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Developmental Biology

Analyse du métabolisme hématopoïétique des cellules progénitrices

Published: November 9, 2019 doi: 10.3791/60234
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Nationwide Children's Hospital, 2The Ohio State University College of Medicine, 3The Ohio State University Comprehensive Cancer Center

Summary

Les cellules progénitrices de tige hématopoïétiques (HSPc) transition d'un état quiescent à un état de différenciation dû à leur plasticité métabolique pendant la formation de sang. Ici, nous présentons une méthode optimisée pour mesurer la respiration mitochondriale et la glycolyse des HSPC.

Abstract

Les cellules hématopoïétiques progénitrices de tige (HSPc) ont la plasticité métabolique distincte, qui leur permet de passer de leur état quiescent à un état de différenciation pour soutenir des demandes de la formation de sang. Cependant, il a été difficile d'analyser l'état métabolique (respiration mitochondriale et glycolyse) des HSPC en raison de leur nombre limité et de l'absence de protocoles optimisés pour les HSPC fragiles et non adhérents. Ici, nous fournissons un ensemble d'instructions claires, étape par étape pour mesurer la respiration métabolique (taux de consommation d'oxygène; OCR) et la glycolyse (taux d'acidification extracellulaire; ECAR) de la moelle osseuse murine-Lineageneg Sca1c-Kit(LSK) HSPc. Ce protocole fournit une plus grande quantité de HSPC LSK de la moelle osseuse, améliore la viabilité des HSPC pendant l'incubation, facilite les analyses de flux extracellulaires des HSPC non adhérents, et fournit des protocoles d'injection optimisés (concentration et temps) pour les médicaments ciblant la phosphorylation oxydative et les voies glycolytiques. Cette méthode permet de prédire l'état métabolique et la santé des HSPC pendant le développement sanguin et les maladies.

Introduction

Puisque la durée de vie de la plupart des cellules sanguines matures est courte, l'homéostasie du sang repose sur l'auto-renouvellement et la différenciation d'une population de longue durée mais rare de cellules souches hématopoïétiques (HSPC)1. Les HSPC sont tranquilles, mais ils sont prompts à proliférer et à subir une différenciation à la stimulation pour soutenir les exigences du système sanguin. Comme chaque état cellulaire HSPC nécessite une demande bioénergétique unique, les changements métaboliques sont des moteurs clés des décisions de destin HSPC. Par conséquent, la perte de plasticité métabolique, en modifiant l'équilibre entre la quiescence, l'auto-renouvellement et la différenciation des HSPC, conduit souvent à des troubles myéloou ou lympho-proliférants. Ensemble, la compréhension de la régulation métabolique du développement HSPC est essentielle pour découvrir les mécanismes sous-jacents aux malignités hématologiques2,3,4,5.

La respiration mitochondriale et la glycolyse génèrent de l'ATP pour susciter des réactions intracellulaires et produire les éléments constitutifs nécessaires à la synthèse des macromolécules. Puisque les HSPC ont la basse masse mitochondrique comparée aux cellules différenciées6 et ils soutiennent la quiescence dans les niches hypoxiques de moelle, Les HSPC s'appuient principalement sur la glycolyse. L'activation des HSPC améliore leur métabolisme mitochondrial qui mène à la perte de quiescence et à leur entrée ultérieure dans le cycle cellulaire. Une telle plasticité métabolique des HSPC permet le maintien de la piscine HSPC tout au long de la vie adulte6,7,8,9,10,11,12. Par conséquent, il est essentiel d'étudier leurs activités métaboliques, telles que le taux de consommation d'oxygène (OCR; indice de phosphorylation oxydative) et le taux d'acidification extracellulaire (ECAR; indice de glycolyse) pour analyser l'activation du HSPC et l'état de santé. L'OCR et l'ECAR peuvent être mesurés simultanément, en temps réel, à l'aide d'un analyseur de flux extracellulaire. Cependant, la méthode actuelle nécessite un grand nombre de cellules et est optimisée pour les cellules adhérentes13. Étant donné que les HSPC ne peuvent pas être isolés en grandes quantités de souris14, nécessitent le tri pour obtenir une population pure, sont des cellules non adhérentes15, et ne peuvent pas être cultivés du jour au lendemain sans éviter la différenciation16, il a été difficile de mesurer l'OCR et l'ECAR des HSPC. Ici, nous fournissons un ensemble d'instructions claires, étape par étape pour accompagner des tutoriels vidéo sur la façon de mesurer la respiration métabolique et la glycolyse de quelques milliers de moelle osseusemurine-Lineage negSca1-c-Kit (LSK) HSPCs.

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Protocol

Ce protocole a été approuvé par le Comité national de soins et d'utilisation des animaux de l'Hôpital pour enfants (IACUC).

REMARQUE: Le protocole est décrit dans l'ordre chronologique qui s'étend sur une période de deux jours. Utilisez des réactifs frais tels que décrits dans le protocole ci-dessous.

1. Préparation des réactifs le jour précédant l'essai

  1. Hydratez la cartouche du capteur.
    1. Incuber 5 ml du calibrant (Table of Materials) dans un incubateur non-CO2 37 oC pendant la nuit.
    2. Ouvrez le kit d'analyse de flux (Table of Materials) et séparez la cartouche du capteur (vert; haut) de la plaque d'utilité (transparente; inférieure). Ensuite, placez la cartouche du capteur à l'envers et à côté de la plaque d'utilité.
    3. À l'aide d'eau stérile, remplir les puits de la plaque d'utilité (200 l) et les chambres autour des puits (400 l).
    4. Immerger la cartouche du capteur dans la plaque d'utilité en vous assurant que les capteurs sont complètement recouverts d'eau. Appuyez sur 3x pour éviter la formation de bulles.
    5. Placer la cartouche immergée dans la plaque d'utilité dans un incubateur non-CO2 37 oC pendant la nuit. Pour éviter l'évaporation de l'eau, assurez-vous que l'incubateur est bien humidifié. Placez un bécher ouvert contenant H2O par mesure de précaution supplémentaire à côté de la plaque d'utilité de la cartouche, en particulier si vous utilisez un four ordinaire.
  2. Préparer la plaque d'astodonte.
    1. Stériliser la surface de la classe 2 de l'armoire de biosécurité à l'aide de 70 % d'éthanol. Ouvrez la plaque d'astodonte sous le capot.
    2. Ajouter 40 ll de solution de 0,01 % (w/v) en polylysine (PLL) disponible dans le commerce à chaque puits de la plaque d'assay sous le capot.
    3. Couvrir la plaque d'astodonte avec le couvercle fourni dans le kit. Incuber la plaque d'assay fermée à température ambiante (RT) sous le capot pendant 1 h.
      REMARQUE: Le but de l'incubation est de laisser PLL enrober la surface de la plaque d'assay pour faciliter l'adhérence des cellules de suspension à la surface de la plaque d'assay.
    4. Après 1 h d'incubation de la plaque d'aspiration, retirer l'excédent de solution à l'inpirateur stérile à base de vide et sécher le puits sous le capot.
      REMARQUE: Il faut 30 à 60 min pour sécher à l'air les puits de la plaque d'analyse après l'enlèvement excessif de La PLL à l'aide de l'aspirateur.

2. Jour de l'Assay

  1. Préparer la cartouche.
    1. Soulevez la cartouche du capteur. Placez-le à l'envers dans le capuchon de culture de tissu et jetez l'eau de la plaque d'utilité.
    2. Remplissez les puits de plaque d'utilité avec 200 l du calibrant pré-chauffé.
    3. Remplissez les chambres autour des puits avec 400 l l du calibrant.
    4. Immerger la cartouche du capteur dans la plaque d'utilité, en vous assurant que les capteurs sont complètement couverts par le calibrant. Appuyez sur 3x pour éviter la formation de bulles.
    5. Équilibrez la cartouche du capteur immergée dans la plaque d'utilité dans un incubateur non-CO2 37 oC pendant 45 à 60 min.
  2. Récoltez les HSPC LSK dérivés de la moelle osseuse.
    1. Pour tenir compte de suffisamment de répliques biologiques, prévoyez d'utiliser des HSPC dérivés d'une souris par puits de la plaque d'astodonte.
      REMARQUE: Cette méthode de récolte de moelle osseuse fournit 50 000 à 80 000 HSPc LSK de chaque souris. Ce protocole pour mesurer le flux extracellulaire est optimisé pour 70 000 HSPC LSK par puits d'une plaque de puits de 96.
    2. Euthanasier les souris en utilisant le surdosage de CO2 et la luxation cervicale, suivant les méthodes locales approuvées par l'IACUC.
    3. Stériliser la surface des outils de dissection et le banc à l'aide de 70% d'éthanol.
    4. Pour chaque souris, remplissez un plat Petri avec 1x salin tamponné par phosphate (PBS) contenant 2 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur (SF) à RT.
      REMARQUE: N'utilisez pas de PBS préréfrigéré car il créera des amas dans les étapes suivantes.
    5. Vaporiser 70% d'éthanol (v/v) sur toute la souris euthanasiée. Isoler tous les os, y compris les membres supérieurs et inférieurs, les os de la hanche, le sternum, la cage thoracique et la colonne vertébrale, de la souris17,18. Retirez la matière blanche de la moelle épinière de la souris car elle peut contaminer les cellules LSK. Placer tous les os dans 1x PBS (2% FBS), comme ils sont recueillis, dans un plat Petri jusqu'à une utilisation ultérieure.
    6. Inverser un tube conique de 50 ml (nouveau à chaque fois) et l'utiliser pour triturer les os immergés dans 1x PBS (2 % FBS) dans le plat Petri.
    7. À l'aide d'une pipette sérologique de 10 ml, pipette de haut en bas (10x) pour éliminer uniformément les cellules des os, après avoir écrasé les os.
    8. Placer une passoire cellulaire de 40 m sur un tube conique de 50 ml. Prémouiller la surface de la passoire en passant 1 ml de 1x PBS (2 % FBS).
    9. Récoltez la suspension cellulaire dérivée de la moelle osseuse à partir de l'étape 2.2.7 et passez-la à travers la surface préhumide de la passoire cellulaire pour enlever les débris osseux.
    10. Répétez les étapes 2.2.6 à 2.2.9 jusqu'à ce que tous les matériaux osseux deviennent blancs comme marqueur que la plupart des cellules de moelle osseuse sont rassemblées dans le tube conique de 50 ml.
      REMARQUE: Il faut souvent deux tubes coniques de 50 ml par souris pour recueillir toutes les cellules dérivées de la moelle osseuse.
    11. Centrifugeuse 50 mL tubes coniques contenant des cellules dérivées de la moelle osseuse pendant 5 min à 500 x g et RT.
    12. Retirez le supernatant. Resuspendre les cellules dérivées de la moelle osseuse (combiner le contenu des deux tubes de 50 ml) dans 5 ml de 1x PBS (2 % DE FBS) en volume final et conserver les cellules à RT.
  3. Récoltez les cellules de moelle osseuse murine mononucléées.
    1. Ajouter 5 ml de milieu de gradient de densité (c.-à-d. Ficoll) à un tube conique de 15 ml. Ensuite, ajoutez lentement 5 ml de suspension de la cellule de moelle osseuse. Assurez-vous que les cellules restent comme une couche au-dessus du milieu de gradient de densité.
    2. Centrifugeuse de 30 min à 500 x g et RT. N'utilisez pas de frein dans la centrifugeuse. Assurez-vous que la centrifugeuse est à la plus faible accélération possible (p. ex., 1 accélération et 0 décélération).
    3. Récoltez l'interface médiane des cellules mononucléées (couleur blanche) après centrifugation dans un tube conique frais de 15 ml.
    4. Laver les cellules, récoltées à partir du milieu de gradient de densité, avec 5 ml de 1x PBS (-2 % de FBS). Centrifugeuse de 5 min à 500 x g et 4 oC. Retirez le supernatant.
    5. Répétez l'étape 2.3.4.
    6. Resuspendre le contenu cellulaire du tube en 300 oL de 1x PBS (2 % DE FBS). Aliquot 10 l de suspension cellulaire pour un contrôle non taché ou monocolore dans un tube FACS.
  4. Récoltez des HSPC LSK à partir de cellules de moelle osseuse murine mononucléées.
    1. Faites un cocktail d'anticorps biotineens en mélangeant 3 L par échantillon des anticorps suivants : Gr1, Cd8a, Cd5, B220, Ter119. Ajouter 15 ll du cocktail biotine-anticorps à 300 l de cellules de moelle osseuse mononucléées.
      REMARQUE: Chaque anticorps est utilisé à 1:100 dilution.
    2. Incuber les cellules avec le cocktail biotine-anticorps pendant 30 min à 4 oC avec de l'agitation pour éviter que les cellules ne s'agglutinent au fond du tube.
    3. Ajouter 10 ml de 1x PBS préréfrigéré (2 % de FBS) aux cellules mélangées au cocktail biotine-anticorps.
    4. Centrifuger le tube pendant 5 min à 500 x g et 4 oC. Jetez le supernatant et suspendez la pastille cellulaire en 400 OL de 1x PBS (2 % DE FBS). Aliquot 10 l pour le contrôle des couleurs streptavidin-single.
    5. Brièvement vortex microbilles d'antibiotine (Tableau des matériaux) avant utilisation. Ajouter 80 l de microbilles à chaque échantillon de cellule (de 400 l). Bien mélanger et incuber pendant 20 min supplémentaires à 4 oC, avec de l'agitation.
    6. Ajouter 10 ml de 1x PBS préréfrigéré (2 % de FBS) aux cellules. Centrifuger le tube pendant 5 min à 500 x g et 4 oC.
    7. Jeter le supernatant et resuspendre la pastille cellulaire dans 1 ml de 1x PBS (2% FBS). Conserver à 4 oC pendant la mise en place de l'unité de séparation magnétique.
    8. Placer une colonne (Tableau des Matériaux) dans le champ magnétique du séparateur de tri des cellules assistées magnétiques (MACS) à 4 oC. Préparer la colonne pour la séparation magnétique en la rinçant avec 3 ml de 1x PBS (2 % DE FBS) sous le débit gravitationnel à 4 oC.
    9. Ajouter la suspension cellulaire de l'étape 2.4.7 à la colonne pré-humide à 4 oC. Laisser passer les cellules à travers la colonne à 4 oC et recueillir les effluents dans un tube conique de 15 ml.
      REMARQUE: La fraction avec des cellules non étiquetées dans de tels effluents représente les cellules négatives enrichies de lignée.
    10. Laver la colonne avec 3 ml de 1x PBS (2 % DE FBS) à 4 oC. Répéter 3x. Recueillir le flux à travers et le garder à 4 oC. Comptez les cellules viables élucées par exclusion bleue trypan à l'aide d'un hémocytomètre.
    11. Centrifuger le tube conique de 15 ml contenant l'écoulement pendant 5 min à 500 x g et 4 oC. Jetez le supernatant. Resuspendre les cellules dans 0,5 ml de 1x PBS (2 % DE FBS) et transférer le contenu dans un tube FACS.
    12. Ajouter 24 ll du cocktail d'anticorps LSK à chaque 107 cellules. Le cocktail d'anticorps contient une concentration égale d'anticorps 450-streptavidin, d'anticorps PE-CY7-Sca1 et d'anticorps APC-c-Kit.
    13. Incuber pendant 1 h à 4 oC avec agitation sous l'obscurité (couvert de papier d'aluminium).
    14. Ajouter 3 ml de 1x PBS (2 % FBS) au tube FACS. Centrifugeuse de 5 min à 500 x g et 4 oC. Jetez le supernatant.
    15. Resuspendre les cellules étiquetées par anticorps dans 1 ml de 1x PBS (2 % de FBS). Ajouter 1 oL d'iodide de propidium de 1 mg/mL à la suspension cellulaire juste avant le tri.
    16. Filtrer le contenu du tube FACS à l'aide d'une passoire de 40 m juste avant de trier les cellules LSK.
    17. Recueillir les cellules LSK, via le tri FACS, dans 1,5 mL tube contenant 0,5 ml de médias complets complétés par 2 mM de glutamine, 3 mg/mL de glucose, 1 mM de pyruvate, 1x thrombopoétine (TPO), 1x facteur de cellules souches (SCF), 0,5x pénicilline/streptomycine (P/S), pH 7.4 (tableau 1).

3. Tests de respiration mitochondriale et de glycolyse des HSPC LSK

  1. Ensemencement LSK dans la plaque d'assay
    1. Centrifugeuses cellules LSK à partir de l'étape 2.4.17 pour 5 min à 500 x g et RT. Jetez le supernatant.
    2. Resuspendre les cellules dans un support complet à une concentration finale d'au moins 70 000 cellules/40 l.
    3. Contenu de graines de 40 l'enclenché (contenant 70 000 cellules) dans la plaque de 8 puits recouverte de PLL à partir de l'étape 1.2.4. Laissez tous les puits d'angle vides.
    4. Centrifugeuse pour 1 min à 450 x g et RT. N'appliquez pas le frein. Assurez-vous que les cellules sont fixées au fond du puits à l'aide du microscope inversé.
    5. Ajouter 135 l de support complet aux cellules de chaque puits pour un volume final de 175 l. Ajouter 175 l de support complet aux 2 coins de la plaque comme des blancs.
    6. Incuber les cellules de l'incubateur non-CO2 pendant 2 h à 37 oC.
    7. Mettre en place un programme pour ajouter des médicaments à chaque puits de la plaque de puits dans l'analyseur à l'aide d'une mesure décrite dans le tableau 2 (test d'effort mitochondrial) et le tableau 3 (test d'effort de glycolyse).
      REMARQUE : Pendant que les cellules couvent, allumez l'instrument et assurez-vous qu'il est à 37 oC.
  2. Test de stress mitochondrial
    1. Préparer 45 millions de solutions de stock d'oligomycine, 50 M de cyanure de carbonyle 4-(trifluromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) et 25 solutions de stock M de rotenone/antimycine A. Pour préparer une solution de stock d'oligomycine de 45 M, dissoudre le contenu de la pochette disponible dans le commerce dans 280 l'un des supports complets. Pour préparer une solution d'actions FCCP de 50 M, dissoudre le contenu de la pochette disponible dans le commerce dans 288 L du support complet. Pour préparer une solution de bouillon de 25 M rotenone/antimycine, dissoudre le contenu de la poche commerciale disponible dans 216 L du support complet.
    2. Retirez la cartouche du capteur dans la plaque d'utilité de l'incubateur et chargez ses ports (A, B et C) de sorte que chaque puits ait une concentration finale de 2 m d'oligomycine, de 1,5 M FACP et de 0,5 M de roténonne/antimycine A au besoin, selon les mesures de dilution décrites dans le tableau 4 (pour le taux de consommation d'oxygène).
    3. Retirez le couvercle de la cartouche du capteur assemblée dans la plaque d'utilité et placez-le sur le plateau de l'instrument. Démarrer l'étalonnage qui prendra 20 min.
    4. Après l'étalonnage, retirez la plaque d'utilité et remplacez-la par une plaque d'ascompte contenant des cellules LSK, qui sont maintenant adhérées au fond du puits.
    5. Presse Continuer à lancer le programme décrit dans le tableau 2. Après l'achèvement du programme, récupérez les données et analysez-les à l'aide du logiciel Wave Desktop.
      REMARQUE: Les données générées à partir des analyses de flux extracellulaires peuvent être tracées à l'aide de la parcelle de point du logiciel Wave Desktop ou exportées vers le programme de statistiques sur le Web.
  3. Test de stress de glycolyse
    1. Reconstituer le glucose en 300 l (100 mM), l'oligomycine en 288 l (50 M), le glucose 2-D (2-DG) dans 300 l (500 mM) de support complet à partir de la poche commercialedisponible.
    2. Pipette doucement de haut en bas (10x) pour solubilité les composés. Vortex le 2-DG pendant environ 1 min pour assurer une dissolution appropriée dans les médias.
    3. Retirez la cartouche du capteur de l'incubateur. Ports de chargement A à C suivant les mesures de dilution décrites dans le tableau 5 pour obtenir une concentration finale de 10 mM de glucose, d'oligomycine de 2 M. et de 50 mM de 2-DG.
    4. Répétez les étapes 3.2.3 et 3.2.4.
    5. Presse Continuer à lancer le programme décrit dans le tableau 3. Après l'achèvement du programme, récupérez les données et analysez-les à l'aide du logiciel Wave Desktop.

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Representative Results

Notre méthode d'extraction nous a permis de récolter jusqu'à 80 000 HSPc LSK par souris. La viabilité et le nombre de cellules LSK ont été améliorés avec notre méthode, parce que nous : (1) la moelle osseuse combinée des membres supérieurs et inférieurs, des os de hanche, du sternum, de la cage thoracique, et de la colonne vertébrale, (2) évité d'utiliser le tampon de lyse de cellules rouges qui aurait augmenté la mort cellulaire et l'agglutination, (3) a utilisé la séparation moyenne de gradient de densité des cellules mono-nucléées, et (4) a évité d'utiliser le tampon pré-réfrigéré qui aurait causé la perte des cellules d'intérêt dans les touffes.

Bien que l'analyse extracellulaire de flux ait été traditionnellement employée pour des cellules adhérentes, notre utilisation du revêtement de PLL des puits, suivie de la centrifugation des cellules sur elle, a facilité l'adhérence des HSPC de LSK à la surface du puits. Cela nous a permis de mesurer le flux extracellulaire, et donc la santé métabolique des HSPC LSK. Compte tenu du nombre limité de cellules qui peuvent être récoltées à partir d'une souris et de la longue durée du protocole pour leur isolement, notre utilisation de l'analyseur avec son format de 8 puits est apparue comme la solution la plus rentable et la plus faisable (Figure 1).

Les cellules utilisent la glycolyse et la respiration mitochondriale pour reconstituer leurs besoins énergétiques et produire les intermédiaires nécessaires à leur prolifération et à leur croissance19. L'enzyme hexokinase convertit le glucose en glucose-6-phosphate et qui est ensuite transformé en pyruvate20. Le pyruvate peut ensuite être transformé en lactate et est exporté de la cellule avec des protons21. L'ECAR mesure l'acidification des médias et est donc un indicateur de glycolyse. Le pyruvate peut également être transporté dans les mitochondries et transformé en coenzyme acétyle A (CoA). Acetyl CoA entre dans le cycle TCA, qui fournit des intermédiaires d'énergie pour conduire les mouvements d'électrons de la chaîne de transport électronique (ETC) et génère un gradient de proton dans l'espace intermembrane mitochondrial22. L'oxygène agit comme l'accepteur d'électrons final, et les protons se déplacent de nouveau à la matrice mitochondriale par le complexe de synthase d'ATP tout en générant ATP23. L'OCR mesure la consommation d'oxygène et il est donc utilisé pour quantifier la respiration mitochondriale.

Afin d'analyser l'OCR et l'ECAR dans des conditions basales et stressées, nous avons utilisé l'injection séquentielle de médicaments qui interfèrent avec la glycolyse et la respiration mitochondriale. Nous avons employé le glucose et le 2-deoxyglucose (2-DG), un analogue de glucose, pour initier et bloquer la glycolyse respectivement24. Nous avons utilisé la rotenone (un inhibiteur complexe I-spécifique de l'ETC), l'antimycine A (un inhibiteur complexe III spécifique de l'ETC), l'oligomycine (inhibiteur de la synthase ATP), et l'agent de découplage carbonyl cyanure-4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) pour bloquer des événements spécifiques de l'ETC25. Nous avons titré de tels réactifs pour trouver la concentration optimale pour les HSPC LKS (Figure 2A,B).

Pour effectuer le test d'effort de glycolyse, nous avons cultivé les HSPC de LSK dans un support privé de glucose/pyruvate (comme recommandé par le fabricant), ou dans le glucose/pyruvate contenant des médias. Comme prévu, nous avons constaté que le niveau basal de l'ECAR était plus élevé pour les HSPC LSK cultivés dans les médias de glucose/pyruvateMD par rapport aux HSPC LSK cultivés dans le glucose/pyruvate-média. La première injection de glucose n'a pas changé le niveau basal de l'ECAR pour les HSPC LSK cultivés dans les médias de glucose/pyruvateMD alors qu'elle a stimulé la glycolyse dans les HSPC LSK cultivés dans le glucose/pyruvate-média. Cependant, le niveau basal de l'ECAR, après l'injection avec le glucose, est resté plus bas comparé au groupe de glucose/pyruvate. La deuxième injection avec l'oligomycine, qui pourrait bloquer la production de l'ATP par phosphorylation oxydative, a activé la glycolyse à son niveau maximum de HSPC de LSK dans le glucose/pyruvateMD médias, mais elle n'a pas affecté le glucose/pyruvate- groupe. La dernière injection avec l'analogue du glucose 2-DG a ramené l'ECAR à son niveau non-glycolytique (figure 2C).

Pour le test d'effort mitochondrial, nous avons mesuré le niveau basal de l'OCR des HSPC de LSK dans le support de glucose/pyruvate. Nous avons d'abord injecté l'oligomycine qui a d'abord hyperpolarisé la membrane mitochondriale, empêché plus de pompage de proton par les complexes etc, et ainsi réduit le taux de respiration mitochondriale. La deuxième injection des ionophores de FCCP a poussé des niveaux d'ETC et d'OCR à leur maximum pendant que les cellules essayaient de récupérer le potentiel mitochondrique de membrane. L'injection finale avec deux autres inhibiteurs de l'ETC (antimycine A et roténe) a causé l'arrêt complet de la respiration mitochondriale et donc l'OCR est revenu à son niveau minimum (Figure 2D).

Figure 1
Figure 1 : Schema démontrant l'isolementdes cellules hématopoïétiques de progéniteur de la souris. La moelle osseuse est extraite des os et les cellules mononucléaires (MNC) sont isolées par la séparation du gradient moyen de gradient de densité. Ensuite, les cellules sont incubées avec des cellules de lignée biotinylated- anticorps et des perles magnétiques conjuguées à la streptavidine pour éliuer les cellules négatives de lignée (Lin-) après leur séparation magnétique. Lin- les cellules sont ensuite incubées avec des anticorps LSK et des cellules LSK isolées par tri cellulaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Analyses extracellulairesdes flux de cellules hématopoïétiques de l'ancêtre de la lignée murine Sca1etc-Kit (LSK). (A,B) Description mécaniste des médicaments utilisés pour les analyses de flux extracellulaires pendant la glycolyse et la respiration mitochondriale. (C) Résultats représentatifs du test d'effort de glycolyse sur les HSPC lsk l'urine en présence ou l'absence de glucose/pyruvate dans les médias. (D) Résultats représentatifs du test d'effort mitochondrial sur les HSPC lsqueinaux. Les barres d'erreur représentent l'écart standard de la moyenne (S.D.) Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Stock Concentration finale Volume pour 30 ml
Médias complets 28,691 ml
P/S 100x 100x 0,5x (en) 150 l
L-Glutamine 200 mm 2 mM 300 l
Pyruvate 100 mm 1 mM 300 l
Glucose 1 M/180,2 mg/mL 3 mg/ml 499,4 l
Tpo 100 g/mL 100 ng/mL 30 l
Scf 100 g/mL 100 ng/mL 30 l

Tableau 1 : Contenu et préparation des supports XF complets.

Basale Oligomycine (2 M) FCCP (1,5 M) R/A (0,5 M)
Répétition 3 fois 3 fois 3 fois 3 fois
Mélange 3 min 3 min 3 min 3 min
Attendre 0 min 0 min 0 min 0 min
Mesure 4 min 4 min 4 min 4 min

Tableau 2 : Protocole d'injection pour le test de stress mitochondrial.

Basale Glucose (10 mm) Oligomycine (2 M) 2-DG (50 mM)
Répétition 3 fois 3 fois 3 fois 3 fois
Mélange 3 min 3 min 3 min 3 min
Attendre 0 min 0 min 0 min 0 min
Mesure 7 min 7 min 7 min 7 min

Tableau 3 : Protocole d'injection pour le test d'effort de glycolyse.

Port Drogue Concentration finale du puits (M) Volume de la solution d'actions (L) Volume des médias (L) Solution de port (M) Volume ajouté au port (L)
Port A Oligomycine 2 100 181.25 16 25
Port B FCCP (en) 1.5 100 270.4 13.5 25
Port C Rotenone/antimycine A 0.5 60 240 5 25

Tableau 4 : Mesures de dilution pour obtenir une concentration optimale de médicaments pour le test de stress mitochondrial dans chaque puits de l'analyseur.

Port Drogue Concentration finale du puits Volume de la solution d'actions (L) Volume des médias (L) Solution portuaire Volume ajouté au port (L)
Port A Glucose 10 mM 300 75 80 mM 25
Port B Oligomycine 2 M 108 192 18 M 25
Port C 2-DG 50 mM 300 0 500 mm 25

Tableau 5 : Mesures de dilution pour obtenir une concentration optimale de médicaments pour le test d'effort de glycolyse dans chaque puits de l'analyseur.

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Discussion

Ici, nous démontrons l'isolement d'une quantité maximale de population pure et viable de HSPCs murine aussi bien que la mesure de leur glycolyse et respiration mitochondriale avec un analyseur extracellulaire de flux. Plus précisément, le protocole surmonte les problèmes techniques suivants pour l'utilisation des HSPC LSK : i) la basse fréquence des HSPC LSK dans la moelle osseuse murine14, ii) faible activité métabolique basale de LSK HSPCs26, iii) la fragilité de LSK HSPc27, et iv) la non-adhésion de LSK HSPCs culture15. En outre, nous avons optimisé les concentrations de médicaments et la composition des médias pour la performance optimale des analyses de flux extracellulaires.

Les HSPC dérivés de la moelle osseuse résident dans la niche hypoxique et ils présentent un phénotype glycolytique, qui est crucial pour le maintien de leur tige28. Inversement, la respiration est essentielle pour la différenciation HSPC6. Comme le dysfonctionnement métabolique des HSPC conduit à des maladies du sang; ici, nous avons décrit le protocole et les tutoriels vidéo pour mesurer les caractéristiques des fonctions métaboliques, telles que l'OCR et l'ECAR, pour les HSPC LSK dérivés de la moelle osseuse.

Contrairement aux recommandations du fabricant pour les cellules adhérentes, nous avons constaté que les résultats des tests d'effort de glycolyse sur les HSPC LSK sont optimaux lorsque les cellules sont cultivées dans les médias de glucose/pyruvateMD par rapport au glucose/pyruvate-média. Nous nous sommes rendu compte que le manque de glucose dans les médias pour Les HSPC de LSK a comme conséquence la mort cellulaire pendant la période d'équilibre de 2 h dans un incubateur de non-CO2. Comme l'injection de glucose n'a pas modifié le niveau basal de l'ECAR pour les HSPC LSK cultivés dans les médias de glucose/pyruvateMD, notre modification du protocole préserve non seulement l'essence du test d'effort glycolytique, mais elle nous permet également de distinguer entre la glycolyse basale (avant toute injection), la capacité glycolytique (après injection d'oligomycine) et l'acidification non glycolytique (après injection avec 2-DG) des HSPC de LSK.

Notre essai d'effort mitochondrial des HSPc de LSK a prouvé que l'ATP produit par la phosphorylation oxydative dans les HSPC de LSK est minimal comme vu avec la petite réduction de l'OCR après l'injection d'oligomycine. Inversement, l'élévation de l'OCR lors de l'injection du PCFC affirme que les HSPC LSK sont en mesure de répondre à une demande énergétique plus élevée.

Ensemble, l'objectif de ce protocole était de fournir un ensemble d'instructions claires et concises pour accompagner des tutoriels vidéo sur la façon de mesurer les fonctions métaboliques, telles que l'OCR et l'ECAR, des HSPC. Avec des modifications clés et des recommandations supplémentaires pour la récolte d'un plus grand nombre de LSK HSPc sains, les rendant adhérents à la surface du puits, ainsi que l'optimisation du temps d'incubation et de la concentration de médicaments, ce protocole permettra d'habiliter les investigateurs pour analyser la glycolyse et l'état de respiration mitochondriale des HSPc aussi bien que les cellules hématopoïétiques non-adhérentes pendant le développement sanguin et les maladies.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Ce travail est en partie soutenu par le soutien financier des National Institutes of Health (HL131645, CA016058), de la Fondation St. Baldrick's et de la Fondation Pelotonia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.01% (w/v) poly-L-lysine solution Sigma P8920 Used for LSK attachment
40 µm cell strainer Fisher Scientific 22-363-547 Used for cell filtration after bone crushing
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi 130-090-485 Used for Lin- separation
Biotin Rat Anti-Mouse CD45R/B220 Clone RA3-6B2 BD Biosciences 553086 Used for Lin- separation
Biotin Rat Anti-Mouse CD5 Clone 53-7.3 BD Biosciences 553019 Used for Lin- separation
Biotin Rat Anti-Mouse CD8a Clone 53-6.7 BD Biosciences 553029 Used for Lin- separation
Biotin Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C Clone RB6-8C5 BD Biosciences 553125 Used for Lin- separation
Biotin Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells Clone TER-119 BD Biosciences 553672 Used for Lin- separation
CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody (2B8), APC eBioscience 17-1171-83 Used for LSK sorting
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Falcon-Fischer Scientific 14-959-53A Used in cell isolation
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Falcon-Fischer Scientific 14-432-22 Used in cell isolation
Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes Falcon-Fischer Scientific 14-959-11A Used for LSK sorting
Fetal Bovine Serum Neuromics FBS001-HI Used in FACS buffer
Histopaque-1083 Sigma 10831 Used for ficoll gradient separation
L-glutamine 100x Fisher Scientific 25-030-081 Used for the assay media
LS Column Miltenyi 130-042-401 Used for Lin- separation
Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonal Antibody (D7), PE-Cyanine7 eBioscience 25-5981-82 Used for LSK sorting
Murine Stem Cell Factor (SCF) PeproTech 250-03-100UG Used for the assay media
Murine Thrombopoietin (TPO) PeproTech 315-14-100UG Used for the assay media
PBS 1% Fisher Scientific SH3002802 Used for FACS buffer
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Fisher Scientific 15140122 Used for the assay media
Propidium Iodide Fisher Scientific P1304MP Used for LSK sorting
Seahorse XFp Cell Culture Miniplate Agilent Technologies 103025-100 Used for LSK seeding
Sodium Pyruvate (100 mM) ThermoFisher 11360070 Used for the assay media
Streptavidin eFluor 450 Conjugate eBioscience 48-4317-82 Used for LSK sorting
XF Calibrant Agilent Technologies 100840-000 Used for cartridge equilibration
XF media Agilent Technologies 103575-100 Used for the assay media
XFp Glycolysis Stress Test Kit Agilent Technologies 103017100 Drugs for glycolysis stress test
XFp Mitochondrial Stress Test Kit Agilent Technologies 103010100 Drugs for mitochondrial stress test
XFp Sensor Cartridge Agilent Technologies 103022-100 Used for glycolysis and mitochondrial stress test

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References

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Scapin, G., Goulard, M. C., Dharampuriya, P. R., Cillis, J. L., Shah, D. I. Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism. J. Vis. Exp. (153), e60234, doi:10.3791/60234 (2019).

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