Summary
Hematopoietische stam voorlopercellen (Hspc's) overgang van een rusttoestand naar een differentiatie toestand als gevolg van hun metabole plasticiteit tijdens de bloedvorming. Hier presenteren we een geoptimaliseerde methode voor het meten van de mitochondriale ademhaling en glycolyse van Hspc's.
Abstract
Hematopoietische stam voorlopercellen (Hspc's) hebben een duidelijke metabole plasticiteit, waardoor ze kunnen overgaan van hun rusttoestand naar een differentiatie toestand om de eisen van de bloedvorming te ondersteunen. Echter, het is moeilijk om de metabole status te analyseren (mitochondriale ademhaling en glycolyse) van Hspc's vanwege hun beperkte aantallen en het ontbreken van geoptimaliseerde protocollen voor niet-aanhandige, fragiele Hspc's. Hier bieden we een set van duidelijke, stapsgewijze instructies voor het meten van metabole ademhaling (zuurstofverbruik; OCR) en glycolyse (extracellulaire verzuring; ECAR) van muriene beenmerg-LineageNEGSca1+c-Kit+ (LSK) hspcs. Dit protocol biedt een hogere hoeveelheid LSK-Hspc's van muriene beenmerg, verbetert de levensvatbaarheid van Hspc's tijdens de incubatie, vergemakkelijkt extracellulaire flux analyses van niet-aanhangende Hspc's en biedt geoptimaliseerde injectie protocollen (concentratie en tijd) voor geneesmiddelen gericht op oxidatieve fosforylering en glycolytische trajecten. Deze methode maakt de voorspelling van de metabole status en de gezondheid van Hspc's tijdens de ontwikkeling van het bloed en ziekten.
Introduction
Aangezien de levensduur van de meeste volwassen bloedcellen kort is, de homeostase van bloed berust op de zelf vernieuwing en differentiatie van een langlevende maar zeldzame populatie van hematopoietische stamcellen (HSPCs)1. Hspc's zijn stilaan, maar ze zijn snel te vermenigvuldigen en differentiëren op stimulatie om de eisen van het bloedsysteem te ondersteunen. Aangezien elke HSPC cellulaire staat een unieke bioenergetische vraag vereist, zijn de metabole veranderingen belangrijke drijf-en- Daarom, het verlies van metabole plasticiteit, door het veranderen van het evenwicht tussen quiescentie, zelf vernieuwing, en differentiatie van Hspc's, leidt vaak tot myelo-of LYMPHO-proliferatieve stoornissen. Samen is het begrip van metabole regulering van de ontwikkeling van hspc van cruciaal belang om mechanismen te ontdekken die onderliggende hematologische maligniteiten2,3,4,5vormen.
Mitochondriale ademhaling en glycolyse genereren ATP om intracellulaire reacties te stimuleren en produceren de bouwstenen die nodig zijn voor Macromolecuul synthese. Aangezien Hspc's lage mitochondriale massa in vergelijking met gedifferentieerde cellen6 en ze ondersteunen quiescentie in hypoxische beenmerg niches, hspc's voornamelijk vertrouwen op glycolyse. Activering van Hspc's verbetert hun mitochondriale metabolisme dat leidt tot het verlies van de quiescentie en hun daaropvolgende binnenkomst in de celcyclus. Dergelijke metabole plasticiteit van hspc's maakt het mogelijk om de hspc-pool te onderhouden gedurende het hele volwassen leven6,7,8,9,10,11,12. Daarom is het van cruciaal belang om hun metabole activiteiten te onderzoeken, zoals het zuurstofverbruik (OCR; index van oxidatieve fosforylering) en de extracellulaire verzuring rate (ECAR; index van glycolyse) om de HSPC-activatie en de gezondheidsstatus te analyseren. Zowel de OCR als de ECAR kunnen gelijktijdig worden gemeten, in real-time, met behulp van een extracellulaire flux Analyzer. De huidige methode vereist echter een groot aantal cellen en is geoptimaliseerd voor aanhandige cellen13. Aangezien Hspc's niet kunnen worden geïsoleerd in grote hoeveelheden van muizen14, vereisen sortering om een zuivere populatie te verkrijgen, zijn niet-aanhandende cellen15en kunnen niet 's nachts worden gekweekt zonder differentiatie te vermijden16, het is moeilijk om de OCR en de ECAR van hspc's te meten. Hier bieden we een set van duidelijke, stapsgewijze instructies om video-gebaseerde tutorials te begeleiden over het meten van metabole ademhaling en glycolyse van enkele duizenden muriene beenmerg-LineageNEGSca1+c-Kit+ (LSK) hspcs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol werd goedgekeurd door Nationwide Children's Hospital Animal Care and use Committee (IACUC).
Opmerking: Het protocol wordt beschreven in chronologische volgorde die over de periode van twee dagen overspant. Gebruik verse reagentia zoals beschreven in het onderstaande protocol.
1. bereiding van de reagentia op de dag voorafgaand aan de bepaling
-
Hydrateer de sensor cartridge.
- Incuberen 5 mL van het ijkmiddel (tafel van de materialen) in een niet-CO2 37 °c-incubator 's nachts.
- Open de flux assay kit (tabel met materialen) en scheid de sensor cartridge (groen; boven) van de Utility Plate (transparant; onder). Plaats vervolgens de sensor cartridge ondersteboven en grenzend aan de Utility Plate.
- Vul met steriel water de putjes van het hulp bord (200 μL) en de kamers rond de putjes (400 μL).
- Dompel de sensor cartridge in de hulp plaat en zorg ervoor dat de sensoren volledig bedekt zijn met water. Tik 3x om de vorming van bubbels te voorkomen.
- Plaats de cartridge 's nachts in de bijkeuken in een niet-CO2 37 °c-incubator. Om verdamping van het water te voorkomen, moet u ervoor zorgen dat de incubator goed wordt bevoficeerd. Plaats een open bekerglas met H2O als extra voorzorgsmaatregel naast de cartridge-Utility Plate, met name bij gebruik van een gewone oven.
-
Maak de test plaat klaar.
- Steriliseer het oppervlak van bioveiligheid Cabinet klasse 2 met 70% ethanol. Open de test plaat onder de motorkap.
- Voeg 40 μL in de handel verkrijgbare 0,01% (w/v) poly-L-lysine (PLL) oplossing toe aan elk goed van de test plaat onder de motorkap.
- Dek de test plaat af met het deksel dat in de kit is meegeleverd. Incuberen de gesloten test plaat bij kamertemperatuur (RT) onder de motorkap gedurende 1 uur.
Opmerking: Het doel van de incubatie is om PLL het oppervlak van de test plaat te laten verlijmen om de hechting van de suspensie cellen aan het oppervlak van de test plaat te vergemakkelijken. - Verwijder na 1 uur incubatie van de test plaat de overtollige oplossing met een steriele, op vacuüm gebaseerde aspirator en lucht droog de put onder de motorkap.
Opmerking: Het duurt ~ 30 − 60 min naar lucht-droog de putjes van de test plaat na de overmatige PLL verwijderen met behulp van de aspirator.
2. dag van de test
- Maak de cartridge klaar.
- Til de sensor cartridge op. Plaats het ondersteboven in de weefselcultuur kap en gooi het water weg van het hulp bord.
- Vul de bijkeuken met 200 μL van het voorverwarmde ijkmiddel.
- Vul de kamers rond de putjes met 400 μL van het ijkmiddel.
- Dompel de sensor cartridge in de hulp plaat en zorg ervoor dat de sensoren volledig door het ijkmiddel worden afgedekt. Tik 3x om de vorming van bubbels te voorkomen.
- Het sensor patroon wordt in een incubator van niet-CO2 37 °c ondergedompeld in de gebruiks plaat gedurende 45 − 60 minuten.
- Oogst muriene beenmerg-afgeleide LSK Hspc's.
- Om voldoende biologische replicaten te kunnen gebruiken, is het van plan om Hspc's van de ene muis per put van de test plaat te maken.
Opmerking: Deze beenmerg-oogst methode biedt ~ 50000 − 80000 LSK Hspc's van elke muis. Dit protocol voor het meten van extracellulaire flux is geoptimaliseerd voor ~ 70.000 LSK Hspc's per put van een 96 goed plaat. - Euthanize muizen met CO2 overdosis en cervicale dislocatie, na lokale IACUC goedgekeurde methoden.
- Steriliseer het oppervlak van ontsnij gereedschappen en de Bank met 70% ethanol.
- Voor elke muis vult u een Petri schaaltje met 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 2% warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) bij RT.
Opmerking: Gebruik geen voorgekoelde PBS omdat deze in de volgende stappen er klontjes zal maken. - Spray 70% ethanol (v/v) op de hele geëeuthaniseerde muis. Isoleer alle botten, met inbegrip van de bovenste en onderste ledematen, heup beenderen, borstbeen, ribbenkast en wervelkolom, van de muis17,18. Trek wit materiaal uit het ruggenmerg van de muis omdat het LSK-cellen kan besmetten. Plaats alle botten in 1x PBS (+ 2% FBS), zoals ze worden verzameld, in een Petri schaaltje tot verder gebruik.
- Inverteer een conische buis van 50 mL (elke keer nieuw) en gebruik deze om de botten te tritureren ondergedompeld in 1x PBS (+ 2% FBS) in de Petri schaal.
- Pipetteer met een serologische Pipet van 10 mL op en neer (~ 10x) om cellen gelijkmatig uit de botten te spoelen, na het breken van de botten.
- Plaats een 40 μm celzeef op een conische buis van 50 mL. Pre-Bevochtig het oppervlak van de zeef door 1 mL 1x PBS (+ 2% FBS) te passeren.
- Oogst beenmerg-afgeleide celsuspensie uit stap 2.2.7 en geef deze door het pre-natte oppervlak van de celzeef om botpuin te verwijderen.
- Herhaal de stappen 2.2.6 tot en met 2.2.9 totdat alle botmaterialen wit worden als een marker die de meeste beenmergcellen in de conische buis van 50 mL worden verzameld.
Opmerking: Het duurt vaak 2 50 mL conische buizen per muis te verzamelen alle cellen van het beenmerg-afgeleide. - Centrifugeer 50 mL conische buisjes met beenmergcellen gedurende 5 min bij 500 x g en RT.
- Verwijder het supernatant. Respendeer cellen met beenmerg (Combineer de inhoud van beide buisjes van 50 mL) in 5 mL 1x PBS (+ 2% FBS) als een definitief volume en houd de cellen op RT.
- Om voldoende biologische replicaten te kunnen gebruiken, is het van plan om Hspc's van de ene muis per put van de test plaat te maken.
- Oogst mononucleated Murine beenmergcellen.
- Voeg 5 mL dichtheidsgradiënt medium (d.w.z. Ficoll) toe aan een conische buis van 15 mL. Voeg vervolgens langzaam 5 mL beenmerg celsuspensie toe. Zorg ervoor dat cellen als een laag boven de dichtheidsgradiënt blijven.
- Centrifugeer 30 min bij 500 x g en RT. Gebruik geen rem in de centrifuge. Zorg ervoor dat de centrifuge bij de laagst mogelijke acceleratie is (bijv. 1 versnelling en 0 vertraging).
- Oogst de middelste interface van mononucleated cellen (witte kleur) na centrifugeren in een nieuwe conische buis van 15 mL.
- Was cellen, geoogst uit dichtheidsgradiënt medium, met 5 mL 1x PBS (+ 2% FBS). Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 500 x g en 4 °c. Verwijder het supernatant.
- Herhaal stap 2.3.4.
- Rebreng de celinhoud van de buis in 300 μL van 1x PBS (+ 2% FBS). Aliquot 10 μL celsuspensie voor ongekleurde of éénkleurige controle in een FACS buis.
- Oogst LSK Hspc's van mononucleated Murine beenmergcellen.
- Maak een cocktail van biotine-antilichamen door 3 μL per monster van de volgende antilichamen te mengen: GR1, Cd8a, Cd5, B220, Ter119. Voeg 15 μL biotin-antilichaam cocktail toe aan 300 μL mononucleated beenmergcellen.
Opmerking: Elk antilichaam wordt gebruikt bij 1:100 verdunning. - Incuberen cellen met de cocktail van biotin-antilichamen gedurende 30 minuten bij 4 °C met roeren om te voorkomen dat cellen in de bodem van de buis klonteren.
- Voeg 10 mL voorgekoelde 1x PBS (+ 2% FBS) toe aan cellen vermengd met de cocktail van biotin-antilichamen.
- Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten bij 500 x g en 4 °c. Gooi de supernatant weg en regeer de celpellet in 400 μL 1x PBS (+ 2% FBS). Aliquot 10 μL voor streptavidine-enkele kleur regeling.
- Kort Vortex anti-Biotine microbeads (tabel van de materialen) voor gebruik. Voeg 80 μL microbeads toe aan elk celmonster (van 400 μL). Meng goed en inbroed 20 minuten bij 4 °C, met agitatie.
- Voeg 10 mL voorgekoelde 1x PBS (+ 2% FBS) toe aan cellen. Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten bij 500 x g en 4 °c.
- Gooi de supernatant weg en regeer de celpellet in 1 mL 1x PBS (+ 2% FBS). Bewaren bij 4 °C bij het instellen van de magnetische scheidings eenheid.
- Plaats een kolom (tabel met materialen) in het magnetische veld van het magnetisch geassisteerde celsorteerscheidings teken (Macs) bij 4 °c. Bereid de kolom voor magnetische scheiding door deze met 3 mL 1x PBS (+ 2% FBS) onder de zwaartekracht bij 4 °C te spoelen.
- Voeg de celsuspensie van stap 2.4.7 toe aan de pre-natte kolom bij 4 °C. Laat de cellen door de kolom passeren bij 4 °C en verzamel effluent in een conische buis van 15 mL.
Opmerking: De breuk met niet-gelabelde cellen in dergelijke effluent vertegenwoordigt de verrijkte Lineage negatieve cellen. - Spoel de kolom met 3 mL 1x PBS (+ 2% FBS) bij 4 °C. Herhaal 3x. Vang de doorstroom en houd deze bij 4 °C. Tel de geeleerde levensvatbare cellen door trypeen blauwe uitsluiting met behulp van een hemocytometer.
- Centrifugeer de conische buis van 15 mL met de doorstroming gedurende 5 minuten bij 500 x g en 4 °c. Gooi het supernatant weg. Respendeer cellen in 0,5 mL 1x PBS (+ 2% FBS) en breng de inhoud over naar een FACS Tube.
- Voeg 24 μL van de cocktail van het antilichaam van LSK toe aan elke 107 cellen. De antilichaam cocktail bevat een gelijke concentratie van 450-streptavidine antilichaam, PE-CY7-Sca1 antilichamen, en APC-c-Kit antilichamen.
- Inincuberen gedurende 1 uur bij 4 °C met agitatie onder donker (bedekt met blik folie).
- Voeg 3 mL 1x PBS (+ 2% FBS) toe aan de FACS Tube. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 500 x g en 4 °c. Gooi het supernatant weg.
- Respendeer cellen met een antilichaam label in 1 mL 1x PBS (+ 2% FBS). Voeg 1 μL van 1 mg/mL propidium jodide toe aan de celsuspensie vlak voor het sorteren.
- Filter inhoud van de FACS buis met behulp van een 40 μm zeef rechts voor het sorteren van LSK cellen.
- Verzamel LSK-cellen, via FACS sortering, in 1,5 mL tube met 0,5 mL complete media aangevuld met 2 mM glutamine, 3 mg/mL glucose, 1 mM pyruvate, 1x trombopoietin (TPO), 1x stamcel factor (SCF), 0,5 x penicillaire/streptomycine (P/S), pH 7,4 (tabel 1).
- Maak een cocktail van biotine-antilichamen door 3 μL per monster van de volgende antilichamen te mengen: GR1, Cd8a, Cd5, B220, Ter119. Voeg 15 μL biotin-antilichaam cocktail toe aan 300 μL mononucleated beenmergcellen.
3. mitochondriale ademhaling en glycolyse-assays van LSK-Hspc's
-
LSK zaaien in de test plaat
- Centrifugeer LSK-cellen uit stap 2.4.17 gedurende 5 minuten bij 500 x g en RT. Gooi het supernatant weg.
- Respendeer cellen in volledige media tot een uiteindelijke concentratie van ten minste 70.000 cellen/40 μL.
- Zaad inhoud van 40 μL media (bevattende 70.000 cellen) in de PLL-gecoate 8-well plaat uit stap 1.2.4. Laat alle hoek putten leeg.
- Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 450 x g en RT. Breng de rem niet aan. Zorg ervoor dat de cellen zijn bevestigd aan de put bodem met behulp van de omgekeerde Microscoop.
- Voeg 135 μL complete media toe aan de cellen in elke put voor een eindvolume van 175 μL. Voeg 175 μL complete media toe aan de 2 hoeken van de plaat als blanco.
- Incueren de cellen in de niet-CO2 incubator voor 2 uur bij 37 °c.
- Stel een programma in om drugs toe te voegen aan elk goed van het goed plaatje in de Analyzer met behulp van een metriek zoals beschreven in tabel 2 (mitochondriale stresstest) en tabel 3 (glycolyse stresstest).
Opmerking: terwijl cellen worden geïnbroed, zet u het apparaat aan en controleert u of het op 37 °C staat.
-
Mitochondriale stresstest
- Bereid 45 μM stamoplossingen van oligomycine, 50 μM carbonyl cyanide 4-(trifluromethoxy) fenylhydrazone (FCCP) en 25 μM stamoplossingen van rotenone/antimycine A. Om 45 μM oligomycine voorraadoplossing te bereiden, lost u de inhoud van het in de handel verkrijgbare etui op in 280 μL van de volledige media. Om een FCCP-voorraadoplossing van 50 μM te bereiden, lost u de inhoud van het in de handel verkrijgbare etui op in 288 μL van de volledige media. Om 25 μM rotenone/antimycine een stamoplossing te bereiden, lost u de inhoud van het in de handel verkrijgbare etui op in 216 μL van de volledige media.
- Neem de sensor cartridge in de hulp plaat uit de incubator en laad de poorten (A, B en C) zodanig dat elk goed de uiteindelijke concentratie van 2 μM oligomycine, 1,5 μM FCCP en 0,5 μM rotenone/antimycine A heeft, indien nodig, volgens de verdunnings gegevens zoals beschreven in tabel 4 (voor het zuurstofverbruik).
- Verwijder het deksel van de sensor cartridge die in de hulp plaat is gemonteerd en plaats deze in het instrumenten bakje. Start de kalibratie die 20 minuten duurt.
- Na de kalibratie, verwijder de Utility plaat en vervang deze door een test plaat met LSK cellen, die nu worden gehecht aan de bodem van de put.
- Druk op Doorgaan om het programma te starten dat wordt beschreven in tabel 2. Na de voltooiing van het programma, de gegevens op te halen en te analyseren met behulp van de Wave Desktop software.
Opmerking: De gegenereerde gegevens uit de extracellulaire flux testen kunnen worden uitgezet met behulp van de puntplot van de Wave Desktop software of geëxporteerd naar het webgebaseerde Statistiekprogramma.
-
Glycolyse stresstest
- Reconstitueer glucose in 300 μL (100 mM), oligomycine in 288 μL (50 μM), 2-D glucose (2-DG) in 300 μL (500 mM) volledige media uit het in de handel verkrijgbare zakje.
- Pipetteer voorzichtig op en neer (~ 10x) om de verbindingen te solubiliseren. Vortex het 2-DG gedurende ongeveer 1 minuut om een juiste oplossing in de media te garanderen.
- Verwijder de sensor cartridge uit de incubator. Laadpoorten A tot en met C volgende verdunnings meetwaarden beschreven in tabel 5 om een eindconcentratie van 10 mm glucose, 2 μM oligomycine en 50 mm 2-DG te verkrijgen.
- Herhaal stap 3.2.3 en 3.2.4.
- Druk op Doorgaan om het programma te starten dat is beschreven in tabel 3. Na de voltooiing van het programma, de gegevens op te halen en te analyseren met behulp van de Wave Desktop software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met onze extractiemethode konden we tot ~ 80.000 LSK Hspc's per muis oogsten. De levensvatbaarheid en aantallen LSK cellen werden verbeterd met onze methode, omdat wij: (1) gecombineerde beenmerg van bovenste en onderste ledematen, heup botten, borstbeen, ribbenkast, en wervelkolom, (2) vermeden met behulp van rode cel lysis buffer die zou hebben verhoogd cel-dood en klonteren, (3) gebruikt de dichtheidsgradiënt middelmatige scheiding van mono-nucleated cellen, en (4) vermeden met behulp van voorgekoelde buffer die zou hebben veroorzaakt het verlies van cellen-van-belang in klontjes.
Hoewel extracellulaire flux analyse van oudsher wordt gebruikt voor aanhangers van de hechting, ons gebruik van de PLL coating van putten, gevolgd door het centrifugeren van cellen op het, vergemakkelijkt de hechting van LSK HSPCs aan het oppervlak van de put. Dit stelde ons in staat om de extracellulaire flux te meten, en dus metabole gezondheid van LSK Hspc's. gezien het beperkte aantal cellen dat kan worden geoogst van een muis en de lange duur van het protocol voor hun isolatie, is ons gebruik van de Analyzer met zijn 8 well-formaat ontstaan als de meest kosteneffectieve en haalbare oplossing (Figuur 1).
Cellen gebruiken glycolyse en mitochondriale ademhaling om hun energiebehoeften aan te vullen en tussen producten te produceren die nodig zijn voor hun proliferatie en groei19. Het hexokinase-enzym converteert glucose in glucose-6-fosfaat en wordt vervolgens omgezet in pyruvaatlaat20. Pyruvate kan vervolgens worden verwerkt tot lactaat en wordt geëxporteerd uit de cel met protonen21. ECAR meet de verzuring van de media en is dus een indicator van de glycolyse. Pyruvate kan ook worden vervoerd in de mitochondriën en getransformeerd in acetyl coenzym A (CoA). Acetyl CoA komt in de TCA-cyclus, die voorziet in energie tussen producten om de elektronen bewegingen van de elektronen transport keten (etc) te stimuleren en genereert een proton gradiënt in de mitochondriale Inter-membraan ruimte22. Zuurstof fungeert als de laatste elektron acceptor, en protonen gaan terug naar de mitochondriale matrix door het ATP-synthase complex tijdens het genereren van ATP23. OCR meet het zuurstofverbruik en wordt daarom gebruikt om de mitochondriale ademhaling te kwantificeren.
Om de OCR en de ECAR in basale en gestresste omstandigheden te analyseren, gebruikten we sequentiële injectie van medicijnen die interfereren met glycolyse en mitochondriale ademhaling. We gebruikten glucose en 2-Deoxyglucose (2-DG), een glucose-analoog, te initiëren en te blokkeren glycolyse respectievelijk24. We gebruikten Rotenone (een complexe I-specifieke remmer van de ETC), antimycine A (een complexe III-specifieke remmer van de ETC), oligomycine (remmer van ATP-synthase), en de ontkoppelings agent carbonyl cyanide-4-(trifluoromethoxy) fenylhydrazone (FCCP) om specifieke gebeurtenissen van de ETC25te blokkeren. We hebben dergelijke reagentia getitreerd om de optimale concentratie voor LKS-Hspc's te vinden (Figuur 2A, B).
Om de glycolyse-stresstest uit te voeren, hebben we de LSK-Hspc's gekweekt in een glucose/pyruvate-media (zoals aanbevolen door de fabrikant), of in glucose/pyruvate met media. Zoals verwacht vonden we het basale niveau van de ECAR hoger voor LSK Hspc's gekweekt in glucose/pyruvate + media in vergelijking met LSK Hspc's gekweekt in glucose/pyruvate-media. De eerste injectie met glucose niet het basale niveau van ECAR voor LSK Hspc's gekweekt in glucose/pyruvate + media, terwijl het versterkt glycolyse in LSK HSPCs gekweekt in glucose/pyruvate-media. Echter, de basale niveau van de ECAR, na de injectie met glucose, bleef lager in vergelijking met de glucose/pyruvate + groep. De tweede injectie met oligomycine, die de productie van ATP via oxidatieve fosforylering kon blokkeren, activeerde de glycolyse op het maximale niveau van LSK Hspc's in glucose/pyruvate + media, maar het had geen invloed op de glucose/pyruvate-groep. De laatste injectie met het glucose-analoog 2-DG heeft de ECAR teruggebracht tot het niet-glycolytische niveau (Figuur 2C).
Voor de mitochondriale stresstest, we gemeten de basale niveau van OCR van LSK HSPCs in glucose/pyruvate + media. We eerst geïnjecteerd oligomycine die in eerste instantie hypergepolariseerd het mitochondriale membraan, voorkomen meer Proton pompen door de ETC complexen, en dus verminderde de snelheid van de mitochondriale ademhaling. De tweede injectie van FCCP ionoforen geduwd ETC en OCR niveaus tot hun maximum als cellen probeerde te herstellen van de mitochondriale membraan potentieel. De laatste injectie met andere twee van de ETC-remmers (antimycine A en rotenone) veroorzaakte de volledige stop van mitochondriale ademhaling en dus werd de OCR teruggedraaid naar het minimumniveau (Figuur 2D).
Figuur 1: schema demonstreren isolatie van LineageNEGSca1+c-Kit+ (LSK) hematopoietische stam voorlopercellen van muis beenmerg. Beenmerg wordt geëxtraheerd uit botten en mononucleaire cellen (Mnc's) worden geïsoleerd door middel van dichtheidsgradiënt, halfgradiënt scheiding. Vervolgens worden cellen geïnincubeerd met biotinyleerd Lineage+ antilichamen en streptavidine-geconjugeerde magnetische parels om Lineage Negative (Lin-) cellen te Elueer na hun magnetische scheiding. De Lin-cellen worden vervolgens geïntrigeerd met LSK-antilichamen en LSK- cellen, geïsoleerd door celsortering. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: extracellulaire flux analyses van Murine LineageNEGSca1+c-Kit+ (LSK) hematopoietische stam voorlopercellen. (a, B) Mechanistische beschrijving van drugs gebruikt voor extracellulaire flux analyses tijdens de glycolyse en mitochondriale ademhaling. C) representatieve resultaten van de glycolyse-stresstest op MURIENE LSK-Hspc's in aanwezigheid of afwezigheid van glucose/pyruvaat in de media. D) representatieve resultaten van de mitochondriale stresstest op MURIENE LSK-Hspc's. foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie van het gemiddelde (S.D.) Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Voorraad | Eindconcentratie | Volume voor 30 mL | |
| Volledige media | 28,691 mL | ||
| P/S | 100x | 0.5 x | 150 μL |
| L-glutamine | 200 mM | 2 mM | 300 μL |
| Pyruvaat | 100 mM | 1 mM | 300 μL |
| Glucose | 1 M/180.2 mg/mL | 3 mg/mL | 499,4 μL |
| Tpo | 100 μg/mL | 100 ng/mL | 30 μL |
| Scf | 100 μg/mL | 100 ng/mL | 30 μL |
Tabel 1: inhoud en voorbereiding van de complete XF-media.
| Basale | Oligomycine (2 μM) | FCCP (1,5 μM) | R/A (0,5 μM) | |
| Herhaling | 3 keer | 3 keer | 3 keer | 3 keer |
| Mix | 3 min. | 3 min. | 3 min. | 3 min. |
| Wachten | 0 min. | 0 min. | 0 min. | 0 min. |
| Maatregel | 4 min. | 4 min. | 4 min. | 4 min. |
Tabel 2: injectie protocol voor de mitochondriale stresstest.
| Basale | Glucose (10 mM) | Oligomycine (2 μM) | 2-DG (50 mM) | |
| Herhaling | 3 keer | 3 keer | 3 keer | 3 keer |
| Mix | 3 min. | 3 min. | 3 min. | 3 min. |
| Wachten | 0 min. | 0 min. | 0 min. | 0 min. |
| Maatregel | 7 min. | 7 min. | 7 min. | 7 min. |
Tabel 3: injectie protocol voor de glycolyse-stresstest.
| Poort | Drug | Eindconcentratie van de put (μM) | Voorraadoplossing volume (μL) | Media volume (μL) | Poort oplossing (μM) | Volume toegevoegd aan poort (μL) |
| Port A | Oligomycine | 2 | 100 | 181,25 | 16 | 25 |
| Port B | FCCP | 1,5 | 100 | 270,4 | 13,5 | 25 |
| Port C | Rotenone/antimycine A | 0,5 | 60 | 240 | 5 | 25 |
Tabel 4: verdunnings statistieken voor het verkrijgen van een optimale geneesmiddelconcentratie voor mitochondriale stresstest in elke put van de analysator.
| Poort | Drug | Uiteindelijke goed-concentratie | Voorraadoplossing volume (μL) | Media volume (μL) | Poort oplossing | Volume toegevoegd aan poort (μL) |
| Port A | Glucose | 10 mM | 300 | 75 | 80 mM | 25 |
| Port B | Oligomycine | 2 μM | 108 | 192 | 18 μM | 25 |
| Port C | 2-DG | 50 mM | 300 | 0 | 500 mM | 25 |
Tabel 5: verdunnings statistieken voor het verkrijgen van een optimale geneesmiddelconcentratie voor de glycolyse-stresstest in elke put van de analysator.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier tonen we de isolatie van een maximale hoeveelheid zuivere en levensvatbare Murine LSK HSPCs populatie, evenals de meting van hun glycolyse en mitochondriale ademhaling met een extracellulaire flux Analyzer. Het protocol overkomt met name de volgende technische problemen voor het gebruik van LSK Hspc's: i) de lage frequentie van LSK-Hspc's in het lymfklier beenmerg14, II) lage basale metabole activiteit van LSK hspc's26, III) de FRAGILITEIT van LSK hspcs27, en IV) de niet-naleving van LSK-hspc's aan kweek vaartuigen15. Daarnaast hebben we de geneesmiddelconcentraties en de media samenstelling geoptimaliseerd voor de optimale prestaties van de extracellulaire flux testen.
Hspc's van het beenmerg bevinden zich in de hypoxische niche en vertonen een glycolytisch fenotype, dat van cruciaal belang is voor het behoud van hun stemheid28. Omgekeerd is ademhaling essentieel voor HSPC-differentiatie6. Als metabole disfunctie van HSPCs leidt tot bloedziekten; hier, we hebben beschreven het protocol en video-gebaseerde tutorials voor het meten van de kenmerken van metabole functies, zoals de OCR en de ECAR, voor Murine beenmerg-afgeleide LSK HSPCs.
In tegenstelling tot de aanbevelingen van de fabrikant voor aanhangende cellen, we vonden dat de glycolyse stresstest resultaten op LSK Hspc's zijn optimaal wanneer cellen worden gekweekt in glucose/pyruvate + media in vergelijking met glucose/pyruvate-media. We beseften dat het gebrek aan glucose in de media voor LSK Hspc's resulteert in celdood tijdens de ~ 2 h equilibratie periode in een niet-CO2 incubator. Omdat de glucose injectie het basale niveau van ECAR voor LSK Hspc's niet heeft gewijzigd in glucose/pyruvate + media, onze modificatie van het protocol bewaart niet alleen de essentie van de glycolytische stresstest, maar stelt ons ook in staat om onderscheid te maken tussen de basale glycolyse (vóór eventuele injecties), glycolytische capaciteit (na oligomycine injectie) en niet-glycolytische verzuring (na injectie met 2-DG) van LSK Hspc's.
Onze mitochondriale stresstest van LSK Hspc's toonde aan dat de ATP geproduceerd door oxidatieve fosforylering in LSK Hspc's minimaal is zoals gezien met de kleine reductie in de OCR na de injectie met oligomycine. Omgekeerd bevestigt de verhoging in de OCR op de FCCP-injectie dat LSK-Hspc's in staat zijn om te reageren op een hogere energievraag.
Samen, het doel van dit protocol was om een set van duidelijke, beknopte instructies te begeleiden video-gebaseerde tutorials over hoe de metabole functies te meten, zoals de OCR en de ECAR, van HSPCs. Met belangrijke wijzigingen en aanvullende aanbevelingen voor het oogsten van hogere aantallen gezonde LSK-Hspc's, waardoor ze zich hechten aan het oppervlak van de put, evenals de optimalisatie van de incubatietijd en de geneesmiddelconcentratie, zal dit Protocol onderzoekers te analyseren glycolyse en mitochondriale respiratie status van HSPCs, alsmede niet-aanhangend hematopoietische cellen tijdens de ontwikkeling van het bloed en ziekten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk wordt deels gesteund door de steun van de National Institutes of Health (HL131645, CA016058), de Stichting van de St. Baldrick en de Pelotonia Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.01% (w/v) poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | Used for LSK attachment |
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-547 | Used for cell filtration after bone crushing |
| Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi | 130-090-485 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD45R/B220 Clone RA3-6B2 | BD Biosciences | 553086 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD5 Clone 53-7.3 | BD Biosciences | 553019 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD8a Clone 53-6.7 | BD Biosciences | 553029 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C Clone RB6-8C5 | BD Biosciences | 553125 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells Clone TER-119 | BD Biosciences | 553672 | Used for Lin- separation |
| CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody (2B8), APC | eBioscience | 17-1171-83 | Used for LSK sorting |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-53A | Used in cell isolation |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-432-22 | Used in cell isolation |
| Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-11A | Used for LSK sorting |
| Fetal Bovine Serum | Neuromics | FBS001-HI | Used in FACS buffer |
| Histopaque-1083 | Sigma | 10831 | Used for ficoll gradient separation |
| L-glutamine 100x | Fisher Scientific | 25-030-081 | Used for the assay media |
| LS Column | Miltenyi | 130-042-401 | Used for Lin- separation |
| Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonal Antibody (D7), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-5981-82 | Used for LSK sorting |
| Murine Stem Cell Factor (SCF) | PeproTech | 250-03-100UG | Used for the assay media |
| Murine Thrombopoietin (TPO) | PeproTech | 315-14-100UG | Used for the assay media |
| PBS 1% | Fisher Scientific | SH3002802 | Used for FACS buffer |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Fisher Scientific | 15140122 | Used for the assay media |
| Propidium Iodide | Fisher Scientific | P1304MP | Used for LSK sorting |
| Seahorse XFp Cell Culture Miniplate | Agilent Technologies | 103025-100 | Used for LSK seeding |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher | 11360070 | Used for the assay media |
| Streptavidin eFluor 450 Conjugate | eBioscience | 48-4317-82 | Used for LSK sorting |
| XF Calibrant | Agilent Technologies | 100840-000 | Used for cartridge equilibration |
| XF media | Agilent Technologies | 103575-100 | Used for the assay media |
| XFp Glycolysis Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103017100 | Drugs for glycolysis stress test |
| XFp Mitochondrial Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103010100 | Drugs for mitochondrial stress test |
| XFp Sensor Cartridge | Agilent Technologies | 103022-100 | Used for glycolysis and mitochondrial stress test |
References
- Dharampuriya, P. R., et al. Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).
- Wilkinson, A. C., Yamazaki, S. The hematopoietic stem cell diet. International Journal of Hematology. 107, 634-641 (2018).
- Kohli, L., Passegue, E. Surviving change: the metabolic journey of hematopoietic stem cells. Trends in Cell Biology. 24, 479-487 (2014).
- Abdel-Wahab, O., Levine, R. L. Metabolism and the leukemic stem cell. The Journal of Experimental Medicine. 207, 677-680 (2010).
- Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells International. 2019, 4067162 (2019).
- Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communication. 7, 13125 (2016).
- Anso, E., et al. The mitochondrial respiratory chain is essential for haematopoietic stem cell function. Nature Cell Biology. 19, 614-625 (2017).
- Wanet, A., Arnould, T., Najimi, M., Renard, P. Connecting Mitochondria, Metabolism, and Stem Cell Fate. Stem Cells and Development. 24, 1957-1971 (2015).
- Maryanovich, M., et al. An MTCH2 pathway repressing mitochondria metabolism regulates haematopoietic stem cell fate. Nature Communication. 6, 7901 (2015).
- Suda, T., Takubo, K., Semenza, G. L. Metabolic regulation of hematopoietic stem cells in the hypoxic niche. Cell Stem Cell. 9, 298-310 (2011).
- Zhang, C. C., Sadek, H. A. Hypoxia and metabolic properties of hematopoietic stem cells. Antioxidants & Redox Signaling. 20, 1891-1901 (2014).
- Snoeck, H. W. Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, 125-136 (2007).
- Chen, J., et al. Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice. Experimental Hematology. 36, 1236-1243 (2008).
- Jung, Y., et al. Hematopoietic stem cells regulate mesenchymal stromal cell induction into osteoblasts thereby participating in the formation of the stem cell niche. Stem Cells. 26, 2042-2051 (2008).
- Masuda, S., Li, M., Izpisua Belmonte, J. C. Niche-less maintenance of HSCs by 2i. Cell Research. 23, 458-459 (2013).
- Anderson, H., et al. Hematopoietic stem cells develop in the absence of endothelial cadherin 5 expression. Blood. 126, 2811-2820 (2015).
- Lo Celso, C., Scadden, D. Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs). Journal of Visualized Experiment. (157), (2007).
- Van Wyngene, L., Vandewalle, J., Libert, C. Reprogramming of basic metabolic pathways in microbial sepsis: therapeutic targets at last. EMBO Molecular Medicine. 10, (2018).
- Olson, K. A., Schell, J. C., Rutter, J. Pyruvate and Metabolic Flexibility: Illuminating a Path Toward Selective Cancer Therapies. Trends in Biochemical Sciences. 41, 219-230 (2016).
- Halestrap, A. P., Wilson, M. C. The monocarboxylate transporter family--role and regulation. IUBMB Life. 64, 109-119 (2012).
- Kim, A. Mitochondria in Cancer Energy Metabolism: Culprits or Bystanders. Toxicological Research. 31, 323-330 (2015).
- Fosslien, E. Mitochondrial medicine--molecular pathology of defective oxidative phosphorylation. Annals of Clinical & Laboratory Science. 31 (1), 25-67 (2001).
- Wick, A. N., Nakada, H. I., Wolfe, J. B. Localization of the primary metabolic block produced by 2-deoxyglucose. The Journal of Biological Chemistry. 224 (2), 963-969 (1957).
- Linnett, P. E., Beechey, R. B.
- Rimmele, P., et al. Mitochondrial metabolism in hematopoietic stem cells requires functional FOXO3. EMBO Reports. 16, 1164-1176 (2015).
- Riviere, I., Dunbar, C. E., Sadelain, M. Hematopoietic stem cell engineering at a crossroads. Blood. 119, 1107-1116 (2012).
- Ito, K., Suda, T. Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).
