Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Analyse av blodkreft stem stamfar celle metabolisme

Published: November 9, 2019 doi: 10.3791/60234
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Nationwide Children's Hospital, 2The Ohio State University College of Medicine, 3The Ohio State University Comprehensive Cancer Center

Summary

Blodkreft stammen stamceller (HSPCs) overgang fra en Quiescent tilstand til en differensiering tilstand på grunn av deres metabolske plastisitet under bloddannelse. Her presenterer vi en optimalisert metode for måling av mitokondrie åndedrett og Glykolysen av HSPCs.

Abstract

Blodkreft stammen stamceller (HSPCs) har forskjellige metabolske plastisitet, som tillater dem å gå over fra sine Quiescent staten til en differensiering stat å opprettholde kravene i bloddannelse. Det har imidlertid vært vanskelig å analysere metabolsk status (mitokondrie åndedrett og Glykolysen) av HSPCs på grunn av deres begrensede tall og mangel på optimaliserte protokoller for ikke-tilhenger, skjøre HSPCs. Her gir vi et sett av klare, trinn-for-trinn-instruksjoner for å måle metabolsk åndedrett (oksygenforbruk rate; OCR) og Glykolysen (ekstracellulære forsuring rate; ECAR) av murine benmarg-LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) HSPCs. Denne protokollen gir en høyere mengde LSK HSPCs fra murine benmarg, forbedrer levedyktigheten til HSPCs under inkubasjons, forenkler ekstracellulære Flux analyser av ikke-tilhenger HSPCs, og gir optimalisert injeksjon protokoller (konsentrasjon og tid) for narkotika målretting oksidativt fosforylering og glycolytic trasé. Denne metoden gjør at prediksjon av metabolsk status og helsen til HSPCs under blod utvikling og sykdommer.

Introduction

Siden levetiden til de fleste eldre blodlegemer er kort, er homeostase av blod avhengig av selv-fornyelse og differensiering av en lang levetid, men sjelden befolkning på blodkreft stamceller (HSPCs)1. HSPCs er Quiescent, men de er raske til å spre og gjennomgå differensiering ved stimulering for å opprettholde kravene i blod systemet. Som hver HSPC mobilnettet tilstand krever en unik bioenergetisk etterspørsel, den metabolske endringene er sentrale drivere av HSPC skjebne beslutninger. Derfor, tap av metabolsk plastisitet, ved å endre likevekt mellom fredfulle omgivelser, selv-fornyelse, og differensiering av HSPCs, fører ofte til myelo-eller lymfe-proliferativ lidelser. Sammen er forståelsen av metabolsk regulering av HSPC utvikling avgjørende for å avdekke mekanismer underliggende Hematologic ondartet2,3,4,5.

Mitokondrie åndedrett og Glykolysen genererer ATP for å drive intracellulære reaksjoner og produsere byggesteinene som er nødvendige for Makromolekyl syntese. Siden HSPCs har lav mitokondrie masse i forhold til differensiert celler6 og de oppholder fredfulle omgivelser i hypoxic benmarg nisjer, HSPCs primært stole på Glykolysen. Aktivering av HSPCs forbedrer deres mitokondrie metabolisme som fører til tap av fredfulle omgivelser og deres påfølgende inntreden i cellesyklusen. Slike metabolske plastisitet av HSPCs tillater vedlikehold av HSPC bassenget gjennom voksne liv6,7,8,9,10,11,12. Derfor er det avgjørende å undersøke deres metabolske aktiviteter, slik som oksygen forbruksraten (OCR; indeks av oksidativt fosforylering) og ekstracellulære forsuring rate (ECAR; indeks av Glykolysen) for å analysere HSPC-aktiveringen og tilstandsstatusen. Både OCR og ECAR kan måles samtidig, i sanntid, ved hjelp av en ekstracellulære Flux analysator. Den gjeldende metoden krever imidlertid et stort antall celler og er optimalisert for tilhenger celler13. Siden HSPCs ikke kan isoleres i store mengder fra mus14, krever sortering for å få en ren befolkning, er ikke-tilhenger celler15, og kan ikke være kultivert over natten uten å unngå differensiering16, har det vært vanskelig å måle OCR og ECAR av HSPCs. Her gir vi et sett med klare, trinn-for-trinn-instruksjoner for å følge video-baserte opplæringsprogrammer om hvordan du kan måle metabolsk åndedrett og Glykolysen av få tusen murine benmarg-LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) HSPCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokollen ble godkjent av Nationwide Children ' s Hospital Animal Care og use Committee (IACUC).

Merk: Protokollen er beskrevet i kronologisk rekkefølge som strekker seg over perioden på to dager. Bruk friske reagenser som beskrevet i protokollen nedenfor.

1. utarbeidelse av reagenser på dagen før analysen

  1. Fukt sensor patronen.
    1. Ruge 5 mL av calibrant (tabell over materialer) i en ikke-CO2 37 ° c inkubator over natten.
    2. Åpne Flux analysen Kit (tabell av materialer) og skille sensor patron (grønn; topp) fra verktøyet plate (transparent; bunn). Deretter plasserer du sensor patronen opp ned og ved siden av verktøy platen.
    3. Ved bruk av sterilt vann, fyll brønnene på verktøy platen (200 μL) og kamrene rundt brønnene (400 μL).
    4. Senk sensor patronen inn i verktøy platen og pass på at sensorene er fullstendig dekket av vann. Tapp 3x for å unngå dannelse av bobler.
    5. Plasser kassetten nedsenket i verktøy platen i en ikke-CO2 37 ° c inkubator over natten. For å hindre fordampning av vann, sørg for at inkubator er riktig fuktet. Plasser et åpent beger som inneholder H2O som en ekstra forholdsregel ved siden av patron platen, spesielt hvis du bruker en vanlig ovn.
  2. Klargjør analyse platen.
    1. Sterilisere overflaten av biosafety kabinett klasse 2 med 70% etanol. Åpne analyse platen under panseret.
    2. Tilsett 40 μL av kommersielt tilgjengelige 0,01% (w/v) Poly-L-lysin (PLL) løsning til hver brønn av analysen plate under panseret.
    3. Dekk til analyse platen med lokket som følger med i settet. Ruge den lukkede analysen platen ved romtemperatur (RT) under panseret for 1 t.
      Merk: Målet med inkubasjons er å la PLL coat overflaten av analysen plate for å lette vedheft av suspensjon celler til overflaten av analysen plate.
    4. Etter 1 h inkubasjons av analysen plate, fjerne overflødig oppløsning med en steril vakuum-baserte aspirator og lufttørke brønnen under panseret.
      Merk: Det tar ~ 30 − 60 min å luft-tørke brønnene av analysen plate etter overdreven PLL fjerning ved hjelp av aspirator.

2. dag i analysen

  1. Klargjør kassetten.
    1. Løft sensor patronen. Plasser den opp-ned i vevet kultur panseret og kast vannet fra verktøy platen.
    2. Fyllverktøy plate brønnene med 200 μL av forvarmet calibrant.
    3. Fyll kamrene rundt brønnene med 400 μL av calibrant.
    4. Senk sensor patronen inn i verktøy platen, og pass på at sensorene er fullstendig dekket av calibrant. Tapp 3x for å unngå dannelse av bobler.
    5. Likevekt sensor kassetten nedsenket i verktøy platen i en ikke-CO2 37 ° c inkubator for 45 − 60 min.
  2. Harvest murine benmarg-avledet LSK HSPCs.
    1. For å imøtekomme tilstrekkelig biologiske replikerer, planlegger å bruke HSPCs avledet fra en mus per brønn av analysen plate.
      Merk: Dette benmarg-høsting metoden gir ~ 50000 − 80000 LSK HSPCs fra hver mus. Denne protokollen til å måle ekstracellulære Flux er optimalisert for ~ 70 000 LSK HSPCs per brønn av en 96 godt plate.
    2. Euthanize mus bruker CO2 overdose og cervical forvridning, etter lokale IACUC godkjente metoder.
    3. Sterilisere overflaten av dissekere verktøy og benken med 70% etanol.
    4. For hver mus, pre-fylle en Petri parabolen med 1x fosfat-bufret saltvann (PBS) inneholder 2% varme deaktivert fosterets storfe serum (FBS) ved RT.
      Merk: Ikke bruk pre-kjølt PBS som det vil skape klumper i følgende trinn.
    5. Spray 70% etanol (v/v) på hele euthanized musen. Isolere alle bein, inkludert øvre og nedre lemmer, hofte bein, brystbenet, rib Cage, og ryggraden, fra musa17,18. Trekk ut hvit materie fra ryggmargen på musen som det kan forurense LSK celler. Plasser alle bein i 1x PBS (+ 2% FBS), som de blir samlet inn, i en Petri parabolen til videre bruk.
    6. Inverter en 50 mL konisk rør (ny hver gang) og bruke den til å triturate bein neddykket i 1x PBS (+ 2% FBS) i Petri parabolen.
    7. Ved hjelp av en 10 mL serologisk pipette, pipette opp og ned (~ 10x) til jevnt skylle ut celler fra bein, etter knusing bein.
    8. Plasser et 40 μm celle sil på et 50 mL konisk rør. Pre-Wet overflaten av sil ved å passere 1 mL av 1x PBS (+ 2% FBS).
    9. Harvest benmarg-avledet celle suspensjon fra trinn 2.2.7 og gi det gjennom pre-våte overflaten av celle sil for å fjerne bein rusk.
    10. Gjenta trinn 2.2.6 gjennom 2.2.9 til alle bein materialer blir hvite som en markør som de fleste av benmargceller er samlet inn i 50 mL konisk rør.
      Merk: Det tar ofte 2 50 mL koniske rør per mus for å samle alle benmarg-avledede celler.
    11. Sentrifuger 50 mL koniske rør som inneholder benmarg-avledede celler i 5 min ved 500 x g og RT.
    12. Fjern supernatanten. Resuspend benmarg-avledede celler (kombinere innhold av begge 50 mL rør) i 5 mL 1x PBS (+ 2% FBS) som et endelig volum og holde celler på RT.
  3. Harvest mononucleated murine benmargceller.
    1. Tilsett 5 mL tetthet gradient medium (dvs. Ficoll) til en 15 mL konisk rør. Deretter sakte tilsett 5 mL av benmarg celle suspensjon. Sørg for at cellene forblir som et lag over tettheten gradient medium.
    2. Sentrifuger for 30 min ved 500 x g og RT. Ikke bruk en brems i sentrifuge. Sørg for at sentrifuger er på lavest mulig akselerasjon (f. eks 1 akselerasjon og 0 retardasjon).
    3. Harvest midten grensesnittet av mononucleated celler (hvit farge) etter sentrifugering inn i en frisk 15 mL konisk rør.
    4. Vaske celler, høstet fra tetthet gradient medium, med 5 mL 1x PBS (+ 2% FBS). Sentrifuger for 5 min ved 500 x g og 4 ° c. Fjern supernatanten.
    5. Gjenta trinn-2.3.4.
    6. Resuspend celleinnholdet i røret i 300 μL av 1x PBS (+ 2% FBS). Alikvot 10 μL av celle fjæring for unstained eller enkelt fargekontroll i et FACS-rør.
  4. Harvest LSK HSPCs fra mononucleated murine benmargceller.
    1. Lag en cocktail av biotin-antistoffer ved å blande 3 μL per prøve av følgende antistoffer: Gr1, Cd8a, Cd5, B220, Ter119. Tilsett 15 μL-cocktail av biotin-antistoff til 300 μL av mononucleated benmargceller.
      Merk: Hvert antistoff brukes ved 1:100 fortynning.
    2. Ruge cellene med biotin-antistoff cocktail i 30 min ved 4 ° c med agitasjon for å unngå celler klumper i bunnen av røret.
    3. Tilsett 10 mL av pre kjølt 1x PBS (+ 2% FBS) til celler blandet med biotin-antistoff cocktail.
    4. Sentrifuger røret i 5 min ved 500 x g og 4 ° c. Kast supernatanten og resuspend celle pellet i 400 μL av 1x PBS (+ 2% FBS). Alikvot 10 μL for streptavidin-enkelt fargekontroll.
    5. En kort Vortex mikroperler (materialfortegnelsen) før bruk. Tilsett 80 μL av mikroperler i hvert celleutvalg (av 400 μL). Bland godt og ruge for ytterligere 20 min ved 4 ° c, med agitasjon.
    6. Tilsett 10 mL av pre kjølt 1x PBS (+ 2% FBS) til celler. Sentrifuger røret i 5 min ved 500 x g og 4 ° c.
    7. Kast supernatanten og resuspend celle pellet i 1 mL 1x PBS (+ 2% FBS). Oppbevares ved 4 ° c mens du setter opp magnet skille enhet.
    8. Plasser en kolonne (tabell av materialer) i det magnetiske feltet for den magnetiske assistert celle sortering (Mac) separator ved 4 ° c. Klargjør søylen for magnetisk separasjon ved å skylle den med 3 mL 1x PBS (+ 2% FBS) under tyngdekraft strømningen ved 4 ° c.
    9. Legg celle fjæringen fra trinn 2.4.7 til den pre-våte søylen ved 4 ° c. Tillat at cellene passerer gjennom kolonnen ved 4 ° c og samler inn avløpsvann i et 15 mL konisk rør.
      Merk: Fraksjonen med umerkede celler i slike avløpsvann representerer beriket avstamning negative celler.
    10. Vask søyle med 3 mL 1x PBS (+ 2% FBS) ved 4 ° c. Gjenta 3x. Samle gjennomstrømning og holde den ved 4 ° c. Telle eluert levedyktige celler ved trypan blå eksklusjon ved hjelp av en hemocytometer.
    11. Sentrifuger 15 mL konisk rør som inneholder gjennomstrømning i 5 min ved 500 x g og 4 ° c. Kast supernatanten. Resuspend celler i 0,5 mL av 1x PBS (+ 2% FBS) og overføre innholdet til en FACS tube.
    12. Tilsett 24 μL av LSK antistoff cocktail til hver 107 celler. Antistoff-cocktail inneholder lik konsentrasjon av 450-streptavidin antistoff, PE-CY7-Sca1 antistoff, og APC-c-Kit-antistoff.
    13. Ruge for 1 time ved 4 ° c med agitasjon under mørk (dekket med tinn folie).
    14. Tilsett 3 mL 1x PBS (+ 2% FBS) til FACS røret. Sentrifuger for 5 min ved 500 x g og 4 ° c. Kast supernatanten.
    15. Resuspend antistoff-merkede celler i 1 mL 1x PBS (+ 2% FBS). Tilsett 1 μL av 1 mg/mL propidium iodide til celle oppheng like før sortering.
    16. Filtrer innholdet i FACS røret ved hjelp av en 40 μm sil rett før sortering LSK celler.
    17. Samle LSK-celler, via FACS-sortering, i 1,5 mL rør som inneholder 0,5 mL komplett Media supplert med 2 mM glutamin, 3 mg/mL glukose, 1 mM pyruvat, 1x thrombopoietin (TPO), 1x stilk cellen faktor (SCF), 0,5 x penicillin/Streptomycin (P/S), pH 7,4 (tabell 1).

3. mitokondrie åndedrett og Glykolysen analyser av LSK HSPCs

  1. LSK seeding i analysen plate
    1. Sentrifuger LSK celler fra trinn 2.4.17 i 5 min ved 500 x g og RT. kast supernatanten.
    2. Resuspend celler i komplette medier til en endelig konsentrasjon på minst 70 000 celler/40 μL.
    3. Seed innhold av 40 μL Media (som inneholder 70 000 celler) i PLL-belagt 8-brønn plate fra trinn 1.2.4. La alle hjørne brønner være tomme.
    4. Sentrifuger for 1 min ved 450 x g og RT. Ikke Påfør bremsen. Sørg for at cellene er festet til brønn bunnen ved hjelp av det omvendte mikroskopet.
    5. Tilsett 135 μL av komplette medier til cellene i hver brønn for et endelig volum på 175 μL. Tilsett 175 μL av komplette medier til de 2 hjørnene på tallerkenen som blanke.
    6. Ruge cellene i Non-CO2 inkubator for 2 h ved 37 ° c.
    7. Sett opp et program for å legge narkotika til hver brønn av brønnen plate i analysator ved hjelp av en beregning beskrevet i tabell 2 (mitokondrie stress test) og tabell 3 (Glykolysen stress test).
      Merk: mens cellene er incubating, slå på instrumentet og sørg for at det er på 37 ° c.
  2. Mitokondrie stress test
    1. Forbered 45 μM lager løsninger av oligomycin, 50 μM karbonyl cyanid 4-(trifluromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) og 25 μM lager løsninger av rotenon/antimycin A. For å klargjøre 45 μM oligomycin lagerløsning, oppløse innholdet i den kommersielt tilgjengelige posen i 280 μL av hele mediet. For å klargjøre 50 μM FCCP lagerløsning, oppløse innholdet i den kommersielt tilgjengelige posen i 288 μL av hele mediet. For å klargjøre 25 μM rotenon/antimycin en lagerløsning, oppløse innholdet i den kommersielt tilgjengelige posen i 216 μL av hele mediet.
    2. Ta sensor patronen i verktøy platen ut av inkubator og Last inn portene (A, B og C) slik at hver brønn vil ha endelig konsentrasjon av 2 μM-oligomycin, 1,5 μM FCCP og 0,5 μM av rotenon/antimycin A etter behov, etter fortynning-beregninger beskrevet i Tabell 4 (for oksygen forbruks rate).
    3. Fjern lokket fra sensor kassetten som er montert i verktøy platen, og plasser den på instrumentbrettet. Start kalibreringen som vil ta 20 min.
    4. Etter kalibreringen, fjerne verktøyet plate og erstatte den med analysen plate som inneholder LSK celler, som nå overholdt bunnen av brønnen.
    5. Trykk på Fortsett for å starte programmet som er beskrevet i tabell 2. Etter ferdigstillelse av programmet, hente data og analysere dem ved hjelp av Wave desktop programvare.
      Merk: Dataene generert fra ekstracellulære Flux analysene kan tegnes ved hjelp av prikken tomten fra Wave desktop programvare eller eksporteres til Web-basert statistikk program.
  3. Glykolysen stress test
    1. Rekonstituer glukose i 300 μL (100 mM), oligomycin i 288 μL (50 μM), 2-D glukose (2-DG) i 300 μL (500 mM) av komplette medier fra den kommersielt tilgjengelige posen.
    2. Forsiktig pipette opp og ned (~ 10x) for å solubilize forbindelsene. Vortex 2-DG i ca 1 min for å sikre riktig oppløsning i Media.
    3. Fjernsensor patronen ut fra inkubator. Last inn porter A til C etter fortynnings målingene beskrevet i tabell 5 for å oppnå en endelig konsentrasjon på 10 mm glukose, 2 μM oligomycin og 50 mm 2-DG.
    4. Gjenta trinn 3.2.3 og 3.2.4.
    5. Trykk på Fortsett for å starte programmet som er beskrevet i tabell 3. Etter ferdigstillelse av programmet, hente data og analysere dem ved hjelp av Wave desktop programvare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vår utvinning metoden tillot oss å høste opp til ~ 80 000 LSK HSPCs per mus. Levedyktigheten og antall LSK celler ble forbedret med vår metode, fordi vi: (1) kombinert benmarg fra øvre og nedre lemmer, hofte bein, brystbenet, ribbe bur, og ryggraden, (2) unngås ved hjelp av rød cellelyse buffer som ville ha økt celle-død og klumper, (3) brukt tettheten gradient medium separasjon av mono-kjerne celler, og (4) unngås ved hjelp av pre-kjølt buffer som ville ha forårsaket tap av celler-av-interesse i klumper.

Selv om ekstracellulære Flux analyse har vært tradisjonelt brukt til tilhenger celler, vår bruk av PLL belegg av brønner, etterfulgt av sentrifugering av celler på den, lettere overholdelse av LSK HSPCs til overflaten av brønnen. Dette tillot oss å måle ekstracellulære Flux, og dermed metabolske helsen til LSK HSPCs. tatt i betraktning det begrensede antall celler som kan høstes fra en mus og den lange varigheten av protokollen for isolering deres, vår bruk av analysator med sin 8 brønn format har dukket opp som den mest kostnadseffektive og gjennomførbare løsning (figur 1).

Celler bruker Glykolysen og mitokondrie åndedrett til å etterfylle sine energibehov og til å produsere mellom produkter som trengs for deres spredning og vekst19. Den heksokinase enzym konverterer glukose i glukose-6-fosfat og det er senere forvandlet til pyruvat20. Pyruvat kan deretter bearbeides til melkesyre og eksporteres fra cellen med protoner21. ECAR måler forsuring av mediene og er således en indikator på Glykolysen. Pyruvat kan også transporteres inn i mitokondrier og omdannes i acetyl koenzym A (CoA). Acetyl CoA inn i TCA-syklusen, som gir energi mellom produkter for å drive elektron bevegelser av Electron transport Chain (ETC) og genererer et proton gradient i mitokondrie Inter-membran plass22. Oksygen fungerer som den endelige elektron Acceptor, og protoner flytte tilbake til mitokondrie matrise gjennom ATP syntase komplekse samtidig generere ATP23. OCR måler oksygen forbruket og brukes derfor til å kvantifisere mitokondrie åndedrett.

For å analysere OCR og ECAR i basal og stresset forhold, brukte vi sekvensiell injeksjon av legemidler som forstyrrer Glykolysen og mitokondrie åndedrett. Vi brukte glukose og 2-deoxyglucose (2-DG), en glukose analog, til å initiere og blokkere Glykolysen henholdsvis24. Vi brukte rotenon (en kompleks I-spesifikk hemmer av ETF), antimycin A (en kompleks III-spesifikk hemmer av ETF), oligomycin (hemmer av ATP syntase), og frakobling agent karbonyl cyanid-4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) for å blokkere bestemte hendelser av ETC25. Vi titrert slike reagenser for å finne den optimale konsentrasjonen for LKS HSPCs (figur 2A, B).

For å utføre Glykolysen stress test, dyrket vi LSK HSPCs i en glukose/pyruvat fratatt Media (som anbefalt av produsenten), eller i glukose/pyruvat som inneholder Media. Som forventet, fant vi basal nivået på ECAR var høyere for LSK HSPCs kultivert i glukose/pyruvat + Media i forhold til LSK HSPCs kultivert i glukose/pyruvat-Media. Den første injeksjon med glukose ikke endre basal nivået av ECAR for LSK HSPCs kultivert i glukose/pyruvat + Media mens det styrket Glykolysen i LSK HSPCs kultivert i glukose/pyruvat-Media. Men basal nivået av ECAR, etter injeksjon med glukose, forble lavere sammenlignet med glukose/pyruvat + gruppe. Den andre injeksjon med oligomycin, som kan blokkere produksjonen av ATP gjennom oksidativt fosforylering, aktiverte Glykolysen på sitt maksimale nivå av LSK HSPCs i glukose/pyruvat + Media, men det påvirket ikke glukose/pyruvat-gruppen. Den siste injeksjonen med den analoge glukose 2-DG returnerte ECAR til sitt ikke-glycolytic nivå (figur 2C).

For mitokondrie stress test, målte vi basal nivået av OCR av LSK HSPCs i glukose/pyruvat + Media. Vi først injisert oligomycin som i utgangspunktet hyperpolarized mitokondrie membranen, hindret mer Proton pumping gjennom ETF komplekser, og dermed reduserte frekvensen av mitokondrie åndedrett. Den andre injeksjon av FCCP ionophores skjøvet ETC og OCR nivåer til sitt maksimum som celler prøvde å gjenopprette mitokondrie membran potensialet. Den endelige injeksjonen med andre to av ETF-hemmere (antimycin A og rotenon) forårsaket hele stopp av mitokondrie åndedrett og dermed OCR tilbake til sitt minimumsnivå (figur 2D).

Figure 1
Figur 1: skjema demonstrere isolering av avstamningnegSca1+c-Kit+ (LSK) blodkreft stem stamceller fra mus benmarg. Benmarg er Hentet fra bein og mononukleære celler (MNCs) er isolert gjennom tetthet gradient medium gradient separasjon. Deretter blir celler inkubert med biotinylated Lineage+ antistoffer og streptavidin magnetiske perler for å eluere Lineage negative (Lin-) celler etter deres magnetiske separasjon. Lin- celler er senere INKUBERT med LSK ANTISTOFFER og LSK celler isolert ved celle sortering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: ekstracellulære Flux analyser av murine LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) blodkreft stem stamceller. (A, B) Mekanistisk beskrivelse av medikamenter benyttet for ekstracellulære Flux analyser under Glykolysen og mitokondrie åndedrett. (C) representative resultater av Glykolysen stress test på murine LSK HSPCs i nærvær eller fravær av glukose/pyruvat i Media. (D) representative resultater av mitokondrie stress test på murine LSK HSPCs. feilfelt representerer standardavviket for middelverdien (S.D.) Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Lager Endelig konsentrasjon Volum for 30 mL
Komplette medier 28,691 mL
P/S 100x 0,5 x 150 μL
L-glutamin 200 mM 2 mM med 300 μL
Pyruvat 100 mM 1 mM med 300 μL
Glukose 1 M/180.2 mg/mL 3 mg/mL 499,4 μL
TPO 100 μg/mL 100 ng/mL 30 μL
SCF 100 μg/mL 100 ng/mL 30 μL

Tabell 1: innhold og utarbeidelse av komplette XF-medier.

Basal Oligomycin (2 μM) FCCP (1,5 μM) R/A (0,5 μM)
Gjentakelse tre ganger tre ganger tre ganger tre ganger
Blanding 3 min 3 min 3 min 3 min
vent 0 min 0 min 0 min 0 min
Måle 4 min 4 min 4 min 4 min

Tabell 2: injeksjon protokoll for mitokondrie stress test.

Basal Glukose (10 mM) Oligomycin (2 μM) 2-DG (50 mM)
Gjentakelse tre ganger tre ganger tre ganger tre ganger
Blanding 3 min 3 min 3 min 3 min
vent 0 min 0 min 0 min 0 min
Måle 7 min 7 min 7 min 7 min

Tabell 3: injeksjon protokoll for Glykolysen stress test.

Port Stoffet Endelig brønn konsentrasjon (μM) Volum for lagerløsning (μL) Medie volum (μL) Port løsning (μM) Volum lagt til port (μL)
Port A Oligomycin 2 100 181,25 16 25
Port B FCCP 1,5 100 270,4 13,5 25
Port C Rotenon/antimycin A 0,5 60 240 5 25

Tabell 4: Fortynnings målinger for å oppnå optimal legemiddelkonsentrasjon for mitokondrie stress test i hver brønn av analysator.

Port Stoffet Endelig brønn konsentrasjon Volum for lagerløsning (μL) Medie volum (μL) Port løsning Volum lagt til port (μL)
Port A Glukose 10 mM av 300 75 80 mM 25
Port B Oligomycin 2 μM av 108 192 18 μM 25
Port C 2-DG 50 mM 300 0 500 mM 25

Tabell 5: Fortynnings målinger for å oppnå optimal legemiddelkonsentrasjon for Glykolysen stress test i hver brønn av analysator.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her viser vi isolering av en maksimal mengde ren og levedyktig murine LSK HSPCs befolkning samt måling av deres Glykolysen og mitokondrie åndedrett med en ekstracellulære Flux analysator. Nærmere bestemt, overvinner protokollen følgende tekniske problemer for bruk av LSK HSPCs: i) den lave frekvensen av LSK HSPCs i murine benmarg14, II) lav basal metabolsk aktivitet av LSK HSPCs26, III) skjørhet av LSK HSPCs27, og IV) den ikke-overholdelse av LSK HSPCs til kultur fartøy15. I tillegg har vi optimalisert konsentrasjonen av legemidlet og medie sammensetning for å oppnå optimal ytelse for ekstracellulære Flux-analyser.

Benmarg-avledet HSPCs bor i hypoxic nisje og de viser en glycolytic fenotype, som er avgjørende for vedlikehold av deres stemness28. Motsatt er åndedrett viktig for HSPC differensiering6. Som metabolsk dysfunksjon av HSPCs fører til blodsykdommer; Her har vi beskrevet protokollen og video-baserte opplæringsprogrammer for å måle kjennetegnene av metabolske funksjoner, slik som OCR og ECAR, for murine benmarg-avledet LSK HSPCs.

I motsetning til produsenten anbefalinger for tilhenger celler, fant vi ut at Glykolysen stress testresultater på LSK HSPCs er optimal når cellene er kultivert i glukose/pyruvat + Media i forhold til glukose/pyruvat-Media. Vi innså at mangelen på glukose i media for LSK HSPCs resulterer i celle død i løpet av ~ 2 h likevekts periode i en ikke-CO2 inkubator. Som glukose injeksjon ikke endre basal nivået på ECAR for LSK HSPCs kultivert i glukose/pyruvat + Media, vår modifikasjon av protokollen ikke bare bevarer essensen av glycolytic stress test, men også tillater oss å skille mellom basal Glykolysen (før noen injeksjoner), glycolytic kapasitet (etter oligomycin injeksjon) og ikke-glycolytic forsuring (etter injeksjon med 2-DG) av LSK HSPCs.

Vår mitokondrie stress test av LSK HSPCs viste at ATP produsert av oksidativt fosforylering i LSK HSPCs er minimal sett med den lille reduksjonen i OCR etter oligomycin injeksjon. Motsatt, den høyde i OCR på FCCP injeksjon bekrefter at LSK HSPCs er i stand til å svare på høyere energibehov.

Sammen, målet med denne protokollen var å gi et sett av klare, konsise instruksjoner for å følge video-baserte opplæringsprogrammer om hvordan å måle metabolske funksjoner, slik som OCR og ECAR, av HSPCs. Med viktige modifikasjoner og ytterligere anbefalinger for høsting høyere antall sunne LSK HSPCs, noe som gjør dem tilhenger til overflaten av brønnen, samt optimalisering av inkubasjonstid og medikament konsentrasjon, vil denne protokollen styrke etterforskere til å analysere Glykolysen og mitokondrie åndedrett status HSPCs så vel som ikke-tilhenger blodkreft celler under blod utvikling og sykdommer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet er delvis støttet av finansieringen støtte fra National Institutes of Health (HL131645, CA016058), St. Baldrick ' s Foundation, og Pelotonia Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.01% (w/v) poly-L-lysine solution Sigma P8920 Used for LSK attachment
40 µm cell strainer Fisher Scientific 22-363-547 Used for cell filtration after bone crushing
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi 130-090-485 Used for Lin- separation
Biotin Rat Anti-Mouse CD45R/B220 Clone RA3-6B2 BD Biosciences 553086 Used for Lin- separation
Biotin Rat Anti-Mouse CD5 Clone 53-7.3 BD Biosciences 553019 Used for Lin- separation
Biotin Rat Anti-Mouse CD8a Clone 53-6.7 BD Biosciences 553029 Used for Lin- separation
Biotin Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C Clone RB6-8C5 BD Biosciences 553125 Used for Lin- separation
Biotin Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells Clone TER-119 BD Biosciences 553672 Used for Lin- separation
CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody (2B8), APC eBioscience 17-1171-83 Used for LSK sorting
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Falcon-Fischer Scientific 14-959-53A Used in cell isolation
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Falcon-Fischer Scientific 14-432-22 Used in cell isolation
Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes Falcon-Fischer Scientific 14-959-11A Used for LSK sorting
Fetal Bovine Serum Neuromics FBS001-HI Used in FACS buffer
Histopaque-1083 Sigma 10831 Used for ficoll gradient separation
L-glutamine 100x Fisher Scientific 25-030-081 Used for the assay media
LS Column Miltenyi 130-042-401 Used for Lin- separation
Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonal Antibody (D7), PE-Cyanine7 eBioscience 25-5981-82 Used for LSK sorting
Murine Stem Cell Factor (SCF) PeproTech 250-03-100UG Used for the assay media
Murine Thrombopoietin (TPO) PeproTech 315-14-100UG Used for the assay media
PBS 1% Fisher Scientific SH3002802 Used for FACS buffer
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Fisher Scientific 15140122 Used for the assay media
Propidium Iodide Fisher Scientific P1304MP Used for LSK sorting
Seahorse XFp Cell Culture Miniplate Agilent Technologies 103025-100 Used for LSK seeding
Sodium Pyruvate (100 mM) ThermoFisher 11360070 Used for the assay media
Streptavidin eFluor 450 Conjugate eBioscience 48-4317-82 Used for LSK sorting
XF Calibrant Agilent Technologies 100840-000 Used for cartridge equilibration
XF media Agilent Technologies 103575-100 Used for the assay media
XFp Glycolysis Stress Test Kit Agilent Technologies 103017100 Drugs for glycolysis stress test
XFp Mitochondrial Stress Test Kit Agilent Technologies 103010100 Drugs for mitochondrial stress test
XFp Sensor Cartridge Agilent Technologies 103022-100 Used for glycolysis and mitochondrial stress test

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dharampuriya, P. R., et al. Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).
  2. Wilkinson, A. C., Yamazaki, S. The hematopoietic stem cell diet. International Journal of Hematology. 107, 634-641 (2018).
  3. Kohli, L., Passegue, E. Surviving change: the metabolic journey of hematopoietic stem cells. Trends in Cell Biology. 24, 479-487 (2014).
  4. Abdel-Wahab, O., Levine, R. L. Metabolism and the leukemic stem cell. The Journal of Experimental Medicine. 207, 677-680 (2010).
  5. Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells International. 2019, 4067162 (2019).
  6. Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communication. 7, 13125 (2016).
  7. Anso, E., et al. The mitochondrial respiratory chain is essential for haematopoietic stem cell function. Nature Cell Biology. 19, 614-625 (2017).
  8. Wanet, A., Arnould, T., Najimi, M., Renard, P. Connecting Mitochondria, Metabolism, and Stem Cell Fate. Stem Cells and Development. 24, 1957-1971 (2015).
  9. Maryanovich, M., et al. An MTCH2 pathway repressing mitochondria metabolism regulates haematopoietic stem cell fate. Nature Communication. 6, 7901 (2015).
  10. Suda, T., Takubo, K., Semenza, G. L. Metabolic regulation of hematopoietic stem cells in the hypoxic niche. Cell Stem Cell. 9, 298-310 (2011).
  11. Zhang, C. C., Sadek, H. A. Hypoxia and metabolic properties of hematopoietic stem cells. Antioxidants & Redox Signaling. 20, 1891-1901 (2014).
  12. Snoeck, H. W. Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).
  13. Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, 125-136 (2007).
  14. Chen, J., et al. Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice. Experimental Hematology. 36, 1236-1243 (2008).
  15. Jung, Y., et al. Hematopoietic stem cells regulate mesenchymal stromal cell induction into osteoblasts thereby participating in the formation of the stem cell niche. Stem Cells. 26, 2042-2051 (2008).
  16. Masuda, S., Li, M., Izpisua Belmonte, J. C. Niche-less maintenance of HSCs by 2i. Cell Research. 23, 458-459 (2013).
  17. Anderson, H., et al. Hematopoietic stem cells develop in the absence of endothelial cadherin 5 expression. Blood. 126, 2811-2820 (2015).
  18. Lo Celso, C., Scadden, D. Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs). Journal of Visualized Experiment. (157), (2007).
  19. Van Wyngene, L., Vandewalle, J., Libert, C. Reprogramming of basic metabolic pathways in microbial sepsis: therapeutic targets at last. EMBO Molecular Medicine. 10, (2018).
  20. Olson, K. A., Schell, J. C., Rutter, J. Pyruvate and Metabolic Flexibility: Illuminating a Path Toward Selective Cancer Therapies. Trends in Biochemical Sciences. 41, 219-230 (2016).
  21. Halestrap, A. P., Wilson, M. C. The monocarboxylate transporter family--role and regulation. IUBMB Life. 64, 109-119 (2012).
  22. Kim, A. Mitochondria in Cancer Energy Metabolism: Culprits or Bystanders. Toxicological Research. 31, 323-330 (2015).
  23. Fosslien, E. Mitochondrial medicine--molecular pathology of defective oxidative phosphorylation. Annals of Clinical & Laboratory Science. 31 (1), 25-67 (2001).
  24. Wick, A. N., Nakada, H. I., Wolfe, J. B. Localization of the primary metabolic block produced by 2-deoxyglucose. The Journal of Biological Chemistry. 224 (2), 963-969 (1957).
  25. Linnett, P. E., Beechey, R. B. Inhibitors of the ATP synthetase systems. Methods in Enzymology. 55, 472-518 (1979).
  26. Rimmele, P., et al. Mitochondrial metabolism in hematopoietic stem cells requires functional FOXO3. EMBO Reports. 16, 1164-1176 (2015).
  27. Riviere, I., Dunbar, C. E., Sadelain, M. Hematopoietic stem cell engineering at a crossroads. Blood. 119, 1107-1116 (2012).
  28. Ito, K., Suda, T. Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).

Tags

Utviklingsmessige Biology blodkreft stilk stamceller metabolisme mitokondrie åndedrett Glykolysen ekstracellulære Flux analyse ikke-tilhenger celler
Analyse av blodkreft stem stamfar celle metabolisme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Scapin, G., Goulard, M. C.,… More

Scapin, G., Goulard, M. C., Dharampuriya, P. R., Cillis, J. L., Shah, D. I. Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism. J. Vis. Exp. (153), e60234, doi:10.3791/60234 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter