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Bioengineering

메타유기 연구 및 보존을 위한 생물 정화 및 프로바이오틱스 개발을 위한 미생물 균주 발굴

Published: October 31, 2019 doi: 10.3791/60238
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 2, 2, 1,2,3
1LEMM, Laboratory of Molecular Microbial Ecology, Institute of Microbiology Paulo de Góes, Federal University of Rio de Janeiro (UFRJ), 2Genome Center, University of California, Davis, 3IMAM-AquaRio - Rio de Janeiro Aquarium Research Center

Summary

오염은 모든 생물군석에 영향을 미칩니다. 해양 환경은 특히 지구상에서 가장 민감한 생태계 중 하나인 산호초에 영향을 미쳤습니다. 생물 정화는 오염 물질을 분해하는 유기체의 용량입니다. 여기에서, 우리는 산호에 대한 생물 정화 능력과 잠재적 인 프로바이오틱 특성을 제시하는 미생물을 분리하고 테스트하는 방법론을 설명합니다.

Abstract

오염은 모든 생물군석에 영향을 미칩니다. 해양 환경은 특히 지구상에서 가장 민감한 생태계 중 하나인 산호초에 영향을 미쳤습니다. 전 세계적으로 45억 명의 사람들이 산호초에 의해 생계를 제공하는 바다에 경제적으로 의존하고 있습니다. 산호는 매우 중요하고 따라서 그들의 멸종은 치명적인 결과로 이어집니다. 생물 정화를 포함하여 해양 오염 물질 및 지역 오염을 치료하기 위한 몇 가지 가능한 솔루션이 있습니다. 생물 정화는 오염 물질을 분해하는 유기체의 용량입니다. 이 접근 방식은 지속 가능성, 상대적으로 저렴한 비용 및 다른 생태계에 적용할 수 있다는 사실과 같은 몇 가지 장점을 제시하여 환경에 미치는 영향을 최소화합니다. 추가 장점으로, 내 인 성 미생물의 조작, 산호에 대 한 putative 유익한 미생물을 포함 하 여 (pBMCs), 해양 동물에 대 한 probiotic 효과 가질 수 있습니다. 이러한 맥락에서, 두 가지 접근법, 생체 개선 및 pBMC 접종결합의 사용은 유망할 수 있다. 이 전략은 산호및 기타 메타유기에 해로울 수 있는 특정 오염물질의 분해를 촉진하는 동시에 오염 및 기타 위협에 대처하기 위한 호스트 저항과 탄력성을 증가시킬 것입니다. 이 방법은 합성 에스트로겐 17a-에티닐에스트라디올(EE2) 및 원유의 두 가지 오염물질을 분해하기 위한 pBmc 선택에 중점을 둡니다. 둘 다 부정적인 해양 동물에 영향을 보고 되었습니다., 산호를 포함 하 여, 그리고 인간. 이 프로토콜은 특정 오염 물질을 분해 할 수있는 박테리아를 분리하고 테스트하는 방법을 설명하고 산호 숙주에게 이러한 관련 미생물의 일부 putative 유익한 특성을 감지하는 방법에 대한 설명이 뒤따릅니다. 여기에 설명된 방법론은 비교적 저렴하고 수행하기 쉬우며 적응력이 높습니다. 거의 모든 종류의 수용성 표적 화합물을 EE2 및 오일 대신 사용할 수 있습니다.

Introduction

오염은 전 세계적으로 인간, 동물 및 식물 건강에 영향을 미치는 주요 문제입니다. 화산 재1과같이 오염이 자연스러울 수 있지만 인간의 활동은 대부분의 오염의 주요 원인입니다. 인위적 인 활동은 토양, 물 및 공기를 오염시키고 있으며, 이는 직간접적으로 거의 2천만 명의 조기 인간사망2및 매년 수십억 개의 다른 생명체를 죽입니다. 오염 물질은 지구상에서 가장 외딴 지역에도 존재합니다. 예를 들어, 중금속 및 지속성 유기 화합물은 심해 무척추 동물과 극성 포유류에서 각각3,4에서검출되었다.

해양 환경은 특히 오염의 영향을 받았습니다. 오랜 시간 동안, 그것은 바다가 영향을받지 않고 물5의거대한 볼륨으로 인해 상품의 끝없는 소스를 공급 할 것이라고 가정했다. 이러한 이유로, 산업 및 기관의 모든 유형은 수세기 동안 수역에서 폐기물을 자유롭게 방출6,7. 플라스틱8,합성 호르몬9,살충제10,오일11,영양분12,중금속3,방사성 폐기물13 등 모든 유형의 여러 오염 물질이 영향을 미치는 것으로 보고되었습니다. 해양 생태계. 이러한 맥락에서, 산호초는 해양 환경에서 가장 중요하고 민감한 생태계 중 하나입니다14. 산호초는 영양분 순환 과 기후 조절에 필수적인 역할을함으로써 해양 종의 수천의 개발에 중요한 해안 보호자입니다. 산호초는 또한 물고기, 상품 및 관광을 제공함으로써 경제에 기여합니다15. 예를 들어, 45억 명의 사람들이 산호초의 지원을 받는 주요 식량 원천16으로바다 물고기에 의존하고 있습니다.

생태학적, 사회적, 경제적 중요성에 관계없이 산호초는17,18로파괴되고 있습니다. 인위적 활동은 주로 산호의 죽음의 세 가지 주요 원인에 기여에 대한 책임: 기후 변화, 남획, 수질 오염19. 지구 온난화 완화를 위해 노력하는 것이 중요하지만, 산호 감소20에크게 기여할 수 있는 수질 오염을 포함한 지역 오염을 최소화하는 것도 중요합니다. 따라서, 적응하고 생존을 위해 여분의 시간을 제공 할 수있는 산호의 수명을 증가시키는 전략의 개발에 대한 긴급한 필요가있다.

이와 관련하여, 오염을 최소화하고 산호의 체력을 높이기위한 전략을 개발하는 것이 매우 중요합니다. 해양 오염 물질을 치료하기 위한 전략은 매우 다양하며 물리적, 화학적, 생물학적 접근법으로 분류될 수 있습니다. 물리적 인 접근 방식이 도움이됩니다. 그러나 항상 효율적인 것은 아닙니다. 예를 들어, 플라스틱 폐기물은 물리적 인 제거를 통해 최소화 될 수 있으며 수용성 화합물은 제거해야합니다. 이러한 화합물의 예로는 원유, 석유 산업 활동 및 유출에 의해 방출되는 원유뿐만 아니라 합성 호르몬과 같은 다른 미세 오염 물질, 일반적으로 경구 피임약의 에스트로겐 성분으로 사용되며 하수21에존재하며, 22. 오염을 줄이기 위해 화학 물질을 사용하면 특정 문제를 해결할 수 있지만 추가 오염 원을 나타낼 수도 있습니다. 이는 석유 오염을 완화하기 위한 화학적 분산제의 경우이며, 이는 석유 오염자체(23)보다해양 생태계에 더욱 독성이 있다고 설명되어 왔다. 이러한 이유로, 생물학적 접근법은 다른 방법과 비교할 때 몇 가지 장점을 제시한다. 생물 정화는 오염 물질을 덜 독성 또는 무독성 형태로 변환하는 살아있는 유기체 또는 그들의 대사산물(24)의용량이다. 생물학적 방법을 사용하는 주요 장점은 지속 가능성, 상대적 저렴한 비용, 생태 학적으로 우호적이며 다른 생태계에 적용 될 수 있다는 사실이며 환경에 미치는 영향을 최소화하거나 적게 유발합니다21, 25,26,27.

추가적으로, 환경에 존재하는 미생물 지역 사회의 조작은 추가 잠재적인 이점을 허용합니다. 호스트와 관련 되 고 그들의 건강에 필수적인 미생물군유전체가 있다. 이러한 관련 공생 미생물군유전체는 숙주 항상성19를유지하기 위해 필요하다는 것은 잘 알려져 있다. 이러한 관련 미생물의 조작은 식물과 포유류28,29,그러나 산호 프로바이오틱스의 사용은 여전히 새로운15. 산호는 또한 호스트, 상호 작용, 그리고 살아남기 위해 미생물의 크고 특정 인구에 의존19. 산호의 건강과 dysbiosis에 있는 이 미생물 지역 사회의 역할은 적극적인 연구 결과, 그러나 아직도 완전히 이해되고 에서30입니다. 가장 인기 있는 가설 중 하나는 산호 probiotic 가설 이라고. 공생 미생물과 환경 조건 사이의 역동적인 관계의 존재를 시사하는 것은 가장 유리한 산호메타유기체(31)의선택을 가져온다. 이 정보에 따라, 주요 잠재적인 probiotic 메커니즘, 격리에 대 한 전략 뿐만 아니라, 조작, 그리고 산호에 대 한 유익한 미생물의 배달 (BMC) 여러 가지 목적을 위해, 제안 되었다32 그리고 테스트33. 이러한 잠재적 유익한 특성으로는 온도 상승에 대한 저항성, 반응성 산소 종으로부터의 보호(ROS), 질소 고정, 오염물질에 대한 내성, 병원체에 대한 생물학적 통제 등이32.

이 연구는 해양 환경에서 흔하게 발견되는 합성 에스트로겐 17a-에티닐레스트라디올(EE2) 및 원유의 두 가지 오염물질을 분해하는 능력을 제시하는 BmCs 및 자유 살아있는 미생물의 선택에 초점을 맞추고 있습니다. 호르몬 활성제를 포함하는 오염물질은수체34,35,36,37,38,39,40, 41,42. 그 중, 합성 에스트로겐 내분비-파괴 화합물 (EDCs) 대상 세포에 에스트로겐의 작용을 모방, 동물에 여러 영향을 일으키는, 유방암을 포함 하 여, 불 임, 그리고 hermaphroditism9. EE2는 경구 피임약의 사용 때문에 인간에 의해 배설됩니다. 그것은 전통적인 폐수 처리 공장에 의해 하수에서 제거되지 않으며 매우 낮은 농도 (예를 들어, ng/L 또는 μg/L)43,44,45에서도부정적인 영향을 미칩니다. 산호 생리학에 에스트로겐의 효과에 대해 거의 알려져 있다46,47. 그러나, 스폰지, 갑각류 및 연체 동물과 같은 다른 해양 무척추 동물에, 에스트로겐은 주로 재생과 관련된 몇 가지 부정적인 영향을 일으키는 것으로 보고되었다, 이러한 개발 및 / 또는 게임테의 자극등, 효소및 단백질 행동, 배아 과정의 문제 및 기타48,49,50,51,52. EE2 오염으로 인한 부정적인 결과는 해양 생물에 영향을 미치지 않으면서 이 화합물을 환경에서 제거하기 위한 지속 가능한 접근법을 개발할 필요성을 강조합니다.

이와 병행하여 현재 전 세계 소비 에너지원의 약 40%를 차지하는오일53과마찬가지로, 만성적인 오염과 기름 유출은 암초지역(11)근처에서 종종 발생한다. 오일 오염은 여러 종의 해양 동물, 조류, 식물 및 인간54,55,56,57에부정적인 영향을 미치는 것으로 보고되었다. 산호에, 그것은 표백을 일으키는 원인이 되고, 열 긴장(58)에애벌레의 저항을 감소시키고, 미생물 관련 지역 사회(21)를중단하고, 조직 괴사를 일으키는 원인이 됩니다. 또한, 유출을 시정하기 위해 석유 회사에서 일반적으로 사용하는 석유 정화 기술인 화학 분산제는 오일자체(23)보다산호에 훨씬 더 독성이 있다. 반면, 산호에서 분리된 유익한 미생물은 숙주 건강에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있습니다. 그러나, 이러한 잠재적인 probiotics의 조작 가능한 부정적인 부작용 및 메타 유기의 적합성을 개선 하기 위해 선별 될 수 있는 신진 대사 능력을 조사 하기 위해 더 나은 탐구 해야 합니다. 이러한 맥락에서, 산호 병원균에 대한 항균 활성, 산화 스트레스와 싸우는 카살라제 의 생산, 요소 분해 능력 (석회화 과정에서 중요한 역할을 할 수 있음), 유전자의 존재와 같은 특성 잠재적 인 유익한 특성을 부여하는 것은 조사의 초점이어야합니다. 여기에서, 우리는 어떻게 생물 정화와 프로바이오틱스가 오염의 영향을 완화하고 산호 건강을 향상시키는 데 사용될 수 있는지 보여줍니다. 해양 종의 지속성을 높이기 위한 개입으로 사용될 수 있는 혁신적인 접근법의 개발은 보다 지속 가능하고 건강한 지구를 향한 한 걸음을 나타냅니다.

Protocol

1. 미생물 격리를 위한 물과 산호 수집 및 저장

참고: 샘플링 사이트의 좌표와 온도를 조정하는 것이 필수적입니다. 가능하면 염도, pH, 깊이 및 광 강도와 같은 메타데이터는 미세조정된 재배 접근 방식과 향후 데이터 해석을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 신뢰할 수 있는 결과를 얻으려면 가능한 한 최소한의 시간 동안 샘플을 보관하십시오. 시료가 적당한 온도로 유지되지 않거나 장기간 보관되지 않으면 물/산호 미생물군유전체가 상당히 변할 수 있습니다. 분리 단계가 수집 후 즉시 수행되지 않으면 처리 될 때까지 샘플을 4 °C로 유지하는 것이 중요합니다. 샘플이 더 오래 저장될수록 4°C에서도 미생물 커뮤니티가 더 많이 변합니다.

  1. 바닷물을 채점하고 보관합니다.
    1. 각 표적 샘플링 사이트에서 적어도 세 배의 물로 500 mL 샘플을 수집합니다. 스크류 캡이 있는 멸균 병을 사용하는 것이 좋습니다.
    2. 수거 후 즉시 물을 처리하는 경우 병을 RT에 잠시 보관하십시오. 나중에 시료 처리가 진행되는 경우 병을 4°C로 유지하십시오.
  2. 산호를 샘플링하고 보관합니다.
    1. 멸균 된 펜치 쌍을 사용하여 물 샘플의 동일한 샘플링 사이트에서 산호 조각을 잘라냅니다. 오염을 방지하려면 멸균 장갑으로만 산호를 만지십시오.
    2. 20 mL 멸균 식염수 용액 (증류수에서 3 % NaCl) 또는 인공 바닷물을 사용하여 샘플링 된 산호 조각을 헹구어 바닷물의 느슨하게 부착 된 자유 생활 박테리아를 제거하십시오.
    3. 집게를 사용하여 각 산호 조각을 멸균 식염수 용액이 들어있는 나사 캡이있는 멸균 250-500 mL 용기에 넣습니다.
    4. 실험실에서 멸균 집게와 펜치를 사용하여 계량 스케일의 멸균 100mm x 20mm 페트리 접시를 사용하여 산호 조각 5g의 무게를 측정합니다.
    5. 산호 샘플 5g을 멸균 모르타르로 옮기고 멸균 유봉을 사용하여 macerate합니다.
    6. 멸균 주걱을 사용하여, 45 mL의 3% NaCl 멸균 용액 및 5 mm의 10-15 유리 구슬을 포함하는 멸균 배양 플라스크에 메이스 샘플을 옮김을 옮기고, 45 mL 멸균 식염수 용액중 일부를 사용하여 모르타르를 세척하고 메이스레이트의 최대 량을 회수한다.
    7. 플라스크를 샘플링 부위의 수온에서 16시간 동안 일정한 교반(150 x g)으로유지합니다.
      참고 : 얕은 물 산호의 경우 최적의 온도는 24-28 ° C에서 범위것입니다. 이 단계는 호스트 세포에 붙어 있는 것과 같은 다른 산호 구획에서 미생물을 분리할 것입니다, 또는 조직과 골격 안쪽에 사는 그들. 이 단계 후, 산호 철퇴는 저장되지 않아야하고, 격리 단계는 즉시 수행해야합니다.

2. 해수 및 /또는 산호에서 EE2 분해 박테리아의 격리

  1. 박테리아를 선택합니다.
    참고 : 단계 1.1.2 및 1.2.7 후, 다른 산호 철퇴에서 분리 된 해수의 미생물의 농도는 알 수없는 변수가 될 것입니다. 한천 매체를 포함하는 페트리 접시에 개별 미생물 식민지의 격리를 보장하기 위해, 연속 희석이 필요합니다.
    1. 산호 시료의 멸균 식염수 용액에서 최대10-9, 물 시료의 경우 최대10-6까지 연속 희석을 수행합니다. 피펫은 팁을 버리기 전에 위아래로 5배 희석됩니다. 다음 직렬 희석을 수행하기 전에 매번 5 s에 대한 소용돌이 샘플.
    2. 피펫 100 μL을 페트리 접시에 희석하여 3% NaCl 리소제니 국물(LB) 한천 배지를 함유하고, 이를 플레이트한다.
      참고: 해양 한천(MA)을 대체 매체로 사용하십시오. 신뢰할 수 있는 결과를 얻으려면 각 희석의 삼중항이 필요합니다.
    3. 대상 온도(예: 26°C)에서 1-3일 동안 플레이트를 배양합니다. 하루에 한 번 접시를 확인하십시오.
    4. 줄무늬 플레이트 기술을 사용하여 새로운 플레이트에 뚜렷한 성장 형태를 제시하는 식민지를 선택하고 분리합니다. 접시에 순수한 식민지가 자라도록 하려면 이 단계를 필요한 만큼 여러 번 반복한다.
    5. 시술이 즉시 2.3.1단계로 계속되지 않으면, 섹션 2.2에 설명된 바와 같이 4°C 또는 글리세롤에서 분리된 것을 저장한다.
  2. 글리세롤 주식을 준비합니다.
    참고: 이 단계는 선택 사항이며 장기 세균 성 주식 저장에 사용할 수 있습니다.
    1. 신선한 접시 또는 4 °C에 저장된 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하고 멸균 LB 배지 의 2 mL에서 독립적으로 접종하십시오.
    2. 튜브를 일정한 교반(150 x g)에놓고 밤새 24-28°C(ON)에 놓습니다.
    3. 2.2.2 단계에서 세균 배양물의 1 mL을 추가하고 멸균 글리세롤을 2mL 극저온에 20 %의 최종 농도로 추가하십시오.
    4. 4 °C에서 cryovials를 둡니다.
    5. 글리세롤 세균성 스톡을 필요할 때까지 -80°C에 놓습니다.
  3. EE2 분해 능력 테스트를 수행합니다.
    1. LB 국물 또는 대체 매체에서 분리물을 활성화합니다. 이를 위해, 4°C에 저장된 신선한 플레이트 또는 플레이트로부터 단일 콜로니를 선택하고, 멸균 LB 배지의 2 mL을 접종한다. 글리세롤 스톡인 경우, 먼저 LB 한천 플레이트에 줄무늬를 하고 24-28°C ON에서 배양하여 단일 콜로니가 자라도록 합니다. LB 배지를 함유하는 튜브를 24-28°C ON에서 일정한 교반(150 x g)하에서 경감시다.
    2. 세균 성장 후, 실온(RT)에서 8분 동안 8,000 x g에서 세포를 원심분리하여 세포를 펠렛한다. 상급물을 버리고, 부드럽게 위아래로 파이펫팅, 나머지 LB 국물을 세척식염수의 동일한 볼륨 (2mL)에서 세포를 다시 일시 중단.
    3. 2.3.2 단계를 두 번 반복하여 탄소 원의 흔적이 없음을 보장하고 동일한 양의 식염수로 세포를 다시 중단합니다. 예를 들어, 2 mL 배양으로 시작한 경우, 2 mL 식염수의 최종 부피에서 세포를 다시 중단시한다.
    4. EE2를 함유하는 최소 부셸하스 배양배지(BH Broth)에서 세척 및 재부유 세포를 유일한탄소원(59)으로접종한다.
      참고: EE2는 배양 배지에서 5 mg/L의 최종 농도에서 에탄올에 용해됩니다. 필요한 경우 오염 물질 유형 및/또는 농도를 변경합니다.
    5. LB 한천 배지33에서600 nm 및 /또는 콜로니 형성 단위 (CFU)에서 광학 밀도로 세균 성장을 평가하여 16-72 시간의 배양을 합니다.
      참고: 대안적으로, 미생물은 유일한 탄소 공급원으로 EE2, 또는 다른 화합물을 포함하는 최소 매체에 직접 분리될 수 있다. 이 단계는 선택을 지시하고 바람직하지 않은 성장을 피할 것입니다.

3. 바닷물 및/또는 산호로부터 오일 분해 박테리아의 분리

  1. 유일한탄소원(21)으로서오일 수용성 분획(oWSF) 및 오일 수용성 분획(oWIF)을 함유하는 최소 용지를 준비한다.
    1. 멸균 증류수 500 mL에 1-2% 원유를 추가합니다. 바닥에 열린 필터 플라스크를 사용하여 용해성 분획의 상층을 방해하지 않고 용해성 분획을 꺼낼 수 있습니다.
    2. 혼합물을 48시간 동안 150 x g에서 24-28°C에서 일정한 교반 하에 유지합니다.
    3. 원유 분획을 포함하는 필터 플라스크를 안정된 표면에 놓고 용해성 및 불용성 분획 분리가 가능하도록 10-20 분 정도 기다립니다.
    4. oWSF를 새로운 멸균 플라스크로 옮기고, 바닥 필터 플라스크를 열고 수용성 분획을 꺼내 oWIF를 저장합니다.
    5. 이전 단계(~400 mL)에서 회수된 모든 oWSF를 사용하여, 유일한 탄소 공급원으로 oWSF를 함유하는 BH 한천 최소 배지 1L을 준비한다.
    6. 3.1.4단계에서 플라스크에 잔여되는 oWIF를 사용하여, 유일한 탄소 공급원으로 oWIF를 함유하는 BH 한천 최소 배지 1L을 준비한다.
  2. oWSF- 및 oWIF 분해 박테리아를 분리합니다.
    1. 각각 1.1.2 단계 및 1.2.7 단계에서 물과 산호 macerate를 사용하여, 단계 2.1.1에 설명된 바와 같이 멸균 식염수 용액에서10-6까지 샘플을 희석.
    2. BH-oWSF 및 BH-oWIF 한천 매질을 함유하는 페트리 접시상에 각 희석물의 피펫 100 μL을 플레이트.
    3. 2.1.3단계에서 2.1.5단계까지 설명된 절차를 반복합니다.

4. 컨소시엄 회원 선정

  1. 분류학적 식별을 위해 DNA를 추출하고 서열.
    1. 2.3.1단계에서 설명한 바와 같이 글리세롤에 비축된 분리체를 활성화한다.
    2. DNA 추출 키트를 사용하여 DNA를 추출합니다(재료 표참조).
    3. 프라이머를 사용 27f (5′-AGA GTT TGA TGA TGG CTC CTC AG-3′) 및 1492r (5′-GTT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′) 16S rRNA 유전자의 증폭에 대 한.
    4. 다음 프로토콜에 따라 50 μL PCR 반응을 수행: 10x 폴리머라제 완충제의 5 μL, 2 mMMMgCl 2,0.2 mM dNTPs, 각 프라이머의 5 mMM, 게놈 DNA의 10 ng, 및 2.5 Taq DNA 폴리머라제의 U. 오염이 없는지 확인하기 위해 부정적인 대조군(즉, 빈 DNA 추출 및 템플릿 DNA 없이 PCR 반응)을 추가합니다.
    5. 다음 열 순환 단계를 설정: 4 분 동안 94 °C에서 첫 번째 변성 주기; 35 사이클을 94°C에서 1분 동안, 1분 동안 50°C, 2.5분 동안 72°C; 72 °C에서 10 분 동안 최종 연장 주기.
    6. 80V를 사용하여 1.2% 아가로즈 젤에서 앰플리온 무결성을 확인하십시오.
    7. 겔정제 키트를 사용하여 샘플을 정제합니다(재료 표참조).
    8. 플루오로미터를 사용하여 PCR 제품을 정량화합니다.
    9. 시퀀싱을 위해 제품을 보냅니다.
      참고: 더 나은 분류를 위해 Sanger 메서드는 긴 시퀀스를 제공하기 때문에60을사용하는 것이 좋습니다. 범용 프라이머 27f 및 1492r는 16S rRNA 유전자61의거의 전체 길이를 증폭시키는데 사용될 수 있다. 한 쌍의 프라이머를 사용하여 콘티그를 어셈블할 수 없는 경우 시퀀스 중간에 추가 쌍을 고려해야 합니다.
  2. 성장 곡선을 결정합니다.
    1. 2.3.1 단계에서 설명한 대로 2.2.5 단계에서 글리세롤 스톡에서 분리를 활성화하지만 2 mL 대신 5 mL을 사용하십시오.
    2. 성장한 5 mL 배양물의 1%(v/v)를 삼중배액에서 4.2.1단계에서 3% LB 배지의 100 mL을 함유하는 250 mL 플라스크에 추가합니다. 부정적인 제어 (접종 없음)의 삼중체도 준비하십시오.
    3. 플라스크를 24-28°C에서 일정한 교반(150 x g)하에인큐베이터에 놓습니다.
    4. 48시간 동안 4시간마다 1mL 의 알리쿼트(aliquots)를 복용하십시오. 균주가 높은 성장률을 제시하는 경우, 4 시간 간격을 감소.
    5. 리치 매질 플레이트에 도금된 직렬 희석으로부터 계산된 600 nm 파장 및 콜로니 형성 유닛(CFU)에서 광학 밀도(OD) 추정값을 측정합니다(100 μL은 각 플레이트에 접종하고 1 mL의 부피로 정규화되어야 합니다).
    6. OD 및 CFU 곡선을 플롯하고 각 개별 변형의 OD/CFU 상관관계를 분석합니다. 이제부터 OD 값을 기반으로 셀 수를 계산합니다.
  3. 적대성 테스트를 수행합니다.
    1. 2.3.1단계에서 설명한 대로 격리를 활성화합니다.
    2. 한천 매체와 중앙에 수직으로 다른 것들을 포함하는 판의 중간을 따라 한 번에 하나의 변형을 접종. 선택한 모든 미생물 변형이 다른 모든 균주에 대해 테스트될 때까지 반복합니다.
    3. 플레이트를 24-28 °C에서 배양하고 길항 작용을 나타내는 잠재적 후광을 관찰하기 위해 매일 모니터링하십시오. 후광이 두 균주 사이의 적대 적 활동을 나타내는 관찰되는 경우, 그들 중 하나는 제외되어야한다.
  4. 컨소시엄 어셈블리를 수행합니다.
    1. 2.3.1단계에서 설명한 대로 격리를 활성화합니다.
    2. 3,500 x g의 세포를 펠렛하고 동일한 양의 식염수로 2 x 부드럽게 씻으십시오. 동일한 볼륨으로 세포를 다시 일시 중단합니다 (즉, 최종 부피가 2 mL인 경우, 식염수 용액 2 mL을 사용하여 세척하고 최종 부피 2 mL로 다시 일시 중단).
    3. 100 mL에서 1 mL 배양을 접종 3% NaCl LB 배지 및 150 x g에서 ON 배양.
    4. 4.5.2 단계를 반복하고, 10L 배양물에서 100 mL 재배, 세척 및 재중단 배양액을 접종한다. 멸균 공기 리프트 바이오 리액터에서 ON을 배양하고 펌프에서 여과 된 공기를 받습니다. 더 많은 문화가 필요한 경우, 항상 신선한 미디어에서 재배 문화의 1 %를 접종하십시오.
    5. 원심분리기는 4°C에서 8분 동안 8,000 x g에서 재배하였다. 원심 분리 후 상급을 폐기하십시오.
    6. 500 mL의 멸균 식염수 용액으로 세포를 부드럽게 재중단하여 펠릿을 씻으십시오.
    7. 4.5.5 및 4.5.6 단계를 반복합니다.
    8. 식염수 용액의 100 mL에서 각 개별 배양을 재중단하고 OD를 측정하여 세포 수를 추정하였다.
    9. 107 세포 mL-1의최종 농도에 도달하는 데 필요한 각 배양량의 부피를 계산한다.
    10. 세포 생존력과 농도의 최종 확인을 위해 리치 미디어에 CFU 카운트를 수행합니다.
    11. 멸균 플라스크에 각 개별 배양물의 동일한 부피를 혼합하고 컨소시엄을 50 mL 멸균 튜브에 aliquot.
    12. 접종전까지 4°C에서 유지하십시오.
      참고: 컨소시엄 어셈블리를 가능한 한 신선하게 준비하여 셀이 여전히 실행 가능하도록 보장합니다. 또는 접종 전에 CFU 카운트를 수행할 수 있습니다. 이상적인 컨소시엄을 구성하려면 서로 다르고 상호 보완적인 대사 능력을 제시하는 분리를 사용해야 합니다. 일반적으로 6-10 분리는 컨소시엄을 형성하는 데 사용되지만 이 숫자는 구성원의 특성과 목적에 따라 달라집니다.

5. 산호에 대한 가용 유익한 특성의 검출

  1. LB 한천 플레이트에 줄무늬를 두드리고 24-28 °C ON에서 배양하여 글리세롤 스톡으로부터 분리시켜 단일 콜로니가 자라도록 합니다. 접시에서 단일 콜로니를 선택하고 멸균 LB 배지 2 mL로 접종하십시오. 24--28°C ON에서 일정한 교반(150 x g)하에LB 배지를 함유하는 튜브를 놓습니다.
  2. PCR에 의해 잠재적으로 유익한 유전자의 검출을 위해 섹션 4.1에 설명된 대로 DNA 추출을 수행합니다.
    참고: PCR 반응 조건 및 프라이머는 표적 유전자에 의존할 것이다. 잠재적으로 유익한 유전자에 대한 개별 균주 및 PCR 검출의 BMC 특성을 테스트하는 방법론은 표 1에기재되어 있다.

Representative Results

여기에 기재된 방법에 기초하여, 미생물을 상이한 수원및 산호 누빈으로부터 분리하여 BMC 특성을 제시하고 상이한 종류의 오염물질을 분해할 수있었다(도 1). CESA-UFRJ(리우데자네이루 연방대학 환경위생실험센터)에서 채취한 하수처리장에서 채취한 수질시료를 사용하여, 여기에 제시된 절차에 따라, 33개의 세균균주에서 EE2를 저하시킬 수 있는 세균균 5mg/L의 최종 농도를분리하였다(도 2A). 부가적으로, 오일 분해 균을 선택하는 기술을 사용하여, oWSF(도 2B)및 oWIF(도2C)를모두 분해할 수 있는 20개의 균주를 분리하였다.

Putative BMC 특성은 다양한 조건하에서 상이한 산호 종으로부터 분리된 미생물에서 스크리브되었다. 그 중에서도 산호병원균비브리오코랄리틱쿠스(그림 3A)에대하여 강한적대활성을 제시하는 균주, 우레아를 분해할 수 있는 균주(그림3B),좋은 카랄라아제 생산자(그림3) C),잠재적으로 유익한 유전자를 제시하는미생물(도 3D)이발견되었다.

두 가지 접근법(즉, 생물 정화 및 BMC 접종)을 채택하여 산호를 오일 노출 영향으로부터 보호할 수 있었습니다. 이를 위해, 산호 Mussismilia harttii로부터분리된 오일 바이오리포어 pBMC컨소시엄은, 삼중21에서1%의 오일에 노출된 산호 누빈에 접종하였다. 오일에 노출된 치료법은 4일째부터 Fv/Fm의 점진적인 감소를 보이며 10일째까지 0에 가까운 값에 도달했습니다. 가변 형광/최대 형광(Fv/Fm)은 산호 건강의 간접 측정을 나타내는 zooxanthellae의 최대 광시스템 II(PSII) 광화학적 효율을 측정했습니다. 한편, 컨소시엄과 함께 접종된 수족관에 존재하는 산호 누빈은 더 잘 보존된 광화학능력을보였다(도 4).

Figure 1
그림 1: 바이오리포터-pBMC 컨소시엄 선택 및 조립의 주요 단계 요약. 오염물질 분해 미생물 선택 단계(회색) 및 컨소시엄 미생물 선택(DNA 염기서열 분석, 성장 곡선, 길항 테스트 및 적색 컨소시엄 조립)에 사용되는 최종 단계의 계획. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 오염 물질 분해 박테리아의 선택. (A)유일한 탄소 원으로 EE2를 포함하는 최소 미디어 플레이트에서 세균이 자생합니다. (B)유일한 탄소 원으로 oWSF를 포함하는 최소 미디어 플레이트에서 성장하는 박테리아 식민지. (C)유일한 탄소 원으로 oWIF를 포함하는 최소 미디어 플레이트에서 성장하는 박테리아 식민지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: pBMC 특성 의 검출. (A)산호 병원균 비브리오 coralliilyticus (검은 색)와 제어 균주 (녹색)에 대한 길항 활성을 제시 균주의 삼중 반점. (B)유일한 탄소 원으로 요소포함 매체에서 성장하는 균주. (C)카랄라아제(+)를 생산하는 균주 및 나쁜 카세라아제 생산자 균주(-). (D)nirK 유전자의 PCR 검출의 예(레인 1= 1kb 사다리; 레인 2=빈 DNA 추출 음성 대조군; 레인 3= nirK 검출; 레인 4= 템플릿 DNA 가없는 PCR 반응). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: Fv/Fm 측정M. harttii nubbins 어두운 적응 5 오후, 다이빙 PAM 엽록소 형광계를 사용 하 여. 컨소시엄을 통해 처리 제어 컨소시엄, 오일 및 오일의 Fv/Fm 측정은 10일 동안 매일 삼중항에서 수행되었습니다. 표준 편차가 표시됩니다. 그래프의 기능은 크리에이티브 커먼즈 저작자 표시 4.0에서 https://www.nature.com/articles/srep18268 사용할 수 있는 이전 결과21의허가를 받아 수정되었습니다. http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ 전체 용어. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Moa 미생물 검출 기술 참조
기후 규제; surfur 사이클링; 항균 화합물; 세포의 항 산화 보호를 증가. 아스퍼질러스 시도비 dddP 유전자용 PCR 81
슈도비브리오 sp. P12 DMSP를 가진 배양 매체 82
슈돌로모나스 sp. dmdA 유전자를 위한 PCR 33
병원균의 생물학적 조절. 아크로페라 팔마타 점액의 미생물군유전체 억제의 명확한 영역 83
산호추출물 성장 억제 분석 84
마리노박터 sp. 떼지어 다니는 어세이 85
슈돌로모나스 sp. 한천 플레이트 크로스 줄무늬 86
슈돌로모나스 sp. 한천 확산 방법 33
석회화 공정의 이점; scleractinian 산호에 대한 질소의 소스. 공생체 디늄 spp. 반색 방법 87
스틸로포라 피스티야타 점액의 미생물군유전체 ___ 88
아크로보라 알시미나타에서 온 미생물군유전체 볼랜드 외.80에 의한 방법 89
질소 사이클; 질소 고정을 증가시. 미생물 커뮤니티 qPCR 90
미생물 커뮤니티 Pcr 91
미생물 커뮤니티 qPCR 92
미생물 커뮤니티 적응 된 아세틸렌 (C2H2) 감소 기술 93
슈돌타로모나스 sp. 할로모나스 태아넨시스 Pcr 33
질소 사이클; 암모늄 농도의 감소. 슈돌로모나스 sp. Pcr 33
투바스트라에아 코시네아의 미생물군유전체 Pcr 94
제스토스폰기아 테투디나리아의 미생물군유전체 예측 메타게놈 분석 95
반응성 산소 종에 대한 홀로비오닉 보호 (ROS). 슈도알터로모나스 sp., 코베티아 마리나 및 할로모나스 태안넨시스 카탈라제 테스트 33
공생체 디늄 spp. 앰플렉스 레드 96
비브리오 펠라기우스와 싱크초코쿠스 sp. 고추냉이 페록시다아제-스코폴레틴 방법 97
비브리오 피셰리 여러 메서드 98

표 1: 가용 BMC 특성의 검출, 작용 기전(MOA), 특성을 검출하는 데 사용되는 전위 및 기술을 제시하는 미생물보고.

Discussion

생물 정화 접근법은 지난 50년 동안 엄청나게 탐구되었습니다. 예를 들어, 여러 다른 서식지에서 박테리아, 시아노박테리아, 미세조류 및 곰팡이 중 200개 이상의 미생물이 유화수소62,63,64의 존재를 나타내거나 분해할 수 있도록 지정되었습니다. . 또한 플라스틱, 비스페놀 A, 내분비 분열기 및 중금속과 같이 환경과 인간에 영향을 미치는 다른 종류의 화합물은 생물 정화 기술 개발65,66 ,66, 67. 한편, 해양프로바이오틱스 개발은 양식업68,69에서어류 프로바이오틱스 등 경제에 명백한 영향을 미치는 분야로 제한되어 있다. 그러나 산호초를 보호하기 위한 유익한 미생물의 고립과 특성화, 어업, 관광 및 기타 수익성 있는 활동을 지원하는 해양 생태계는15의가치가 평가되기 시작했습니다. 여기서, 지역 해양 생태계, 특히 유익한 미생물을 산호(pBMCs)에 잠재적으로 유익한 특성으로 제시할 수 있는 오염물질 분해 미생물을 선택하는 저렴하고 용이하며 접근가능한 프로토콜은, 설명.

추가적으로, 여기에서 설명된 방법은 몇몇 화합물 및 미생물 근원의 다양한 모형에 높게 적응성입니다. 최소 매질에 첨가된 유일한 탄소 원을 대체하여 상이한 오염물질을 표적화할 수 있다. 이를 위해 오일 이나 EE2 대신 다른 화합물을 원하는 농도로 첨가해야 합니다. 이것은 표적 오염 물질에 대한 열하를 격리하는 선택적 압력이 될 것입니다. 예를 들어, 내분비 장애의 다른 클래스를 저하시킬 수 있는 미생물은 이미 동일한방법론(70)을사용하여 선택및 시험되었다. 더욱이, 스폰지 및식물(71,72)과같은 다른 해양 및 육상 생물뿐만 아니라 토양, 연료 및 암석과 같은 뚜렷한 유형의 환경 샘플은 분해 미생물 공급원으로서 사용될 수있다(25) 73,74. 예를 들어, 상이한 토양 및 퇴적물 샘플25,54,63, 64,75로부터탄화수소 분해 박테리아를 검출하고 분리할 수 있었다. 마지막으로, 매체에 약간의 변형을 수행, 박테리아 이외의 미생물은 쉽게 분해 미생물로 선택 될 수있다. 예를 들어, 에스트로겐 화합물을 효율적으로 분해하는 능력을 가진 미세조류 균주는76으로보고되었다.

이상적으로, 생물 학적 - 프로바이오틱 컨소시엄은 각 특정 화합물 또는 영역에 대해 조립되어야합니다. 특정 환경에서 성장 하는 미생물 그들의 네이티브 조건에 비해 새로운 사이트에서 뿐만 아니라 성장 하지 않을 수 있습니다. 연구원은 모든 다른 환경 조건하에서 효율적으로 적용 할 수있는 제품을 찾지 못했기 때문에 각 특정 상황에 대해 새로운 컨소시엄 어셈블리를 수행해야합니다. 이것은 환경 맞춤형 회복을위한 개인화 된 약과 비슷합니다. 이러한 이유로, 잠재적인 probiotic 특성 및 저하 용량을 가진 미생물 균주의 중앙 은행의 창조는이 분야의 진행에 대 한 중요 한 단계. 이 이니셔티브는 시간과 작업을 절약하여 전 세계적으로 새로운 특정 컨소시엄의 조립에 기여할 것입니다.

산호와 관련된 미생물(즉, 미세조류, 박테리아, 고고학, 곰팡이 및 바이러스)은 숙주 항상성19를유지하는 데 복잡하고 복잡한 역할을 한다. 오염과 같은 환경 스트레스는 또한 산호 미생물군유전체를 불안정하게 할 수 있으며, 이로 인해 질병과사망률이 30을유발할 수 있는 이영양증이 발생할 수 있다. 산호 미생물군유전체가 산호 건강을 지원할 수 있는 메커니즘이 밝혀지기 시작했습니다. 이러한 메커니즘은 산호 저항과 환경 스트레스에 대한 탄력성을 이해하고, 결과적으로 암초 지속성과 보존을 촉진하는 열쇠입니다. 또한, 필드에 있는 사실 인정은 일반적인 호스트 microbiome 상호 작용을 이해하는 것을 도울 것입니다, 그밖 지역에 있는 더 나은 probiotics 및 건강 증진 전략의 발달에 기여할 수 있는. 그것은 또한 더 나은 이러한 probiotics 접종 스트레스 이벤트 동안 메타 유기의 건강에 방해가 될 수 있는 방법을 조사 하는 것이 중요 하다. 예를 들어, 산호 성능에 있는 확대는 probiotics 때문 이며 단순히 음식 소스로 박테리아를 사용 하 여 산호는 여전히 필요.

이와 동시에 새로운 컨소시엄 전달 접근법의 개발과 기존 컨소시엄의 개선이 매우 중요합니다. 컨소시엄 고정화뿐만 아니라 산호 식품 (즉, 동맥 및 회전기)을 접종하고 벡터로 사용하는 것과 같은 혁신적인 접근 법을 위한 대체 방법이 유망합니다. 이러한 전달 시스템은 또한 다른 해양 생물을 대상으로 수정될 수 있으며 해양 프로바이오틱스 분야의 성공에 필수적일 것입니다.

오염 완화와 산호초 지속성은 현재 환경 컨퍼런스에서 정기적으로 강조되는 주요 주제 중 두 가지입니다. 아젠다 2030은 유엔이 발표한 글로벌 목표 사회가 지속 가능한 미래를 위해 도달해야 하는 것을 설명하는 문서로, 각 문제에 대한 구체적인 목표를 헌납한다. 목표 6은 오염을 줄임으로써 수질 개선의 중요성을 강조하는 반면, 목표 14는 해양, 바다 및 해양자원77의보존과 지속 가능한 사용의 관련성을 강화합니다. 이러한 맥락에서 산호초 보존은 오염 완화를 포함하여 가까운 장래에 달성해야 하는 변화에 달려 있습니다. 이것은 매우 중요 한, 대부분의 거 대 한 산호 손실 지역 서식지 파괴 및 오염 등 기후 이벤트에 추가 될 때 발생 하기 때문에78,79. 이 논문은 생물 학적 교정 및 pBMC 접종을 결합하여 특정 오염 물질을 분해 할 수 있음을 보여주었으며, 오염 물질 및 기타 문제를 다루는 산호의 저항성과 탄력성을 증가시킬 수 있음을 입증했습니다. 기존 프로토콜의 최적화 및/또는 결합되거나 독립적으로 적용되는 혁신적인 방법의 개발은 해양 생태계의 미래를 결정하는 데 매우 중요합니다.

Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

이 연구는 ANP 21005-4로 등록된 진행 중인 R&D 프로젝트와 관련하여 수행되었으며, "PROBIO-DEEP - 심해 해양 홀로비오엔트에 대한 석유 및 가스 탐사로 인한 잠재적 영향 조사 및 잠재적 생물 지표 선정 및 이러한 생태계에 대한 생물 정화 과정" (UFRJ / 쉘 브라질 / ANP) – "PROBIO-DEEP - 레반타멘토 드 potenciais impactos 코스타도스 펠라 exploração de óleo e gás em holobiontes marinhos em mar profundo e seleção de potenciais bioindicadores biorremediadores para essses ecossses", ANP R&D 레비에서 쉘 브라질 후원 "Compromisso de Investimentos com Pesquisa e Desenvolvimento. 저자는 또한 콘셀호 나시오날 드 데센볼비멘토 Científico e Tecnológico (CNPq) 및 쿠르데나카오 드 아페르페이소아멘토 드 페소알 드 니벨 슈페리어 (CAPES) 재정 지원을 위해 감사하고, 카밀라 메시아스, 필립 로사도, 그리고 엔리케 프라고소, 제공된 이미지에 대한 것입니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
500 mL PYREX Media Storage Bottle thomas scientific/Corning 1743E20/1395-500 Used to sample water.
500 mL Aspirator Bottles thomas scientific/Corning 1234B28/1220-2X Used to separate the oil fractions.
6-inch wire cutter plier thomas scientific/Restek 1173Y64/23033 Used to cut coral fragments.
17a-Ethinylestradiol LGC Standards DRE-C13245100 Used as the only carbon source to make the selective media.
Agar Himedia PCT0901-1KG Used to make solid media.
Bushnell Haas Broth Himedia M350-500G Used as minimum media to be supplemented with carbon sources.
Erlenmeyer Flask thomas scientific/DWK Life Sciences (Kimble) 4882H35/26500-125 Used to incubate coral macerate with glass beads.
GFX PCR DNA and Gel Band Purification kit GE Healthcare 28903470 Used to purify PCR products before sending them for sequencing.
Glass Beads MP Biomedicals 1177Q81/07DP1070 Used to detach the microorganisms from coral structures.
Laminar Flow Hood Needed to work at sterile conditions.
Luria Bertani Broth, Miller (Miller Luria Bertani Broth) Himedia M1245-1KG Used as rich media to grow bacteria.
Marine Agar 2216 (Zobell Marine Agar) Himedia M384-500G Used as rich media to grow bacteria.
Orbital-Shaker Incubator Used to incubate liquid media and oil.
Plates Incubator Used to incubate plates.
Porcelain Mortar and Pestle Thomas scientific/United Scientific Supplies 1201U69/JMD150 Used to macerate coral fragments.
Qubit 2.0 Fluorometer Invitrogen Used for nucleic acids quantification of DNA and PCR products.
Refrigerated Centrifuge Used to centrifuge bacterial cultures.
Spectrophotometer Used to measure optical density of bacterial cultures.
Wizard Genomic DNA Purification kit Promega A1120 Used for microbial strains DNA extraction.

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Villela, H. D. M., Vilela, C. L. S., Assis, J. M., Varona, N., Burke, C., Coil, D. A., Eisen, J. A., Peixoto, R. S. Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation. J. Vis. Exp. (152), e60238, doi:10.3791/60238 (2019).

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