Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Analyse af hæmatopoietisk Stam Progenitorcellernes metabolisme

Published: November 9, 2019 doi: 10.3791/60234
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Nationwide Children's Hospital, 2The Ohio State University College of Medicine, 3The Ohio State University Comprehensive Cancer Center

Summary

Hæmatopoietiske Stam progenitorceller (Hspc'er) overgang fra en lysende tilstand til en differentierings tilstand på grund af deres metaboliske plasticitet under dannelse af blod. Her præsenterer vi en optimeret metode til måling af mitokondrie respiration og glycolyse af Hspc'er.

Abstract

Hæmatopoietiske Stam progenitorceller (Hspc'er) har en distinkt metabolisk plasticitet, som giver dem mulighed for at overgå fra deres lysende tilstand til en differentierings tilstand for at opretholde kravene til bloddannelsen. Men, det har været vanskeligt at analysere metabolisk status (mitokondrie respiration og glycolyse) af Hspc'er på grund af deres begrænsede antal og mangel på optimerede protokoller for ikke-vedlige, skrøbelige Hspc'er. Her giver vi et sæt klare, trin-for-trin instruktioner til at måle metabolisk respiration (iltforbrug sats; OCR) og glykolyse (ekstracellulær forsurings hastighed; VOGN) af murine knoglemarvs LineagenegSca1+c-kit+ (LSK) hspc'er. Denne protokol giver en højere mængde af LSK Hspc'er fra murine knoglemarv, forbedrer levedygtigheden af Hspc'er under inkubation, letter ekstracellulære flux analyser af ikke-klæbende Hspc'er, og giver optimerede injektions protokoller (koncentration og tid) for lægemidler rettet mod oxidativ fosforylering og glykolytiske veje. Denne metode gør det muligt at forudsige den metaboliske status og sundheden for Hspc'er under blod udvikling og sygdomme.

Introduction

Da levetiden for de fleste modne blodlegemer er kort, er homøostase af blod afhængig af selvfornyelse og differentiering af en langvarig, men sjælden population af hæmatopoietiske stamceller (Hspc'er)1. Hspc'er er quiescent, men de er hurtige til at formere sig og undergår differentiering efter stimulation for at opretholde kravene i blodsystemet. Da hver HSPC cellulære tilstand kræver en unik bioenergetisk efterspørgsel, de metaboliske ændringer er centrale drivkræfter for HSPC skæbne beslutninger. Derfor, tabet af metabolisk plasticitet, ved at ændre balancen mellem quiescence, selvfornyelse, og differentiering af Hspc'er, ofte fører til myelo-eller lympho-proliferative lidelser. Sammen, forståelsen af metaboliske regulering af HSPC udvikling er afgørende for at afdække mekanismer underliggende hæmatologiske maligniteter2,3,4,5.

Mitokondrie respiration og glycolyse genererer ATP til at drive intracellulære reaktioner og producere de byggeklodser, som er nødvendige for makromolekyle syntese. Da hspc'er har lav mitokondrie masse sammenlignet med differentierede celler6 og de opretholder inaktive i hypoxisk knoglemarvs nicher, er hspc'er primært afhængige af glykolyse. Aktivering af hspc'er forbedrer deres mitokondrie metabolisme, der fører til tab af inaktive og deres efterfølgende indtræden i cellecyklussen. En sådan metabolisk plasticitet af hspc'er gør det muligt at vedligeholde HSPC-puljen i hele voksenlivet6,7,8,9,10,11,12. Derfor er det afgørende at undersøge deres metaboliske aktiviteter, såsom iltforbrug (OCR, indeks for oxidativ fosforylering) og den ekstracellulære forsuring (ECAR, Index of glycolyse) for at analysere HSPC-aktiveringen og sundhedsstatussen. Både OCR og ECAR kan måles samtidigt, i realtid, ved hjælp af en ekstracellulær flux analysator. Men den aktuelle metode kræver et stort antal celler og er optimeret til vedlige celler13. Da Hspc'er ikke kan isoleres i store mængder fra mus14, kræver sortering for at opnå en ren population, er ikke-vedstående celler15, og kan ikke dyrkes natten over uden at undgå differentiering16, har det været vanskeligt at måle OCR og ECAR af hspc'er. Her giver vi et sæt af klare, trin-for-trin instruktioner til at ledsage video-baserede tutorials om, hvordan man måler metabolisk respiration og glycolyse af få tusinder murine knoglemarv-LineagenegSca1+c-kit+ (LSK) hspc'er.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokol blev godkendt af landsdækkende børnepasning og brug Komité (IACUC).

Bemærk: Protokollen er beskrevet i kronologisk rækkefølge, der strækker sig over perioden på to dage. Brug friske reagenser som beskrevet i nedenstående protokol.

1. klargøring af reagenser dagen før analysen

  1. Fugt sensor patronen.
    1. Der Inkubér 5 mL af kalibranten (tabel over materialer) i en ikke-CO2 37 °c rugemaskine natten over.
    2. Åbn flux assay Kit (tabel over materialer) og adskille sensor patronen (grøn; top) fra brugs pladen (transparent; bund). Placer derefter sensor patronen på hovedet og støder op til brugs pladen.
    3. Ved hjælp af sterilt vand fyldes hullerne på brugs pladen (200 μL) og kamrene omkring brøndene (400 μL).
    4. Nedsænk sensor patronen i brugs pladen for at sikre, at sensorerne er helt dækket af vand. Tryk på 3x for at undgå dannelse af bobler.
    5. Anbring cylinderampullen nedsænket i brugs pladen i en ikke-CO2 37 °c inkubator natten over. For at undgå fordampning af vandet skal du sørge for, at inkubator er korrekt befuret. Anbring et åbent bægerglas, der indeholder H2O, som en ekstra forholdsregel ved siden af cylinderampullens brugs plade, især hvis der anvendes en almindelig ovn.
  2. Klargør analyse pladen.
    1. Steriliser overfladen af biosikkerhed kabinet klasse 2 ved hjælp af 70% ethanol. Åbn analyse pladen under hætten.
    2. Der tilsættes 40 μL kommercielt tilgængelig 0,01% (w/v) poly-L-lysin (PLL) opløsning til hver brønd af analyse pladen under hætten.
    3. Dæk analyse pladen til med låget i sættet. Den lukkede prøveplade inkubates ved stuetemperatur (RT) underkøler hjelmen i 1 time.
      Bemærk: Målet med inkubationen er at lade PLL belægge overfladen af analyse pladen for at lette vedhæftningen af suspension celler til overfladen af analyse pladen.
    4. Efter 1 h inkubation af analyse pladen, fjernes den overskydende opløsning med en steril vakuum baseret indsugnings og lufttørre brønden underkøler hjelmen.
      Bemærk: Det tager ~ 30 − 60 min at lufttørre brøndene af analyse pladen efter overdreven PLL fjernelse ved hjælp af aspiratoren.

2. analysens dag

  1. Klargør patronen.
    1. Løft sensor patronen. Placer det på hovedet i vævs kulturen hætte og kassér vandet fra brugs pladen.
    2. Fyld brugs pladen med 200 μL af den præ-varmede kalibrant.
    3. Fyld kamrene omkring brøndene med 400 μL kalibranten.
    4. Nedsænk sensor patronen i brugs pladen, og sørg for, at sensorerne er helt dækket af kalibranten. Tryk på 3x for at undgå dannelse af bobler.
    5. I en ikke-CO2 37 °c inkubator i 45 − 60 min. er sensor patronen nedsænket i brugs pladen.
  2. Høst murine knoglemarv-afledte LSK Hspc'er.
    1. For at imødekomme tilstrækkelige biologiske replikater, planlægger at bruge Hspc'er afledt af en mus pr brønd af analyse pladen.
      Bemærk: Denne knoglemarvs høst metode giver ~ 50000 − 80000 LSK Hspc'er fra hver mus. Denne protokol til måling af ekstracellulær flux er optimeret til ~ 70.000 LSK Hspc'er pr. brønd af en 96-brønd plade.
    2. Euthanize mus ved hjælp af CO2 overdosering og cervikal dislokation, efter lokale IACUC godkendte metoder.
    3. Steriliser overfladen af dissekere værktøjer og bænken ved hjælp af 70% ethanol.
    4. For hver mus, pre-fill en Petri skål med 1x fosfat-Buffered saltvand (PBS) indeholdende 2% varme inaktiveret føtal kvægserum (FBS) på RT.
      Bemærk: Brug ikke forkølet PBS, da det vil skabe klumper i følgende trin.
    5. Spray 70% ethanol (v/v) på hele den aflives mus. Isoler alle knogler, herunder øvre og nedre lemmer, hofte knogler, brystbenet, rib bur, og rygsøjlen, fra musen17,18. Træk ud hvidt stof fra rygmarven af musen, da det kan forurere LSK celler. Placer alle knogler i 1x PBS (+ 2% FBS), som de bliver indsamlet, i en Petri skål indtil videre brug.
    6. Vend et 50 mL konisk rør (nyt hver gang), og brug det til at triturere knogler nedsænket i 1x PBS (+ 2% FBS) i Petri skålen.
    7. Ved hjælp af en 10 mL serologisk pipette pipetter op og ned (~ 10x) for at skylle cellerne ensartet ud fra knogler efter knusning af knogler.
    8. Anbring et 40 μm-cellefilter på et 50 mL konisk rør. Før våd overfladen af si ved at passere 1 ml 1x PBS (+ 2% FBS).
    9. Høst knoglemarv-afledte cellesuspension fra trin 2.2.7 og passere det gennem den præ-våde overflade af cellen si at fjerne knoglerester.
    10. Gentag trin 2.2.6 til 2.2.9, indtil alle knogle materialer bliver hvide som en markør for, at de fleste knoglemarvsceller opsamles i 50 mL konisk slange.
      Bemærk: Det tager ofte 2 50 mL koniske rør pr. mus til at indsamle alle knoglemarv-afledte celler.
    11. Centrifuge 50 mL koniske rør indeholdende knoglemarvs afledte celler i 5 min ved 500 x g og rt.
    12. Fjern supernatanten. Resuspension knoglemarv-afledte celler (kombinere indholdet af begge 50 mL rør) i 5 mL 1x PBS (+ 2% FBS) som en endelig volumen og holde cellerne på RT.
  3. Høst mononukleerede murine knoglemarvsceller.
    1. Der tilsættes 5 mL tætheds gradient medium (dvs. Ficoll) til et 15 mL konisk rør. Tilsæt derefter langsomt 5 mL af knoglemarvs cellens suspension. Sørg for, at cellerne forbliver som et lag over massefylde forløbs mediet.
    2. Centrifuger i 30 minutter ved 500 x g og rt. Brug ikke en bremse i centrifugen. Sørg for, at centrifugen er ved den lavest mulige acceleration (f. eks. 1 acceleration og 0 deceleration).
    3. Høst den midterste grænseflade af mononukleerede celler (hvid farve) efter centrifugering i et frisk 15 mL konisk rør.
    4. Vaske celler, høstet fra tæthed gradient medium, med 5 mL 1x PBS (+ 2% FBS). Centrifugeres i 5 minutter ved 500 x g og 4 °c. Fjern supernatanten.
    5. Gentag trin 2.3.4.
    6. Resuspension af cellens indhold af røret i 300 μL 1x PBS (+ 2% FBS). Aliquot 10 μL cellesuspension til ufarvet eller enkelt farvet kontrol i et FACS-rør.
  4. Høst LSK Hspc'er fra mononukleerede murine knoglemarvsceller.
    1. Lav en cocktail af biotin-antistoffer ved at blande 3 μL pr. prøve af følgende antistoffer: Gr1, Cd8a, Cd5, B220, Ter119. Tilsæt 15 μL af biotin-antistof cocktailen til 300 μL mononukleerede knoglemarvsceller.
      Bemærk: Hvert antistof anvendes ved 1:100 fortynding.
    2. Inkuber celler med biotin-antistof-cocktail i 30 minutter ved 4 °C med agitation for at undgå, at cellerne klumpes i bunden af røret.
    3. Tilsæt 10 mL forkølet 1x PBS (+ 2% FBS) til celler blandet med biotin-antistof-cocktail.
    4. Centrifugeglasset centrifugeres i 5 minutter ved 500 x g og 4 °c. Supernatanten kasseres, og celle pellet opslæmmes i 400 μL 1x PBS (+ 2% FBS). Aliquot 10 μL for streptavidin-enkelt farve kontrol.
    5. Kortvarigt vortex anti-biotin mikroperler (tabel over materialer) før brug. Tilsæt 80 μL mikroperler til hver celleprøve (på 400 μL). Bland godt og Inkuber i yderligere 20 minutter ved 4 °C, med agitation.
    6. Tilsæt 10 mL forkølet 1x PBS (+ 2% FBS) til cellerne. Centrifugeglasset centrifugeres i 5 minutter ved 500 x g og 4 °c.
    7. Supernatanten kasseres, og celle pellet opslæmmes i 1 mL 1x PBS (+ 2% FBS). Opbevares ved 4 °C under Opsætning af magnetisk separations enhed.
    8. Placer en kolonne (tabel over materialer) i magnetfeltet i den magnetiske, assisterede celle sorterings-(Macs) separator ved 4 °c. Kolonnen forberedes til magnetisk separation ved at skylle den med 3 mL 1x PBS (+ 2% FBS) under gravitations strømmen ved 4 °C.
    9. Tilsæt cellesuspensionen fra trin 2.4.7 til den præ-våde kolonne ved 4 °C. Cellerne kan passere gennem søjlen ved 4 °C og opsamles i et 15 mL konisk rør.
      Bemærk: Brøken med ikke-mærkede celler i et sådant spildevand repræsenterer de forbedrede Lineage negative celler.
    10. Vask søjlen med 3 mL 1x PBS (+ 2% FBS) ved 4 °C. Gentag 3x. Saml gennemstrømningen og opbevar den ved 4 °C. Tæl de elueret levedygtige celler ved trypan og et blå udelukkelse ved hjælp af en hemocytometer.
    11. Den 15 mL koniske slange, der indeholder gennemstrømnings røret, centrifugeres i 5 min ved 500 x g og 4 °c. Kassér supernatanten. Resuspendér cellerne i 0,5 mL 1x PBS (+ 2% FBS) og Overfør indholdet til et FACS-rør.
    12. Tilsæt 24 μL LSK antistof cocktail til hver 107 celler. Antistof cocktail indeholder lige koncentration af 450-streptavidin antistof, PE-CY7-Sca1 antistof, og APC-c-kit antistof.
    13. Inkuber i 1 time ved 4 °C med agitation under mørke (dækket med tinfolie).
    14. Tilsæt 3 mL 1x PBS (+ 2% FBS) til FACS-røret. Centrifugeres i 5 minutter ved 500 x g og 4 °c. Kassér supernatanten.
    15. Resuspension af antistof-mærkede celler i 1 mL 1x PBS (+ 2% FBS). Tilsæt 1 μL 1 mg/mL propidium Iodid til cellesuspension lige før sortering.
    16. Filtrer indholdet af FACS-røret ved hjælp af en 40 μm-si lige før sortering af LSK-celler.
    17. Saml LSK-celler, via FACS sortering, i 1,5 mL rør indeholdende 0,5 mL komplette medier suppleret med 2 mM glutamin, 3 mg/mL glucose, 1 mM pyruvat, 1x trombopoietin (TPO), 1x stamcellefaktor (SCF), 0.5 x penicillin/streptomycin (P/S), pH 7,4 (tabel 1).

3. mitokondrie respiration og Glycolyse assays af LSK HSPCs

  1. LSK såning i analyse pladen
    1. Centrifuger LSK-celler fra trin 2.4.17 i 5 minutter ved 500 x g og rt. kassér supernatanten.
    2. Resuspension af celler i komplette medier til en endelig koncentration på mindst 70.000 celler/40 μL.
    3. Indhold af frø på 40 μL medier (indeholdende 70.000 celler) i den PLL-belagte 8-brønd plade fra trin 1.2.4. Lad alle hjørne brønde stå tomme.
    4. Centrifuge i 1 min ved 450 x g og rt. Anvend ikke bremsen. Sørg for, at cellerne er fastgjort til brønd bunden ved hjælp af det inverterede mikroskop.
    5. Der tilsættes 135 μL komplette medier til cellerne i hver brønd for et endeligt volumen på 175 μL. Tilsæt 175 μL komplette medier til pladens 2 hjørner som tomme.
    6. Cellerne i den ikke-CO2 -inkubator inkubates i 2 timer ved 37 °c.
    7. Indstil et program til at tilføje stoffer til hver brønd af brønd pladen i analysatoren ved hjælp af en måling beskrevet i tabel 2 (mitokondriel stresstest) og tabel 3 (glykolyse stresstest).
      Bemærk: mens cellerne inkubeerer, skal du tænde instrumentet og sikre, at det er ved 37 °C.
  2. Mitokondriel stresstest
    1. Forbered 45 μM stamopløsninger af oligomycin, 50 μM carbonylcyanid 4-(trifluromethoxy) phenylhydrazon (FCCP) og 25 μM stamopløsninger af rotenone/antimycin A. For at tilberede 45 μM oligomycin stamopløsning opløses indholdet af den kommercielt tilgængelige pose i 280 μL af hele mediet. For at tilberede 50 μM FCCP-stamopløsning opløses indholdet af den kommercielt tilgængelige pose i 288 μL af hele mediet. For at tilberede 25 μM rotenone/antimycin en stamopløsning opløses indholdet af den kommercielt tilgængelige pose i 216 μL af hele mediet.
    2. Tag sensor patronen i brugs pladen ud af inkubatoren, og læg dens porte (A, B og C) således, at hver brønd ville have den endelige koncentration af 2 μM oligomycin, 1,5 μM FCCP og 0,5 μM rotenone/antimycin A efter behov med de fortyndings målinger, der er beskrevet i tabel 4 (for iltforbrug).
    3. Fjern låget fra sensor patronen, der er samlet i brugs pladen, og anbring den på instrument bakken. Start kalibreringen, der vil tage 20 min.
    4. Efter kalibreringen fjernes brugs pladen og erstattes med en analyse plade, der indeholder LSK-celler, som nu overholdes i bunden af brønden.
    5. Tryk på Continue for at starte det program, der er beskrevet i tabel 2. Efter færdiggørelsen af programmet, hente data og analysere dem ved hjælp af Wave Desktop software.
      Bemærk: De data, der genereres fra de ekstracellulære flux-assays, kan afbildes ved hjælp af dot plot fra Wave Desktop software eller eksporteres til web-baseret statistikprogram.
  3. Glykolyse stresstest
    1. Der rekonstruere glucose i 300 μL (100 mM), oligomycin i 288 μL (50 μM), 2-D glucose (2-DG) i 300 μL (500 mM) komplette medier fra den kommercielt tilgængelige pose.
    2. Pipetten forsigtigt op og ned (~ 10x) for at solubilize forbindelserne. Vortex 2-DG i ca. 1 min for at sikre korrekt opløsning i medierne.
    3. Fjernsensor patronen fra inkubatoren. Indhent portene A til C efter fortyndings metrik som beskrevet i tabel 5 for at opnå en endelig koncentration på 10 mm glucose, 2 μM oligomycin og 50 mm 2-DG.
    4. Gentag trin 3.2.3 og 3.2.4.
    5. Tryk på Continue for at starte det program, der er beskrevet i tabel 3. Efter færdiggørelsen af programmet, hente data og analysere dem ved hjælp af Wave Desktop software.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vores ekstraktionsmetode tillod os at høste op til ~ 80.000 LSK Hspc'er pr. mus. Levedygtigheden og antallet af LSK-celler blev forbedret med vores metode, fordi vi: (1) kombineret knoglemarv fra øvre og nedre lemmer, hofte knogler, brystbenet, rib bur, og rygsøjlen, (2) undgås ved hjælp af rød cellelyse buffer, der ville have øget celle-død og clumping, (3) brugte tætheden gradient medium adskillelse af mono-nucleated celler, og (4) undgås ved hjælp af præ-kølet buffer, der ville have forårsaget tab af celler-af-interesse i klumper.

Selv om ekstracellulær flux analyse traditionelt har været anvendt til vedsiddende celler, vores brug af PLL belægning af brønde, efterfulgt af centrifugering af celler på det, lettet overholdelse af LSK HSPCs til overfladen af brønden. Dette tillod os at måle den ekstracellulære flux, og dermed metabolisk sundhed LSK HSPCs. i betragtning af det begrænsede antal celler, der kan høstes fra en mus og den lange varighed af protokollen for deres isolation, vores brug af analysator med sin 8 brønd format er dukket op som den mest omkostningseffektive og gennemførlige løsning (figur 1).

Cellerne bruger glycolyse og mitokondrie respiration til at genopbygge deres energibehov og til at producere mellemprodukter, der er nødvendige for deres spredning og vækst19. Hexokinaseenzymet omdanner glucose i glucose-6-phosphat, og det omdannes derefter til pyruvat20. Pyruvat kan derefter forarbejdes til laktat og eksporteres fra cellen med protoner21. ECAR måler forsuring af medierne og er således en indikator for glykolyse. Pyruvat kan også transporteres ind i mitokondrierne og omdannes i acetyl coenzym A (CoA). Acetyl CoA kommer ind i TCA cyklus, som giver energi mellemprodukter til at drive elektron bevægelser af elektron transport kæden (ETC) og genererer en protongradient i mitokondrie Inter-membran rum22. Oxygen fungerer som den endelige elektron acceptor, og protoner flytter tilbage til mitokondrie matrix gennem ATP syntase-komplekset og genererer ATP23. OCR måler iltforbruget, og det bruges derfor til at kvantificere mitokondrie respiration.

For at analysere OCR og ECAR i basal og stressede forhold, brugte vi sekventiel injektion af lægemidler, der forstyrrer glycolyse og mitokondrie respiration. Vi brugte glucose og 2-deoxyglucose (2-DG), en glukose analog, at initiere og blokere glycolyse henholdsvis24. Vi brugte Rotenone (en kompleks I-specifik hæmmer af ETC), antimycin A (en kompleks III-specifik hæmmer af ETC), oligomycin (hæmmer af ATP syntase), og afkoblings midlet carbonyl cyanid-4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazon (FCCP) til at blokere specifikke hændelser af ETC25. Vi titrerede sådanne reagenser for at finde den optimale koncentration for LKS Hspc'er (figur 2A, B).

For at udføre den glykolyse stresstest, vi dyrkede LSK Hspc'erne i en glukose/pyruvate dårligt stillede medier (som anbefalet af producenten), eller i glucose/pyruvat indeholder medier. Som forventet fandt vi det basale niveau af VOGNEN var højere for LSK Hspc'er dyrket i glucose/pyruvat + medier i forhold til LSK HSPCs dyrket i glucose/pyruvat-medier. Den første injektion med glucose ændrede ikke det basale niveau af ECAR for LSK Hspc'er dyrket i glucose/pyruvat + medier, mens det boostede glycolyse i LSK Hspc'er, der dyrkes i glucose/pyruvat-medier. Men det basale niveau af VOGNEN, efter injektionen med glucose, forblev lavere sammenlignet med glucose/pyruvat + gruppen. Den anden injektion med oligomycin, som kunne blokere produktionen af ATP gennem oxidativ fosforylering, aktiverede glycolysen på sit maksimale niveau af LSK Hspc'er i glucose/pyruvat + medier, men det påvirkede ikke glucose/pyruvat-gruppen. Den sidste injektion med glucose analog 2-DG returnerede VOGNEN til det ikke-glykolytiske niveau (figur 2C).

Til mitokondriel stresstest målte vi det basale niveau af OCR af LSK Hspc'er i glucose/pyruvat + medier. Vi injicerede først oligomycin, der oprindeligt hyperpolariserede mitokondrie membranen, forhindrede mere proton pumpning gennem ETC komplekser, og dermed reduceret satsen for mitokondrie respiration. Den anden injektion af FCCP ionophorer skubbet ETC og OCR niveauer til deres maksimum som celler forsøgte at genvinde mitokondrie membran potentiale. Den endelige injektion med andre to af de ETC-hæmmere (antimycin A og rotenon) forårsagede den komplette stop af mitokondrie respiration og dermed OCR vendt til sit mindsteniveau (figur 2D).

Figure 1
Figur 1: skema, som viser isolation af LineagenegSca1+c-kit+ (LSK) hæmatopoietiske Stam progenitorceller fra musens knoglemarv. Knoglemarv udvindes af knogler og mononukleare celler (multinationale selskaber) er isoleret gennem tæthed gradient medium gradient separation. Dernæst inkuberet cellerne med biotinyleret Lineage+ antistoffer og streptavidin-konjugeret magnetiske perler for at elueres Lineage negative (Lin-) celler efter deres magnetiske separation. Lin- cellerne inkuberet efterfølgende med LSK-antistoffer og LSK-celler isoleret ved celle sortering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: ekstracellulære flux analyser af murine LineagenegSca1+c-kit+ (LSK) hæmatopoietiske stamceller. (A, B) Mekanistisk beskrivelse af lægemidler anvendes til ekstracellulære flux analyser under glykolyse og mitokondrie respiration. C) repræsentative resultater af glykolyse stresstest på murine LSK hspc'er ved tilstedeværelse eller fravær af glucose/pyruvat i medierne. D) repræsentative resultater af mitokondriel stresstest på MURINE LSK Hspc'er. fejllinjer repræsenterer standardafvigelsen for middelværdien (S.D.) Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Lager Endelig koncentration Volumen i 30 mL
Komplette medier 28,691 mL
P/S 100x 0,5 x 150 μL
L-glutamin 200 mM 2 mM 300 μL
Pyruvat 100 mM 1 mM 300 μL
Glukose 1 M/180.2 mg/mL 3 mg/mL 499,4 μL
Tpo 100 μg/mL 100 ng/mL 30 μL
Scf 100 μg/mL 100 ng/mL 30 μL

Tabel 1: indhold og forberedelse af komplette XF-medier.

Basal Oligomycin (2 μM) FCCP (1,5 μM) R/A (0,5 μM)
Gentagelse 3 gange 3 gange 3 gange 3 gange
Mix 3 min 3 min 3 min 3 min
Vent 0 min 0 min 0 min 0 min
Foranstaltning 4 min 4 min 4 min 4 min

Tabel 2: injektions protokol for mitokondriel stresstest.

Basal Glucose (10 mM) Oligomycin (2 μM) 2-DG (50 mM)
Gentagelse 3 gange 3 gange 3 gange 3 gange
Mix 3 min 3 min 3 min 3 min
Vent 0 min 0 min 0 min 0 min
Foranstaltning : 7 minutters : 7 minutters : 7 minutters : 7 minutters

Tabel 3: injektions protokol for stresstesten af glykolyse.

Port Stof Endelig brønd koncentration (μM) Mængde af stamopløsning (μL) Medie volumen (μL) Portopløsning (μM) Volumen føjet til port (μL)
Port A Oligomycin 2 100 181,25 16 25
Port B FCCP 1,5 100 270,4 13,5 25
Port C Rotenone/antimycin A 0,5 60 240 5 25

Tabel 4: fortyndings målinger for at opnå optimal lægemiddelkoncentration for mitokondriel stresstest i hver brønd af analysatoren.

Port Stof Endelig brønd koncentration Mængde af stamopløsning (μL) Medie volumen (μL) Port-løsning Volumen føjet til port (μL)
Port A Glukose 10 mM 300 75 80 mM 25
Port B Oligomycin 2 μM 108 192 18 μM 25
Port C 2-DG 50 mM 300 0 500 mM 25

Tabel 5: fortyndings målinger for at opnå optimal lægemiddelkoncentration for glykolyse stresstest i hver brønd af analysatoren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her viser vi isolering af en maksimal mængde af ren og levedygtig murine LSK HSPCs befolkning samt måling af deres glycolyse og mitokondrie respiration med en ekstracellulær flux analysator. Protokollen overvinder især følgende tekniske problemer i forbindelse med brugen af LSK Hspc'er: i) den lave hyppighed af LSK Hspc'er i murine knoglemarv14, II) lav basal metabolisk aktivitet af LSK hspcs26, III) skrøbelighed af LSK hspcs27, og IV) manglende overholdelse af LSK hspc'er til kultur fartøjer15. Derudover har vi optimeret lægemiddel koncentrationerne og medie sammensætningen for den optimale ydeevne af de ekstracellulære flux-assays.

Knoglemarv-afledte hspc'er opholde sig i hypoksiske niche og de udviser en glykolytisk fænotype, som er afgørende for opretholdelsen af deres stemthed28. Omvendt er respiration afgørende for HSPC-differentiering6. Som metabolisk dysfunktion af Hspc'er fører til blodsygdomme; Her har vi beskrevet protokollen og video-baserede tutorials til at måle kendetegnene for metaboliske funktioner, såsom OCR og ECAR, for murine knoglemarv-afledte LSK HSPCs.

I modsætning til producentens anbefalinger til vedlægger celler, vi fandt, at glykolyse stresstest resultater på LSK hspc'er er optimale, når cellerne dyrkes i glucose/pyruvat + medier sammenlignet med glucose/pyruvat-medier. Vi indså, at manglen på glukose i medierne for LSK HSPCs resulterer i celledød i løbet af ~ 2 h ækvibrationsperioden i en ikke-CO2 inkubator. Da glukose indsprøjtningen ikke ændrede det basale niveau af ECAR for LSK Hspc'er, som dyrkes i glucose/pyruvat + medier, vores ændring af protokollen ikke kun bevarer essensen af glykolytisk stresstest, men det giver os også mulighed for at skelne mellem basal glycolyse (før nogen injektioner), glykolytisk kapacitet (efter oligomycin injektion) og ikke-glycolytisk forsuring (efter injektion med 2-DG) af LSK Hspc'er.

Vores mitokondrielle stresstest af LSK HSPCs viste, at ATP produceret af oxidativ fosforylering i LSK HSPCs er minimal som det ses med den lille reduktion i OCR efter oligomycin injektion. Omvendt bekræfter elevation i OCR på FCCP injektion, at LSK Hspc'er er i stand til at reagere på højere energiefterspørgsel.

Sammen, målet med denne protokol var at give et sæt af klare, præcise instruktioner til at ledsage video-baserede tutorials om, hvordan man måler de metaboliske funktioner, såsom OCR og ECAR, af Hspc'er. Med vigtige modifikationer og yderligere anbefalinger til høst af et højere antal sunde LSK Hspc'er, hvilket gør dem klækker til overfladen af brønden, samt optimering af inkubationstiden og stofkoncentrationen, vil denne protokol styrke efterforskere til at analysere glycolyse og mitokondrie respiration status af Hspc'er samt ikke-klædige hæmatopoietiske celler under blod udvikling og sygdomme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde er delvis støttet af finansieringen støtte fra National Institutes of Health (HL131645, CA016058), St. Baldrick Foundation, og Pelotonia Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.01% (w/v) poly-L-lysine solution Sigma P8920 Used for LSK attachment
40 µm cell strainer Fisher Scientific 22-363-547 Used for cell filtration after bone crushing
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi 130-090-485 Used for Lin- separation
Biotin Rat Anti-Mouse CD45R/B220 Clone RA3-6B2 BD Biosciences 553086 Used for Lin- separation
Biotin Rat Anti-Mouse CD5 Clone 53-7.3 BD Biosciences 553019 Used for Lin- separation
Biotin Rat Anti-Mouse CD8a Clone 53-6.7 BD Biosciences 553029 Used for Lin- separation
Biotin Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C Clone RB6-8C5 BD Biosciences 553125 Used for Lin- separation
Biotin Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells Clone TER-119 BD Biosciences 553672 Used for Lin- separation
CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody (2B8), APC eBioscience 17-1171-83 Used for LSK sorting
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Falcon-Fischer Scientific 14-959-53A Used in cell isolation
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Falcon-Fischer Scientific 14-432-22 Used in cell isolation
Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes Falcon-Fischer Scientific 14-959-11A Used for LSK sorting
Fetal Bovine Serum Neuromics FBS001-HI Used in FACS buffer
Histopaque-1083 Sigma 10831 Used for ficoll gradient separation
L-glutamine 100x Fisher Scientific 25-030-081 Used for the assay media
LS Column Miltenyi 130-042-401 Used for Lin- separation
Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonal Antibody (D7), PE-Cyanine7 eBioscience 25-5981-82 Used for LSK sorting
Murine Stem Cell Factor (SCF) PeproTech 250-03-100UG Used for the assay media
Murine Thrombopoietin (TPO) PeproTech 315-14-100UG Used for the assay media
PBS 1% Fisher Scientific SH3002802 Used for FACS buffer
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Fisher Scientific 15140122 Used for the assay media
Propidium Iodide Fisher Scientific P1304MP Used for LSK sorting
Seahorse XFp Cell Culture Miniplate Agilent Technologies 103025-100 Used for LSK seeding
Sodium Pyruvate (100 mM) ThermoFisher 11360070 Used for the assay media
Streptavidin eFluor 450 Conjugate eBioscience 48-4317-82 Used for LSK sorting
XF Calibrant Agilent Technologies 100840-000 Used for cartridge equilibration
XF media Agilent Technologies 103575-100 Used for the assay media
XFp Glycolysis Stress Test Kit Agilent Technologies 103017100 Drugs for glycolysis stress test
XFp Mitochondrial Stress Test Kit Agilent Technologies 103010100 Drugs for mitochondrial stress test
XFp Sensor Cartridge Agilent Technologies 103022-100 Used for glycolysis and mitochondrial stress test

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dharampuriya, P. R., et al. Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).
  2. Wilkinson, A. C., Yamazaki, S. The hematopoietic stem cell diet. International Journal of Hematology. 107, 634-641 (2018).
  3. Kohli, L., Passegue, E. Surviving change: the metabolic journey of hematopoietic stem cells. Trends in Cell Biology. 24, 479-487 (2014).
  4. Abdel-Wahab, O., Levine, R. L. Metabolism and the leukemic stem cell. The Journal of Experimental Medicine. 207, 677-680 (2010).
  5. Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells International. 2019, 4067162 (2019).
  6. Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communication. 7, 13125 (2016).
  7. Anso, E., et al. The mitochondrial respiratory chain is essential for haematopoietic stem cell function. Nature Cell Biology. 19, 614-625 (2017).
  8. Wanet, A., Arnould, T., Najimi, M., Renard, P. Connecting Mitochondria, Metabolism, and Stem Cell Fate. Stem Cells and Development. 24, 1957-1971 (2015).
  9. Maryanovich, M., et al. An MTCH2 pathway repressing mitochondria metabolism regulates haematopoietic stem cell fate. Nature Communication. 6, 7901 (2015).
  10. Suda, T., Takubo, K., Semenza, G. L. Metabolic regulation of hematopoietic stem cells in the hypoxic niche. Cell Stem Cell. 9, 298-310 (2011).
  11. Zhang, C. C., Sadek, H. A. Hypoxia and metabolic properties of hematopoietic stem cells. Antioxidants & Redox Signaling. 20, 1891-1901 (2014).
  12. Snoeck, H. W. Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).
  13. Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, 125-136 (2007).
  14. Chen, J., et al. Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice. Experimental Hematology. 36, 1236-1243 (2008).
  15. Jung, Y., et al. Hematopoietic stem cells regulate mesenchymal stromal cell induction into osteoblasts thereby participating in the formation of the stem cell niche. Stem Cells. 26, 2042-2051 (2008).
  16. Masuda, S., Li, M., Izpisua Belmonte, J. C. Niche-less maintenance of HSCs by 2i. Cell Research. 23, 458-459 (2013).
  17. Anderson, H., et al. Hematopoietic stem cells develop in the absence of endothelial cadherin 5 expression. Blood. 126, 2811-2820 (2015).
  18. Lo Celso, C., Scadden, D. Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs). Journal of Visualized Experiment. (157), (2007).
  19. Van Wyngene, L., Vandewalle, J., Libert, C. Reprogramming of basic metabolic pathways in microbial sepsis: therapeutic targets at last. EMBO Molecular Medicine. 10, (2018).
  20. Olson, K. A., Schell, J. C., Rutter, J. Pyruvate and Metabolic Flexibility: Illuminating a Path Toward Selective Cancer Therapies. Trends in Biochemical Sciences. 41, 219-230 (2016).
  21. Halestrap, A. P., Wilson, M. C. The monocarboxylate transporter family--role and regulation. IUBMB Life. 64, 109-119 (2012).
  22. Kim, A. Mitochondria in Cancer Energy Metabolism: Culprits or Bystanders. Toxicological Research. 31, 323-330 (2015).
  23. Fosslien, E. Mitochondrial medicine--molecular pathology of defective oxidative phosphorylation. Annals of Clinical & Laboratory Science. 31 (1), 25-67 (2001).
  24. Wick, A. N., Nakada, H. I., Wolfe, J. B. Localization of the primary metabolic block produced by 2-deoxyglucose. The Journal of Biological Chemistry. 224 (2), 963-969 (1957).
  25. Linnett, P. E., Beechey, R. B. Inhibitors of the ATP synthetase systems. Methods in Enzymology. 55, 472-518 (1979).
  26. Rimmele, P., et al. Mitochondrial metabolism in hematopoietic stem cells requires functional FOXO3. EMBO Reports. 16, 1164-1176 (2015).
  27. Riviere, I., Dunbar, C. E., Sadelain, M. Hematopoietic stem cell engineering at a crossroads. Blood. 119, 1107-1116 (2012).
  28. Ito, K., Suda, T. Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).

Tags

Udviklingsmæssige biologi hæmatopoietiske stamceller metabolisme mitokondriel respiration glykolyse ekstracellulær flux analyse ikke-vedlige celler
Analyse af hæmatopoietisk Stam Progenitorcellernes metabolisme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Scapin, G., Goulard, M. C.,… More

Scapin, G., Goulard, M. C., Dharampuriya, P. R., Cillis, J. L., Shah, D. I. Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism. J. Vis. Exp. (153), e60234, doi:10.3791/60234 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter