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Bioengineering

Prospektion mikrobielle Stämme für Bioremediation und Probiotika Entwicklung für Metaorganismus Forschung und Konservierung

Published: October 31, 2019 doi: 10.3791/60238
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 2, 2, 1,2,3
1LEMM, Laboratory of Molecular Microbial Ecology, Institute of Microbiology Paulo de Góes, Federal University of Rio de Janeiro (UFRJ), 2Genome Center, University of California, Davis, 3IMAM-AquaRio - Rio de Janeiro Aquarium Research Center

Summary

Die Verschmutzung betrifft alle Biome. Besonders betroffen sind die Meeresumwelten, insbesondere Korallenriffe, eines der empfindlichsten Ökosysteme der Erde. Bio-Remediation ist die Fähigkeit von Organismen, Verunreinigungen zu abbauen. Hier beschreiben wir Methoden zur Isolierung und Erprobung von Mikroben, die Biosanierungsfähigkeit und potenzielle probiotische Eigenschaften für Korallen darstellen.

Abstract

Die Verschmutzung betrifft alle Biome. Besonders betroffen sind die Meeresumwelten, insbesondere Korallenriffe, eines der empfindlichsten Ökosysteme der Erde. Weltweit sind 4,5 Milliarden Menschen wirtschaftlich vom Meer abhängig, wo der größte Teil ihres Lebensunterhalts von Korallenriffen bereitgestellt wird. Korallen sind von großer Bedeutung und daher führt ihr Aussterben zu katastrophalen Folgen. Es gibt mehrere mögliche Lösungen zur Beseitigung von Meeresschadstoffen und lokaler Kontamination, einschließlich der Biosanierung. Bio-Remediation ist die Fähigkeit von Organismen, Verunreinigungen zu abbauen. Der Ansatz bietet mehrere Vorteile, wie Nachhaltigkeit, relativ niedrige Kosten und die Tatsache, dass er in verschiedenen Ökosystemen angewendet werden kann, was minimale Auswirkungen auf die Umwelt verursacht. Als zusätzlichen Vorteil, die Manipulation von endogenen Mikrobiomen, einschließlich vermeintlichvorteilhafte Mikroorganismen für Korallen (pBMCs), kann probiotische Effekte für Meerestiere haben. In diesem Zusammenhang könnte der Einsatz der beiden Ansätze Biosanierung und pBMC-Impfung zusammen vielversprechend sein. Diese Strategie würde den Abbau spezifischer Schadstoffe fördern, die für Korallen und andere Metaorganismen schädlich sein können, und gleichzeitig die Widerstandsfähigkeit und Widerstandsfähigkeit der Aufnahme erhöhen, um mit Verschmutzung und anderen Bedrohungen umzugehen. Diese Methode konzentriert sich auf die Auswahl von pBMCs, um zwei Verunreinigungen zu abbauen: das synthetische Östrogen 17a-ethinylestradiol (EE2) und Rohöl. Beides soll sich negativ auf Meerestiere, einschließlich Korallen, und Menschen auswirken. Das Protokoll beschreibt, wie Bakterien isoliert und getestet werden können, die in der Lage sind, die spezifischen Verunreinigungen zu degradieren, gefolgt von einer Beschreibung, wie man einige vermeintlich vorteilhafte Eigenschaften dieser assoziierten Mikroben zu ihrem Korallenwirt erkennt. Die hier beschriebenen Methoden sind relativ günstig, einfach durchzuführen und sehr anpassungsfähig. Anstelle von EE2 und Öl kann fast jede Art von löslicher Zielverbindung verwendet werden.

Introduction

Die Umweltverschmutzung ist ein wichtiges Problem, das die Gesundheit von Mensch, Tier und Pflanze weltweit beeinträchtigt. Obwohl Verschmutzung natürlich sein kann, wie vulkanische Asche1,sind menschliche Aktivitäten die Hauptursache für die meisten Verschmutzungen. Anthropogene Aktivitäten kontaminieren Boden, Wasser und Luft, die direkt oder indirekt zu fast 20 Millionen vorzeitigen Todesfällen bei Menschenführen 2 und jährlich Milliarden anderer Lebensformen dezimieren. Schadstoffe sind auch in den entlegensten Gebieten des Planeten vorhanden. So wurden beispielsweise Bei Wirbellosen und Polarsäugetieren in der Tiefsee schwereMetalle und persistente organische Verbindungen nachgewiesen.

Die Meeresumwelt wurde besonders von der Verschmutzung betroffen. Für eine lange Zeit wurde angenommen, dass der Ozean unberührt bleiben würde und eine endlose Quelle von Gütern wegen seiner massiven Wassermenge liefern würde5. Aus diesem Grund haben alle Arten von Industrie n. Chr. und Institutionen Abfälle in Gewässern seit Jahrhunderten frei freigesetzt6,7. Mehrere Verunreinigungen aller Art, wie Kunststoff8, synthetische Hormone9, Pestizide10, Öl11, Nährstoffe12, Schwermetalle3und radioaktive Abfälle13 wurden als Auswirkungen gemeldet Ökosysteme der Ozeane. In diesem Zusammenhang gehören Korallenriffe zu den wichtigsten und empfindlichsten Ökosystemen inMeeresumwelten 14. Riffe sind Küstenschützer, die für die Entwicklung Tausender Meeresarten von entscheidender Bedeutung sind, da sie eine wesentliche Rolle beim Nährstoffkreislauf und bei der Klimatisierung spielen. Riffe tragen auch zur Wirtschaft bei, indem sie unter anderem Fisch, Waren und Tourismus anbieten, unter anderem15. So sind beispielsweise 4,5 Milliarden Menschen von Meeresfischen als Hauptnahrungsquelle16abhängig, die stark von Korallenriffen unterstützt werden.

Ungeachtet ihrer ökologischen, sozialen und wirtschaftlichen Bedeutung werden Korallenriffe dezimiert17,18. Anthropogene Aktivitäten sind in erster Linie dafür verantwortlich, zu den drei Hauptursachen des Korallensterbens beizutragen: Klimawandel, Überfischung und Wasserverschmutzung19. Auch wenn es wichtig ist, an der Eindämmung der globalen Erwärmung zu arbeiten, ist es auch wichtig, an der Minimierung der lokalen Kontamination, einschließlich der Wasserverschmutzung, zu arbeiten, die entscheidend zum Rückgang der Korallen beitragen kann20. Daher ist es dringend erforderlich, Strategien zur Erhöhung der Lebensdauer von Korallen zu entwickeln, die ihnen zusätzliche Zeit zum Anpassen und Überleben verschaffen könnten.

In dieser Hinsicht ist es äußerst wichtig, Lösungen zu finden, um Kontamination zu minimieren und Strategien zu entwickeln, um die Fitness von Korallen zu erhöhen. Strategien zur Sanierung von Meeresschadstoffen sind sehr vielfältig und können in physikalische, chemische und biologische Ansätze eingeteilt werden. Physische Ansätze sind hilfreich. Sie sind jedoch nicht immer effizient. So können beispielsweise Kunststoffabfälle durch physikalische Entfernung minimiert werden, während wasserlösliche Verbindungen andere Methoden benötigen, um beseitigt zu werden. Beispiele für solche Verbindungen sind Rohöl, das durch Tätigkeiten der Ölindustrie freigesetzt wird und verschüttet wird, sowie andere Mikroverunreinigungen, wie synthetische Hormone, die normalerweise als östrogene Komponente in oralen Kontrazeptiva verwendet werden und in Abwasser21 vorhanden sind, 22. Die Verwendung chemischer Stoffe zur Verringerung der Kontamination kann ein spezifisches Problem lösen, aber sie kann auch eine zusätzliche Verschmutzungsquelle darstellen. Dies ist der Fall bei chemischen Dispergiermitteln zur Milderung der Ölkontamination, die als noch giftiger für marine Ökosysteme beschrieben wurden als die Ölkontamination selbst23. Aus diesen Gründen bieten biologische Ansätze im Vergleich zu den anderen Methoden mehrere Vorteile. Bio-Remediation ist die Fähigkeit lebender Organismen oder ihrer Stoffwechselprodukte, Verunreinigungen in weniger toxische oder ungiftige Formen umzuwandeln24. Die Hauptvorteile des Einsatzes biologischer Methoden sind Nachhaltigkeit, relativ niedrige Kosten, die Tatsache, dass sie umweltfreundlich sind, und dass sie in verschiedenen Ökosystemen angewendet werden können, was minimale oder weniger Auswirkungen auf die Umwelt verursacht21, 25,26,27.

Darüber hinaus ermöglicht die Manipulation der mikrobiellen Gemeinschaft in einer Umgebung einen zusätzlichen potenziellen Vorteil. Es gibt Mikrobiome, die mit Wirten verbunden sind und für ihre Gesundheit unerlässlich sind. Es ist bekannt, dass diese zugehörigen symbiotischen Mikrobiome notwendig sind, um die Hosthomöostase19aufrechtzuerhalten. Die Manipulation dieser assoziierten Mikroorganismen wurde gut für Wirte wie Pflanzen und Säugetiereerforscht 28,29, aber die Verwendung von Korallenprobiotika ist immer noch neu15. Korallen beherbergen auch, interagieren mit und sind auf große und spezifische Populationen von Mikroorganismen angewiesen, um19zu überleben. Die Rolle dieser mikrobiellen Gemeinschaften in der Gesundheit und Dysbiose von Korallen ist aktiv untersucht, aber es ist noch weit davon entfernt, vollständig verstanden werden30. Eine der beliebtesten Hypothesen wird die Korallen probiotische Hypothese genannt. Es deutet auf eine dynamische Beziehung zwischen symbiotischen Mikroorganismen und Umweltbedingungen hin, die die Auswahl der vorteilhaftesten Korallenmetaorganismen31 bewirkt. Basierend auf diesen Informationen, wichtige potenzielle probiotische Mechanismen, sowie die Strategien für die Isolierung, Manipulation, und Lieferung von nützlichen Mikroorganismen für Korallen (BMCs) für mehrere Zwecke, wurdenvorgeschlagen 32 und getestet33. Zu diesen potentiellen positiven Eigenschaften gehören die Widerstandsfähigkeit gegen Temperaturanstieg, der Schutz vor reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), die Stickstofffixierung, die Beständigkeit gegen Verunreinigungen und die biologische Bekämpfung gegen Krankheitserreger, unter anderem32.

Diese Studie konzentriert sich auf die Auswahl von BMCs und frei lebenden Mikroorganismen, die die Fähigkeit darstellen, zwei Schadstoffe zu abbauen, die häufig in Meeresumgebungen vorkommen: das synthetische Östrogen 17a-ethinylestradiol (EE2) und Rohöl. Schadstoffe, die Hormonwirkstoffe enthalten, sind oft in Gewässernvorhanden 34,35,36,37,38,39,40, 41,42. Unter ihnen, synthetische östrogene endokrine Disruptor Verbindungen (EDCs) imitieren die Wirkung von Östrogenen auf Zielzellen, verursacht mehrere Auswirkungen auf Tiere, einschließlich Brustkrebs, Unfruchtbarkeit, und Hermaphroditism9. EE2 wird vom Menschen wegen der Verwendung oraler Kontrazeptiva ausgeschieden. Es wird von herkömmlichen Kläranlagen nicht aus dem Abwasser entfernt und hat auch bei sehr geringen Konzentrationen (z.B. ng/L oder g/L)43,44,45negative Auswirkungen. Über die Auswirkungen von Östrogenen auf die Korallenphysiologie ist wenig bekannt46,47. Bei anderen wirbellosen Meerestieren, wie Schwämmen, Krebstieren und Weichtieren, wurden jedoch Östrogene berichtet, die mehrere negative Auswirkungen verursachten, die hauptsächlich mit der Fortpflanzung zusammenhingen, wie entwicklung und/oder Stimulation von Gameten, Protein-Aktionen, Probleme in embryonalen Prozessen, und andere48,49,50,51,52. Die negativen Folgen der EE2-Kontamination unterstreichen die Notwendigkeit, nachhaltige Ansätze zu entwickeln, um diese Verbindung aus der Umwelt zu entfernen, ohne die Meereslebewesen zu beeinträchtigen.

Parallel dazu, mit Öl derzeit fast 40% der weltweit verbrauchten Energiequellen53, chronische Kontamination und Ölverschmutzungen häufig in der Nähe von Riffgebietenauftreten 11. Ölkontamination wurde berichtet, negative Auswirkungen bei mehreren Arten von Meerestieren, Vögeln, Pflanzen und Menschenverursachen 54,55,56,57. Auf Korallen verursacht es Bleichen, reduziert den Widerstand von Larven gegen thermischen Stress58, stört die mikrobiellen assoziierten Gemeinschaften21, und verursacht Gewebenekrose. Darüber hinaus sind chemische Dispergiermittel, eine Ölsanierungstechnik, die häufig von Ölgesellschaften zur Behebung von Verschmutzungen verwendet wird, für Korallen noch giftiger als das Öl selbst23. Günstige Mikroorganismen, die aus Korallen isoliert sind, sind dagegen dafür bekannt, eine entscheidende Rolle bei der Gesundheit des Wirts zu spielen. Jedoch, die Manipulation dieser potenziellen Probiotika müssen besser erforscht werden, um mögliche negative Nebenwirkungen und die metabolischen Kapazitäten zu untersuchen, die überprüft werden können, um die Fitness des Metaorganismus zu verbessern. In diesem Zusammenhang sind Merkmale wie die antimikrobielle Aktivität gegen Korallenpathogene, die Herstellung von Kataalase zur Bekämpfung von oxidativem Stress, die Fähigkeit, Harnstoff zu abbauen (der eine wichtige Rolle im Verkalkungsprozess spielen kann) und das Vorhandensein von Genen die unter anderem potenzielle positive Merkmale verleihen, muss im Mittelpunkt der Untersuchung stehen. Hier zeigen wir, wie Bio-Remediation und Probiotika verwendet werden können, um gleichzeitig die Auswirkungen der Verschmutzung zu mildern und die Gesundheit der Korallen zu verbessern. Die Entwicklung innovativer Ansätze, die als Interventionen zur Erhöhung der Persistenz von Meeresarten eingesetzt werden können, stellt einen Schritt hin zu einem nachhaltigeren und gesünderen Planeten dar.

Protocol

1. Wasser- und Korallensammlung und -speicherung für mikrobielle Isolierung

HINWEIS: Es ist wichtig, die Koordinaten und die Temperatur der Probenahmestellen zu nehmen. Wenn möglich, können Metadaten wie Salzgehalt, pH-Wert, Tiefe und Lichtintensität auch bei der Suche nach fein abgestimmten Anbauansätzen und der zukünftigen Interpretation von Daten helfen. Für zuverlässige Ergebnisse lagern Sie die Proben so lange wie möglich. Die Wasser-/Korallenmikrobiome können sich erheblich ändern, wenn die Proben nicht auf der richtigen Temperatur gehalten und/oder über einen längeren Zeitraum gelagert werden. Wenn der Isolationsschritt nicht sofort nach der Entnahme durchgeführt wird, ist es wichtig, Proben bis zur Verarbeitung bei 4 °C zu halten. Je länger die Proben gelagert werden, auch bei 4 °C, desto mehr wird sich die mikrobielle Gemeinschaft verändern.

  1. Probe und speichern Meerwasser.
    1. Sammeln Sie 500 ml Wasserproben mindestens dreifach von jeder gezielten Probenahmestelle. Verwenden Sie vorzugsweise sterile Flaschen mit Schraubverschlüssen.
    2. Wenn Sie das Wasser sofort nach der Abholung verarbeiten, halten Sie die Flaschen für ein kurzes Intervall bei RT auf. Wenn die Probenverarbeitung später erfolgt, halten Sie die Flaschen bei 4 °C.
  2. Probieren und lagern Sie die Koralle.
    1. Verwenden Sie eine sterile Zange, um Korallenfragmente von der gleichen Probenahmestelle der Wasserproben zu schneiden. Um eine Kontamination zu vermeiden, berühren Sie Korallen nur mit sterilen Handschuhen.
    2. Spülen Sie das beprobte Korallenfragment mit 20 ml steriler Salzlösung (3% NaCl in destilliertem Wasser) oder künstlichem Meerwasser, um die lose befestigten frei lebenden Bakterien des Meerwassers loszuwerden.
    3. Mit Zangen jedes Korallenfragment in einen sterilen 250 x 500 ml Behälter mit einer Schraubkappe mit steriler Wäschelösung legen.
    4. Im Labor wiegen mit sterilen Zangen und Zangen 5 g Korallenfragmente mit sterilen 100 mm x 20 mm Petrischalen auf einer Waage.
    5. Übertragen Sie die 5 g Korallenprobe auf einen sterilen Mörtel und mazerieren Sie sie mit einem sterilen Stößel.
    6. Mit einem sterilen Spachtel, übertragen Sie die mazerierte Probe in einen sterilen Kulturkolben mit 45 ml 3% NaCl sterile Lösung und 10-15 Glasperlen von 5 mm. Verwenden Sie einige der 45 ml sterilen Saline-Lösung, um den Mörtel zu waschen und die maximale Menge des Mazerat sanieren.
    7. Halten Sie die Kolben unter ständiger Rührung (150 x g) 16 h bei der Wassertemperatur der Probenahmestelle auf.
      HINWEIS: Bei Flachwasserkorallen liegt die optimale Temperatur zwischen 24 und 28 °C. Dieser Schritt löst Mikroorganismen aus verschiedenen Korallenkompartimenten, wie z. B. denen, die an den Wirtszellen befestigt sind, oder von denen, die im Gewebe und im Skelett leben. Nach diesem Schritt sollten die Korallenmazerate nicht gespeichert werden, und der Isolationsschritt muss sofort durchgeführt werden.

2. Isolierung von EE2-abbauenden Bakterien aus Meerwasser und/oder Korallen

  1. Wählen Sie Bakterien.
    HINWEIS: Nach den Schritten 1.1.2 und 1.2.7 ist die Konzentration von Mikroorganismen im Meerwasser, die sich von den verschiedenen Korallenmazeraten gelöst haben, unbekannt und variabel. Um die Isolierung einzelner mikrobieller Kolonien in Petrischalen mit Agarmedien zu gewährleisten, sind serielle Verdünnungen erforderlich.
    1. Führen Sie serielle Verdünnungen bis zu 10-9 in steriler Salzlösung für Korallenproben und bis zu 10-6 für Wasserproben durch. Pipette verdünnt 5x nach oben und unten, bevor die Spitze entsorgt wird. Vortex-Proben für 5 s jedes Mal vor der nächsten seriellen Verdünnung.
    2. Pipette 100 l jeder Verdünnung auf Petrischalen mit 3% NaCl Lysogeny Brühe (LB) Agar Medium, und Teller sie.
      HINWEIS: Verwenden Sie Marine-Agar (MA) als alternatives Medium. Für zuverlässige Ergebnisse sind Dreifache jeder Verdünnung erforderlich.
    3. Inkubieren Sie die Platten für 1 bis 3 Tage bei der Zieltemperatur (z. B. 26 °C). Überprüfen Sie die Platten einmal täglich.
    4. Wählen und isolieren Sie die Kolonien, die mit der Streifenplattentechnik unterschiedliche Wachstumsmorphologien auf neuen Platten präsentieren. Wiederholen Sie diesen Schritt so oft wie nötig, um reine Kolonien auf den Tellern wachsen zu lassen.
    5. Wenn das Verfahren nicht sofort fortgesetzt wird, Schritt 2.3.1, lagern Sie Isolate bei 4 °C oder in Glycerin, wie in Abschnitt 2.2 beschrieben.
  2. Bereiten Sie Glycerin-Bestände vor.
    HINWEIS: Dieser Schritt ist optional und kann für die langfristige Lagerung von Bakterienbeständen verwendet werden.
    1. Wählen Sie einzelne Kolonien von der frischen Platte oder von den bei 4 °C gelagerten Platten und impfen Sie sie unabhängig voneinander in 2 ml sterilem LB-Medium.
    2. Rohre über Nacht (EIN) bei 24 bis 28 °C unter konstanter Rührung (150 x g)aufstellen.
    3. 1 ml der Bakterienkulturen ab Schritt 2.2.2 und steriles Glycerin zu einer Endkonzentration von 20% zu den 2 ml Kryovials hinzufügen.
    4. Lassen Sie die Kryovials bei 4 °C ein.
    5. Die Glyzerinbakterienbestände bis zum Bedarf auf -80 °C legen.
  3. Führen Sie den EE2-Degradationsfähigkeitstest durch.
    1. Aktivieren Sie die Isolate in LB-Brühe oder alternativen Medien. Wählen Sie dazu eine einzelne Kolonie aus den frischen Platten oder der Platte, die bei 4 °C gelagert wird, und impfen Sie 2 ml steriles LB-Medium. Falls es sich um einen Glycerinbestand handelt, streift es zuerst auf LB-Agarplatten und brütet bei 24 bis 28 °C EIN, um einzelne Kolonien wachsen zu lassen. Legen Sie das Rohr mit LB-Medium unter konstanter Rührung geneigt (150 x g) bei 24 bis 28 °C ein.
    2. Nach bakteriellem Wachstum pellet die Zellen durch Zentrifugieren bei 8.000 x g für 8 min bei Raumtemperatur (RT). Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in einem gleichen Volumen (2 ml) Salzwasser, um die verbleibende LB-Brühe zu waschen.
    3. Wiederholen Sie Schritt 2.3.2 zweimal, um sicherzustellen, dass es keine Spuren von Kohlenstoffquelle gibt, und setzen Sie die Zellen in einem gleichen Volumen der Salinelösung wieder auf. Wenn sie z. B. mit einer 2-ml-Kultur gestartet wurde, setzen Sie die Zellen in einem Endvolumen von 2 ml-Salinelösung wieder aus.
    4. Impfen Sie die gewaschenen und resuspendierten Zellen im minimalen Bushnell Haas Kulturmedium (BH Broth), das EE2 als einzige Kohlenstoffquelleenthält 59.
      HINWEIS: EE2 wird in Ethanol in einer Endkonzentration von 5 mg/L im Kulturmedium gelöst. Nehmen Sie bei Bedarf Änderungen an der Schadstoffart und/oder -konzentration vor.
    5. Bewerten Sie das Bakterienwachstum durch optische Dichte bei 600 nm und/oder Kolonien bildende Einheiten (CFU) auf LB Agar Medium33, für 16-72 h Inkubation.
      HINWEIS: Alternativ können die Mikroorganismen direkt auf minimalen Medien isoliert werden, die EE2 oder andere Verbindungen als einzige Kohlenstoffquelle enthalten. Dieser Schritt würde die Auswahl lenken und unerwünschtes Wachstum vermeiden.

3. Isolierung ölabbauender Bakterien aus Meerwasser und/oder Korallen

  1. Bereiten Sie minimale Medien vor, die eine ölwasserlösliche Fraktion (oWSF) und eine ölwasserunlösliche Fraktion (oWIF) als einzige Kohlenstoffquelle enthalten21.
    1. Fügen Sie 1 bis 2 % Rohöl zu 500 ml sterilem destilliertem Wasser hinzu. Verwenden Sie einen Filterkolben, der auf der Unterseite geöffnet ist, um die lösliche Fraktion herauszunehmen, ohne die obere Schicht der unlöslichen Fraktion zu stören.
    2. Halten Sie die Mischung bei 24 x 28 °C bei 150 x g für 48 h konstant.
    3. Legen Sie den Filterkolben, der die Rohölfraktionen enthält, auf eine stabile Oberfläche und warten Sie 10 bis 20 min, um eine lösliche und unlösliche Bruchtrennung zu ermöglichen.
    4. Übertragen Sie den oWSF in einen neuen sterilen Kolben, indem Sie den oWIF sparen, indem Sie den unteren Filterkolben öffnen und die lösliche Fraktion herausnehmen.
    5. Bereiten Sie mit allen oWSF, die im vorherigen Schritt wiederhergestellt wurden (ca. 400 ml), 1 L BH-Agar-Mindestmedium vor, das oWSF als einzige Kohlenstoffquelle enthält.
    6. Mit dem oWIF, der ab Schritt 3.1.4 im Kolben verbleibt, bereiten Sie 1 L BH-Agar-Mindestmedium vor, das oWIF als einzige Kohlenstoffquelle enthält.
  2. Isolieren Sie oWSF- und oWIF-abbauende Bakterien.
    1. Mit Wasser und Korallenmazerat aus den Schritten 1.1.2 bzw. 1.2.7 die Proben bis10-6 in steriler Salzlösung, wie in Schritt 2.1.1 beschrieben, verdünnen.
    2. Pipette 100 l jeder Verdünnung auf Petrischalen, die BH-oWSF und BH-oWIF Agarmedien enthalten, und platte.
    3. Wiederholen Sie die von Schritt 2.1.3 bis Schritt 2.1.5 beschriebenen Verfahren.

4. Mitgliederauswahl des Konsortiums

  1. Extrahieren und Sequenzieren der DNA zur taxonomischen Identifizierung.
    1. Aktivieren Sie die in Glycerin gelagerten Isolate, wie in Schritt 2.3.1 beschrieben.
    2. Extrahieren Sie die DNA mit einem DNA-Extraktionskit (siehe Tabelle der Materialien).
    3. Verwenden Sie die Primer 27f (5-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3) und 1492r (5-GTT TAC CTT GTT GTT ACG ACT T-3)) für die Verstärkung des 16S rRNA-Gens.
    4. Führen Sie 50-L-PCR-Reaktionen nach folgendem Protokoll durch: 5 l 10x Polymerase-Puffer, 2 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, 5 mM jedes Primers, 10 ng genomische DNA und 2,5 U Taq-DNA-Polymerase. Fügen Sie negative Kontrollen (d. h. leere DNA-Extraktionen und PCR-Reaktionen ohne Vorlagen-DNA) hinzu, um sicherzustellen, dass es keine Kontamination gibt.
    5. Richten Sie die folgenden thermischen Radfahrschritte ein: einen ersten Denaturierungszyklus bei 94 °C für 4 min; 35 Zyklen bei 94 °C für 1 min, gefolgt von 50 °C für 1 min und 72 °C für 2,5 min; einen abschließenden Verlängerungszyklus für 10 min bei 72 °C.
    6. Überprüfen Sie die Amplikonintegrität in 1,2% Agarose-Gel mit 80 V.
    7. Gel reinigen die Proben mit einem Gel-Reinigungskit (siehe Materialtabelle).
    8. Quantifizieren Sie PCR-Produkte mit einem Fluorometer.
    9. Produkt zur Sequenzierung senden.
      HINWEIS: Für bessere taxonomische Klassifikationen wird die Sanger-Methode60empfohlen, da sie lange Sequenzen bietet. Die universellen Primer 27f und 1492r können verwendet werden, um fast die gesamte Länge des 16S rRNA Gen61zu verstärken. Wenn Contigs nicht mit einem Paar Primer zusammengesetzt werden können, sollte ein zusätzliches Paar in der Mitte der Sequenz berücksichtigt werden.
  2. Bestimmen Sie die Wachstumskurve.
    1. Aktivieren Sie die Isolate in Glycerinbeständen ab Schritt 2.2.5, wie in Schritt 2.3.1 beschrieben, jedoch mit 5 ml statt 2 ml.
    2. Fügen Sie 1% (v/v) der gewachsenen 5 ml Kultur von Schritt 4.2.1 in Triplicaten zu einem 250 ml Kolben hinzu, der 100 ml 3% LB-Medien enthält. Achten Sie darauf, Auch Triplicates einer Negativkontrolle (kein Inokulum) vorzubereiten.
    3. Die Kolben unter ständiger Rührung (150 x g)bei 24 bis 28 °C in einen Inkubator stellen.
    4. Nehmen Sie 1 ml Aliquots alle 4 h für 48 h. Wenn die Stämme eine hohe Wachstumsrate aufweisen, verringern Sie das 4-H-Intervall.
    5. Messen Sie die optische Dichte (OD) Schätzung bei 600 nm Wellenlänge und Koloniebildenden Einheiten (CFU) aus seriellen Verdünnungen, die auf Rich Media Platten plattiert sind (100 l sollten in jeder Platte geimpft und auf das Volumen von 1 ml normalisiert werden).
    6. Zeichnen Sie die OD- und CFU-Kurven auf und analysieren Sie die Korrelation von OD/CFU jeder einzelnen Sorte. Berechnen Sie von nun an die Anzahl der Zellen basierend auf den OD-Werten.
  3. Führen Sie einen Antagonismustest durch.
    1. Aktivieren Sie die Isolate wie in Schritt 2.3.1 beschrieben.
    2. Impfen Sie eine Sorte nach der anderen entlang der Mitte von Platten, die Agarmedien enthalten, und die anderen senkrecht zum zentralen. Wiederholen Sie dies, bis jeder ausgewählte mikrobielle Stamm gegen alle anderen getestet wird.
    3. Inkubieren Sie die Platten bei 24 bis 28 °C und überwachen Sie sie täglich, um potenzielle Halos zu beobachten, die auf eine antagonistische Aktivität hinweisen. Wenn Halos beobachtet werden, die auf eine antagonistische Aktivität zwischen zwei Stämmen hinweisen, sollte eine davon ausgeschlossen werden.
  4. Führen Sie die Konsortialmontage durch.
    1. Aktivieren Sie die Isolate wie in Schritt 2.3.1 beschrieben.
    2. Pellet die Zellen bei 3.500 x g und waschen Sie sie vorsichtig 2x in einem gleichen Volumen der Saline-Lösung. Unterbrechen Sie die Zellen in einem gleichen Volumen (d. h., wenn das Endvolumen 2 ml Zellen betrug, waschen Sie sie mit 2 ml Salinelösung und setzen Sie sie in einem Endvolumen von 2 ml wieder aus).
    3. 1 ml Kultur in 100 ml 3% NaCl LB medium impfen und ON bei 150 x g inkubieren.
    4. Wiederholen Sie Schritt 4.5.2, impfen Sie die 100 ml gewachsenen, gewaschenen und resuspendierten Kulturen in 10 L Kulturen. Inkubieren Sie ON in sterilen Luftbrücken-Bioreaktoren und empfangen Gefilterte Luft von einer Pumpe. Wenn mehr Kultur benötigt wird, impfen Sie immer 1% der erwachsenen Kultur in frischen Medien.
    5. Zentrifugenkulturen bei 8.000 x g für 8 min bei 4 °C. Überstand nach Zentrifugation entsorgen.
    6. Waschen Sie das Pellet, sanft die Zellen in 500 ml steriler Köchellösung wieder aufhängen.
    7. Wiederholen Sie die Schritte 4.5.5 und 4.5.6.
    8. Setzen Sie jede einzelne Kultur in 100 ml Salinelösung aus und messen Sie die OD, um die Anzahl der Zellen zu schätzen.
    9. Berechnen Sie das Volumen jeder Kultur, die notwendig ist, um eine Endkonzentration von 107 Zellen ml-1zu erreichen.
    10. Perform CFU zählt auf Rich Media für eine endgültige Bestätigung der Zelllebensfähigkeit und Konzentration.
    11. Mischen Sie ein gleiches Volumen jeder einzelnen Kultur in sterilen Kolben und aliquot das Konsortium in 50 ml sterile Rohre.
    12. Bei 4 °C bis zur Impfung aufbewahren.
      HINWEIS: Bereiten Sie die Konsortialversammlung so frisch wie möglich vor, um zu gewährleisten, dass die Zellen weiterhin lebensfähig sind. Alternativ können CFU-Zählungen vor der Impfung durchgeführt werden. Um ein ideales Konsortium zusammenzustellen, ist es notwendig, Isolate zu verwenden, die unterschiedliche und komplementäre metabolische Kapazitäten darstellen. In der Regel werden 6-10 Isolate verwendet, um Konsortien zu bilden, aber diese Zahl variiert je nach den Eigenschaften und Zwecken der Mitglieder.

5. Nachweis vermeintlicher vorteilhafter Eigenschaften für Korallen

  1. Aktivieren Sie die Isolate aus den Glyzerinvorräten, indem Sie sie auf LB-Agarplatten ausspionieren und bei 24 bis 28 °C eins inkubieren, um einzelne Kolonien wachsen zu lassen. Wählen Sie eine einzelne Kolonie aus den Platten und impfen Sie sie in 2 ml sterilem LB-Medium. Rohre mit LB-Medium unter konstanter Rührung (150 x g)bei 24 bis 28 °C einneigen.
  2. Führen Sie die DNA-Extraktion gemäß Abschnitt 4.1 durch, um potenziell vorteilhafte Gene per PCR zu detektieren.
    HINWEIS: PCR-Reaktionsbedingungen und Primer hängen vom Zielgen ab. Methoden zur Prüfung der BMC-Eigenschaften einzelner Stämme und des PCR-Nachweises auf potenziell vorteilhafte Gene sind in Tabelle 1beschrieben.

Representative Results

Basierend auf den hier beschriebenen Methoden war es möglich, Mikroorganismen aus verschiedenen Wasserquellen und Korallen-Nubbins zu isolieren, die vermeintliche BMC-Eigenschaften aufweisen und in der Lage sind, verschiedene Klassen von Verunreinigungen zu abbauen (Abbildung 1). Mit Wasserproben, die in einer Kläranlage entnommen wurden, die vom CESA-UFRJ (Experimental Center of Environmental Sanitation der Federal University of Rio de Janeiro) gewonnen wurden, und basierend auf dem hier vorgestellten Verfahren 33 Bakterienstämme, die EE2 eine Endkonzentration von 5mg/L isoliert wurden (Abbildung 2A). Zusätzlich wurden mit der Technik zur Auswahl ölabbauender Bakterien 20 Stämme isoliert, die sowohl oWSF (Abbildung 2B) als auch oWIF (Abbildung 2C) abbauen konnten.

Die vermeintlichen BMC-Eigenschaften wurden in Mikroorganismen untersucht, die von verschiedenen Korallenarten unter verschiedenen Bedingungen isoliert wurden. Darunter ein Stamm, der eine starke antagonistische Aktivität gegen den Korallenpathogen Vibrio coralliilyticus (Abbildung 3A), Stämme, die Harnstoff abbauen können (Abbildung 3B), ein guter Katasaseproduzent ( Abbildung3 C) und Mikroorganismen, die potenziell vorteilhafte Gene darstellen (Abbildung 3D) wurden gefunden.

Unter Verwendung der beiden kombinierten Ansätze (z. B. Biosanierung und BMC-Impfung) war es möglich, Korallen vor Ölexpositionseinwirkungen zu schützen. Dazu wurde ein ölbioremediator pBMC-Konsortium, isoliert von der Koralle Mussismilia harttii, auf Korallennubbins geimpft, die 1% Öl in Triplicaten ausgesetzt waren21. Die dem Öl ausgesetzten Behandlungen zeigten ab dem vierten Tag einen progressiven Rückgang von Fv/Fm und erreichten bis zum zehnten Tag Werte nahe Null. Variable Fluoreszenz/maximale Fluoreszenz (Fv/Fm) lieferte ein Maß für die maximale photosystem II (PSII) photochemische Effizienz der Zooxanthellen, die eine indirekte Messung der Korallengesundheit darstellen. Auf der anderen Seite zeigten Korallennubbine, die in den mit dem Konsortium geimpften Aquarien vorhanden sind, eine besser erhaltene photochemische Fähigkeit (Abbildung 4).

Figure 1
Abbildung 1: Zusammenfassung der wichtigsten Schritte der Auswahl und Montage eines Bioremediator-pBMC-Konsortiums. Schema der schadstoffabbauenden Mikroorganismen-Auswahlschritte (in Grau) und letzte Schritte, die für die mikrobielle Auswahl des Konsortiums verwendet werden (DNA-Sequenzierung, Wachstumskurve, Antagonismustest und Konsortienmontage in Rot). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Auswahl schadstoffabbauender Bakterien. (A) Bakterielle Isolate, die auf minimalen Medienplatten wachsen, die EE2 als einzige Kohlenstoffquelle enthalten. (B) Bakterienkolonien, die auf minimalen Medienplatten wachsen, die oWSF als einzige Kohlenstoffquelle enthalten. (C) Bakterienkolonien, die auf minimalen Medienplatten wachsen, die oWIF als einzige Kohlenstoffquelle enthalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Erkennung von pBMC-Eigenschaften. (A) Flecken in Triplicaten von Stämmen, die antagonistische Aktivität gegen den Korallenpathogen Vibrio coralliilyticus (in schwarz) und einen Kontrollstamm (in grün) darstellen. (B) Stämme, die auf Medien wachsen, die Harnstoff als einzige Kohlenstoffquelle enthalten. (C) Dehnung serprozissende Kataalase (+) und eine schlechte Kataalase-Erzeuger-Sorte (-). (D) Beispiel für die PCR-Erkennung des NirK-Gens (Spur 1 = 1kb Leiter; Spur 2 = leere DNA-Extraktion negativ control; Lane 3 = NirK-Erkennung; Spur 4 = PCR-Reaktionen ohne Vorlagen-DNA). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Fv/Fm-Messungen von M. harttii nubbins dunkel angepasst um 17.00 Uhr, mit einem Tauch-PAM-Chlorophyll-Fluorometer. Fv/Fm-Messungen des Behandlungskontrollkonsortiums, Öl und Öl mit Konsortium wurden täglich 10 Tage lang in Triplicaten durchgeführt. Standardabweichung wird angezeigt. Die Features des Diagramms wurden mit Genehmigung der vorherigen Ergebnisse21geändert, die unter https://www.nature.com/articles/srep18268 unter einer Creative Commons Attribution 4.0 verfügbar sind. Vollständige Konditionen bei http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Moa mikroorganismus Detektionstechnik Verweise
Klimaregulierung; Surfur Radfahren; antimikrobielle Verbindungen; den antioxidativen Schutz der Zellen zu erhöhen. Aspergillus sydowii PCR für dddP-Gen 81
Pseudovibrio sp. P12 Kulturmedium mit DMSP 82
Pseudoalteromonas sp. PCR für dmdA-Gen 33
Biologische Regulierung von Krankheitserregern. Mikrobiom von Acropora palmata schleim Klare Sperrzone 83
Extrakte aus Korallen Wachstumshemmungstest 84
Marinobacter sp. Schwärmende Assays 85
Pseudoalteromonas sp. Agar-Platte Cross-Streaking 86
Pseudoalteromonas sp. Agar-Diffusionsmethode 33
Nutzen des Verkalkungsprozesses; Stickstoffquelle für Skleractinian Korallen. Symbiodinium spp. Kolorimetrische Methode 87
Mikrobiom von Stylophora pistillata schleim ___ 88
Mikrobiom von Acropora alciminata Methode von Bolland et al.80 89
Stickstoffkreislauf; Stickstofffixierung zu erhöhen. Mikrobielle Gemeinschaft Qpcr 90
Mikrobielle Gemeinschaft Pcr 91
Mikrobielle Gemeinschaft Qpcr 92
Mikrobielle Gemeinschaft Angepasste Acetylen (C2H2) Reduktionstechnik 93
Pseudoalteromonas sp. und Halomonas taeanensis Pcr 33
Stickstoffkreislauf; Abnahme der Ammoniumkonzentration. Pseudoalteromonas sp. Pcr 33
Mikrobiom aus Tubastraea coccinea Pcr 94
Mikrobiom von Xestospongia testudinaria Prädiktive Metagenom-Analyse 95
Holobiont-Schutz gegen reaktive Sauerstoffspezies (ROS). Pseudoalteromonas sp., Cobetia marina und Halomonas taeanensis Katassetest 33
Symbiodinium spp. Amplex rot 96
Vibrio pelagius und Sync- chococcus sp. Meerrettichperoxidase-Scopoletin-Methode 97
Vibrio fischeri Mehrere Methoden 98

Tabelle 1: Nachweis von vermeintlichen BMC-Eigenschaften, Wirkmechanismus (MOA), gemeldeten Mikroorganismen, die das Potenzial und die Technik zum Nachweis des Merkmals darstellen.

Discussion

In den letzten 50 Jahren wurden ansätze zur Biosanierung massiv erforscht. So wurden beispielsweise über 200 Mikroben zwischen Bakterien, Cyanobakterien, Mikroalgen und Pilzen in verschiedenen Lebensräumen als in der Lage bezeichnet, das Vorhandensein und/oder den Abbau von Ölkohlenwasserstoffenanzugeben 62,63,64 . Darüber hinaus sind andere Klassen von Verbindungen, die Auswirkungen auf die Umwelt und den Menschen verursachen, wie Kunststoff, Bisphenol A, endokrine Disruptoren und Schwermetalle, Ziele für die Entwicklung der Biosanierungstechnik65,66, 67. Auf der anderen Seite, Marine probiotische Entwicklung wurde auf die Felder beschränkt, die einen offensichtlichen Einfluss auf die Wirtschaft haben, wie Fisch probiotikatische in aquaculture68,69. Die Isolierung und Charakterisierung nützlicher Mikroorganismen zum Schutz von Korallenriffen, marinen Ökosystemen, die Fischerei, Tourismus und andere rentable Aktivitäten unterstützen, wird jedoch allmählichauf 15geschätzt. Hier wird ein billiges, einfaches und zugängliches Protokoll zur Auswahl schadstoffabbauender Mikroorganismen erstellt, die auch potenziell vorteilhafte Merkmale für lokale meeresökosysteme aufweisen können, insbesondere vermeintliche vorteilhafte Mikroorganismen für Korallen (pBMCs). Beschrieben.

Darüber hinaus ist die hier gezeigte Methode sehr anpassungsfähig an verschiedene Verbindungen und verschiedene Arten von mikrobiellen Quellen. Es ist möglich, verschiedene Schadstoffe anzusprechen, indem die einzige Kohlenstoffquelle ersetzt wird, die den minimalen Medien hinzugefügt wird. Dazu sollten anstelle von Öl oder EE2 andere Verbindungen in der gewünschten Konzentration zugesetzt werden. Dies wäre der selektive Druck, Degrader für die gezielten Schadstoffe zu isolieren. So wurden beispielsweise Mikroorganismen, die in der Lage sind, andere Klassen von endokrinen Disruptoren zu erniedrigen, bereits mit derselben Methode ausgewählt und getestet70. Darüber hinaus können andere meeres- und terrestrische Organismen, wie Schwämme und Pflanzen71,72, sowie verschiedene Arten von Umweltproben, wie Boden, Brennstoff und Gestein, als abbauende-mikrobielle Quellen verwendet werden25, 73,74. So konnten beispielsweise kohlenwasserstoffabbauende Bakterien aus verschiedenen Boden- und Sedimentproben25,54,63,64,75erkannt und isoliert werden. Schließlich können bei geringfügigen Modifikationen in den Medien andere Mikroorganismen als Bakterien leicht als abbauende Mikroben ausgewählt werden. Zum Beispiel, ein Mikroalgenstamm mit der Fähigkeit, effizient abbauen Östrogen-Verbindungen wurde berichtet76.

Idealerweise, Bio-Remediation-probiotische Konsortien müssen für jede spezifische Verbindung oder Bereich montiert werden. Mikroben, die in einer bestimmten Umgebung wachsen, wachsen möglicherweise nicht so gut in neuen Standorten im Vergleich zu ihren nativen Bedingungen. Da die Forscher kein Produkt gefunden haben, das unter allen Umgebungsbedingungen effizient angewendet werden kann, sollte für jede spezifische Situation eine neue Konsortienmontage durchgeführt werden. Dies wäre vergleichbar mit personalisierter Medizin für eine umweltgerechte Genesung. Aus diesem Grund ist die Schaffung einer Zentralbank von mikrobiellen Stämmen mit potenziellen probiotischen Eigenschaften und Abbaukapazität ein entscheidender Schritt für den Fortschritt dieses Bereichs. Diese Initiative würde Zeit und Arbeit sparen und zur weltweiten Zusammenstellung neuer spezifischer Konsortien beitragen.

Mikroorganismen, die mit Korallen assoziiert sind (d. h. Mikroalgen, Bakterien, Archaeen, Pilze und Viren) haben eine komplexe und komplizierte Rolle bei der Aufrechterhaltung der Wirtshomöostase19. Umweltstressoren, wie z. B. Verschmutzung, können auch das Korallenmikrobiom destabilisieren, was zu Dysbiose führt, die Krankheiten und Sterblichkeit verursachen kann30. Die Mechanismen, mit denen das Korallenmikrobiom die Gesundheit der Korallen unterstützen kann, beginnen sich zu zeigen. Diese Mechanismen sind der Schlüssel zum Verständnis der Korallenresistenz und Widerstandsfähigkeit gegenüber Umweltstressoren und damit zur Förderung der Persistenz und Erhaltung von Riffen. Zusätzlich, Erkenntnisse auf dem Gebiet wird dazu beitragen, allgemeine Host-Mikrobiom-Wechselwirkungen zu verstehen, die zur Entwicklung von besseren Probiotika und gesundheitsfördernde Strategien in anderen Bereichen beitragen können. Es ist auch wichtig, besser zu untersuchen, wie diese Probiotika Impfungen auf die Gesundheit des Metaorganismus während Stressereignisse stören können. Zum Beispiel, Arbeit zeigt, dass die Erhöhung in Korallen Leistung ist aufgrund der Probiotika und nicht nur die Korallen mit Bakterien als Nahrungsquelle sind immer noch benötigt.

Parallel dazu sind die Entwicklung neuer Konsortien-Lieferansätze und die Verbesserung der bestehenden von großer Bedeutung. Alternative Methoden zur Immobilisierung des Konsortiums sowie innovative Ansätze, wie die Impfung von Korallenfutter (d.h. Artemia und Fäifer) und deren Verwendung als Vektoren, sind vielversprechend. Diese Trägersysteme können auch modifiziert werden, um andere Meeresorganismen anzusprechen und werden für den Erfolg des Marineprobiotika-Feldes unerlässlich sein.

Verschmutzungsminderung und Korallenriffpersistenz sind derzeit zwei der Hauptthemen, die regelmäßig auf Umweltkonferenzen hervorgehoben werden. Die Agenda 2030, ein von den Vereinten Nationen veröffentlichtes Dokument, das die globalen Ziele beschreibt, die die Gesellschaft erreichen sollte, um eine nachhaltige Zukunft zu ermöglichen, widmet für jede Ausgabe spezifische Ziele. Während Ziel 6 die Bedeutung der Verbesserung der Wasserqualität durch Verringerung der Verschmutzung hervorhebt, verstärkt Ziel 14 die Bedeutung der Erhaltung und nachhaltigen Nutzung der Ozeane, Meere und Meeresressourcen77. In diesem Zusammenhang hängt der Schutz von Korallenriffen von Veränderungen ab, die in naher Zukunft erreicht werden sollten, einschließlich der Verringerung der Umweltverschmutzung. Dies ist von großer Bedeutung, da die meisten massiven Korallenverluste aufgetreten sind, wenn andere Faktoren zu Klimaereignissen hinzugefügt wurden, wie lokale Zerstörung und Kontamination78,79. Dieses Papier zeigte, dass es möglich ist, Bio-Remediation und pBMC-Impfung zu kombinieren, um bestimmte Schadstoffe zu abbauen, während es die Widerstandsfähigkeit und Widerstandsfähigkeit von Korallen erhöhen kann, um mit Schadstoffen und anderen Problemen umzugehen. Die Optimierung vorhandener Protokolle und/oder die Entwicklung innovativer Methoden, kombiniert oder unabhängig angewendet, wird entscheidend sein, um die Zukunft der marinen Ökosysteme zu bestimmen.

Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Forschung wurde im Zusammenhang mit dem laufenden F&E-Projekt "PROBIO-DEEP - Survey of potential impacts caused by oil and gas exploration on deep-sea marine holobionts and selection of potential bioindicators and Bio-Remediation-Prozesse für diese Ökosysteme" (UFRJ / Shell Brasil / ANP) – "PROBIO-DEEP - Levantamento de potenciais impactos causados pela exploraéo de éleo e g es em holobiontes marinhos em mar profundo e seleéo de potenciais bioindicadores e processos biorremediadores para esses ecossistemas", gesponsert von Shell Brasil im Rahmen der ANP-F&E-Abgabe als "Compromisso de Investimentos com Pesquisa e Desenvolvimento" Die Autoren danken auch Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientéfico e Tecnolégico (CNPq) und Coordenaéo de Aperfeiéoamento de Pessoal de Nével Superior (CAPES) für die finanzielle Unterstützung, und Camila Messias, Phillipe Rosado und Henrique Fragoso dos Santos, für die bereitgestellten Bilder.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
500 mL PYREX Media Storage Bottle thomas scientific/Corning 1743E20/1395-500 Used to sample water.
500 mL Aspirator Bottles thomas scientific/Corning 1234B28/1220-2X Used to separate the oil fractions.
6-inch wire cutter plier thomas scientific/Restek 1173Y64/23033 Used to cut coral fragments.
17a-Ethinylestradiol LGC Standards DRE-C13245100 Used as the only carbon source to make the selective media.
Agar Himedia PCT0901-1KG Used to make solid media.
Bushnell Haas Broth Himedia M350-500G Used as minimum media to be supplemented with carbon sources.
Erlenmeyer Flask thomas scientific/DWK Life Sciences (Kimble) 4882H35/26500-125 Used to incubate coral macerate with glass beads.
GFX PCR DNA and Gel Band Purification kit GE Healthcare 28903470 Used to purify PCR products before sending them for sequencing.
Glass Beads MP Biomedicals 1177Q81/07DP1070 Used to detach the microorganisms from coral structures.
Laminar Flow Hood Needed to work at sterile conditions.
Luria Bertani Broth, Miller (Miller Luria Bertani Broth) Himedia M1245-1KG Used as rich media to grow bacteria.
Marine Agar 2216 (Zobell Marine Agar) Himedia M384-500G Used as rich media to grow bacteria.
Orbital-Shaker Incubator Used to incubate liquid media and oil.
Plates Incubator Used to incubate plates.
Porcelain Mortar and Pestle Thomas scientific/United Scientific Supplies 1201U69/JMD150 Used to macerate coral fragments.
Qubit 2.0 Fluorometer Invitrogen Used for nucleic acids quantification of DNA and PCR products.
Refrigerated Centrifuge Used to centrifuge bacterial cultures.
Spectrophotometer Used to measure optical density of bacterial cultures.
Wizard Genomic DNA Purification kit Promega A1120 Used for microbial strains DNA extraction.

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