Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Prospektering mikrobiella stammar för bioremediering och probiotika utveckling för Metaorganismforskning och bevarande

Published: October 31, 2019 doi: 10.3791/60238
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 2, 2, 1,2,3
1LEMM, Laboratory of Molecular Microbial Ecology, Institute of Microbiology Paulo de Góes, Federal University of Rio de Janeiro (UFRJ), 2Genome Center, University of California, Davis, 3IMAM-AquaRio - Rio de Janeiro Aquarium Research Center

Summary

Föroreningar påverkar alla biomer. Marina miljöer har särskilt påverkats, särskilt korallrev, ett av de känsligaste ekosystemen på jorden. Bioremediering är organismernas förmåga att försämra föroreningar. Här beskriver vi metoder för att isolera och testa mikrober presentera bioremediering förmåga och potentiella probiotiska egenskaper för koraller.

Abstract

Föroreningar påverkar alla biomer. Marina miljöer har särskilt påverkats, särskilt korallrev, ett av de känsligaste ekosystemen på jorden. Globalt, 4 500 000 000 människor är ekonomiskt beroende av havet, där de flesta av deras försörjning tillhandahålls av korallrev. Koraller är av stor betydelse och därför deras utrotning leder till katastrofala följder. Det finns flera möjliga lösningar för att avhjälpa Marina föroreningar och lokal förorening, inklusive biologisk sanering. Bioremediering är organismernas förmåga att försämra föroreningar. Metoden innebär flera fördelar, såsom hållbarhet, relativt låg kostnad, och det faktum att den kan tillämpas i olika ekosystem, vilket ger minimal påverkan på miljön. Som en extra fördel, manipulation av endogena mikrobiomer, inklusive förmodade nyttiga mikroorganismer för koraller (pbmcs), kan ha probiotiska effekter för marina djur. I detta sammanhang kan användningen av de två metoderna, bioremediering och pBMC-ympning kombineras, vara lovande. Denna strategi skulle främja nedbrytning av specifika föroreningar som kan vara skadliga för koraller och andra metaorganismer och samtidigt öka värd motståndet och motståndskraften för att hantera föroreningar och andra hot. Denna metod fokuserar på valet av pBMCs att försämra två föroreningar: den syntetiska östrogen 17a-etinylestradiol (EE2) och råolja. Båda har rapporterats negativt påverka marina djur, inklusive koraller, och människor. Protokollet beskriver hur man isolerar och testar bakterier som kan försämra de specifika föroreningarna, följt av en beskrivning av hur man upptäcker några förmodade fördelaktiga egenskaper hos dessa associerade mikrober till deras korall värd. De metoder som beskrivs här är relativt billiga, lätt att utföra, och mycket anpassningsbar. Nästan alla typer av lösliga mål förening kan användas i stället för EE2 och olja.

Introduction

Förorening är en viktig fråga som berör människors, djurs och växters hälsa i världen. Även om föroreningar kan vara naturliga, såsom vulkaniska aska1, är mänsklig verksamhet den främsta orsaken till de flesta föroreningar. Antropogena verksamhet förorenar jord, vatten och luft, som direkt eller indirekt leder till nästan 20 000 000 förtida dödsfall i människor2 och decimera miljarder andra former av liv årligen. Föroreningar är närvarande även i de mest avlägsna områden av planeten. Till exempel har tungmetaller och långlivade organiska föreningar upptäckts i djup havslevande ryggradslösa djur och Polar däggdjur, respektive3,4.

Marina miljöer har särskilt påverkats av föroreningar. Under en lång tid, det antogs att havet skulle förbli opåverkade och leverera en oändlig källa av varor på grund av dess massiva volym av vatten5. Av denna anledning, alla typer av industri och institutioner fritt släppt avfall i vattenförekomster i århundraden6,7. Flera föroreningar av alla slag, såsom plast8, syntetiska hormoner9, bekämpningsmedel10, olja11, näringsämnen12, tungmetaller3, och radioaktivt avfall13 har rapporterats som påverkar havsekosystem. I detta sammanhang är korallrev bland de viktigaste och mest känsliga ekosystemen i marina miljöer14. Rev är kust beskyddare, avgörande för utvecklingen av tusentals marina arter genom att spela viktiga roller i näringsämnen cykling och klimatkontroll. Reven bidrar också till ekonomin genom att erbjuda fisk, varor och turism, bland annat15. Till exempel, 4 500 000 000 människor är beroende av havsfisk som sin huvudsakliga födokälla16, som i hög grad stöds av korallrev.

Oavsett deras ekologiska, sociala och ekonomiska betydelse, är korallrev som decimerats17,18. Antropogena verksamhet är främst ansvarig för att bidra till de tre främsta orsakerna till koraller död: klimatförändringar, överfiske och vattenförorening19. Även om det är viktigt att arbeta med att mildra den globala uppvärmningen, är det också viktigt att arbeta på att minimera lokala föroreningar, inklusive vattenföroreningar, som kan kritiskt bidra till korall nedgång20. Därför finns det ett brådskande behov av att utveckla strategier för att öka korallernas livstid, vilket skulle kunna ge dem extra tid att anpassa sig och överleva.

I detta avseende är det oerhört viktigt att hitta lösningar för att minimera kontaminering och utveckla strategier för att öka konditionen av koraller. Strategier för att avhjälpa Marina föroreningar är mycket varierande och kan grupperas i fysikaliska, kemiska och biologiska metoder. Fysiska metoder är till hjälp. De är dock inte alltid effektiva. Till exempel kan plastavfall minimeras genom fysisk borttagning, medan vattenlösliga föreningar behöver andra metoder för att elimineras. Exempel på sådana föreningar är råolja, frigörs genom oljeindustrin verksamhet och spill, liksom andra mikroföroreningar, såsom syntetiska hormoner, som normalt används som östrogena komponenten i orala preventivmedel och finns i avloppsvatten21, 22. användningen av kemiska ämnen för att minska kontaminering kan lösa ett specifikt problem, men det kan också utgöra en extra föroreningskälla. Detta är fallet med kemiska dispergeringsmedel för att mildra oljeförorening, som har beskrivits som ännu mer giftigt för marina ekosystem än oljeföroreningen själv23. Av dessa skäl, biologiska metoder uppvisar flera fördelar jämfört med de andra metoderna. Biologisk sanering är förmågan hos levande organismer, eller deras metaboliska produkter, att omvandla föroreningar till mindre giftiga eller giftfria former24. De främsta fördelarna med att använda biologiska metoder är hållbarhet, relativ låg kostnad, det faktum att de är ekologiskt vänliga, och att de kan tillämpas i olika ekosystem, vilket orsakar minimal eller mindre påverkan på miljön21, 25,26,27.

Dessutom tillåter manipulering av den mikrobiella gemenskapen som finns i en miljö en extra potentiell fördel. Det finns mikrobiomer som är associerade med värdar och är viktiga för deras hälsa. Det är välkänt att dessa tillhörande symbiotiska mikrobiomer är nödvändiga för att bibehålla värd homeostas19. Manipuleringen av dessa associerade mikroorganismer har väl utforskats för värdar som växter och däggdjur28,29, men användningen av korall probiotika är fortfarande ny15. Koraller också värd, interagera med, och beror på stora och specifika populationer av mikroorganismer att överleva19. Den roll som dessa mikrobiella samhällen i hälsa och dysbios av koraller är under aktiv studie, men det är fortfarande långt ifrån helt förstått30. En av de mest populära hypoteser kallas Coral probiotiska hypotesen. Det antyder att det finns en dynamisk relation mellan symbiotiska mikroorganismer och miljöförhållanden som leder till valet av de mest fördelaktiga korallmetaorganismerna31. Baserat på denna information, viktiga potentiella probiotiska mekanismer, samt strategier för isolering, manipulation, och leverans av nyttiga mikroorganismer för koraller (BMC) för flera ändamål, föreslogs32 och testade33. Dessa potentiella nyttiga egenskaper inkluderar resistens mot temperaturökning, skydd mot reaktiva syreradikaler (ROS), kvävefixering, resistens mot föroreningar, och biologisk kontroll av patogener, bland annat32.

Denna studie fokuserar på valet av BMC och fritt levande mikroorganismer som presenterar möjligheten att försämra två föroreningar som vanligtvis finns i marina miljöer: den syntetiska östrogen 17a-etinylestradiol (EE2) och råolja. Förorenande ämnen som innehåller hormon aktiva substanser finns ofta i vattenförekomster34,35,36,37,38,39,40, 41,42. Bland dem, syntetiska östrogena endokrina-disruptor föreningar (EDCs) efterlikna effekten av östrogener på målceller, orsakar flera effekter på djur, inklusive bröstcancer, infertilitet, och hermafroditism9. EE2 utsöndras av människor på grund av användningen av p-piller. Det tas inte bort från avloppsvatten av traditionella reningsverk och har negativa effekter även vid mycket låga koncentrationer (t. ex. ng/l eller μg/l)43,44,45. Lite är känt om effekterna av östrogener på korallfysiologi46,47. Emellertid, på andra Marina ryggradslösa djur, såsom svampar, kräftdjur och blötdjur, östrogener rapporterades orsaka flera negativa effekter främst relaterade till reproduktion, såsom utveckling och/eller stimulering av könsceller, förändring i enzymatisk och protein åtgärder, problem i embryonala processer, och andra48,49,50,51,52. De negativa konsekvenser som orsakas av EE2 förorening belysa nödvändigheten att utveckla hållbara metoder för att avlägsna denna förening från miljön utan att påverka det marina livet.

Parallellt med olja som för närvarande står för nästan 40% av världens förbrukade energikällor53, kronisk förorening och oljeutsläpp förekommer ofta nära revområden11. Oljeförorening rapporterades orsaka negativa effekter i flera arter av marina djur, fåglar, växter, och människor54,55,56,57. På koraller, det orsakar blekning, minskar motståndet av larver till termisk stress58, stör de mikrobiella associerade samhällen21, och orsakar vävnadsnekros. Dessutom kemiska dispergeringsmedel, en olja sanering teknik som vanligen används av oljebolag för att avhjälpa spill, är ännu mer giftiga för koraller än oljan själv23. Nyttiga mikroorganismer isolerade från koraller, däremot, är kända för att spela avgörande roller på värdens hälsa. Emellertid, manipulation av dessa potentiella probiotika måste utforskas bättre för att undersöka eventuella negativa biverkningar och den metaboliska kapacitet som kan undersökas för att förbättra konditionen av metaorganismen. I detta sammanhang, egenskaper såsom antimikrobiell aktivitet mot korallpatogener, produktion av katalas att bekämpa oxidativ stress, förmågan att försämra urea (som kan ha viktiga roller i förkalkning), och närvaron av gener som ger potentiella fördelaktiga egenskaper, bland annat, måste vara i fokus för utredning. Här visar vi hur bioremediering och probiotika kan användas för att samtidigt mildra effekterna av föroreningar och förbättra korallhälsan. Utvecklingen av innovativa metoder som kan användas som interventioner för att öka den marina arternas beständighet utgör ett steg mot en mer hållbar och hälsosammare planet.

Protocol

1. uppsamling och lagring av vatten och korall för mikrobiell isolering

Anmärkning: det är viktigt att ta koordinaterna och temperaturen på provtagningsplatserna. Om möjligt kan metadata som salthalt, pH, djup och ljusintensitet också bidra till att hitta finjusterade odlingsmetoder och framtida tolkning av data. För tillförlitliga resultat, hålla proverna lagras för minsta möjliga tid. Vatten/korallmikrobiomerna kan förändras avsevärt om proverna inte hålls vid rätt temperatur och/eller lagras under långa perioder. Om isolerings steget inte utförs omedelbart efter insamlingen, är det viktigt att hålla proverna vid 4 ° c tills bearbetningen. Ju längre proverna lagras, även vid 4 ° c, desto mer kommer den mikrobiella gemenskapen att förändras.

  1. Provtagning och lagring av havsvatten.
    1. Samla in 500 mL vattenprov i minst tre exemplar från varje riktad provtagningsplats. Använd gärna sterila flaskor med skruvlock.
    2. Om du bearbetar vattnet direkt efter insamling, förvara flaskorna på RT för ett kort intervall. Om prov bearbetningen sker senare, förvara flaskorna vid 4 ° c.
  2. Prova och förvara koraller.
    1. Använd ett sterilt par tång för att skära korall fragment från samma provtagningsplats av vattenproverna. För att undvika kontaminering, rör koraller endast med sterila handskar.
    2. Skölj provet korall fragment med 20 mL steril saltlösning (3% NaCl i destillerat vatten) eller artificiell havsvatten för att bli av med löst bifogade fritt levande bakterier i havsvattnet.
    3. Med hjälp av pinps, placera varje korall fragment i en steril 250 − 500 mL behållare med ett skruvlock som innehåller steril saltlösning.
    4. I laboratoriet, med hjälp av sterila pinpett och tång, väg 5 g korall fragment med hjälp av sterila 100 mm x 20 mm petriskålar på en våg.
    5. Överför 5 g korall prov till en steril murbruk och lös upp det med hjälp av en steril mortelstöt.
    6. Överför det urlakade provet med en steril spatel till en steril odlings kolv som innehåller 45 mL 3% NaCl-steril lösning och 10 − 15 glaspärlor på 5 mm. Använd några av de 45 mL steril saltlösning för att tvätta murbruket och återvinna den maximala mängden av den macerate.
    7. Förvara flaskerna under konstant omrörning (150 x g) i 16 timmar vid provtagnings platsens vattentemperatur.
      Anmärkning: för grunt vatten koraller den optimala temperaturen kommer att variera från 24 − 28 ° c. Detta steg kommer att lossa mikroorganismer från olika korall fack, såsom de som är knutna till värdceller, eller de som lever inne i vävnaden och skelettet. Efter detta steg, koraller macerates bör inte lagras, och isolerings steget måste omedelbart utföras.

2. isolering av EE2-nedbrytande bakterier från havsvatten och/eller koraller

  1. Välj bakterier.
    Anmärkning: efter steg 1.1.2 och 1.2.7 kommer koncentrationen av mikroorganismer i havsvatten som har lossnat från de olika korallmakeraterna att vara okänd och varierande. För att garantera isolering av enskilda mikrobiella kolonier i petriskålar som innehåller agarmedia behövs seriella utspädningar.
    1. Utför seriella utspädningar upp till 10-9 i steril saltlösning för korall-prover och upp till 10-6 för vattenprover. Pipettera spädningar upp och ner 5x innan du kastar spetsen. Vortex prover för 5 s varje gång innan du utför nästa serie utspädning.
    2. Pipettera över 100 μL av varje spädning på petriskålar som innehåller 3% NaCl lysogeny buljong (LB) agar medium, och platta dem.
      Obs: Använd Marine agar (MA) som ett alternativt medium. Tre exemplar av varje utspädning krävs för tillförlitliga resultat.
    3. Inkubera plattorna i 1 − 3 dagar vid måltemperaturen (t. ex. 26 ° c). Kontrollera plattorna en gång om dagen.
    4. Välj och isolera kolonierna som uppvisar distinkta tillväxt morfologier på nya plattor med hjälp av Streak plattan teknik. Upprepa detta steg så många gånger som behövs för att få rena kolonier som växer på plattorna.
    5. Om ingreppet inte omedelbart fortsätter till steg 2.3.1, förvara isolat vid 4 ° c eller i glycerol enligt beskrivningen i avsnitt 2,2.
  2. Förbered glycerol lager.
    Obs: detta steg är frivilligt och kan användas för långsiktig bakterie bestånd lagring.
    1. Välj enstaka kolonier från den färska plattan eller från plattorna som förvaras vid 4 ° c och Inokulera dem självständigt i 2 mL sterilt LB-medium.
    2. Placera rören under konstant omrörning (150 x g) vid 24 − 28 ° c över natten (på).
    3. Tillsätt 1 mL av bakterie kulturerna från steg 2.2.2 och steril glycerol till en slutlig koncentration på 20% till 2 mL cryovials.
    4. Lämna kryovialerna på vid 4 ° c.
    5. Placera glycerolbakterielagren vid-80 ° c tills det behövs.
  3. Utför testet EE2-nedbrytbarhet.
    1. Aktivera isolat i LB buljong eller alternativ media. För detta, plocka en enda koloni från de färska plattorna eller plattan lagras vid 4 ° c, och Inokulera 2 mL sterilt LB medium. Om det är en glycerol lager, först strimma den på LB agar plattor och inkubera vid 24 − 28 ° c på att ha enstaka kolonier växer. Placera röret som innehåller LB medium lutande under konstant agitation (150 x g) vid 24 − 28 ° c på.
    2. Efter bakterietillväxt, pellet cellerna genom centrifugering dem vid 8 000 x g för 8 min vid rumstemperatur (RT). Kassera supernatanten och Pipettera försiktigt upp och ner, Omsuspendera cellerna i en lika stor volym (2 mL) saltvatten för att tvätta resterande LB-buljong.
    3. Upprepa steg 2.3.2 två gånger för att garantera att det inte finns några spår av kol källa, omåterupprepa cellerna i en lika mängd saltlösning. Till exempel, om det startades med en 2 mL kultur, Omsuspendera cellerna i en slutlig volym av 2 mL saltlösning.
    4. Inokulera de tvättade och återsuspenderade cellerna i minsta Bushnell Haas odlingsmedium (BH-buljong) som innehåller EE2 som den enda kol källan59.
      Anmärkning: EE2 löses i etanol vid en slutkoncentration på 5 mg/L i odlingsmediet. Gör ändringar av föroreningens typ och/eller koncentration vid behov.
    5. Bedöm bakterietillväxt med optisk densitet vid 600 Nm och/eller kolonier bildar enheter (CFU) på LB agar medium33, för 16 − 72 h av inkubering.
      Notera: Alternativt kan mikroorganismerna isoleras direkt på minimimedia som innehåller EE2, eller andra föreningar, som den enda kol källan. Detta steg skulle leda urvalet och undvika oönskad tillväxt.

3. isolering av oljenedbrytande bakterier från havsvatten och/eller koraller

  1. Förbered minimimedia som innehåller en oljevattenlöslig fraktion (oWSF) och olja vatten-olöslig fraktion (oWIF) som enda kol källa21.
    1. Tillsätt 1 − 2% råolja till 500 mL sterilt destillerat vatten. Använd en filterkolv öppnad på botten för att ta den lösliga fraktionen ut utan att störa det övre skiktet av den olösliga fraktionen.
    2. Håll blandningen under ständig agitation vid 24 − 28 ° c vid 150 x g för 48 h.
    3. Placera filterkolven som innehåller råolje fraktionerna på en stabil yta och vänta i 10 − 20 minuter så att löslighet och olöslig fraktion skiljs åt.
    4. Överför oWSF till en ny steril kolv, spara oWIF genom att öppna botten filterkolven och ta ut den lösliga fraktionen.
    5. Använda alla oWSF återvinns i föregående steg (~ 400 mL), förbereda 1 L BH agar minimum medium som innehåller oWSF som enda kol källa.
    6. Använd oWIF kvar i kolven från steg 3.1.4, Förbered 1 L BH agar minimum medium innehållande oWIF som enda kol källa.
  2. Isolera oWSF-och oWIF-nedbrytande bakterier.
    1. Med hjälp av vatten och korall-Lös upp från steg 1.1.2 respektive 1.2.7 späds proverna upp till 10-6 i steril saltlösning enligt beskrivningen i steg 2.1.1.
    2. Pipettera 100 μL av varje spädning på petriskålar som innehåller BH-oWSF och BH-oWIF agar media och platta dem.
    3. Upprepa procedurerna som beskrivs i steg 2.1.3 till steg 2.1.5.

4. urval av konsortiemedlemmar

  1. Extrahera och sekvensera DNA för taxonomisk identifiering.
    1. Aktivera isolat som lagras i glycerol enligt beskrivningen i steg 2.3.1.
    2. Extrahera DNA med hjälp av en DNA-extraktion Kit (se tabell över material).
    3. Använd primers 27f (5 ′-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3 ′) och 1492r (5 ′-GTT TAC CTT GTT ACG ACT T-3 ′) för amplifiering av 16S rRNA genen.
    4. Utför 50 μL PCR-reaktioner enligt följande protokoll: 5 μL 10X polymeras-buffert, 2 mM MgCl2, 0,2 mm dNTPs, 5 mm av varje primer, 10 ng av genomiskt dna och 2,5 U av Taq DNA-polymeras. Lägg till negativa kontroller (dvs. tomma DNA-extraktioner och PCR-reaktioner utan mallDNA) för att säkerställa att det inte finns någon förorening.
    5. Ställ in följande termiska cykel steg: en första denatureringscykel vid 94 ° c i 4 min; 35 cykler vid 94 ° c i 1 min, följt av 50 ° c i 1 min, och 72 ° c för 2,5 min; en slutlig förlängnings cykel i 10 min vid 72 ° c.
    6. Kontrollera amplikon integritet i 1,2% aguppstod gel med 80 V.
    7. Gel renar proverna med hjälp av en gel renings sats (se tabell över material).
    8. Kvantifiera PCR-produkter med hjälp av en fluorometer.
    9. Skicka produkt för sekvensering.
      Anmärkning: för bättre taxonomiska klassificeringar rekommenderas Sanger-metoden60, eftersom det ger långa sekvenser. Universal primers 27f och 1492r kan användas för att förstärka nästan hela längden av 16S rRNA Gene61. Om contigs inte kan monteras med ett par primers, bör ett extra par i mitten av sekvensen övervägas.
  2. Bestämma tillväxtkurvan.
    1. Aktivera isolat i glycerol lager från steg 2.2.5 som beskrivs i steg 2.3.1 men med 5 mL i stället för 2 mL.
    2. Tillsätt 1% (v/v) av den odlade 5 mL-kulturen från steg 4.2.1 i tre exemplar till en 250 mL kolv med 100 mL 3% LB-media. Se till att förbereda tripletter av en negativ kontroll (ingen inoculum) också.
    3. Placera kolvar i en inkubator under konstant omrörning (150 x g) vid 24 − 28 ° c.
    4. Ta 1 mL alikvoter var 4 h för 48 h. Om stammarna uppvisar en hög tillväxttakt, minska 4 h intervall.
    5. Mät den optiska densitetens (OD) uppskattning vid 600 Nm våglängd och kolonibildande enheter (CFU) räknat från seriella utspädningar pläterade på Rich Media Plates (100 μL bör vaccineras i varje tallrik och normaliseras till volymen av 1 mL).
    6. Rita OD och CFU kurvor och analysera sambandet mellan OD/CFU av varje enskild stam. Från och med nu beräknar du antalet celler baserat på OD-värdena.
  3. Utföra antagonism test.
    1. Aktivera isolat enligt beskrivningen i steg 2.3.1.
    2. Inokulera en stam i taget längs mitten av plattorna som innehåller agarmedia och de andra som är vinkelräta mot den centrala. Upprepa tills varje utvald mikrobiell stam testas mot alla andra.
    3. Inkubera plattorna vid 24 − 28 ° c och övervaka dem dagligen för att observera potentiella glorior som indikerar antagonistisk aktivitet. Om glorior observeras indikerar antagonistisk aktivitet mellan två stammar, bör en av dem uteslutas.
  4. Utför konsortiesammansättningen.
    1. Aktivera isolat enligt beskrivningen i steg 2.3.1.
    2. Pellets cellerna vid 3 500 x g och försiktigt tvätta dem 2x i en lika volym av saltlösning. Omsuspendera cellerna i en lika volym (dvs. om den slutliga volymen var 2 mL celler, tvätta dem med 2 mL saltlösning och Omsuspendera dem i en slutlig volym av 2 mL).
    3. Inokulera 1 mL kultur i 100 mL 3% NaCl LB medium och inkubera på vid 150 x g.
    4. Upprepa steg 4.5.2, Inokulera de 100 mL odlade, tvättade och återsuspenderade kulturerna i 10 L kulturer. Inkubera i sterila luft-Lift bioreaktorer, ta emot filtrerad luft från en pump. Om mer kultur behövs, Inokulera alltid 1% av den odlade kulturen i färska medier.
    5. Centrifugera odlade kulturer vid 8 000 x g för 8 min vid 4 ° c. Kassera supernatanten efter centrifugering.
    6. Tvätta pelleten, försiktigt omåterupplägga cellerna i 500 mL steril saltlösning.
    7. Upprepa steg 4.5.5 och 4.5.6.
    8. Omsuspendera varje enskild kultur i 100 mL saltlösning och mät OD för att uppskatta antalet celler.
    9. Beräkna volymen av varje kultur som behövs för att nå en slutlig koncentration av 107 celler ml-1.
    10. Utföra CFU räknas på Rich media för en slutlig bekräftelse av cellernas lönsamhet och koncentration.
    11. Blanda en lika volym av varje enskild kultur i sterila flaskor och alikvot konsortiet i 50 mL sterila rör.
    12. Håll vid 4 ° c till inympning.
      Anmärkning: Förbered konsortieförsamlingen så färskt som möjligt för att garantera att cellerna fortfarande är livskraftiga. Alternativt kan CFU-antal utföras före inympning. För att sätta ihop ett ideal konsortium är det nödvändigt att använda isolat som presenterar olika och kompletterande metaboliska kapaciteter. Vanligtvis används 6 − 10 isolat för att bilda konglomerat, men detta antal kommer att variera beroende på medlemmarnas egenskaper och syften.

5. detektion av förruttande fördelaktiga egenskaper för koraller

  1. Aktivera isolat från glycerollagren genom att strimmor dem på lb-agar plattor och inkuberar dem vid 24 − 28 ° c på att ha enstaka kolonier växer. Välj en enda koloni från plattorna och Inokulera den i 2 mL sterilt LB-medium. Placera röret som innehåller LB medium lutande under konstant agitation (150 x g) vid 24 − 28 ° c på.
  2. Utför DNA-extraktion enligt beskrivningen i avsnitt 4,1 för detektion av potentiellt nyttiga gener med PCR.
    Anmärkning: PCR-reaktionsförhållanden och primers kommer att bero på den riktade genen. Metoder för att testa BMC-egenskaperna hos enskilda stammar och PCR-detektion för potentiellt nyttiga gener beskrivs i tabell 1.

Representative Results

Baserat på de metoder som beskrivs här, var det möjligt att isolera mikroorganismer från olika vattenkällor och korall nubbiner presentera förmodade BMC egenskaper och kan försämra olika klasser av föroreningar (figur 1). Använda vattenprover som samlats in vid ett reningsverk, som erhållits från CESA-UFRJ (experimental Center of Environmental sanitet vid Federal University of Rio de Janeiro), och baserat på det förfarande som presenteras här, 33 bakteriestammar kan försämra EE2 vid en slutlig koncentration på 5mg/L isolerades (figur 2A). Dessutom, med hjälp av tekniken för att välja olje nedbrytande bakterier, 20 stammar kunna försämra både owsf (figur 2B) och owif (figur 2C) isolerades.

För mikroorganismer som isolerats från olika korallarter under olika förhållanden. Bland dem, en stam som presenterar stark antagonistisk aktivitet mot korallpatogen Vibrio coralliilyticus (figur 3a), stammar som kan försämra urea (figur 3B), en bra katalas producent (figur 3 C), och mikroorganismer som uppvisar potentiellt nyttiga gener (figur 3D) hittades.

Genom att använda de båda metoderna kombinerade (dvs. bioremediering och BMC-inympning) var det möjligt att skydda koraller från olje exponeringseffekter. För detta, en olja bioremediator pBMC Consortium, isolerade från Korallmussismilia harttii, inokulerades på korall nubbiner utsätts för 1% olja i tre exemplar21. De behandlingar som utsätts för olja presenterade en progressiv minskning av FV/FM från och med fjärde dagen och nådde värden nära noll med den tionde dagen. Variabel fluorescens/maximal fluorescens (FV/FM) som ett mått på maximal system II (psii) fotokemisk effektivitet zooxanthellae, vilket motsvarar en indirekt mätning av korall hälsa. Å andra sidan visade korall nubbiner i akvarierna inokulerade med konsortiet en bättre bevarad fotokemisk förmåga (figur 4).

Figure 1
Figur 1: Sammanfattning av de viktigaste stegen i en bioremediator-pBMC Consortium urval och montering. System för förorening-nedbrytande mikroorganismer urvals steg (i grått) och avslutande steg som används för det mikrobiella urvalet av konsortiet (DNA-sekvensering, tillväxtkurva, antagonism test och konsortiesammansättning i rött). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: urval av bakterier som försämrar föroreningen. Abakterie isolat som växer på minsta tillåtna material plattor som innehåller EE2 som enda kol källa. Bbakteriekolonier som växer på minimiskivor av media som innehåller owsf som enda kol källa. Cbakteriekolonier som växer på minimiskivor av media som innehåller oWIF som enda kol källa. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Påvisande av pBMC-egenskaper. (A) fläckar i tripletter av stam som presenterar antagonistisk aktivitet mot korallpatogen Vibrio coralliilyticus (i svart) och en kontroll stam (i grönt). B) stammar som växer på medier som innehåller karbamid som enda kolkälla. C) stam som producerar katalas (+) och en dålig katalas-producentstam (-). (D) exempel på PCR-detektion av Nirk-genen (Lane 1 = 1kb Ladder; Lane 2 = tom DNA-extraktion negativ kontroll; Lane 3 = Nirk Detection; Lane 4 = PCR-reaktioner utan mallDNA). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: FV/FM mätningar av M. harttii nubbins Dark-anpassad på 5 PM, med hjälp av en dykning-pam klorofyll fluorometer. FV/FM mätningar av behandlingarna kontroll Consortium, olja och olja med konsortium utfördes i tre exemplar varje dag i 10 dagar. Standard avvikelsen visas. Dragen av grafen ändrades med tillstånd från tidigare resultat21, finns på https://www.Nature.com/articles/srep18268 under en Creative Commons Attribution 4,0. Fullständiga villkor på http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Moa Mikroorganism Detektionsteknik Referenser
Klimatreglering. surfur Cykling; antimikrobiella föreningar; öka antioxidant skydd av celler. Aspergillus sydowii PCR för dddP-gen 81
Pseudovibrio SP. p12 Odlingssubstrat med DMSP 82
Pseudoalteromonas SP. PCR för dmdA-genen 33
Biologisk reglering av patogener. Microbiome från Acropora Auktor slem Klar zon för hämning 83
Extrakt från koraller Tillväxthämmande analys 84
Marinobacter SP. Swarming analyser 85
Pseudoalteromonas SP. Agarplate Cross-Streaking 86
Pseudoalteromonas SP. Agar-diffusions metod 33
Fördel för förkalknings processen; källa till kväve för scleractinian koraller. Symbiodinium spp. Kolorimetrisk metod 87
Microbiome från Stylophora pistillata slem ___ 88
Microbiome från Acropora alciminata Metod av Bolland et al. 80 89
Kväve cykeln; öka kvävefixering. Mikrobiell gemenskap qPCR 90
Mikrobiell gemenskap Pcr 91
Mikrobiell gemenskap qPCR 92
Mikrobiell gemenskap Anpassad acetylen (C2H2) reduktions teknik 93
Pseudoalteromonas SP. och Halomonas taeanensis Pcr 33
Kväve cykeln; minskning av ammoniumkoncentrationen. Pseudoalteromonas SP. Pcr 33
Microbiome från Tubastraea coccinea Pcr 94
Microbiome från Xestospongia Testudinaria Prediktiv Metagenomanalys-analys 95
Holobiont skydd mot reaktiva syreradikaler (ROS). Pseudoalteromonas SP., Cobetia Marina och Halomonas taeanensis Katalas test 33
Symbiodinium spp. Amplex röd 96
Vibrio Pelagius och Sync-chococcus SP. Pepparrots peroxidas-scopoletin metod 97
Vibrio fischeri Flera metoder 98

Tabell 1: detektion av förruttande BMC-egenskaper, verkningsmekanism (MOA), rapporterade mikroorganismer som presenterar potentialen och tekniken som används för att detektera den karakteristiska.

Discussion

Bioremediering metoder har kraftigt utforskats under de senaste 50 åren. Till exempel, över 200 mikrober bland bakterier, cyanobakterier, mikroalger, och svampar i flera olika livsmiljöer, har utsetts som kan indikera förekomst och/eller försämra olja kolväten62,63,64 . Dessutom är andra klasser av föreningar som orsakar påverkan på miljön och för människor, såsom plast, bisfenol A, hormonstörande ämnen, och tungmetaller, mål för bioremediering teknikutveckling65,66, 67. Å andra sidan, Marine probiotiska utveckling har begränsats till de områden som har en uppenbar inverkan på ekonomin, såsom fisk probiotika i vattenbruk68,69. Men isolering och karakterisering av nyttiga mikroorganismer för att skydda korallrev, marina ekosystem som stöder fiske, turism och andra lönsamma aktiviteter, börjar värderas15. Här, ett billigt, enkelt och lättillgängligt protokoll för att välja förorening-nedbrytande mikroorganismer som också kan presentera potentiellt gynnsamma egenskaper för lokala marina ekosystem, särskilt förmodade nyttiga mikroorganismer till koraller (pbmcs), är Beskrivs.

Dessutom, den metod som visas här är mycket anpassningsbar till flera föreningar och olika typer av mikrobiella källor. Det är möjligt att inrikta sig på olika föroreningar genom att ersätta den enda kol källan som tillförs minimimediet. För detta, i stället för olja eller EE2, andra föreningar bör läggas till den önskade koncentrationen. Detta skulle vara det selektiva trycket att isolera nedbrytare för de riktade föroreningarna. Till exempel har mikroorganismer som kan försämra andra klasser av hormonstörande ämnen redan valts ut och testats med samma metod70. Dessutom kan andra Marina och landlevande organismer, såsom svampar och växter71,72, samt olika typer av miljöprover, såsom jord, bränsle och bergarter användas som de förnedrande-mikrobiella källorna25, 73,74. Till exempel var det möjligt att upptäcka och isolera kolvätenedbrytande bakterier från olika jord-och sedimentprover25,54,63,64,75. Slutligen, utföra smärre ändringar i media, andra mikroorganismer än bakterier kan lätt väljas som förnedrande mikrober. Till exempel, en mikroalger stam med förmågan att effektivt försämra östrogen föreningar har rapporterats76.

Helst måste bioremediering-probiotiska konvaler monteras för varje specifik förening eller område. Mikrober som växer i en viss miljö kan inte växa lika bra på nya platser jämfört med deras inhemska förhållanden. Eftersom forskarna inte har funnit en produkt som effektivt kan appliceras under alla olika miljöförhållanden, bör nya konkatör utföras för varje specifik situation. Detta skulle vara besläktad med personlig medicin för miljöanpassad återhämtning. Av denna anledning är skapandet av en centralbank av mikrobiella stammar med potentiella probiotiska egenskaper och nedbrytning kapacitet ett viktigt steg för utvecklingen av detta område. Detta initiativ skulle spara tid och arbete och bidra till att församlingen för nya specifika konvaler över hela världen.

Mikroorganismer i samband med koraller (dvs., mikroalger, bakterier, Archaea, svampar, och virus) har en komplex och intrikata roll i att upprätthålla värd homeostas19. Miljömässiga stressfaktorer, såsom föroreningar, kan också destabilisera korallmikrobiomen, vilket resulterar i dysbios, som kan orsaka sjukdom och dödlighet30. De mekanismer genom vilka koraller mikrobiomet kan stödja korall hälsa börjar avslöjas. Dessa mekanismer är nyckeln till att förstå korall motstånd och motståndskraft mot miljömässiga stressfaktorer och, följaktligen, för att främja revet uthållighet och bevarande. Dessutom, resultat på området kommer att bidra till att förstå allmän värd-microbiome interaktioner, som kan bidra till utvecklingen av bättre probiotika och hälsofrämjande strategier inom andra områden. Det är också viktigt att bättre undersöka hur dessa probiotika vaccinationer kan störa metaorganismernas hälsa under stresshändelser. Till exempel, arbete som visar att förstoring i korall prestanda beror på probiotika och inte bara koraller med hjälp av bakterier som en näringskälla behövs fortfarande.

Parallellt med detta är utvecklingen av nya konvalörer och förbättringen av de befintliga konsortietörerna av stor betydelse. Alternativa metoder för konsortieimmobilisering samt innovativa metoder, som att vaccinera korallföda (dvs. Artemia och rotifers) och använda dem som vektorer, är lovande. Dessa leveranssystem kan också ändras för att rikta andra marina organismer och kommer att vara avgörande för framgången för den marina probiotika fältet.

Förorening minskning och korallrev uthållighet är för närvarande två av de viktigaste ämnena lyfts fram i miljökonferenser regelbundet. Agenda 2030, ett dokument som publicerats av FN och som beskriver de globala målen samhället bör nå för att möjliggöra en hållbar framtid, ägnar specifika mål för varje fråga. Medan mål 6 belyser vikten av förbättrad vattenkvalitet genom att minska föroreningarna, förstärker mål 14 betydelsen av bevarande och hållbar användning av haven, haven och marina resurser77. I detta sammanhang, korallrev bevarande beror på förändringar som bör uppnås inom en snar framtid, inklusive förorening minskning. Detta är av stor betydelse, eftersom de flesta massiva korall förluster inträffade när andra faktorer lades till klimathändelser, såsom lokala Habitat förstörelse och förorening78,79. Detta papper visade att det är möjligt att kombinera bioremediering och pBMC-inympning för att försämra specifika föroreningar, samtidigt som det kan öka korallens motståndskraft och motståndskraft mot föroreningar och andra frågor. Optimering av existerande protokoll och/eller utveckling av innovativa metoder, kombinerade eller oberoende tillämpade, kommer att vara avgörande för att fastställa framtiden för de marina ekosystemen.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Denna forskning genomfördes i samarbete med det pågående R & D-projektet som registrerades som ANP 21005-4, "PROBIO-DEEP-undersökning av potentiella effekter orsakade av olje-och gasprospektering på djup havs marin holobionts och urval av potentiella bioindikatorer och bioremedieringsprocesser för dessa ekosystem "(UFRJ/Shell Brasil/ANP)-" PROBIO-DEEP-Levantamento de potenciais impactos causados Pela exploração de Óleo e Gás EM holobiontes Marinhos EM Mar Profundo e Seleção de potenciais bioindicadores e processos biorremediadores para Esses ecossistemas ", sponsrad av Shell Brasil under ANP R & D Levy som" Compromisso de Investimentos com pesquisa e Desenvolvimento. Författarna tackar också Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) och Coordenação de Aperfeiçoamento de pessoal de Nível Superior (CAPES) för ekonomiskt stöd, och Camila Messias, Phillipe Rosado, och Henrique Fragoso dos Santos, för de bilder som tillhandahålls.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
500 mL PYREX Media Storage Bottle thomas scientific/Corning 1743E20/1395-500 Used to sample water.
500 mL Aspirator Bottles thomas scientific/Corning 1234B28/1220-2X Used to separate the oil fractions.
6-inch wire cutter plier thomas scientific/Restek 1173Y64/23033 Used to cut coral fragments.
17a-Ethinylestradiol LGC Standards DRE-C13245100 Used as the only carbon source to make the selective media.
Agar Himedia PCT0901-1KG Used to make solid media.
Bushnell Haas Broth Himedia M350-500G Used as minimum media to be supplemented with carbon sources.
Erlenmeyer Flask thomas scientific/DWK Life Sciences (Kimble) 4882H35/26500-125 Used to incubate coral macerate with glass beads.
GFX PCR DNA and Gel Band Purification kit GE Healthcare 28903470 Used to purify PCR products before sending them for sequencing.
Glass Beads MP Biomedicals 1177Q81/07DP1070 Used to detach the microorganisms from coral structures.
Laminar Flow Hood Needed to work at sterile conditions.
Luria Bertani Broth, Miller (Miller Luria Bertani Broth) Himedia M1245-1KG Used as rich media to grow bacteria.
Marine Agar 2216 (Zobell Marine Agar) Himedia M384-500G Used as rich media to grow bacteria.
Orbital-Shaker Incubator Used to incubate liquid media and oil.
Plates Incubator Used to incubate plates.
Porcelain Mortar and Pestle Thomas scientific/United Scientific Supplies 1201U69/JMD150 Used to macerate coral fragments.
Qubit 2.0 Fluorometer Invitrogen Used for nucleic acids quantification of DNA and PCR products.
Refrigerated Centrifuge Used to centrifuge bacterial cultures.
Spectrophotometer Used to measure optical density of bacterial cultures.
Wizard Genomic DNA Purification kit Promega A1120 Used for microbial strains DNA extraction.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Durand, M., Grattan, J. Effects of volcanic air pollution on health. Lancet. 357, 164 (2001).
  2. Ramaswami, A., Russell, A. G., Culligan, P. J., Sharma, K. R., Kumar, E. Meta-principles for developing smart, sustainable, and healthy cities. Science. 352, 940-943 (2016).
  3. Dökmeci, A. H., Yildiz, T., Ongen, A., Sivri, N. Heavy metal concentration in deepwater rose shrimp species (Parapenaeus longirostris, Lucas, 1846) collected from the Marmara Sea Coast in Tekirdağ. Environmental Monitoring and Assessment. 186, 2449-2454 (2014).
  4. Skaare, J. U., et al. Ecological risk assessment of persistent organic pollutants in the arctic. Toxicology. 181-182, 193-197 (2002).
  5. Garstang, W. The impoverishment of the sea. A critical summary of the experimental and statistical evidence bearing upon the alleged depletion of the trawling grounds. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 6, 1-69 (1900).
  6. Korajkic, A., Brownell, M. J., Harwood, V. J. Investigation of human sewage pollution and pathogen analysis at Florida Gulf coast beaches. Journal of Applied Microbiology. 110, 174-183 (2011).
  7. Liu, J., Yang, W. Water sustainability for China and beyond. Science. 337, 649-650 (2012).
  8. Eriksen, M., et al. Plastic pollution in the world’s oceans: more than 5 trillion plastic pieces weighing over 250,000 tons afloat at sea. PLoS One. 9, 111913 (2014).
  9. Vilela, C. L. S., Bassin, J. P., Peixoto, R. S. Water contamination by endocrine disruptors: Impacts, microbiological aspects and trends for environmental protection. Environmental Pollution. 235, 546-559 (2018).
  10. Ueno, D., et al. Global pollution monitoring of PCBs and organochlorine pesticides using skipjack tuna as a bioindicator. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 45, 378-389 (2003).
  11. Villela, H. D. M., Peixoto, R. S., Soriano, A. U., do Carmo, F. L. Microbial bioremediation of oil contaminated seawater: A survey of patent deposits and the characterization of the top genera applied. Science of the Total Environment. 666, 743-758 (2019).
  12. Rabalais, N. N., et al. Eutrophication-driven deoxygenation in the coastal ocean. Oceanography. 27, 172-183 (2014).
  13. Calmet, D. P. Ocean disposal of radioactive waste. Status report. IAEA Bulletin. 31, 47-50 (1989).
  14. Swart, P. K. Coral Reefs: Canaries of the Sea, Rainforests of the oceans. Nature Education Knowledge. 4, 5 (2013).
  15. National Academies of Sciences and Medicine, E. A Research Review of Interventions to Increase the Persistence and Resilience of Coral Reefs. , The National Academies Press. Washington, D.C. (2019).
  16. Béné, C., et al. Feeding 9 billion by 2050-Putting fish back on the menu. Food Security. 7, 261-274 (2015).
  17. Hughes, T. P., et al. Global warming and recurrent mass bleaching of corals. Nature. 543, 373 (2017).
  18. Hughes, T. P., et al. Spatial and temporal patterns of mass bleaching of corals in the Anthropocene. Science. 359, 80-83 (2018).
  19. Rosenberg, E., Koren, O., Reshef, L., Efrony, R., Zilber-Rosenberg, I. The role of microorganisms in coral health, disease and evolution. Nature Reviews Microbiology. 5, 355 (2007).
  20. Shaver, E. C., Burkepile, D. E., Silliman, B. R. Local management actions can increase coral resilience to thermally-induced bleaching. Nature Ecology & Evolution. 2, 1075-1079 (2018).
  21. Santos, H., et al. Impact of oil spills on coral reefs can be reduced by bioremediation using probiotic microbiota. Scientific Reports. 5, 18268 (2015).
  22. Whitman, W. B. Bacteria and the fate of estrogen in the environment. Cell Chemical Biology. 24, 652-653 (2017).
  23. DeLeo, D. M., Ruiz-Ramos, D. V., Baums, I. B., Cordes, E. E. Response of deep-water corals to oil and chemical dispersant exposure. Deep-Sea Research. Part II Topical Studies in oceanography. 129, 129-147 (2016).
  24. Zinicovscaia, I., Cepoi, L. Cyanobacteria for bioremediation of wastewaters. , Springer. Berlin, Germany. (2016).
  25. Cury, J. C., et al. Microbial diversity and hydrocarbon depletion in low and high diesel-polluted soil samples from Keller Peninsula, South Shetland Islands. Antarctic Science. 27, 263-273 (2015).
  26. Sinha, R. K., Valani, D., Sinha, S., Singh, S., Herat, S. Bioremediation of contaminated sites: a low-cost nature’s biotechnology for environmental clean up by versatile microbes, plants, earthworms. Solid Waste Management and Environmental Remediation. , 971-978 (2009).
  27. Maila, M. P., Cloete, T. E. Bioremediation of petroleum hydrocarbons through landfarming: Are simplicity and cost-effectiveness the only advantages. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 3, 349-360 (2004).
  28. Madsen, K., et al. Probiotic bacteria enhance murine and human intestinal epithelial barrier function. Gastroenterology. 121, 580-591 (2001).
  29. Saleem, M., Arshad, M., Hussain, S., Bhatti, A. S. Perspective of plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) containing ACC deaminase in stress agriculture. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 34, 635-648 (2007).
  30. Sweet, M. J., Bulling, M. T. On the importance of the microbiome and pathobiome in coral health and disease. Frontiers in Marine Science. 4, 9 (2017).
  31. Reshef, L., Koren, O., Loya, Y., Zilber-Rosenberg, I., Rosenberg, E. The coral probiotic hypothesis. Environmental Microbiology. 8, 2068-2073 (2006).
  32. Peixoto, R., Rosado, P. M., Leite, D. C. deA., Rosado, A. S., Bourne, D. G. Beneficial Microorganisms for Corals (BMC): Proposed Mechanisms for Coral Health and Resilience. Frontiers in Microbiology. 8, 341 (2017).
  33. Rosado, P., et al. Marine probiotics: increasing coral resistance to bleaching through microbiome manipulation. The The ISME Journal. 13, 921-936 (2019).
  34. Heberer, T., Reddersen, K., Mechlinski, A. From municipal sewage to drinking water: fate and removal of pharmaceutical residues in the aquatic environment in urban areas. Water Science and Technology. 46, 81-88 (2002).
  35. Barel-Cohen, K., et al. Monitoring of natural and synthetic hormones in a polluted river. Journal of Environmental Management. 78, 16-23 (2006).
  36. Balest, L., Mascolo, G., Di Iaconi, C., Lopez, A. Removal of endocrine disrupter compounds from municipal wastewater by an innovative biological technology. Water Science and Technology. 58, 953-956 (2008).
  37. Liu, Z., Kanjo, Y., Mizutani, S. A review of phytoestrogens: Their occurrence and fate in the environment. Water Research. 44, 567-577 (2010).
  38. Chapman, H. F., et al. A national approach to health risk assessment, risk communication and management of chemical hazards from recycled water. Waterlines. 48, (2011).
  39. Rocha, M. J., Cruzeiro, C., Ferreira, C., Rocha, E. occurrence of endocrine disruptor compounds in the estuary of the Iberian Douro River and nearby Porto Coast (NW Portugal). Toxicological and Environmental Chemistry. 94, 252-261 (2012).
  40. Nie, M., et al. Environmental estrogens in a drinking water reservoir area in Shanghai: occurrence, colloidal contribution and risk assessment. Science of the Total Environment. 487, 785-791 (2014).
  41. Ribeiro, C., Ribeiro, A. R., Tiritan, M. E. Priority substances and emerging organic pollutants in Portuguese aquatic environment: a review. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology. 238, 1-44 (2016).
  42. Wu, C., Huang, X., Lin, J., Liu, J. Occurrence and fate of selected endocrine-disrupting chemicals in water and sediment from an urban lake. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 68, 225-236 (2015).
  43. Shi, W., Wang, L., Rousseau, D. P. L., Lens, P. N. L. Removal of estrone, 17α-ethinylestradiol, and 17ß-estradiol in algae and duckweed-based wastewater treatment systems. Environmental Science and Pollution Research. 17, 824-833 (2010).
  44. Ternes, T., Bonerz, M., Schmidt, T. Determination of neutral pharmaceuticals in wastewater and rivers by liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 938, 175-185 (2001).
  45. Ternes, T. A., Andersen, H., Gilberg, D., Bonerz, M. Determination of estrogens in sludge and sediments by liquid extraction and GC/MS/MS. Analytical Chemistry. 74, 3498-3504 (2002).
  46. Tarrant, A. M., Atkinson, M. J., Atkinson, S. Effects of steroidal estrogens on coral growth and reproduction. Marine Ecology Progress Series. 269, 121-129 (2004).
  47. Atkinson, S., Atkinson, M. J., Tarrant, A. M. Estrogens from sewage in coastal marine environments. Environmental Health Perspectives. 111, 531-535 (2003).
  48. Schoenmakers, H. J. N., Van Bohemen, C. G., Dieleman, S. J. Effects of Oestradiol-17 β on the Ovaries of the Starfish Asterias rubens. Development Growth and Differentiation. 23, 125-135 (1981).
  49. Sarojini, R., Jayalakshmi, K., Sambashivarao, S. Effect of external steroids on ovarian development in freshwater prawn, Macrobrachium lamerrii. Journal of Advanced Zoology. 7, 50 (1986).
  50. Hathaway, R. R., Black, R. E. Interconversions of estrogens and related developmental effects in sand dollar eggs. General and Comparative Endocrinology. 12, 1-11 (1969).
  51. Ghosh, D., Ray, A. K. Subcellular action of estradiol-17β in a freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii. General and Comparative Endocrinology. 90, 274-281 (1993).
  52. Aris, A. Z., Shamsuddin, A. S., Praveena, S. M. occurrence of 17α-ethynylestradiol (EE2) in the environment and effect on exposed biota: a review. Environment International. 69, 104-119 (2014).
  53. International Energy Agency. Key World Energy Statistics (KWES). , (2018).
  54. Carmo, F. L., et al. Bacterial structure and characterization of plant growth promoting and oil degrading bacteria from the rhizospheres of mangrove plants. Journal of Microbiology. 49, 535-543 (2011).
  55. Piatt, J. F., Lensink, C. J., Butler, W., Kendziorek, M., Nysewander, D. R. Immediate impact of the'Exxon Valdez'oil spill on marine birds. The Auk. 107 (2), 387-397 (1990).
  56. White, H. K., et al. Impact of the Deepwater Horizon oil spill on a deep-water coral community in the Gulf of Mexico. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 20303-20308 (2012).
  57. Abdel-Shafy, H. I., Mansour, M. S. M. A review on polycyclic aromatic hydrocarbons: source, environmental impact, effect on human health and remediation. Egyptian Journal of Petroleum. 25, 107-123 (2016).
  58. Negri, A. P., Hoogenboom, M. O. Water contamination reduces the tolerance of coral larvae to thermal stress. PLoS One. 6, 19703 (2011).
  59. Brown, E. J., Resnick, S. M., Rebstock, C., Luong, H. V., Lindstrom, J. UAF radiorespirometric protocol for assessing hydrocarbon mineralization potential in environmental samples. Biodegradation. 2, 121-127 (1991).
  60. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, 5463-5467 (1977).
  61. Vergin, K. L., et al. Screening of a Fosmid Library of Marine Environmental Genomic DNA Fragments Reveals Four Clones Related to Members of the Order Planctomycetales. Applied and Environmental Microbiology. 64 (8), 3075-3078 (1998).
  62. Yakimov, M. M., Timmis, K. N., Golyshin, P. N. Obligate oil-degrading marine bacteria. Current Opinion in Biotechnology. 18, 257-266 (2007).
  63. Santos, H. F., Cury, J. C., Carmo, F. L., Rosado, A. S., Peixoto, R. S. 18S rDNA sequences from microeukaryotes reveal oil indicators in mangrove sediment. PLoS One. 5, 12437 (2010).
  64. Jurelevicius, D., Cotta, S. R., Peixoto, R., Rosado, A. S., Seldin, L. Distribution of alkane-degrading bacterial communities in soils from King George Island, Maritime Antarctic. European Journal of Soil Biology. 51, 37-44 (2012).
  65. Paço, A., et al. Biodegradation of polyethylene microplastics by the marine fungus Zalerion maritimum. Science of the Total Environment. 586, 10-15 (2017).
  66. Zhang, W., Yin, K., Chen, L. Bacteria-mediated bisphenol A degradation. Applied Microbiology and Biotechnology. 97, 5681-5689 (2013).
  67. Gadd, G. M. Metals, minerals and microbes: geomicrobiology and bioremediation. Microbiology. 156, 609-643 (2010).
  68. Balcázar, J. L., et al. The role of probiotics in aquaculture. Veterinary Microbiology. 114, 173-186 (2006).
  69. Gatesoupe, F. J. The use of probiotics in aquaculture. Aquaculture. 180, 147-165 (1999).
  70. Ren, Y. X., Nakano, K., Nomura, M., Chiba, N., Nishimura, O. Effects of bacterial activity on estrogen removal in nitrifying activated sludge. Water Research. 41, 3089-3096 (2007).
  71. Santos-Gandelman, J. F., Giambiagi-deMarval, M., Muricy, G., Barkay, T., Laport, M. S. Mercury and methylmercury detoxification potential by sponge-associated bacteria. Antonie Van Leeuwenhoek. 106, 585-590 (2014).
  72. Yamaga, F., Washio, K., Morikawa, M. Sustainable biodegradation of phenol by Acinetobacter calcoaceticus P23 isolated from the rhizosphere of duckweed Lemna aoukikusa. Environmental Science & Technology. 44, 6470-6474 (2010).
  73. Soriano, A. U., et al. Microbiological aspects of biodiesel and biodiesel/diesel blends biodeterioration. International Biodeterioration & Biodegradation. 99, 102-114 (2015).
  74. Da Cunha, C. D., Rosado, A. S., Sebastián, G. V., Seldin, L., Von der Weid, I. Oil biodegradation by Bacillus strains isolated from the rock of an oil reservoir located in a deep-water production basin in Brazil. Applied Microbiology and Biotechnology. 73, 949-959 (2006).
  75. Prantera, M. T., Drozdowicz, A., Leite, S. G., Rosado, A. S. Degradation of gasoline aromatic hydrocarbons by two N 2-fixing soil bacteria. Biotechnology Letters. 24, 85-89 (2002).
  76. Lai, K. M., Scrimshaw, M. D., Lester, J. N. Biotransformation and bioconcentration of steroid estrogens by Chlorella vulgaris. Applied and Environmental Microbiology. 68, 859-864 (2002).
  77. United Nations. Transforming our World: The 2030 Agenda for Sustainable Development. , (2015).
  78. Bellwood, D. R., Hughes, T. P., Folke, C., Nyström, M. Confronting the coral reef crisis. Nature. 429, 827 (2004).
  79. Pandolfi, J. M., et al. Global trajectories of the long-term decline of coral reef ecosystems. Science. 301, 955-958 (2003).
  80. Bolland, E. G., Cook, A. R., Turner, N. A. Urea as a sole source of nitrogen for plant growth. I. The development of urease activity in Spirodela oligorrhiza. Planta. 83, 1-12 (1968).
  81. Kirkwood, M., Todd, J. D., Rypien, K. L., Johnston, A. W. B. The opportunistic coral pathogen Aspergillus sydowii contains dddP and makes dimethyl sulfide from dimethylsulfoniopropionate. The ISME Journal. 4, 147-150 (2010).
  82. Raina, J., Tapiolas, D., Motti, C., Foret, S., Seemann, T. Isolation of an antimicrobial compound produced by bacteria associated with reef-building corals. Peer J. 4, 2275 (2016).
  83. Ritchie, K. B. Regulation of microbial populations by coral surface mucus and mucus-associated bacteria. Marine Ecology Progress Series. 322, 1-14 (2006).
  84. Gochfeld, D. J., Aeby, G. S. Antibacterial chemical defenses in Hawaiian corals provide possible protection from disease. Marine Ecology Progress Series. 362, 119-128 (2008).
  85. Alagely, A., Krediet, C. J., Ritchie, K. B., Teplitski, M. Signaling mediated cross-talk modulates swarming and biofilm formation in a coral pathogen Serratia marcescens. The ISME Journal. 5, 1609-1620 (2011).
  86. Kvennefors, E. C. E., et al. Regulation of bacterial communities through antimicrobial activity by the coral holobiont. Microbial Ecology. 63, 605-618 (2012).
  87. Biscere, T., et al. Enhancement of coral calcification via the interplay of nickel and urease. Aquatic Toxicology. 200, 247-256 (2018).
  88. Grover, R., Maguer, J., Allemand, D., Ferrier-Pages, C. Urea uptake by the scleractinian coral Stylophora pistillata. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 332, 216-225 (2006).
  89. Crossland, C. J., Barnes, D. J. The Role of Metabolic Nitrogen in Coral Calcification. Marine Biology. 28, 325-332 (1974).
  90. Olson, N. D., Ainsworth, T. D., Gates, R. D., Takabayashi, M. Diazotrophic bacteria associated with Hawaiian Montipora corals: diversity and abundance in correlation with symbiotic dinoflagellates. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 371, 140-146 (2009).
  91. Lema, K. A., Willis, B. L., Bourneb, D. G. Corals form characteristic associations with symbiotic nitrogen-fixing bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 78, 3136-3144 (2012).
  92. Santos, H. F., et al. Climate change affects key nitrogen-fixing bacterial populations on coral reefs. The ISME Journal. 8, 2272-2279 (2014).
  93. Cardini, U., et al. Functional significance of dinitrogen fixation in sustaining coral productivity under oligotrophic conditions. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 282, 20152257 (2015).
  94. Yang, S., Sun, W., Zhang, F., Li, Z. Phylogenetically diverse denitrifying and ammonia-oxidizing bacteria in corals Alcyonium gracillimum Tubastraea coccinea. Marine Biotechnology. 15, 540-551 (2013).
  95. de Voogd, N. J., Cleary, D. F. R. M., Polonia, A. R. M., Gomes, N. C. M. Bacterial community composition and predicted functional ecology of sponges, sediment and seawater from the thousand islands reef complex, West Java, Indonesia. FEMS Microbiology Ecology. 91, (2015).
  96. Suggett, D. J., et al. Photosynthesis and production of hydrogen peroxide by Symbiodinium (Pyrrhophyta) phylotypes with different thermal tolerances. Journal of Phycology. 44, 948-956 (2008).
  97. Petasne, R. G., Zika, R. G. Hydrogen peroxide lifetimes in south Florida coastal and offshore waters. Marine Chemistry. 56, 215-225 (1997).
  98. McFall-Ngai, M. J. Consequences of evolving with bacterial symbionts: insights from the squid-Vibrio associations. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 30, 235-256 (1999).

Tags

Bioteknik mikrobiell biologisk nedbrytning biologisk sanering oljenedbrytande bakterier ethinylstradiol-nedbrytande bakterier korallrev nyttiga mikroorganismer för koraller (BMC) miljö-probiotika bio prospektering havsförorening havs skydd oljeutsläpp hormonstörande ämnen
Prospektering mikrobiella stammar för bioremediering och probiotika utveckling för Metaorganismforskning och bevarande
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Villela, H. D. M., Vilela, C. L. S., … More

Villela, H. D. M., Vilela, C. L. S., Assis, J. M., Varona, N., Burke, C., Coil, D. A., Eisen, J. A., Peixoto, R. S. Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation. J. Vis. Exp. (152), e60238, doi:10.3791/60238 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter