i analys plattan
- Centrifugera LSK-celler från steg 2.4.17 i 5 min vid 500 x g och RT. Kassera supernatanten.
- Omsuspendera celler i kompletta medier till en slutlig koncentration av minst 70 000 celler/40 μL.
- Utsäde innehåll av 40 μL media (innehållande 70 000 celler) i den PLL-belagda 8-brunnen plattan från steg 1.2.4. Låt alla hörn brunnar vara tomma.
- Centrifugera i 1 min vid 450 x g och RT. Använd inte bromsen. Se till att cellerna är fästa till brunnen botten med det inverterade mikroskopet.
- Tillsätt 135 μL komplett media till cellerna i varje brunn för en slutlig volym på 175 μL. Tillsätt 175 μL komplett media till de 2 hörnen av plattan som ämnen.
- Inkubera cellerna i icke-CO2 inkubator för 2 h vid 37 ° c.
- Inrätta ett program för att lägga till läkemedel till varje brunn av brunnen plattan i analysatorn med hjälp av ett mått som beskrivs i tabell 2 (mitokondriell stresstest) och tabell 3 (glykolysis stresstest).
Obs: medan celler inkuberas, slå på instrumentet och se till att det är på 37 ° c.
-
Mitokondriell stresstest
- Bered 45 μM stamlösningar av Oligomycin, 50 μM karbonylcyanid 4-(trifluromethoxy) fenylhydrazon (FCCP) och 25 μM stamlösningar av Rotenon/Antimycin A. För att bereda 45 μM Oligomycin stamlösning, lös upp innehållet i den kommersiellt tillgängliga påsen i 280 μL av hela mediet. För att bereda 50 μM FCCP-lagerlösning, lös upp innehållet i den kommersiellt tillgängliga påsen i 288 μL av hela mediet. För att förbereda en stamlösning på 25 μM Rotenon/Antimycin, upplöses innehållet i den kommersiellt tillgängliga påsen i 216 μL av hela mediet.
- Ta ut sensor patronen i bruks plattan från inkubatorn och lasta dess portar (A, B och C) så att varje brunn skulle ha en slutlig koncentration på 2 μM Oligomycin, 1,5 μM FCCP och 0,5 μM av Rotenon/Antimycin A efter behov, efter utspädnings värden som beskrivs i tabell 4 (för syre förbrukningstakt).
- Ta bort locket från sensor patronen monterad i verktygs plattan och placera den på instrument facket. Starta kalibreringen som kommer att ta 20 min.
- Efter kalibreringen, ta bort verktyget plattan och ersätta den med analys platta som innehåller LSK celler, som nu följs till botten av brunnen.
- Tryck på Fortsätt för att starta programmet som beskrivs i tabell 2. Efter slutförandet av programmet, hämta data och analysera dem med hjälp av Wave Desktop programvara.
Anmärkning: De data som genereras från extracellulära Flux analyser kan ritas med hjälp av dot Plot från Wave Desktop programvara eller exporteras till webbaserade statistik program.
-
Glykolys stresstest
- Rekonstituera glukos i 300 μL (100 mM), Oligomycin i 288 μL (50 μM), 2-D glukos (2-DG) i 300 μL (500 mM) av kompletta medier från den kommersiellt tillgängliga påsen.
- Pipettera försiktigt upp och ner (~ 10X) för att solubilisera föreningarna. Vortex 2-DG för cirka 1 min för att säkerställa korrekt upplösning i media.
- Ta ut sensor patronen ur inkubatorn. Ladda portarna A till C enligt de utspädnings mått som beskrivs i tabell 5 för att uppnå en slutkoncentration på 10 mm glukos, 2 μm Oligomycin och 50 mm 2-DG.
- Upprepa steg 3.2.3 och 3.2.4.
- Tryck på Fortsätt för att starta programmet som beskrivs i tabell 3. Efter slutförandet av programmet, hämta data och analysera dem med hjälp av Wave Desktop programvara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vår extraktionsmetod tillät oss att skörda upp till ~ 80 000 LSK HSPCs per mus. Livskraften och antalet LSK-celler förbättrades med vår metod, eftersom vi: (1) kombinerad benmärg från övre och nedre extremiteter, höft ben, bröstbenet, bröstkorg och ryggrad, (2) undvikas med hjälp av röd cellsbuffert som skulle ha ökat celldöd och klumpar, (3) använde densitetsgradienten medium separation av mono-nucleated celler, och (4) undvikas med hjälp av pre-kyld buffert som skulle ha orsakat förlusten av celler-av-intresse i klumpar.
Även om extracellulär Flux analys traditionellt har använts för anhängare av celler, vår användning av PLL beläggning av brunnar, följt av centrifugering av celler på den, underlättade vidhäftning av LSK HSPCs till ytan av brunnen. Detta tillät oss att mäta extracellulära Flux, och därmed metabolisk hälsa LSK HSPCs. med tanke på det begränsade antalet celler som kan skördas från en mus och den långa varaktigheten av protokollet för deras isolering, har vår användning av analysatorn med dess 8 väl-format vuxit fram som den mest kostnadseffektiva och genomförbara lösningen (figur 1).
Celler använder glykolys och mitokondriell andning för att fylla på sina energibehov och för att producera intermediärer som behövs för deras spridning och tillväxt19. Hexokinasenzymet omvandlar glukos i glukos-6-fosfat och omvandlas därefter till Pyruvat20. Pyruvat kan sedan bearbetas till laktat och exporteras från cellen med protoner21. ECAR åtgärder försurning av medierna och är således en indikator på glykolys. Pyruvat kan också transporteras in i mitokonsamen och omvandlas i acetyl coenzym A (CoA). Acetyl CoA går in i TCA cykeln, som ger energi intermediärer att driva elektron rörelser i elektron transport kedjan (ETC) och genererar en protongradient i mitokondriella Inter-membran utrymme22. Syre fungerar som den sista elektron acceptorn, och protoner flytta tillbaka till mitokondriell matris genom ATP syntas Complex samtidigt generera ATP23. OCR mäter syreförbrukningen och används därför för att kvantifiera mitokondriell andning.
För att analysera OCR och ECAR i basal och stressade förhållanden, vi använde sekventiell injektion av läkemedel som stör glykolys och mitokondriell andning. Vi använde glukos och 2-deoxyglukos (2-DG), en glukos-analog, att initiera och blockera glykolys respektive24. Vi använde Rotenon (en komplex i-specifik hämmare av etc), a a (en komplex III-specifik hämmare av etc), Oligomycin (hämmare av ATP-syntas), och unkopplingsmedlet Karbonylklorid cyanid-4-(trifluoromethoxy) fenylhydrazon (fccp) att blockera specifika händelser i etc25. Vi titrerade sådana reagenser för att hitta den optimala koncentrationen för LKS HSPCs (figur 2A, B).
För att utföra glykolysis stresstest, odlade vi LSK HSPCs i en glukos/pyruvat eftersatta media (som rekommenderas av tillverkaren), eller i glukos/pyruvat innehållande media. Som väntat fann vi den grundläggande nivån i ECAR var högre för LSK HSPCs odlade i glukos/pyruvate + Media jämfört med LSK HSPCs odlade i glukos/pyruvat-media. Den första injektionen med glukos inte ändra den basala nivån av ECAR för LSK HSPCs odlade i glukos/pyruvate + Media medan det boostade glykolys i LSK HSPCs odlade i glukos/pyruvat-media. Men, den basala nivån på ECAR, efter injektion med glukos, förblev lägre jämfört med glukos/pyruvate + gruppen. Den andra injektionen med Oligomycin, som skulle kunna blockera produktionen av ATP genom oxidativ fosforylering, aktiverat glykolys på sin högsta nivå av LSK HSPCs i glukos/pyruvat + media, men det påverkade inte glukos/pyruvat-gruppen. Den sista injektionen med glukos-analog 2-DG återvände ECAR till sin icke-glykolytiska nivå (figur 2C).
För det mitokondriella stresstestet mätte vi den basala nivån av OCR av LSK HSPCs i glukos/pyruvat + media. Vi injicerade först Oligomycin som initialt hyperpolariserade mitokondriella membranet, förhindrade mer Proton pumpa genom ETC-komplex, och därmed minskat graden av mitokondriell andning. Den andra injektionen av fccp jonofor sköt etc och OCR-nivåer till sin maximala som celler försökte återvinna mitokondriella membranet potential. Den slutliga injektionen med andra två av de ETC-hämmare (Antimycin A och Rotenon) orsakade hela stoppet av mitokondriell andning och därmed OCR återgår till sin lägsta nivå (figur 2D).
Figur 1: schema som visar isolering av LineagenegSca1+c-kit+ (LSK) hematopoietiska stamceller från mus benmärg. Benmärgen extraheras från ben och mononukleära celler (mnk) isoleras genom densitetsgradient medelgradientseparation. Därefter inkuberas celler med en Lineage+ antikroppar och streptavidin-konjugerade magnetiska pärlor till eluerahärstamningsnegativa (LIN-) celler efter deras magnetiska separation. Lin- celler inkuberas därefter med LSK-antikroppar och LSK-celler som isolerats genom cell sortering. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: extracellulära Flux analyser av murina LineagenegSca1+c-kit+ (LSK) hematopoietiska stamceller progenitorceller. (a, B) Mekanistisk Beskrivning av läkemedel som används för extracellulära Flux analyser under glykolys och mitokondriell andning. C) representativa resultat av stresstester av Glykolysen på MURINA LSK HSPCs i närvaro eller frånvaro av glukos/pyruvat i medierna. D) representativa resultat av mitokondriell stresstest på murina LSK hspcs. felstaplar representerar medelvärdet (SD) Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Lager | Slutliga koncentrationen | Volym för 30 mL | |
| Kompletta medier | 28,691 mL | ||
| P/S | 100x | 0.5 x | 150 μL |
| L-glutamin | 200 mM | 2 mM | 300 μL |
| Pyruvat | 100 mM | 1 mM | 300 μL |
| Glukos | 1 M/180.2 mg/mL | 3 mg/mL | 499,4 μL |
| Tpo | 100 μg/mL | 100 ng/mL | 30 μL |
| Scf | 100 μg/mL | 100 ng/mL | 30 μL |
Tabell 1: innehåll och förberedelse av hela XF-mediet.
| Basala | Oligomycin (2 μM) | FCCP (1,5 μM) | R/A (0,5 μM) | |
| Upprepning | 3 gånger | 3 gånger | 3 gånger | 3 gånger |
| Mix | 3 minuters | 3 minuters | 3 minuters | 3 minuters |
| Vänta | 0 minuter med | 0 minuter med | 0 minuter med | 0 minuter med |
| Åtgärd | 4 minuters | 4 minuters | 4 minuters | 4 minuters |
Tabell 2: injektions protokoll för det mitokondriella stresstestet.
| Basala | Glukos (10 mM) | Oligomycin (2 μM) | 2-DG (50 mM) | |
| Upprepning | 3 gånger | 3 gånger | 3 gånger | 3 gånger |
| Mix | 3 minuters | 3 minuters | 3 minuters | 3 minuters |
| Vänta | 0 minuter med | 0 minuter med | 0 minuter med | 0 minuter med |
| Åtgärd | 7 minuters | 7 minuters | 7 minuters | 7 minuters |
Tabell 3: injektions protokoll för stresstestet glykolys.
| Port | Läkemedel | Slutlig brunn koncentration (μM) | Lagerlösning volym (μL) | Medie volym (μL) | Port lösning (μM) | Volym tillagd till port (μL) |
| Port A | Oligomycin | 2 | 100 | 181,25 | 16 | 25 |
| Port B | FCCP | 1,5 | 100 | 270,4 | 13,5 | 25 |
| Port C | Rotenon/Antimycin A | 0,5 | 60 | 240 | 5 | 25 |
Tabell 4: utspädnings mätvärden för att erhålla optimal läkemedelskoncentration för mitokondriell stresstest i varje brunn av analysatorn.
| Port | Läkemedel | Slutlig brunn koncentration | Lagerlösning volym (μL) | Medie volym (μL) | Port lösning | Volym tillagd till port (μL) |
| Port A | Glukos | 10 mM | 300 | 75 | 80 mM | 25 |
| Port B | Oligomycin | 2 μM | 108 | 192 | 18 μM | 25 |
| Port C | 2-DG | 50 mM | 300 | 0 | 500 mM | 25 |
Tabell 5: utspädnings mätvärden för att få optimal läkemedelskoncentration för glykolys stresstest i varje brunn av analysatorn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här visar vi isolering av en maximal mängd ren och livskraftig murint LSK HSPCs befolkning samt mätning av deras glykolys och mitokondriell andning med en extracellulär Flux Analyzer. Protokollet övervinner särskilt följande tekniska frågor för användning av LSK HSPCs: i) den låga frekvensen av LSK HSPCs i murin benmärg14, II) låg basal metabolisk aktivitet av LSK hspcs26, III) bräckligheten av LSK hspcs27, och IV) att LSK hspcs inte har anslutit sig till odlings fartyg15. Dessutom har vi optimerat läkemedelskoncentrationerna och mediernas sammansättning för optimal prestanda hos de extracellulära Flux-analyserna.
Benmärg-härledda HSPCs bor i hypoxisk nisch och de uppvisar en glykolytisk fenotyp, vilket är avgörande för upprätthållandet av deras stemness28. Å andra sidan är andningen nödvändig för HSPC-differentiering6. Som metabolisk dysfunktion av HSPCs leder till blodsjukdomar; Här har vi beskrivit protokollet och video-baserade tutorials för att mäta kännetecken för metaboliska funktioner, såsom OCR och ECAR, för murina benmärg-härledda LSK HSPCs.
I motsats till tillverkarens rekommendationer för anhängare celler, fann vi att glykolys stresstestresultat på LSK HSPCs är optimala när celler odlas i glukos/pyruvat + Media jämfört med glukos/pyruvat-media. Vi insåg att bristen på glukos i media för LSK hspcs resulterar i celldöd under ~ 2 h jämvikts period i en icke-Co2 inkubator. Eftersom glukos injektion inte ändra den basala nivån av ECAR för LSK HSPCs odlade i glukos/pyruvat + media, vår modifiering av protokollet bevarar inte bara essensen av det glykolytiska stresstestet, utan ger oss också möjlighet att skilja mellan basal glykolys (före eventuella injektioner), glykolytisk kapacitet (efter Oligomycin injektion) och icke-glykolytisk försurning (efter injektion med 2-DG) av LSK HSPCs.
Vår mitokondriella stresstest av LSK HSPCs visade att ATP produceras av oxidativ fosforylering i LSK HSPCs är minimal sett med den lilla minskningen av OCR efter Oligomycin injektion. Omvänt bekräftar höjden i OCR vid FCCP-injektionen att LSK HSPCs kan reagera på högre efterfrågan på energi.
Tillsammans var målet med detta protokoll att ge en uppsättning tydliga, koncisa instruktioner för att åtfölja video-baserade tutorials om hur man mäter de metaboliska funktionerna, såsom OCR och ECAR, av HSPCs. Med viktiga modifieringar och ytterligare rekommendationer för skörd högre antal friska LSK HSPCs, vilket gör dem anhängare till ytan av brunnen, liksom optimering av inkubationstiden och läkemedelskoncentrationen, detta protokoll kommer att ge utredare att analysera glykolys och mitokondriell andning status av HSPCs samt icke-anhängare hematopoietiska celler under blod utveckling och sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds delvis av finansieringsstödet från National Institutes of Health (HL131645, CA016058), St. Baldrick ' s Foundation och Pelotonia Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.01% (w/v) poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | Used for LSK attachment |
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-547 | Used for cell filtration after bone crushing |
| Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi | 130-090-485 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD45R/B220 Clone RA3-6B2 | BD Biosciences | 553086 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD5 Clone 53-7.3 | BD Biosciences | 553019 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD8a Clone 53-6.7 | BD Biosciences | 553029 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C Clone RB6-8C5 | BD Biosciences | 553125 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells Clone TER-119 | BD Biosciences | 553672 | Used for Lin- separation |
| CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody (2B8), APC | eBioscience | 17-1171-83 | Used for LSK sorting |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-53A | Used in cell isolation |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-432-22 | Used in cell isolation |
| Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-11A | Used for LSK sorting |
| Fetal Bovine Serum | Neuromics | FBS001-HI | Used in FACS buffer |
| Histopaque-1083 | Sigma | 10831 | Used for ficoll gradient separation |
| L-glutamine 100x | Fisher Scientific | 25-030-081 | Used for the assay media |
| LS Column | Miltenyi | 130-042-401 | Used for Lin- separation |
| Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonal Antibody (D7), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-5981-82 | Used for LSK sorting |
| Murine Stem Cell Factor (SCF) | PeproTech | 250-03-100UG | Used for the assay media |
| Murine Thrombopoietin (TPO) | PeproTech | 315-14-100UG | Used for the assay media |
| PBS 1% | Fisher Scientific | SH3002802 | Used for FACS buffer |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Fisher Scientific | 15140122 | Used for the assay media |
| Propidium Iodide | Fisher Scientific | P1304MP | Used for LSK sorting |
| Seahorse XFp Cell Culture Miniplate | Agilent Technologies | 103025-100 | Used for LSK seeding |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher | 11360070 | Used for the assay media |
| Streptavidin eFluor 450 Conjugate | eBioscience | 48-4317-82 | Used for LSK sorting |
| XF Calibrant | Agilent Technologies | 100840-000 | Used for cartridge equilibration |
| XF media | Agilent Technologies | 103575-100 | Used for the assay media |
| XFp Glycolysis Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103017100 | Drugs for glycolysis stress test |
| XFp Mitochondrial Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103010100 | Drugs for mitochondrial stress test |
| XFp Sensor Cartridge | Agilent Technologies | 103022-100 | Used for glycolysis and mitochondrial stress test |
References
- Dharampuriya, P. R., et al. Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).
- Wilkinson, A. C., Yamazaki, S. The hematopoietic stem cell diet. International Journal of Hematology. 107, 634-641 (2018).
- Kohli, L., Passegue, E. Surviving change: the metabolic journey of hematopoietic stem cells. Trends in Cell Biology. 24, 479-487 (2014).
- Abdel-Wahab, O., Levine, R. L. Metabolism and the leukemic stem cell. The Journal of Experimental Medicine. 207, 677-680 (2010).
- Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells International. 2019, 4067162 (2019).
- Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communication. 7, 13125 (2016).
- Anso, E., et al. The mitochondrial respiratory chain is essential for haematopoietic stem cell function. Nature Cell Biology. 19, 614-625 (2017).
- Wanet, A., Arnould, T., Najimi, M., Renard, P. Connecting Mitochondria, Metabolism, and Stem Cell Fate. Stem Cells and Development. 24, 1957-1971 (2015).
- Maryanovich, M., et al. An MTCH2 pathway repressing mitochondria metabolism regulates haematopoietic stem cell fate. Nature Communication. 6, 7901 (2015).
- Suda, T., Takubo, K., Semenza, G. L. Metabolic regulation of hematopoietic stem cells in the hypoxic niche. Cell Stem Cell. 9, 298-310 (2011).
- Zhang, C. C., Sadek, H. A. Hypoxia and metabolic properties of hematopoietic stem cells. Antioxidants & Redox Signaling. 20, 1891-1901 (2014).
- Snoeck, H. W. Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, 125-136 (2007).
- Chen, J., et al. Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice. Experimental Hematology. 36, 1236-1243 (2008).
- Jung, Y., et al. Hematopoietic stem cells regulate mesenchymal stromal cell induction into osteoblasts thereby participating in the formation of the stem cell niche. Stem Cells. 26, 2042-2051 (2008).
- Masuda, S., Li, M., Izpisua Belmonte, J. C. Niche-less maintenance of HSCs by 2i. Cell Research. 23, 458-459 (2013).
- Anderson, H., et al. Hematopoietic stem cells develop in the absence of endothelial cadherin 5 expression. Blood. 126, 2811-2820 (2015).
- Lo Celso, C., Scadden, D. Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs). Journal of Visualized Experiment. (157), (2007).
- Van Wyngene, L., Vandewalle, J., Libert, C. Reprogramming of basic metabolic pathways in microbial sepsis: therapeutic targets at last. EMBO Molecular Medicine. 10, (2018).
- Olson, K. A., Schell, J. C., Rutter, J. Pyruvate and Metabolic Flexibility: Illuminating a Path Toward Selective Cancer Therapies. Trends in Biochemical Sciences. 41, 219-230 (2016).
- Halestrap, A. P., Wilson, M. C. The monocarboxylate transporter family--role and regulation. IUBMB Life. 64, 109-119 (2012).
- Kim, A. Mitochondria in Cancer Energy Metabolism: Culprits or Bystanders. Toxicological Research. 31, 323-330 (2015).
- Fosslien, E. Mitochondrial medicine--molecular pathology of defective oxidative phosphorylation. Annals of Clinical & Laboratory Science. 31 (1), 25-67 (2001).
- Wick, A. N., Nakada, H. I., Wolfe, J. B. Localization of the primary metabolic block produced by 2-deoxyglucose. The Journal of Biological Chemistry. 224 (2), 963-969 (1957).
- Linnett, P. E., Beechey, R. B. Inhibitors of the ATP synthetase systems. Methods in Enzymology. 55, 472-518 (1979).
- Rimmele, P., et al. Mitochondrial metabolism in hematopoietic stem cells requires functional FOXO3. EMBO Reports. 16, 1164-1176 (2015).
- Riviere, I., Dunbar, C. E., Sadelain, M. Hematopoietic stem cell engineering at a crossroads. Blood. 119, 1107-1116 (2012).
- Ito, K., Suda, T. Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).
