Ferskvands muslinge bevaring er afhængig af at overvåge arternes reproduktive mønstre og processer. Denne undersøgelse standardiserer en ikke-dødelig protokol for prøvetagning af Gill indhold, karakterisering larve udvikling, og giver en digital repository for indsamlede data. Denne protokol-databasepakke vil være et vigtigt redskab for muslinge forskere til genopretning af utætte arter.
Aktivt at overvåge timing, udvikling og reproduktive mønstre af truede arter er afgørende, når de forvalter for befolknings genopretning. Ferskvands muslinger er blandt de mest uigennemtrænget organismer i verden, men der mangler stadig oplysninger om tidlige larve (glochidial) udvikling og rugende perioder for mange arter. Tidligere undersøgelser har fokuseret på den komplekse livshistorie scene, når kvindelige muslinger er klar til at parasitisere værts fisk, men få undersøgelser har fokuseret på den ynkelige periode og timing af larve udvikling. Den protokol, der er beskrevet her, giver forskerne mulighed for ikke-dødelighed at evaluere tilstanden af graviditet for kvindelige muslinger. Resultaterne af denne undersøgelse viser, at denne metode ikke påvirker en kvindelig musling evne til at blive gravid eller blive gravid igen efter prøvetagning er udført. Fordelen ved denne metode kan gøre det muligt at anvende den på føderalt truede eller udryddelsestruede arter eller andre populationer med høj bevarings interesse. Denne protokol kan tilpasses til brug på både konserverede eller levende individer og blev testet på en række Mussel arter. Den leverede database er et opbevaringssted for en bredde af oplysninger om tidspunktet for de reproduktive vaner og vil lette fremtidens ferskvands muslinge forskning, bevaring og genopretningsbestræbelser.
Persistens af befolkninger i ferskvandssystemer afhænger af, om reproduktion og rekruttering lykkes. For parasitære organismer, identificere de snørklede af livscyklus (f. eks stadier af larve udvikling og vært attraktion strategier) kan give indsigt i en organismens reproduktive vaner og kritiske processer, der påvirker rekruttering. Sådanne oplysninger bliver vigtige, når arter er uigennemtrængede, og vellykket rekruttering er nødvendig for at opretholde de resterende populationer, eller hvis nyttiggørelse nødvendiggør brug af fangenskab formering for genetablering af udærede populationer.
Ferskvands muslinger (Bivalvia: unionida) betragtes som en af de mest utætte grupper af organismer på verdensplan, og en samling af artsspecifikke reproduktions vaner kan støtte i forskningsindsatsen1,2,3 ,4,5. Med over 800 i øjeblikket anerkendte arter fordelt over hele kloden, ferskvands muslinger har hotspots af mangfoldighed i nord-og Sydamerika, og Sydøstasien, men væsentlige livshistorie oplysninger er ukendt for mange arter2, 5,6,7. Familier inden for denne rækkefølge er karakteriseret ved at have parasitære larvestadier, at fuldføre metamorfose til fri-levende ungfisk under fastgørelse til en vært7,8. Denne unikke livshistorie fase bidrager til biodiversiteten i ferskvandssystemer, som i øjeblikket er i krise9. En høj grad af imperilment kan tilskrives mange menneskeskabte trusler, herunder forurening af vandveje, ændring og ødelæggelse af habitater, reduktioner i overflod og mangfoldighed af værts fisk, og indførelse af invasive arter1, 10. Som bentiske filter foderautomater, muslinger burrow ind i substratet og er modtagelige for forurenende stoffer og forurenende stoffer, der afløb i vandskel11. Genvinding af muslinge arter er relevant, da de giver en bred vifte af økosystemtjenester, herunder kulstofbinding, en fødekilde, og vandrensning ved filter fodring11. Desuden er det blevet konstateret, at muslingerne viser økosystemernes sundhed, fremmer biodiversiteten og igen øger robustheden af et økosystem12.
Mange ferskvands muslinge studier har fokuseret på at undersøge tidlige livshistorie krav for bedre at informere arter status vurderinger og ledelsesstrategier. De ferskvands muslinge familier, der er relevante for denne undersøgelse (f. eks. hyriidae, margaritiferidae, unionidae), har en unik livshistorie strategi, hvor hunnerne Brood larver (glochidia) i deres pungdyr Gills8. Gennem en række strategier, den kvindelige Mussel ekskluderer modne glochidia fra pungdyr Gills at parasitize en hvirveldyr vært med glochidia13. Forskning i glochidial udvikling inden for gællerne blev modificeret fra en teknik, der udnytter hypodermiske sprøjter til at prøve gonadale væske fra levende muslinger og evaluere gamet produktion14,15,16. Som forskere valideret denne ikke-dødbringende metode til gonade prøvetagning, det blev tilpasset til pungdyr Gill prøvetagning til at evaluere yngel udvikling15,16. Brood udvikling kan bruges til at dechifrere phylogenetiske relationer som nogle Mussel arter kan Brood glochidia i kun de ydre to gæller (ectobranchus), kun de indre to gæller (endobranchus), eller i alle fire gæller (tetrabranchus), men denne egenskab er ikke kendt for hver art17. Der er tidligere blevet anvendt brokodnings mønstre til at klassificere muslinge arter ved, om kvindelige muslinger Brood glochidia over vinteren (bradytictic) eller i en kort periode om sommeren (tachytictic)18. Over overvinning af muslingeyngel blev understøttet, da den reproduktive cyklus af anodonta blev undersøgt19. Men, grundlæggende reproduktive biologi blev undersøgt mere grundigt i årenes løb og fandt denne dikotomi var en grov generalisering og rugende perioder af nogle arter er langt mere komplekse end oprindeligt antaget20,21. For eksempel er arter af slægten hyridella (familie hyriidae), glebula og elliptio (Family unionidae) blevet observeret med op til tre yngel pr. avls sæson22,23, 24. Kompleksiteten af artsspecifikke, og undertiden endda befolknings specifikke20, reproduktive vaner har ført til et hul i viden om timing og varighed af brokodning, og antallet af yngel en kvindelig Mussel kan producere.
Selv om der er anvendt hypodermiske sprøjter til at udtrække Gill indhold, er rapporteringen af resultaterne kompliceret på grund af den manglende standardisering for at sikre sammenlignelige resultater på tværs af alle undersøgelser. Tidligere er der identificeret fire udviklingsmæssige stadier af glochidia (dvs. æg, embryo, umoden, fuldt udviklet) i unionidae, men de er ikke blevet vedtaget i standardprocedure16,25,26. Andre undersøgelser, som observerede medlemmer af margaritiferidae, har erstattet klassificeringen af» umoden glochidia «med» udvikling af glochidia «, hvilket fører til potentiel forvirring27,28. Den manglende sammenhæng i karakteriserende de forskellige larve udviklingsstadier har forladt mange forskere til generelt at beskrive rugende hunner som ‘ gravid ‘, som ikke omfatter snørklede af larve udvikling. Livshistorie undersøgelser gennemfører vært-fisk forsøg har prioriteret behovet for gravid kvinder med fuldt udviklet glochidia, men denne information er spredt over hele offentliggjorte og ikke offentliggjort litteratur29,30. I øjeblikket mangler der data om de reproduktive vaner af mange muslinge arter, herunder timing af overgangen mellem æg, umodne glochidia, og fuldt udviklet glochidia klar til fastgørelse til værter. For de fleste arter er det uklart, hvor længe hunnerne Brood glochidia og hvor hurtigt befrugtede æg fuldt ud udvikle. Videnshuller er ofte bredere for arter af bevaringshensyn, som præsenterer behovet for en standardiseret metode til udvinding af Gill indhold, der er blevet testet for ikke-dødelige virkninger og kan fremmes til det videnskabelige samfund for at supplere mainstream dataindsamlingsmetoder uden at udgøre en trussel mod beskyttede befolkninger24,31,32.
Denne undersøgelse havde tre mål: 1) formalisere en Gill sampling teknik og teste det for dødelige og ikke-dødbringende virkninger på kvindelig muslinger in situ, 2) karakterisere forskellige stadier af glochidial udvikling og beskrive en standardiseret metode til at identificere og rapportering af forskellige larvestadier, og 3) oprette et offentligt lager for de indsamlede data. Feltundersøgelser, langtids overvågningsprojekter og museumssamlinger repræsenterer alle muligheder for, at den her beskrevne protokol kan gennemføres, og at der indsamles yderligere data til en bredere interesse. Den formaliserede protokol indeholder visuelle elementer og tegn beskrivelser til at differentiere hver fase af larve udvikling. Ved at standardisere kategorierne kan de indsamlede resultater sammenlignes mellem alle forekomster og arter. Når data er indsamlet, kan alle indsendes til ferskvands Mussel graviditet Almanac (FMGA), som er en database for graviditet oplysninger indsamlet ved hjælp af denne protokol. Et endeligt produkt til at gemme og kompilere alle de graviditet indsamlede oplysninger vil give et forskningsværktøj til at lette fremtidige forskning, bevaring og nyttiggørelse indsats. Indarbejdelsen af denne metode i forskellige Mussel-projekter og indsendelse af data til FMGA vil udvide den brede viden om Mussel arters graviditetsstatus i løbet af året. Denne protokol og den resulterende database om ferskvands muslenes reproduktive vaner er som en meget uigennemtrænget gruppe af organismer afgørende for at forstå befolkningens dynamik og lette bevarelsen af disse arter.
Betydning
Bevarelsen af ubeskyttede arter afhænger af en vellykket rekruttering inden for de eksisterende populationer. I nogle tilfælde kan kunstig formering være nødvendig for at forøge rekrutteringen af disse udsatte populationer. Dette kræver, at forskerne informeres om tidspunktet for aktiv reproduktion for hver art og eventuelt anvender forskellige metoder eller ledelsespraksis for at afbøde indvirkningen på rekrutteringen. Som en mest gruppe af organismer, er det altafgørende at etablere en standardiseret og ikke-dødelig tilgang til at studere reproduktive vaner, og at tilvejebringe en platform, hvor at indsamle og visualisere data til at informere det videnskabelige samfund med den mest up-to-date tilgængelige oplysninger. Denne undersøgelse indeholder en trin-for-trin-protokol for at sikre, at der træffes forholdsregler, og at Gill-indholdet kan udtages på passende vis og evalueres fra kvindelige muslinger. Denne protokol blev testet for dødelige og ikke-dødelige virkninger, så forskere og ledere til ansvarligt at implementere denne metode. Vi har også udviklet en række database styringsværktøjer og-programmer, der letter indsamlingen af graviditetsoplysninger på et offentligt tilgængeligt, brugervenligt Dashboard. Undersøgelser af epidemiologi, glochidia morfologi, livshistorie, fylogenetik, formering, og omplaceringer kan alle gavne og udnytte denne repository af tidsmæssige graviditet information for alle arter af ferskvands muslinger.
Denne undersøgelse alene støttede tidligere undersøgelser ‘ fund af nogle arter reproduktive vaner, men også afsløret nye oplysninger om andre. Selv om v. vibex blev indsamlet i færre tal end v. lienosa, ligheder kan findes mellem de to baseret på graviditet data. Begge arter af villosa synes at Brood fuldt udviklet glochidia i en stor del af året, som karakteriserer dem som en overvintrer brooder. Dette er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser af andre villosa arter43,44,45. Resultaterne af denne undersøgelse tyder på H. Australis kan findes gravid fra oktober og overvintrer til juni, undtagen ingen fanger blev fundet gravid i december. En tidligere offentliggjort undersøgelse identificerede kongener H. altilis med en graviditet periode på fire måneder, marts til juni46,47. Denne konstatering illustrerer en længere graviditets periode end tidligere antaget og generelt grupper H. Australis som en overvintrer brooder. Som føderalt beskyttede arter kan varierende yngletid for h. altilis og h. Australis påvirke ledelsens beslutninger for bedre at beskytte befolkningerne under reproduktivt aktive tider. Elliptio pullata blev kun fundet gravid med æg i maj og juni, hvilket svarer til deres karakterisering som en tachytictic art med en meget kort fordærvnings periode24,48,49, 50. Som data er udarbejdet på Elliptio arter ved hjælp af denne protokol, kan detaljerede oplysninger gøre felt indsats mere effektiv, når visse glochidial udviklingsstadier er målrettet, da glochidia kun findes et par måneder ud af året. Slutninger fra de andre arter med lavere stikprøvestørrelser er begrænsede, men da data indsamles i databasen, vil højere stikprøvestørrelser give indblik i de reproduktive vaner for yderligere muslinge arter.
Proceduremæssige bemærkninger
Ferskvands muslinger og deres glochidia er kendt for at være modtagelige for menneskeskabte stressorer10,35. Ved graviditetsinspektion kan Mussel ventilerne ikke være nemme at åbne, og uforsigtigt at tvinge ventilerne åbne kan forårsage utilsigtet skade og resultere i stress eller dødelighed. Nogle skrøbelige-afskallede arter (f. eks arter af Anodonta, leptodea, utterbackia, etc.) og mindre store individer kan have meget skrøbelige skaller og svage adductor muskler, der kan bryde og rive let. Gill-prøvetagning kan betragtes som en stressor, hvis håndteringen ikke udføres ansvarligt og med forsigtighed. En tidligere undersøgelse viste, at håndtering og luft eksponering af muslinger under reproductivt aktive tider kan forårsage forskellige fysiologiske belastninger, herunder for tidlig frigivelse af Gill indhold34. Men en undersøgelse, der udnytter en lignende metode som beskrevet her, fandt håndtering gravid kvindelige muslinger under Gill sampling ikke afbryde den nuværende yngel eller forårsage for tidlig frigivelse i både kort-og lang sigt yngleart16. Desuden skal der anvendes en steril sprøjte i løbet af denne protokol for at forhindre utilsigtet infektion eller krydskontaminering ved punktering af flere personer. Desuden er glochidia skrøbelige og yngel kan modnes og stressede, men ikke udvist. Ældre glochidia i dårligt helbred kan resultere i færre individer reagerer på salt tests35. Ved sondringen mellem GD (T) og FDG (T) er det vigtigt at foretage en salt test med en stor stikprøvestørrelse, at notere sig observationer for nøje at identificere sondringer mellem GD og FDG glochidia ved hjælp af beskrivelserne i denne undersøgelse. Når der tages ordentlig pleje, den minimale stress induceret af denne procedure kan gøre det muligt for kvindelige muslinger til at fortsætte rugende glochidia naturligt og reducere virkningerne på rekruttering i befolkningen.
Yderligere data kan optages for at supplere databasen og give en bred sammenhæng for de reproduktive vaner af ferskvands muslinger. Nogle arter (f. eks arter af Fusconaia), er blevet observeret for at have gyller af forskellige farver baseret på udviklingen fase af glochidia51. Under en indledende graviditet kontrol af kvinden, en beskrivelse af Gill farve kan indgå i de rapporterede data for at muliggøre fremtidig undersøgelse. Også på dette punkt i protokollen, kan forskerne konstatere, om den brokodning kvinde blev fundet rugende glochidia i de to ydre gæller (ectobranchus), to indre gæller (endobranchus), eller alle fire gæller (tetragenous)17. Disse oplysninger kan tilføjes til FMGA og hjælpe med at udfylde datahuller vedrørende fokodning for hver art, der undersøges. Miljøforhold, specifikt vandtemperatur, kan opsamles og registreres i marken for en mere omfattende observation af graviditet status og timing af arter i forskellige bredde-intervaller. Forskning viser, at miljøparametre, såsom temperatur, fotoperiode, strømningshastighed og fødevaretilgængelighed, kan fremkalde reproduktive hændelser i ferskvands muslinger52,53,54,55 ,56. Der kan tilføjes yderligere felter til databasen, da de indsendes for at fremme fremtidig forskning i abiotiske faktorer, der påvirker graviditeten. En Capture-Mark-recapture modifikation modelleret efter vores undersøgelse kan også føjes til denne protokol, som vil give forskerne mulighed for at overvåge en bestemt Mussel reproduktive vaner og afsløre oplysninger om flere kuld om året.
Nøjagtigheden af oplysningerne i FMGA afhænger af kilden. F. eks. er fejlidentifikation af ferskvands muslinger almindelig på grund af mange arter med lignende ydre karakteristika, som gør det vanskeligt at skelne mellem arterne57. En Gill-prøve fra en forkert identificeret person kan skabe forvirring og urigtige oplysninger om en Arts yngletid. Hvis der udtages en Gill-prøve, skal der tages fotografier af indersiden af begge ventiler (hvis personen ikke er i live), uden for højre ventil, og umbo (hængsel, hvor to ventiler tilsluttes) og indsendes med graviditetsdata via desktop-webstedet eller mobilapplikationen. Vi glæder os også over billeder af Gill indholdet. Inden for Indsendelses formularerne findes en rullemenu, der gør det muligt for opkøberen at angive deres konfidensniveau med hensyn til identifikation af arterne. Før registreringen valideres, vil disse oplysninger blive taget i betragtning ved kontrol af opsamler identifikation i forhold til plausibel distribution osv. På grund af den høje grad af intraspecifik morfologiske variation i arter af Unionidae tilskyndes der til indsendelse af vævsprøver, og det kan være nødvendigt for at lette Molekylær identifikation.
Fremtidige konsekvenser
Som en ikke-dødelig metode, denne protokol kan anvendes til både fælles og mest arter. Graviditetskalenderne for ubeskyttede arter kan hjælpe bevarings ledere, der er involveret i lovgivning om udryddelsestruede arter og genopretningsplanlægning, ved at give oplysninger om tidsperioder, hvor arterne er reproduktivt aktive. De statslige og føderale agenturer, der forvalter udsatte arter kan bedre rådgive tilladelse tildelinger til tidspunkter, hvor arten ikke er sårbar og reproduktion, og endda begrænse høsten af værts fisk i løbet af gange muslinger er rugende fuldt udviklet glochidia. Desuden kan feltundersøgelser målrette arter i ikke-reproduktive perioder for at minimere indvirkningen på rekrutteringsprocesserne. Den offentligt tilgængelige database, FMGA, er et redskab for forskere og ledere til at opnå vigtige reproduktive oplysninger om alle målferskvands muslinge arter. Databasen vil også fremhæve huller i dataene og tilskynde til yderligere forskning i artsspecifikke brokodnings mønstre. Da forståelse af en Arts reproduktive mønster giver mulighed for passende ledelsesbeslutninger, der skal gennemføres, håber vi, at vores protokol og database letter fremtidig ferskvands muslinge forskning, bevaring og nyttiggørelse.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke finansieringskilderne: U.S. Fish and Wildlife Service og U.S. Geological Survey. En særlig tak til Andrew hartzog og Sandra Pursifull for at organisere felt besætninger og dataindsamling, sammen med Lauren Patterson og Chris Anderson for deres værdifulde bidrag til database udvikling. Vi vil også gerne takke alle, der hjalp i marken og laboratoriet, herunder sherry Bostick, Mark Cantrell, Sahale Casebolt, Jordan Holcomb, Howard Jelks, Gary Mahon, John McLeod, Kyle Moon, Cayla Morningstar, Emma Pistole, Matt Rowe, Channing St. Aubin og Jim Williams. Enhver brug af handels-, firma-eller produktnavne er kun til beskrivende formål og indebærer ikke godkendelse fra den amerikanske regering.
1.5 mL snap cap centrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5510 | Snap cap tubes are important in the field so the loose screw cap is not lost. |
20 G needle on 10 mL disposable syringe | Exelint International | 26255 | sterile 10 mL disposable syringe with needle Model: 10ml Luer Lock Tip W/20G X 1 1/2" |
Dissecting Microscope | any | any | |
Marking Pen | Fisher Scientific | 13-379-4 | This is what we used but any marker that can write on small plastic tubes will do. This one is fairly ethanol and water proof. |
Molecular grade ethanol | any | any | Needed if preserving gill contents. Non-denatured 95% is needed for genetic work, 70% is needed for SEM imaging work. |
Paper | any | any | Needed to record information on samples collected. |
Pen/pencil | any | any | If in the field, better to write on waterproof paper with pencil so it doesn't smear. If in the museum/lab, any writing utensil is fine. |
Petri dish | DWK Life Sciences (Kimble) | 23000-9050 | This is what we used but any petri dish available is fine. It is nicer to have the taller walls in case too much water is used. |
Sodium Chloride | any | any | Needed for NaCl test for reactive glochidia. Preserved samples do not need this. |
Speculum | any | any | Only needed if you want help opening the valves of a live mussel. |
Sterile water | any | any | Added to gill samples to be evaluated for reactivity within 24 hours of collection. |
Super glue | Gorilla | Gorilla super glue gel | Used to apply tags and only needed if conducting a capture-mark-recapture study. |
Tags | Hallprint | FPN 8×4 | Only needed if conducting a capture-mark-recapture study. |
Transfer Pipet | Thermo Scientific Samco | 225 | This is what we use but any transfer pipet or squirt bottle is applicable. |
Tweezers | any | any | Needed to move crystals of NaCl for salt test. Preserved samples do not need this. |
Waterproof paper | RainWriter | any | Only needed if conducting work in the field. This allows you to record information on each individual gill contents are extracted from. |
Wooden pick | any | any | Only needed if you want help opening the valves of a live mussel. |