Biology

توحيد طريقه غير مميته لتوصيف الحالة الانجابيه وتنميه اليرقات من بلح المياه العذبة (Bivalvia: النقابات)

Published: October 4, 2019 doi: 10.3791/60244

Caitlin E. Beaver¹, Susan R. Geda², Nathan A. Johnson¹

¹Wetland and Aquatic Research Center, United States Geological Survey, ²Garcon Point Aquatic Research Center, Florida Fish and Wildlife Conservation Commission

Summary

ويعتمد حفظ بلح الماء في المياه العذبة علي رصد أنماط التكاثر وعمليات الأنواع. ويوحد هذه الدراسة بروتوكولا غير فتاك لأخذ عينات من محتويات الجيل ، وتوصيف تنميه اليرقات ، وتوفير مستودع رقمي للبيانات المجمعة. ستكون حزمه قاعده البيانات هذه أداه هامه للباحثين عن بلح الهواء في استعاده الأنواع المهددة بالانقراض.

Abstract

ويعد الرصد النشط لتوقيت الأنواع المهددة بالانقراض وتطورها وأنماطها الانجابيه أمرا بالغ الاهميه عند الاداره من أجل انتعاش السكان. بلح المياه العذبة هي من بين أكثر الكائنات الحية المهددة بالانقراض في العالم ، ولكن لا تزال هناك نقص في المعلومات حول التنمية المبكرة وفترات الاطاله للعديد من الأنواع. وقد ركزت الدراسات السابقة علي مرحله تاريخ الحياة المعقدة عندما بلح النساء علي استعداد لتطفل الأسماك المضيفة ، ولكن القليل من الدراسات ركزت علي فتره المكتئب وتوقيت التنمية اليرقات. البروتوكول الموصوف هنا يسمح للباحثين لغير قاتل بتقييم حاله الجاذبية لبلح النساء الإناث. وتبين نتائج هذه الدراسة ان هذه الطريقة لا تؤثر علي قدره بلح العين الإناث علي البقاء البيض أو تصبح البيض مره أخرى بعد ان تم اجراء أخذ العينات. وقد تسمح ميزه هذه الطريقة باستخدامها في الأنواع المهددة أو المهددة بالانقراض علي المستوي الاتحادي أو غيرها من السكان الذين لهم اهميه كبيره في حفظ البيئة. ويمكن تكييف هذا البروتوكول لاستخدامه علي كل من الافراد المحفوظة أو الحية وتم اختباره علي مجموعه متنوعة من أنواع البلح. وقاعده البيانات المقدمة هي مستودع للمعلومات المتعلقة بتوقيت العادات الانجابيه ستيسر البحوث المقبلة لبلح البحر العذب والحفظ وجهود الإنعاش.

Introduction

ويتوقف استمرار السكان في شبكات المياه العذبة علي نجاح الإنجاب والتجنيد. النسبة للكائنات الطفيلية ، فان تحديد تعقيدات دوره الحياة (مثل مراحل تنميه اليرقات واستراتيجيات جذب المضيفين) يمكن ان يعطي فكره عن عادات الكائن الحي الانجابيه والعمليات الحرجة التي تؤثر علي التوظيف. وتصبح هذه المعلومات مهمة عندما تتعرض الأنواع للخطر ، وهناك حاجه إلى التوظيف الناجح لأعاله السكان المتبقيين ، أو إذا كان الانتعاش يتطلب استخدام الانتشار الاسري لأعاده إنشاء السكان الذين تم الإمساك بهم.

بلح البحر العذب (bivalvia: النقابات) تعتبر واحده من أكثر المجموعات التي تتعرض للخطر من الكائنات الحية في جميع انحاء العالم ، وتجميع العادات الانجابيه الخاصة بالأنواع يمكن ان تساعد في جهود البحث¹^،²^،³ ^،⁴^،⁵. مع أكثر من 800 الأنواع المعترف بها حاليا موزعه في جميع انحاء العالم ، وبلح المياه العذبة لديها بؤر التنوع في أمريكا الشمالية والجنوبية ، وجنوب شرق اسيا ولكن المعلومات الاساسيه تاريخ الحياة غير معروف لكثير من الأنواع²^، ⁵^،⁶^،⁷. وتتميز الأسر في هذا الأمر بوجود مراحل اليرقات الطفيلية التي التحول الكامل إلى الاحداث الذين يعيشون مجانا اثناء التعلق إلى المضيف⁷^,⁸. وتسهم هذه المرحلة الفريدة من تاريخ الحياة في التنوع البيولوجي في نظم المياه العذبة ، التي توجد حاليا في ألازمه⁹. ويمكن ان تعزي المستويات العالية للخطر إلى العديد من التهديدات البشرية المنشا ، بما في ذلك تلوث المجاري المائية ، وتغيير الموائل وتدميرها ، وتخفيض وفره وتنوع الأسماك المضيفة ، وإدخال الأنواع الغازية¹^، ¹⁰-الآن وبوصفها مغذيات الفلتر القاعيه ، فان المحار الذي يدفن في الركيزة وعرضه للملوثات والملوثات التي تستنزف المستجمعات المائية¹¹. ومن المناسب استعاده أنواع بلح البحر لأنها توفر مجموعه واسعه من خدمات النظم الايكولوجيه ، بما في ذلك عزل الكربون ، ومصدر الغذاء ، وتنقيه المياه بواسطة التغذية بالفلتر¹¹. الاضافه إلى ذلك ، تبين ان بلح الهواء يشير إلى صحة النظام الايكولوجي ، ويعزز التنوع البيولوجي ، ويزيد بدوره من مرونة النظام الايكولوجي¹².

وقد ركز العديد من دراسات بلح المياه العذبة علي التحقيق في متطلبات تاريخ الحياة المبكرة لتحسين تقييم حاله الأنواع واستراتيجيات الاداره. الأسر بلح الماء العذبة ذات الصلة بهذه الدراسة (علي سبيل المثال ، hyriidae ، margaritiferidae ، النقابات) لديها استراتيجية تاريخ حياه فريدة من نوعها حيث الإناث الحضنه اليرقات (glochidia) في الخياشيم جرابي بهم⁸. من خلال مجموعه متنوعة من الاستراتيجيات ، والإناث البلح يطرد الكابه الناضجة من الخياشيم جرابي لتطفل مضيف فقاري مع glochidia¹³. تم تعديل البحوث المتعلقة بتطوير glochidial داخل الخياشيم من تقنيه باستخدام المحاقن هيبوديرميك لعينه السائل الغدد التناسلية من بلح البحر الحية وتقييم إنتاج الامشاج¹⁴^,¹⁵^,¹⁶. كما الباحثين التحقق من صحة هذه المنهجية غير الفتاكة لأخذ العينات غدد ، تم تكييفه لأخذ العينات جيل جرابي لتقييم التنمية الحضنه¹⁵^،¹⁶. ويمكن استخدام التنمية الحضنه لفك العلاقات الوراثية كما يمكن لبعض أنواع البلح الحضنه glochidia في الخياشيم اثنين فقط الخارجي (ectobranchus) ، فقط الخياشيم الداخلية اثنين (endobranchus) ، أو في جميع الخياشيم الاربعه (tetrabranchus) ولكن هذه الخاصية ليست المعروف عن كل الأنواع¹⁷. وقد استخدمت في السابق أنماط المكتئب لتصنيف أنواع بلح الشكل من قبل ما إذا كانت الإناث بلح المحار الحضنه علي الشتاء (برادتيتيك) أو لفتره قصيرة في الصيف (تسرع اليد)¹⁸. تم دعم الإفراط في فصل الشتاء من أحضان بلح القدم عندما تمت دراسة الدورة الانجابيه من انونتيتا ¹⁹. ومع ذلك ، تمت دراسة البيولوجيا الانجابيه الاساسيه بشكل أكثر شمولا علي مر السنتين ووجدت ان هذا الانقسام هو التعميم الإجمالي وفترات المكتئب من بعض الأنواع هي أكثر تعقيدا بكثير مما كان يفترض في الأصل²⁰^،²¹. علي سبيل المثال ، وقد لوحظ الأنواع من جنس hyridella (الاسره hyridella) ، glebula ، والبيضاوي (الاسره النقابية) مع ما يزيد عن ثلاثه أحضان لكل موسم التكاثر²²^،²³^، ²⁴-الآن وقد أدت العادات الانجابيه الخاصة بأنواع معينه ، وأحيانا حتى²⁰من السكان ، إلى وجود فجوه في المعرفة بتوقيت ومده أطاله التفكير ، وعدد المواد التي قد تنتجها بلح النساء.

وعلي الرغم من استخدام المحاقن الناقصة لاستخراج محتويات الجيل ، الا ان الإبلاغ عن النتائج معقد بسبب عدم التوحيد لضمان تحقيق نتائج مماثله في جميع الدراسات. في السابق ، تم تحديد أربع مراحل تنموية من غلوتشيديا (اي البيض والاجنه وغير الناضجة والمطورة بالبالكامل) في النقابات ولكن لم يتم اعتمادها في الإجراءات العادية¹⁶^،²⁵^،²⁶. وقد استبدلت الدراسات الأخرى التي رصدت أعضاء الشركة بتصنيف "غلوتشيديا غير الناضجة" بعبارة "تطوير غلوتشيديا" ، مما ادي إلى احتمال حدوث ارتباك²⁷^و²⁸. وقد ترك عدم الاتساق في توصيف مراحل التنمية اليرقات المختلفة العديد من الباحثين لوصف عموما الإناث المكتئب بأنها ' gravid ' ، والتي لا تشمل تعقيدات التنمية اليرقات. دراسات تاريخ الحياة اجراء تجارب الأسماك المضيفة وقد أعطيت الاولويه للحاجة إلى الإناث البيض مع glochidia المتقدمة بالبالكامل ، ولكن هذه المعلومات متناثرة في جميع انحاء نشرت وغير منشوره الأدب²⁹^،³⁰. حاليا ، تفتقر البيانات عن العادات الانجابيه للعديد من أنواع بلح المعدة ، بما في ذلك توقيت الانتقال بين البيض ، والglochidia غير ناضجه ، والتي وضعت تماما glochidia جاهزه للحاق المضيفين. بالنسبة لمعظم الأنواع ، فمن غير الواضح كم من الوقت الإناث الحضنه جلوتشيديا وكيف البيض المخصبة بسرعة تتطور تماما. وغالبا ما تكون الفجوات المعرفية أوسع نطاقا بالنسبة للأنواع التي تثير القلق في مجال الحفظ ، وهو ما يعرض الحاجة إلى طريقه موحده لاستخراج محتويات الجيل التي اختبرت للتاثيرات غير الفتاكة ويمكن ترقيتها إلى الأوساط العلمية لتكمله تعميم منهجيات جمع البيانات ، دون ان تشكل تهديدا للسكان المحميين²⁴^،³¹^،³².

وكان لهذه الدراسة ثلاثه أهداف: 1) إضفاء الطابع الرسمي علي تقنيه أخذ عينات الجيل واختبارها للتاثيرات المميتة وغير الفتاكة علي بلح النساء في الموقع ، 2) تميز المراحل المختلفة لتطوير الglochidial ووصف طريقه موحده لتحديد الإبلاغ عن مراحل اليرقات المختلفة ، و 3) إنشاء مستودع عام للبيانات التي تم جمعها. وتمثل الدراسات الاستقصائية الميدانية ومشاريع الرصد الطويلة الأجل ومجموعات المتاحف فرصا للبروتوكول الموصوف هنا لتنفيذه وجمع بيانات اضافيه لمجموعه أوسع من الاهتمامات. ويشمل البروتوكول الرسمي المرئيات وأوصاف الأحرف للتمييز بين كل مرحله من مراحل تطوير اليرقات. ومن خلال توحيد الفئات ، يمكن مقارنه النتائج المحصلة بين جميع الحوادث والأنواع. وبمجرد جمع البيانات ، يمكن تقديمها جميعا إلى التقويم الوزني لبلح المياه العذبة (FMGA) ، وهو قاعده بيانات للمعلومات المتعلقة بالجاذبية التي تم جمعها باستخدام هذا البروتوكول. سيوفر المنتج النهائي لتخزين وتجميع جميع المعلومات المتعلقة بالجاذبية أداه بحثيه لتسهيل جهود البحث والحفظ والتعافي في المستقبل. ومن شان إدماج هذه المنهجية في مختلف مشاريع بلح العين وتقديم البيانات إلى المركز ان يوسع نطاق المعرفة المتعلقة بحاله الجاذبية لأنواع بلح العين علي مدار السنه. ويعتبر هذا البروتوكول وقاعده البيانات الناتجة عن العادات الانجابيه لبلح المياه العذبة ، بوصفهما مجموعه من الكائنات الحية التي تتعرض لخطر شديد ، أمرا أساسيا لفهم ديناميات السكان وتيسير حفظ هذه الأنواع.

Protocol

1. جمع الإناث gravid

ملاحظه: الاشاره إلى بروتوكول المسح الخاص ببلح المياه العذبة في دائره الأسماك والاحياء البرية³³ للتوجيه بشان كيفيه اجراء مسح كاف لموقع أخذ العينات للأنواع المهددة أو المهددة بالانقراض. ويجب الحصول علي التصاريح الاتحادية المناسبة قبل الجمع الميداني للأنواع المحمية وتصاريح الدولة لجميع الأنواع الموجودة.

جمع بلح الهواء الحية من الميدان باستخدام طرق اللمس والبصرية (الخطوة 1.2) أو الاستفادة من العينات المحفوظة من متحف (الخطوة 1.3).
ملاحظه: من المهم للحفاظ علي بلح الهواء الحي بارده والرطب بعد جمع لمنع الجفاف والحد من الإجهاد ، والحد الأدنى من التعامل مع بلح المحار هو المهم لتجنب الإناث قبل الأوان الإفراج عن محتويات جيل³⁴.
تقييم الجاذبية الانثويه اما عن طريق الفحص البصري اثناء الجمع (علي سبيل المثال ، وجود إغراء عباءة ، التراص ، الخ) أو عن طريق التفتيش البصري بعد جمع (علي سبيل المثال ، المتطفلين بلطف الصمامات المفتوحة بما فيه الكفاية للنظر في الداخل ومعرفه ما إذا كان تضخم الخياشيم ، انظر الشكل 1).
ملاحظه: الأنواع تختلف في كيفيه حضن glochidia داخل الخياشيم جرابي كما في بعض الأحيان فقط الخياشيم الخارجي اثنين (ectobranchus) ، فقط الخياشيم الداخلية اثنين (اندوبورانكوس) ، أو كل الخياشيم الاربعه (tetragenous) هي جرابي¹⁷. يمكن ان يكون البروتوكول متوقفا هنا ، ويمكن نقل الإناث البيض إلى المختبر لأخذ عينات الجيل.

الشكل 1: المتطفلين بلطف الافراد المفتوحة. للتحقق من الجاذبية من بلح الهواء الحية ، نقب بلطف فتح الصمامات مع الإبهام (ا) أو استخدام بحذر منظار أو كماشة عكسية لنقب فتح الصمامات (ب). مراجعه الخطوة 2.3 في البروتوكول للتحذيرات المقترنة بهذا الأسلوب. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

اجراء فحص بصري علي العينات المحفوظة عن طريق فتح الصمامات وفحص الخياشيم لتحديد ما إذا كان الفرد انثي جرافويه (الشكل 2).

الشكل 2: كيفيه تحديد الإناث المتعطشات. تظهر الخياشيم الانثويه المرثية تضخم عندما تكون الأنثى البيض والمكتئب. تظهر الصور A و C خياشيم من المنظور الجانبي في حين ان الصور B و D توفر رؤية بطنيه لخياشيم. المربعات الحمراء الخطوط العريضة الخياشيم لتسليط الضوء علي الاختلافات بين البيض (a/B) وليس البيض (C/D) الإناث lampsilis straminea بلح المحيط. ويبلغ مجموع أطوال الافراد 79 مم (ا/ب) و 88 مم (ج/د). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

2. أخذ عينات المحتوي جيل

ملاحظه: يمكن تكييف هذا البروتوكول ما إذا كان أخذ العينات يحدث علي بلح الهواء الحية في الميدان والمختبر ، أو علي العينات المحفوظة.

اعداد 1.5 mL البلاستيك أنبوب جمع الطرد المركزي المجهرية مع ما يقرب من 1 مل من المياه المعقمة إذا سيتم تقييم محتويات جيل في غضون 24 ساعة من استخراج³⁵ أو الايثانول (etoh) إذا كان تقييم العينة لا يمكن ان يحدث في غضون 24 ساعة من جمع أو إذا جيل المحتويات هي من عينه المتحف المحفوظة في EtOH. إذا كانت الغاية glochidia لمسح المجهر الكترون (SEM) التصوير ، واستخدام 70 ٪ EtOH ، وإذا كان سيتم استخدام glochidia للاختبارات الجينية ، واستخدام غير denatured 95 ٪ EtOH³⁶.
أزاله التفاف ورقه واحده معقمه 20 G شطبه غيض ابره علي حقنه 10 مل. فك الغطاء لفضح الابره واعداد أنبوب من البلاستيك 1.5 mL لجمع المحتوي جيل. دفع مقبض الحقنه علي طول الطريق حتى سداده سوداء هو في 0 mL/cc خط.
ملاحظه: يجب استخدام حقنه معقمه في كل مره يتم فيها أخذ عينات من محتويات الجيل. ويمكن تعقيم حقنه المستخدمة في الميدان عن طريق غمس غيض في محلول التبييض 10 ٪ ، ثم الشطف حقنه عن طريق ملء مع 1 مل من الماء المعقم والاكتئاب الغطاس مره أخرى إلى 0 mL/cc ، وأخيرا تجفيف حقنه مع قطعه قماش نظيفه.
التقاط الإناث البيض ونقب بلطف فتح الصمامات اثنين باستخدام نصائح من الإبهام.
تحذير: كن حذرا لعدم إيذاء الحيوانية. فتح الصمامات واسعه جدا أو سريعة جدا يمكن ان تفرط في مقرب العضلات وتسبب الوفاات. العينات الرقيقة (مثل الأنواع من الاندونتا، ليبتوديا، ألفاظ، الخ) والافراد الشباب هم الضعفاء بشكل خاص في هذه الخطوة. وقد يؤدي التعامل بقوة مع الأنواع الهشة إلى كسر القذائف والتسبب في الوفاات. في بعض الحالات ، والضغط علي الماشية رقيقه قصفت من هوامش قذيفة الامامي والخلفي ، في حين تبحث في السطح البطني ، وسوف يسبب قذيفة لثني وتثاءب قليلا ، مما يسمح لأحد لمراقبه الخياشيم أو نقب فتح القذائف وتجنب الاضرار الهشة قذيفة الهامش.
ملاحظه: يمكن استخدام أدوات للمساعدة في هذه الخطوة ولكن يمكن أيضا ان يسبب وفيات إذا لم تستخدم مع الرعاية وينبغي تجنبها كلما كان ذلك ممكنا. علي سبيل المثال ، يمكن استخدام منظار أو مجموعه تعديل من كماشة عكسية للمساعدة في نقب الفرد مفتوحة ويمكن استخدام اسفين للمساعدة في دعم الصمامات المفتوحة. وقد لا تكون هذه الصكوك ضرورية إذا كان شخص آخر متاحا للمساعدة (اي شخص واحد يحمل الحيوانية مفتوحة في حين ان آخر مناورات حقنه لاستخراج). اتلاف أو فصل النسيج العباءة من العزلة يمكن ان يسبب تشوات النمو والوفاات³⁷. ولذلك ، فمن المهم لتجنب قطع الاتصال بين الانسجه عباءة والهامش الخارجي لقذيفة.
استخدام الابره غيض من حقنه لاختراق بلطف أنبوب مياه واحده من جيل مرسويال متضخمة. بعد ذلك ، مغرفة برفق محتويات الجيل من خلال استخدام غيض مشطوف من الابره.
ملاحظه: محتويات جيل عاده ما يكون الاتساق حليبي الأبيض ، والتي ينبغي ان تكون مرئية علي غيض مشطوف من الابره.
1. قم بإيداع محتويات الحقنه مباشره في طبق بيتري إذا كان المجهر متاحا بسهوله. خلاف ذلك ، تخزين المحتويات في أنبوب الطرد المركزي البلاستيكية 1.5 mL مع السائل المعين (انظر الخطوة 2.1) للتقييم في وقت لاحق.
  ملاحظه: الحد من اضطراب والتعامل مع عينات glochidia اثناء النقل لتجنب الضرر وانخفاض القدرة علي البقاء³²^،³⁵.
سجل معلومات عن تحديد جنس الأنواع ، وحاله الجاذبية ، وطول الإناث (مم) ، وجمع المعلومات والاتصال ، والدولة ، والمقاطعة ، والصرف الصحي ، وموقع مجموعهمحدده ، وخط العرض وخط الطول ، ومعرف فريد لجيل عينه ، ومعرف فريد لموقع الاستطلاع ، وتاريخ الجمع إذا تم استخراج محتويات الجيل (الشكل 3). تسجيل معرف فريد علي كل وعاء تجميع لضمان سجلات بيانات دقيقه اثناء النقل.
1. تصوير الصمام الأيمن الخارجي من بلح الهواء للتحقق من صحة الهوية وتشمل الأنبوب المسمي بالمعرف الفريد المقروء في الصورة. وبشكل اختياري ، جمع المعلمات غير الحيوية والاحيائيه الأخرى لتكمله المعلومات المتعلقة بالبيئة والمجتمع تم العثور علي بلح المحيط في (انظر الشكل 3 للحصول علي اقتراحات).

الشكل 3: مثال لورقه بيانات الجاذبية الميدانية. ومن الضروري الإبلاغ عن البيانات بدقه إذا أخذت عينه من الجيل لإنتاج معلومات موثوق بها. وهذا مثال لورقه بيانات الحقل مع الحد الأدنى من الحقول والمعلمات اللااحيائيه الاضافيه التي سيتم جمعها مع كل عينه من الجيل. لمزيد من المعلومات الشاملة ، يرجى الاطلاع علي الخطوة 4.1 في البروتوكول. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

3-التقييم المختبري لمحتويات الجيل

إذا كانت محتويات جيل في أنبوب 1.5 mL ، نقلها إلى طبق بيتري وملء الجزء السفلي من الطبق مع الماء. دوامه بلطف طبق بيتري في حركه دائريه لجمع المحتويات في وسط الطبق لعرض أكثر تركيزا من العينة.
ملاحظه: أنبوب 1.5 mL قد تحتاج إلى مسح باستخدام زجاجه بخ أو نقل ماصه pipet-x مليئه بالماء إذا كانت محتويات جيل التمسك الجدران أنبوب.
ضع طبق بيتري تحت المجهر تشريح لتقييم العينة. إذا كان ذلك ممكنا ، التقط صوره لعينه الجيل تحت المجهر وقم بتسميتها بالمعرف الفريد لتلك العينة.
1. نتائج قياسيه من المراحل التنموية الموجودة في كل عينه من الجيل. استخدام الشكل 4 كدليل لتوصيف كل مرحله تنموية. في بعض الحالات ، قد تكون الإناث المكتئب اليرقات في مراحل تنموية متعددة ؛ ولذلك ، الإبلاغ عن كل مرحله التنمية التي لوحظت في عينه معينه (علي سبيل المثال ، ' بيضه/DG/IMG/FDG '). وبمجرد تقييم الغلوشيديا المحفوظة ، انتقل إلى القسم 4. إذا تم التعرف علي glochidia المتقدمة بالبالكامل ولم يتم استخدام EtOH للحفاظ علي ، انتقل إلى الخطوة 3.3.
  ملاحظه: البيض ، الجماهير البيض. DG, يطور [غلوكيديا]; IMG ، غلوتشيديا غير ناضجه. FDG ، التي وضعت بالبالكامل glochidia.

الشكل 4: تمثيلات لمراحل مختلفه من التطور الكئيب في الخياشيم المرثية. (ا) الكتل البيض (البيض) لديها غشاء الذي يجعل البيض تتجمع معا. داخل كل غشاء بيضه هناك كتله كرويه مبهمه من الخلايا التفريق. قد تنقسم الكتلة الكروية غير الشفافة إلى كتل كرويه متعددة اثناء انقسام الخلايا المبكرة ولكن يجب ان يتم تسجيلها كبيضه حتى يتم ملاحظه شكل الصمام الفريد. (ب) غلوتشيديا غير الناضجة (IMG) لديها كتله فريدة علي شكل الصمام الموجودة داخل غشاء البيض. (ج) النامية glochidia (المديرية العامة) لديها شكل الصمام المميز ، لا غشاء البيض ، والانسجه غير المنظم داخل ، في كثير من الأحيان غامض في المظهر. لا تعد الاصابه بالكابه النامية رد فعل عند التعرض ل NaCl وتصنف علي انها "DG (T)" عند تسجيل البيانات. (د) glochidia المتقدمة بالبالكامل (fdg) لديها شكل الصمام المميز وواضحة مقرب انسجه العضلات السماح للششديه لإغلاق. وكثيرا ما لوحظت glochidia المتقدمة (FDG) واثنين من الصمامات المفتوحة بعد الحفاظ عليها. سيتم عاده إغلاق اثنين من الصمامات المفتوحة ، أو المفاجئة المفتوحة والمغلقة ، عند التعرض ل NaCl وتصنف علي انها ' FDG (T) '. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

اجراء اختبار كلوريد الصوديوم (NaCl) لمواصله تقييم جدوى اي glochidia المتقدمة بالبالكامل عن طريق أضافه الكريستال من NaCl إلى قطره مجموعه فرعيه من عينه الجيل³⁵. ستستجيب غلوتشيديا القابلة للاستمرار لكلوريد الصوديوم عن طريق إغلاق صماماتها من موضع مفتوح. الإبلاغ عن اي glochidia اختبار الملح مع ' (T) ' في نهاية التعيين عند تسجيل البيانات.
ملاحظه: يمكن أيضا ان يلاحظ المتقدمة تماما glochidia العض بنشاط مفتوحة ومغلقه دون التعرض ل NaCl.

4-الإبلاغ عن قاعده البيانات

الوصول إلى الويب fmga (http://arcg.is/089uee) ، الذي تم تطويرهباستخدام برامج^{الإنترنت 38 ،}³⁹^،⁴⁰. توفر صفحه FMGA ارتباطا إلى نموذج إدخال بيانات سطح المكتب وتنزيل تطبيق للاجهزه المحمولة. يتيح تطبيق الجوال إدخال البيانات في الحقل والرجوع الجغرافي التلقائي⁴¹.
ملاحظه: يمكن أيضا العثور علي التقويم الجاذبية وغيرها من الرسومات المرتبطة بالمياه العذبة أنواع بلح الحياة الاحداث التاريخ علي لوحه القيادة FMGA.
1. استخدم تطبيق الجوال أو موقع سطح المكتب لتسجيل النتائج في نموذج إدخال البيانات عن طريق استخدام القوائم المنسدلة وحقول إدخال النص. بالنسبة لمجموعات البيانات الكبيرة والموجودة مسبقا ، اتصل بالمؤلفين لجدول بيانات القالب. ادخل البيانات المسجلة تحت عناوين الاعمده المناسبة ، مع الأخذ في الاعتبار ان كل سجل ، أو صف في جدول البيانات ، يمثل ملاحظات لعينه من الجيل من فرد واحد.
2. أرسل النتائج ستتم اضافتها إلى قاعده بيانات FMGA بعد التحقق من صحتها من قبل مسؤول ، والذي قد يتصل بالمجمع لطلب المزيد من التفاصيل أو الصور.
  ملاحظه: بمجرد التحقق من صحة البيانات وتحويلها برمجيا في قاعده بيانات FMGA ، سيتم تحديث كافة التقويمات الجاذبية والرسومات التفاعلية الأخرى المعروضة علي لوحه المعلومات FMGA.

Representative Results

وقد طبق هذا البروتوكول خلال دراسة للتقاط العلامات التي تراقب مجتمع بلح المياه العذبة ضمن 750 م² تمتد من بروس كريك (مقاطعه والتون ، فلوريدا) من كانون الثاني/يناير 2015 إلى كانون الأول/ديسمبر 2015. وكان من المقرر ان تحدث العينات الميدانية كل أربعه أسابيع ؛ ومع ذلك ، نظرا للاحداث عاليه التدفق ، لم تجر أخذ العينات في نيسان/ابريل أو أيلول/سبتمبر من 2015. وساعدت الوكالات الحكومية والاتحادية بما في ذلك المسح الجيولوجي الأمريكي وخدمه الأسماك والحياة البرية ولجنه فلوريدا لحفظ الأسماك والحياة البرية في المسوحات الميدانية وأخذ عينات الجيل. وتعرضت كل أمراه متعطشة للدراسة اثناء المسح لأخذ عينات المحتوي في الميدان باستخدام البروتوكول الموصوف أعلاه ، الموسومة (انظر جدول المواد) ، ووضعت مره أخرى في الركيزة النهر. تم تخزين عينات الجيل في 95% EtOH ونقلت إلى مختبر المسح الجيولوجي الأمريكي في الأراضي الرطبة ومركز البحوث المائية لتقييم محتويات الجيل.

وبوضع علامات علي الإناث واستعادهن علي فترات شهريه طوال العام ، قمنا بتقييم كل من الآثار المميتة وغير الفتاكة لبروتوكول أخذ عينات الجيل علي ما مجموعه 90 فردا. وأعيد القبض علي الأنواع السبعة التالية خلال هذه الدراسة: البيضاوي الاهليكيه (ن = 5) ، fusconaia burkei (n = 1) ، هامايوتا اوستراليس (ن = 19) ، obovaria شوكتاونسيس (ن = 1) ، ستروفيتوس ويليامسي (ن = 1) ، Villosa lienosa (ن = 60) ، وفيوسا فيبيكس (ن = 3). شملت أخذ العينات لدينا الافراد تتراوح بين 24 ملم إلى 80 ملم في الطول الإجمالي ونوعين (f. burkei و h. استراليس) التي يحميها قانون الأنواع المهددة بالانقراض في الولايات الامريكيه. جميع البيانات المستخدمة في هذه الدراسة متاحه للعموم لقد وفرنا الوصول إلى مجموعه البيانات الخاصة بنا علي سايلوبيس (https://doi.org/10.5066/P90VU8EN)⁴².

وتم تقييم البقاء علي قيد الحياة من خلال عدد الافراد الذين أعيد القبض عليهم احياء بعد جمع عينه الجيل. لاحظنا ارتفاع مستوي البقاء (97 ٪) خلال الدراسة مع بعض الوفاات ، وربما كونتريبوتابل إلى النهب ، المشار اليها في الملاحظات في الموقع. وأظهرت النتائج ان حوالي 51 في المائة من الافراد (46 من 90) قد وجدوا انهم يقيمون بين الاحداث المتعاقبة لأخذ العينات. تم العثور علي 10 ٪ أخرى من الافراد (9 من 90) البيض ، استعادت لا البيض ، ووجدت البيض مره أخرى. تم العثور علي حوالي 39 ٪ من الافراد (35 من 90) في هذه الدراسة البيض ، أخذت عينه من الجيل ، ولكن عندما استعادت مره أخرى علي مدار السنه ، لم يتم العثور عليهم البيض مره ثانيه. وتشير النتائج إلى ان البروتوكول الموصوف هنا ليس مميتا ولا مميتا ولا يخل كثيرا بفترة الاطاله الحالية بعد أخذ عينات الجيل.

علي الرغم من ان احجام العينات في هذه الدراسة غير متساوية عبر الأنواع ، فان نتائج هذه الدراسة تسلط الضوء علي التطبيقات المفيدة والعملية لهذا البروتوكول. التقويم الجاذبية ل v. lienosa يوضح البيض الإناث المكتئب fdg تم العثور عليها في كل شهر تقريبا من السنه ما عدا أغسطس ، عندما تم العثور علي الإناث فقط المكتئب البيض (الشكل 5a). تم العثور علي الإناث h. استراليس لا البيض (NG) في تموز/يوليه وأب/أغسطس وكانون الأول/ديسمبر. وكانت نسبه أكبر من الإناث مكتئبة في كانون الثاني/يناير وشباط/فبراير ، ولكن عثر عليها أيضا في تشرين الأول/أكتوبر وتشرين الثاني/نوفمبر (الشكل 5 ب). لم يتم العثور علي اي افراد من e. pullata التي المكتئب fdg علي الرغم من ان الإناث المكتئب البيض من مايو إلى يونيو ، وسجلت واحده الإناث البيض (gfr) في يونيو (الشكل 5c). وجدت الأنثى الوحيدة التي كانت في شهر يونيو واستعادت NG في يوليو. وتم جمع نفس الشخص الذي كان في شباط/فبراير واستعاد الحرس العام في تموز/يوليه. تم العثور علي ويليامسي واحد فقط وتم القبض عليه ثلاث مرات. تم العثور علي هذه الأنثى FDG في مارس, NG في مايو, GFR في يونيو, والبيض في أغسطس (الشكل 5 ج). تم العثور علي الإناث gravid من v. vibex المكتئب fdg بين شباط/فبراير وحزيران/يونية (الشكل 5 ج).

الشكل 5: نتائج الدراسة في بروس كريك ، FL عرض في شكل تقويم الجاذبية. (ا) تقويم الجاذبية لل villosa lienosa يلتقط/ريكابتوريس. (ب) الجدول الزمني للجاذبية الوزنية للتقاط/ريكابتوريس. (ج) التقويمات الوزنية لجميع الأنواع التي يقل عدد العينات فيها عن 10 افراد. يتضمن محور y اختصارات للأشهر يناير (Ja) ، فبراير (F) ، مارس (السيد) ، مايو (My) ، يونيو (يو) ، يوليو (Jl) أغسطس (ا) ، أكتوبر (س) ، نوفمبر (ن) وديسمبر (D). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Discussion

اهميه

ويعتمد حفظ الأنواع المهددة بالانقراض علي التجنيد الناجح داخل السكان الباقيين. وفي بعض الحالات ، قد يكون الانتشار الاصطناعي ضروريا لزيادة توظيف هؤلاء السكان المعرضين للخطر. وهذا يتطلب اطلاع الباحثين علي توقيت التكاثر النشط لكل نوع من الأنواع ، وربما تطبيق منهجيات أو ممارسات اداريه مختلفه للتخفيف من اثر التوظيف. وكمجموعه من الكائنات الحية التي تتعرض للخطر ، من الاهميه بمكان وضع نهج موحد وغير فتاك لدراسة العادات الانجابيه ، وتوفير منصة لتجميع البيانات وتصورها لاعلام المجتمع العلمي بأحدث معلومات المتاحة. وتوفر هذه الدراسة بروتوكولا تدريجيا لضمان اتخاذ الاحتياطات ، ويمكن تذوق محتويات الجيل وتقييمها بصوره كافيه من بلح النساء. وقد اختبر هذا البروتوكول للآثار المميتة وغير الفتاكة ، مما أتاح للباحثين والمديرين تنفيذ هذه المنهجية بصوره مسؤوله. كما قمنا بتطوير مجموعه من أدوات أداره قواعد البيانات والتطبيقات لتسهيل تجميع معلومات الجاذبية علي لوحه معلومات متاحه للعامة وسهله الاستخدام. ويمكن للدراسات المتعلقة بعلم الاوبئه ، والمورفولوجية ، وتاريخ الحياة ، والوراثة ، والانتشار ، والنقل ، ان تستفيد من هذا المستودع لمعلومات الجاذبية الزمنيه لجميع أنواع بلح المياه العذبة.

هذه الدراسة وحدها دعمت نتائج الدراسات السابقة لبعض العادات الانجابيه الأنواع ولكن أيضا كشفت معلومات جديده عن الآخرين. علي الرغم من ان v. vibex تم جمعها باعداد اقل من v. lienosa، يمكن العثور علي أوجه التشابه بين الاثنين علي أساس البيانات الجاذبية. كلا نوع من [ فيلوسا ] يبدو إلى الحضنه يطور تماما [غلوكيديا] اثناء جزء كبيره من السنه, اي يميزهم ك [افرينترنغ] حضن. وهذا يتسق مع الدراسات السابقة علي الأنواع الأخرى villosa ⁴³^،⁴⁴^،⁴⁵. وتشير نتائج هذه الدراسة إلى انه يمكن العثور علي الحامض القطبي الجنوبي من تشرين الأول/أكتوبر والإفراط في الشتاء إلى حزيران/يونية ، باستثناء لم يتم العثور علي لقطات البيض في ديسمبر كانون الأول. وحددت دراسة نشرت سابقا المتجانسات h. altilis مع فتره الجاذبية من أربعه أشهر ، مارس من خلال يونيو⁴⁶^،⁴⁷. يوضح هذا الاستنتاج فتره أطول الجاذبية مما كان يعتقد سابقا وعموما المجموعات h. اوساستاليس كحضن الإفراط في الشتاء. كما الأنواع المحمية اتحاديا ، وفترات المكتئب متفاوتة ل h. altilis و h. ويمكن ان تؤثر الاداره الاستراليه علي قرارات اداريه لتحسين حماية السكان خلال الأوقات النشطة المثمرة. تم العثور علي الاهليلجيه الpullata فقط البيض مع البيض في مايو ويونيو والذي يتوافق مع توصيفها باعتبارها الأنواع الحساسة مع فتره المكتئب قصيرة جدا²⁴^,⁴⁸^,⁴⁹^, ⁵⁰. كما يتم تجميع البيانات علي الأنواع الاهليفي باستخدام هذا البروتوكول ، معلومات مفصله يمكن ان تجعل الجهود الميدانية أكثر كفاءه عند استهداف بعض مراحل التنمية الglochidial ، منذ العثور علي glochidial فقط بضعة أشهر من السنه. الاستدلال من الأنواع الأخرى مع احجام عينه اقل محدوده ولكن كما يتم تجميع البيانات في قاعده البيانات ، وارتفاع حجم العينات تعطي نظره ثاقبه في العادات الانجابيه من أنواع البلح اضافيه.

التعليقات الاجرائيه

ومن المعروف ان بلح الماء العذب والمحار الخاص بهم عرضه للضغوطات البشرية المنشا¹⁰^،³⁵. اثناء التفتيش الجاذبية ، قد لا يكون من السهل فتح صمامات بلح الهواء ، وإجبار الصمامات المفتوحة بلا مبالاة يمكن ان يسبب ضررا غير مقصود ويؤدي إلى الإجهاد أو الوفاات. بعض الأنواع الهشة التي قصفت (علي سبيل المثال ، الأنواع من انوتكس، ليبتوديا، ألفاظ، الخ) والافراد الأصغر حجما قد يكون لها قذائف هشه جدا والعضلات المقربة الضعيفة التي يمكن كسر والمسيل للدموع بسهوله. ويمكن اعتبار أخذ العينات جيل الإجهاد إذا لم يتم التعامل بمسؤوليه وبحذر. وجدت دراسة سابقه ان المناولة والتعرض الجوي لبلح المحار خلال الأوقات النشطة المثمرة قد يسبب الإجهاد الفسيولوجي المختلف ، بما في ذلك الإفراج المبكر عن محتويات الجيل³⁴. ومع ذلك ، وجدت دراسة باستخدام منهجيه مماثله كما هو موضح هنا ، والتعامل مع بلح العين الإناث البيض خلال أخذ العينات جيل لا يقطع الحضنه الحالية أو يسبب الإفراج المبكر في كل من الأنواع القصيرة والطويلة الأجل المكتئب¹⁶. وعلاوة علي ذلك ، يجب استخدام حقنه معقمه خلال هذا البروتوكول لمنع اي عدوي غير مقصوده أو التلوث المتقاطع عند ثقب الخياشيم من الافراد متعددة. بالاضافه إلى ذلك ، glochidia هشه ويمكن نضجت أحضان وشدد ولكن لم يطرد. الناضجة glochidia في الصحة السيئة يمكن ان يؤدي إلى عدد اقل من الافراد رد فعل علي اختبارات الملح³⁵. عند اجراء التمييز بين المدير العام (T) و FDG (T) من المهم اختبار الملح مع حجم عينه كبيره ، وجعل الملاحظات علي الملاحظات لتحديد بعناية الفروق بين المدير العام و FDG glochidia باستخدام الأوصاف المقدمة في هذه الدراسة. وعندما تؤخذ العناية المناسبة ، فان الحد الأدنى من الإجهاد الذي يسببه هذا الاجراء يمكن ان يسمح لبلح النساء بمواصله الكابه بشكل طبيعي والحد من الآثار علي التجنيد لدي السكان.

ويمكن تسجيل بيانات اضافيه لتكمله قاعده البيانات وتوفير سياق واسع للعادات الانجابيه لبلح المياه العذبة. بعض الأنواع (علي سبيل المثال ، الأنواع من Fusconaia) ، وقد لوحظ ان الخياشيم من ألوان مختلفه علي أساس مرحله التطوير من⁵¹glochidia. خلال فحص الجاذبية الاولي للإناث ، يمكن ادراج وصف للون الجيل في البيانات المبلغ عنها للسماح بالتحقيق في المستقبل. أيضا ، في هذه المرحلة من البروتوكول ، يمكن للباحثين ملاحظه ما إذا كان قد تم العثور علي الإناث المكتئب المكتئب في الخياشيم الخارجيين (ectobranchus) ، واثنين من الخياشيم الداخلية (اندوبورانكوس) ، أو كل الخياشيم الاربعه (tetragenous)¹⁷. ويمكن أضافه هذه المعلومات إلى FMGA والمساعدة في ملء ثغرات البيانات المتعلقة بالاطاله لكل نوع من الأنواع التي تم التحقيق فيها. ويمكن جمع الظروف البيئية ، وعلي وجه التحديد درجه حرارة المياه ، وتسجيلها في الميدان للحصول علي مراقبه اشمل لحاله الجاذبية وتوقيت الأنواع في مختلف النطاقات العرضية. وتبين البحوث ان المعلمات البيئية ، مثل درجه الحرارة ، والضوئية ، ومعدل التدفق ، وتوافر الغذاء ، قد تحفز الاحداث الانجابيه في بلح البحر العذبة⁵²^،⁵³^،⁵⁴^،⁵⁵ ^،⁵⁶. يمكن أضافه حقول اضافيه إلى قاعده البيانات كما يتم تقديمها لتعزيز البحوث المستقبلية حول العوامل اللااحيائيه التي تؤثر علي الجاذبية. كما يمكن أضافه تعديل للتقاط العلامات علي غرار الدراسة التي أجريناها إلى هذا البروتوكول ، الأمر الذي من شانه ان يسمح للباحثين بمراقبه العادات الانجابيه الخاصة ببلح العين والكشف عن المعلومات المتعلقة بالمواد المتعددة في السنه.

تعتمد دقه المعلومات في FMGA علي المصدر. وعلي سبيل المثال ، فان التعريف الخاطئ لبلح الماء العذب شائع بسبب العديد من الأنواع ذات الخصائص الخارجية المتشابهة التي تجعل من الصعب التمييز بين الأنواع⁵⁷. ويمكن لعينه من الجيل الذي تم التعرف عليه بشكل خاطئ ان تخلق ارتباكا ومعلومات زائفه لفتره أطاله الوقت. إذا تم أخذ عينه من الجيل ، يجب أخذ الصور من داخل كلا الصمامين (إذا كان الفرد ليس علي قيد الحياة) ، خارج الصمام الأيمن ، والمبو (المفصلي حيث يربط اثنين من الصمامات) وقدم مع البيانات الجاذبية من خلال موقع سطح المكتب أو تطبيق المحمول. كما نرحب بصور محتويات الجيل. وفي اطار استمارات التقديم ، توجد قائمه منسدلة تمكن المجمع من الاشاره إلى مستوي ثقته فيما يتعلق بتحديد الأنواع. قبل التحقق من صحة السجل ، سيتم أخذ هذه المعلومات بعين الاعتبار عند التحقق من هويه الجامع مقابل التوزيع المعقول ، الخ. نظرا لدرجه عاليه من التباين المورفولوجية داخل النوع في الأنواع من النقابات ، يتم تشجيع تقديم عينات الانسجه وقد يكون من الضروري لتسهيل التعرف علي الجزيئات.

الآثار المستقبلية

وكطريقه غير مميته ، يمكن تطبيق هذا البروتوكول علي كل من الأنواع الشائعة والمهددة بالانقراض. ويمكن لتقويمات الجاذبية للأنواع المعرضة للخطر ان تساعد مديري الحفظ المعنيين بتشريعات الأنواع المهددة بالانقراض وتخطيط الإنعاش عن طريق توفير معلومات عن الفترات الزمنيه عندما تكون الأنواع نشطه بشكل مثمر. ويمكن للوكالات الحكومية والاتحادية التي تدير الأنواع المعرضة للخطر ان تنصح بشكل أفضل بتخصيص التصاريح لأوقات لا يكون فيها النوع ضعيفا ومستنسخا ، بل وتحد من حصاد الأسماك المضيفة خلال الأوقات التي يكون فيها بلح المعدة مكتئبا تماما. الاضافه إلى ذلك ، يمكن للدراسات الاستقصائية الميدانية ان تستهدف الأنواع خلال فترات غير انجابيه للتقليل من تاثيرها علي عمليات التوظيف. وتوفر قاعده البيانات المتاحة للجمهور ، وهي FMGA ، أداه للباحثين والمديرين للحصول علي معلومات انجابيه هامه عن اي نوع من أنواع بلح الماء العذب المستهدف. ستسلط قاعده البيانات الضوء أيضا علي ثغرات البيانات ، وتشجع علي اجراء مزيد من البحوث بشان أنماط الاطاله الخاصة بالأنواع. وبما ان فهم نمط إنجابي للأنواع يسمح بتنفيذ القرارات الاداريه الملائمة ، فاننا نامل ان ييسر بروتوكولنا وقاعده بياناتنا البحوث المستقبلية لبلح البحر العذب وحفظها والتعافي منها.

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgments

ويود أصحاب البلاغ ان يشكروا مصادر التمويل: الخدمة الامريكيه للأسماك والحياة البرية والمسح الجيولوجي الأمريكي. شكر خاص لأندرو هارزوو وساندرا بورسيفول لتنظيم الطواقم الميدانية وجمع البيانات ، جنبا إلى جانب لورين باترسون وكريس أندرسون لمساهماتهم القيمة في تطوير قاعده البيانات. نود أيضا ان نشكر الجميع الذين ساعدوا في الميدان والمختبر بما في ذلك شيري Bostick ، مارك كانتريل ، ساهيل كاسبولت ، هولكومب الأردن ، هوارد Jelks ، غاري ماهون ، جون ماكليود ، كايل القمر ، كايلا مورنينج ستار ، ايما Pistole ، مات رو ، تشانينج سانت. Aubin ، وجيم وليامز. وأي استخدام لأسماء التجارة أو الشركات أو المنتجات هو لأغراض وصفيه فقط ولا ينطوي علي تاييد من الحكومة الامريكيه.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL snap cap centrifuge tubes	USA Scientific	1615-5510	Snap cap tubes are important in the field so the loose screw cap is not lost.
20 G needle on 10 mL disposable syringe	Exelint International	26255	sterile 10 mL disposable syringe with needle Model: 10ml Luer Lock Tip W/20G X 1 1/2"
Dissecting Microscope	any	any
Marking Pen	Fisher Scientific	13-379-4	This is what we used but any marker that can write on small plastic tubes will do. This one is fairly ethanol and water proof.
Molecular grade ethanol	any	any	Needed if preserving gill contents. Non-denatured 95% is needed for genetic work, 70% is needed for SEM imaging work.
Paper	any	any	Needed to record information on samples collected.
Pen/pencil	any	any	If in the field, better to write on waterproof paper with pencil so it doesn't smear. If in the museum/lab, any writing utensil is fine.
Petri dish	DWK Life Sciences (Kimble)	23000-9050	This is what we used but any petri dish available is fine. It is nicer to have the taller walls in case too much water is used.
Sodium Chloride	any	any	Needed for NaCl test for reactive glochidia. Preserved samples do not need this.
Speculum	any	any	Only needed if you want help opening the valves of a live mussel.
Sterile water	any	any	Added to gill samples to be evaluated for reactivity within 24 hours of collection.
Super glue	Gorilla	Gorilla super glue gel	Used to apply tags and only needed if conducting a capture-mark-recapture study.
Tags	Hallprint	FPN 8x4	Only needed if conducting a capture-mark-recapture study.
Transfer Pipet	Thermo Scientific Samco	225	This is what we use but any transfer pipet or squirt bottle is applicable.
Tweezers	any	any	Needed to move crystals of NaCl for salt test. Preserved samples do not need this.
Waterproof paper	RainWriter	any	Only needed if conducting work in the field. This allows you to record information on each individual gill contents are extracted from.
Wooden pick	any	any	Only needed if you want help opening the valves of a live mussel.