Summary
淡水贝类的保护依赖于监测物种的繁殖模式和过程。这项研究标准化了一种非致命性协议，用于对刺内容进行采样，描述幼虫发育的特征，并为收集的数据提供一个数字存储库。这个协议数据库包将成为贝类研究人员恢复濒危物种的重要工具。
Abstract
在管理种群恢复时，积极监测濒危物种的时间、发展和繁殖模式至关重要。淡水贝类是世界上最濒危的生物体之一，但许多物种仍然缺乏关于早期幼虫（幼虫）发育和育雏期的信息。以前的研究侧重于复杂的生命历史阶段，当雌性贝类准备寄生宿主鱼，但很少有研究侧重于幼虫发育的育雏期和时间。这里描述的协议允许研究人员非致命地评估雌性贝类的重力状态。研究结果表明，该方法不影响雌性贝类在取样后保持肉汁或再次成为肉体的能力。这种方法的优点可能允许将其用于联邦受威胁或濒危物种或其他高度保护的种群。该协议可以适用于保存或活体个体，并在各种贝类物种上进行了测试。所提供的数据库是一个储存资料的储存库，用于提供生殖习惯的时间信息，并将为今后的淡水贝类研究、养护和恢复工作提供便利。
Introduction
淡水系统人口的持续存在取决于繁殖和招募的成功。对于寄生生物，确定生命周期的复杂性（例如幼虫发育阶段和宿主吸引策略）可以深入了解生物体的生殖习惯和影响招募的关键过程。当物种受到威胁时，这种信息就变得很重要，而且需要成功地招募人来维持剩余的种群，或者如果恢复需要利用圈养繁殖来重建灭绝种群。
淡水贝类（比瓦尔维亚：联合达）被认为是全世界最危险的生物群之一，对物种特定繁殖习惯的汇编有助于研究工作1、2、3，4，5.淡水贝类目前分布于全球800多种物种，在北美、南美和东南亚具有多样性的热点，但许多物种都不知道基本生命历史信息。5，6，7.这个顺序内的家庭的特点是有寄生幼虫阶段，在与宿主7，8的依恋期间完全蜕变为自由生活的青少年。这一独特的生命历史阶段有助于淡水系统的生物多样性，目前处于危机9。高度危害可归因于许多人为威胁，包括水道污染、生境改变和破坏、宿主鱼类的丰度和多样性减少以及入侵物种的引进1 10.作为底栖过滤器，贝类钻入基底，易受污染物和污染物排放到流域11。恢复贝类物种是相关的，因为它们提供了各种各样的生态系统服务，包括碳固存，食物来源，和水净化通过过滤器喂养11。此外，已经发现贝类表明生态系统健康，促进生物多样性，反过来，提高生态系统的复原力12。
许多淡水贝类研究侧重于调查早期生命史要求，以便更好地为物种状况评估和管理战略提供信息。与这项研究相关的淡水贝类家族（例如，海瑞达、玛格丽塔里达、尤尼达）有一个独特的生命历史策略，雌性幼虫（球菌）在它们的马尾刺8中育雏。通过各种策略，雌贝将成熟的球状动物从马尾刺中排出，以寄生脊椎动物宿主与球基迪亚13。研究在刺体内的球状发育从利用皮下注射器从活贝类中取样的性腺液，并评估Gamete生产14，15，16的技术。当研究人员验证这种非致命方法的gonad采样，它被改编为马尾刺采样，以评估育雏发育15，16。幼虫发育可用于破译植物遗传关系，因为一些贝类物种只能在外两刺（叶刺），只有内两刺（内刺），或所有四个刺（四分枝）中育雏叶球菌，但这个特征不是以每个物种17而闻名。此前，人们曾使用幼虫模式对贝类物种进行分类，即雌性贝类是在冬季（球状）或夏季（奇数）18短暂期间对球菌进行育雏。在研究阿诺多塔的繁殖周期时，支持了贝类的越冬。然而，基础生殖生物学经过多年的研究更为透彻，发现这种二分法是一种总的概括，一些物种的育雏期比原先假定的20、21要复杂得多。例如，在22、23、23、22、23、22、23、22、23、22、23、23、23、23、23、23、23、23、23、23、23、23、23、23、23、23、23、23、23、23、23、23、23、23、23、23、23、23、23、23、23、23、23、23、23、23、23、23、23、23 24.特定物种的复杂性，有时甚至是特定于种群的20种生殖习惯，导致对育雏的时间和持续时间以及雌性贝类可能产育雏数量的认识出现差距。
虽然皮下注射器已经用于提取刺含量，但报告结果很复杂，因为缺乏标准化，以确保在所有研究中的可比结果。以前，在Unionidae中已经确定了四个发育阶段（即卵子、胚胎、未成熟、完全发育），但尚未被纳入标准程序16、25、26。其他观察玛格丽塔里达成员的研究已经取代了"不成熟的球基迪亚"的分类与"发育的球基迪亚"，导致潜在的混乱27，28。不同幼虫发育阶段缺乏一致性，使得许多研究人员普遍将育雏女性描述为"幼虫"，这还不包括幼虫发育的复杂性。生命史研究进行宿主鱼试验已优先考虑需要肉体雌性与完全发达的球基迪亚，但这些信息分散在出版和未发表的文献29，30。目前，缺乏关于许多贝类物种的繁殖习惯的数据，包括卵子、未成熟的球菌和完全发育的球菌之间的过渡时间，这些生物基迪亚准备附着在宿主上。对于大多数物种来说，目前还不清楚雌性卵卵育育的时间以及受精卵完全发育的速度。对于保护关注的物种，知识差距往往更大，这就需要一种标准化的方法，提取刺含量，这种方法已经过非致命效果测试，可以推广到科学界，以补充主流数据收集方法，不对受保护人群造成威胁24、31、32。
本研究有三个目标：1） 正式确定刺取样技术，并测试其对原位雌贝的致命和非致命影响;2） 描述球体发育的不同阶段，并描述一种标准化的识别和识别方法。报告各种幼虫阶段，3） 为收集的数据创建公共存储库。实地调查、长期监测项目和博物馆藏品都是实施本文所述协议的机会，也是为更广泛的兴趣收集更多数据的机会。形式化的协议包括视觉和字符描述，用于区分幼虫发育的每个阶段。通过标准化类别，可以比较所有事件和物种之间收集的结果。一旦收集数据，所有数据都可以提交到淡水贝类重力年鉴（FMGA），这是一个使用该协议收集的重力信息数据库。存储和汇编所有重力信息的最终产品将提供一个研究工具，以促进未来的研究、保护和回收工作。将这种方法纳入各种贝类项目，并将数据提交到FMGA，将扩大全年有关贝类物种重力状况的知识的广度。作为一个高度濒危的生物群，关于淡水贝类繁殖习惯的议定书和由此产生的数据库对于了解种群动态和促进对这些物种的保护至关重要。
Protocol
1. 格拉维德女性收藏
注：参考鱼类和野生动物管理局的《淡水贝类调查议定书》第33条，就如何充分调查受威胁或濒危物种的取样地点提供指导。在实地收集受保护物种和州许可之前，必须获得适当的联邦许可证。
- 使用触觉视觉方法（步骤 1.2）或利用博物馆保存的标本（步骤 1.3）从野外收集活贝类。
注意：重要的是保持活贝类凉爽和潮湿收集后，以防止干燥和减少压力，和最小的处理肉汁贝类是重要的，以避免雌性过早释放刺含量34。 - 通过在收集过程中进行目视检查（例如，存在地衣诱饵、粘结物等）或通过收集后的视觉检查（例如，轻轻撬开阀门，足以观察内部并查看刺是否膨胀，请观察图 1.
注：物种在狼群刺中育雏的球菌不同，因为有时只有两个外刺（尾刺），只有两个内刺（内刺），或所有四个刺（四种雄性）是马丘普17。该协议可以在这里暂停，肉汁雌性可以运回实验室进行刺取样。
图1：轻轻撬开个体。要检查活贝壳的重力，请用拇指（A） 轻轻撬开阀门，或谨慎使用光谱或反向钳子撬开阀门 （B）。查看协议中的步骤 2.3，查看与此方法相关的注意事项。请点击此处查看此图的较大版本。
- 通过打开阀门并检查刺，以确定个体是否为重力女性，对保存的试样进行目视检查（图2）。
图2：如何识别肉体女性。雌性贝类刺在雌性幼崽和育雏时出现膨胀。照片 A 和 C 从横向角度显示刺，而照片 B 和 D 提供刺的腹视图。红色框勾勒出刺的轮廓，以突出肉汁 （A/B） 和非重力 （C/D） 雌兰普西利斯斜纹贝类之间的差异。个体的总长度为 79 毫米 （A/B） 和 88 毫米 （C/D）。请点击此处查看此图的较大版本。
2. 吉尔含量采样
注：无论在野外和实验室的活贝类上，还是对保存的标本进行取样，都可以调整此方案。
- 如果在提取35的 24 小时内评估刺含量，则准备一个 1.5 mL 塑料微离心收集管，其中约 1 mL 的无菌水，如果样品评估不能在采集的 24 小时内进行，或者如果刺内容来自在EtOH保存的博物馆标本。如果球基迪亚用于扫描电子显微镜（SEM）成像，使用70%EtOH，如果球基迪亚将用于基因测试，使用非变性95%EtOH36。
- 在 10 mL 注射器上取出一个无菌 20 G 斜尖针的纸包装。拧下盖子以暴露针头，并准备一个 1.5 mL 塑料管，用于收集刺含量。一直向下推注射器手柄，使黑色塞在 0 mL/cc 线处。
注：每次对刺内容物进行取样时，应使用无菌注射器。用过的注射器可以通过将尖端浸入 10% 漂白溶液中，然后用 1 mL 的无菌水填充注射器，并将柱塞压回 0 mL/cc，最后用干净的布干燥注射器，从而在现场进行消毒。 - 拿起母体，用拇指的尖端轻轻撬开两个阀门。
注意：小心不要伤害动物。打开阀门太宽或太快会过度延长加法器肌肉，导致死亡。薄壳标本（例如，阿诺多塔、莱普托迪娅、乌特巴基亚等物种）和年轻人在这一步中特别容易受到攻击。强行处理易碎壳的物种可能会裂开贝壳并导致死亡。在某些情况下，从前壳和后壳边缘挤压薄壳动物，同时观察腹腔表面，会导致壳稍微弯曲和间隙，从而可以观察刺或撬开壳，避免损坏易碎的外壳壳边距。
注： 工具可用于协助此步骤，但如果不谨慎使用，也可能导致死亡，应尽可能避免使用。例如，可以使用一组规格或经过改进的反向钳子帮助撬开单个打开，并且楔块可用于帮助支撑阀门打开。如果另一个人可以协助（即，一个人将动物保持打开，而另一人操纵注射器进行提取），则这些仪器可能没有必要。破坏或分离地壳组织与表层组织可导致生长畸形和死亡率37;因此，避免切断地壳组织和壳体外边缘之间的连接至关重要。 - 使用注射器的针尖轻轻穿透膨胀的马尾刺的单根水管。接下来，利用针的刀尖轻轻挖出刺内容物。
注：Gill 内容物通常具有乳白色一致性，应在针尖上可见。- 如果显微镜随时可用，请将注射器的内容直接放入培养皿中。否则，将内容物存放在1.5 mL塑料微离心管中，并带有指定液体（参见步骤2.1），以便日后评估。
注：尽量减少在运输过程中对球菌样品的干扰和处理，以避免损坏和降低生存能力32，35。
- 如果显微镜随时可用，请将注射器的内容直接放入培养皿中。否则，将内容物存放在1.5 mL塑料微离心管中，并带有指定液体（参见步骤2.1），以便日后评估。
- 记录有关属种识别、重力状态、雌性长度（mm）、收集器和联系信息、州、县、排水、特定采集位置、纬度和经度的信息，这是刺的唯一标识符示例，调查站点的唯一标识符，以及提取刺内容时收集的日期（图 3）。在每个收集容器上记录唯一标识符，以确保运输过程中的数据记录准确。
- 拍摄贝类的右外侧阀以进行身份验证，并在图片中包括标有唯一标识符的管子。或者，收集其他非生物和生物参数，以补充有关贝类在环境和社区的信息（有关建议见图3）。
图 3：字段重力数据表的示例。如果采用刺样本来生成可靠的信息，则需要准确的数据报告。这是一个字段数据表的示例，其中包含要随每个刺样本一起收集的最小字段和额外的非生物参数。有关更全面的信息，请参阅协议中的步骤 4.1。请点击此处查看此图的较大版本。
3. 实验室对刺含量的评估
- 如果刺内容物在1.5 mL管中，将其转移到培养皿中，然后装满盘子底部的水。以圆形运动轻轻旋转培养皿，在菜的中心收集内容，以便更集中地查看样品。
注：如果刺内容物粘在管壁上，可能需要使用喷瓶或输送装满水的移液器冲洗出 1.5 mL 管。 - 将培养皿置于解剖显微镜下以评估样品。如果可能，在显微镜下拍摄刺样品的照片，并用该样本的唯一标识符将其贴上标签。
- 记录每个刺样本中存在发育阶段的结果。使用图 4作为描述每个发育阶段的指南。在某些情况下，雌性可能在多个发育阶段育雏幼虫;因此，报告在给定样本中观察到的每个发育阶段（例如，"EGG/DG/IMG/FDG"）。一旦保存的球基迪亚被评估，继续第4节。如果完全发育的球基迪亚被识别，并且EtOH没有用于保存，继续步骤3.3。
注：蛋，蛋团;DG， 开发球基迪亚;IMG，不成熟的球基迪亚;FDG，完全发育的球基迪亚。
- 记录每个刺样本中存在发育阶段的结果。使用图 4作为描述每个发育阶段的指南。在某些情况下，雌性可能在多个发育阶段育雏幼虫;因此，报告在给定样本中观察到的每个发育阶段（例如，"EGG/DG/IMG/FDG"）。一旦保存的球基迪亚被评估，继续第4节。如果完全发育的球基迪亚被识别，并且EtOH没有用于保存，继续步骤3.3。
图4：在马尾刺中，球状发育的各个阶段的表现。（A） 蛋团 （EGG） 有一个膜，使鸡蛋聚集在一起.在每个蛋膜内都有一个不透明的球形的区分细胞。在早期细胞分裂期间，不透明球形质量可分裂成多个球面质量，但仍应记录为 EGG，直到观察到明显的双壳形状。（B） 未成熟的球基体 （IMG） 在蛋膜中具有明显的双壳体质量。（C） 发育的球状体 （DG） 具有独特的双壳体形状，没有卵膜，内部组织无组织，在外观上往往模糊不清。开发球基迪亚 （DG） 在暴露于 NaCl 时不反应，在记录数据时被归类为"DG（T）"。（D） 完全发育的球基迪亚 （FDG） 具有独特的双壳体形状和明显的加法器肌肉组织，使球基迪亚关闭。完全发育的球基迪亚 （FDG） 通常被观察为两个打开的阀门保存后。当暴露于 NaCl 并归类为"FDG（T）"时，两个打开的阀门通常会卡住关闭，或卡住和关闭。请点击此处查看此图的较大版本。
- 进行氯化钠（NaCl）测试，通过在刺样品35的子集液滴中加入NaCl晶体，进一步评估任何完全发育的球菌的生存能力。活的球基迪亚将响应NaCl关闭他们的阀门从打开的位置。在记录数据时，在指定末尾报告任何经过盐测试的球状物，并在指定结束时使用"（T）"。
注： 完全发育的球基度也可以看到主动捕捉打开和关闭，而不暴露于 NaCl.
4. 向数据库报告
- 访问FMGA网络（http://arcg.is/089uee），这是使用在线软件程序38，39，40开发。FMGA 页面提供桌面数据输入表单的链接和移动设备的应用程序下载。移动应用程序支持数据输入在现场和自动地理配准41。
注： 重力日历和其他图形与淡水贝类物种生命历史事件也可以在 FMGA 仪表板上找到。- 使用移动应用或桌面网站使用下拉菜单和文本输入字段在数据输入表单中记录结果。对于大型预先存在的数据集，请与模板电子表格的作者联系。在相应的列标题下输入记录的数据，请记住，电子表格上的每条记录或行都表示来自一个重力个体的刺样本的观察结果。
- 提交结果，在管理员验证后，这些结果将添加到 FMGA 数据库中，管理员可能会与收集器联系以请求更多详细信息或照片。
注：在 FMGA 数据库中验证和编译数据后，FMGA 仪表板上显示的所有重力日历和其他交互式图形都将更新。
Representative Results
该协议在2015年1月至2015年12月期间在布鲁斯克里克（佛罗里达州沃尔顿县）750米2长段内的淡水贝类群落监测期间应用。现场取样计划每四周进行一次;然而，由于高流量事件，2015年4月或9月没有进行取样。州和联邦机构，包括美国地质调查局、美国鱼类和野生动物管理局以及佛罗里达州鱼类和野生动物保护委员会，协助进行实地调查和刺取样。在调查过程中遇到的每个肉汁雌性，都使用上述协议进行现场刺含量取样，贴上标签（见材料表），然后放回河基底。刺样本储存在95%的EtOH中，并运送到美国地质调查局的湿地和水生研究中心的实验室，以评估刺的含量。
通过标记女性并全年每月间隔重新捕获它们，我们评估了刺取样协议对总共 90 个人的致命和非致命影响。在这项研究中，重新夺回了以下七个物种：埃利普蒂奥拉塔（n = 5），富斯科纳亚·布尔基（n = 1），哈米奥塔·澳大利亚（n = 19），奥博瓦里亚·乔卡文西（n = 1），斯特罗皮图斯·威廉利（n = 1）， 维洛萨·利诺萨（n = 60），和维洛萨 vibex （n = 3）.我们的取样包括总长度为24毫米至80毫米的个体，以及受《美国濒危物种法》保护的两种物种（F.burkei和H.Australis）。本研究中使用的所有数据都是公开的，我们提供了访问ScienceBase（https://doi.org/10.5066/P90VU8EN）42上的数据集。
幸存者是评估有多少人被活捉后，刺样本收集。我们观察到高存活率（97%）在研究期间，一些死亡率，可能归因于掠夺，通过现场观察表明。结果显示，约51%的人（90人中有46人）在连续抽样事件之间保持重力。另有10%的人（90人中有9人）被发现肉汁，重新捕获的不是肉汁，并再次发现肉汁。在这项研究中，大约39%的人（90人中有35人）被发现肉汁，采集了刺样本，但当全年再次捕获时，他们再也没有第二次被发现肉汁。结果表明，本文所述的规程既不是致命的，也不是亚致命的，并且没有实质性地扰乱对刺取样后目前的育雏期。
尽管本研究中的样本数量在不同物种间是不平等的，但这项研究的结果强调了该协议的有益和实际应用。V. lienosa的重力日历显示，在一年中几乎每个月都发现肉汁雌性育雏 FDG，但 8 月除外，当时只发现雌性育雏 EGG（图 5A）。在7月、8月和12月，发现雌性澳大利人没有肉汁（NG）。在一月和二月，有较大比例的女性在育雏FDG，但在10月和11月也发现（图5B）。虽然雌性在5月至6月育雏EGG，6月有一只肉汁雌性（GFR）记录（图5C），但没有发现E.pullata的亲育性FDG。唯一的重力F.Burkei女性于6月被发现GFR，并在7月被抓获。同一O.Choctawensis个体于2月被收集，7月被抓获。只有一个S.威廉西被发现，并被夺回三次。这名女性在3月被发现FDG，5月发现NG，6月发现GFR，8月发现EGG（图5C）。在2月至6月间，发现V.vibex育雏FDG的重力雌性（图5C）。
图5：以重力日历格式显示的佛罗里达州布鲁斯克里克的研究结果。（A）维洛萨·利诺萨的重力日历捕获/重新捕获.（B）哈米奥塔澳大利的重力日历捕获/回收。（C） 所有样本少于10人的物种的重力日历。y 轴包括 1 月 （Ja）、2 月 （F）、3 月 （先生）、五月 （我的）、六月 （Jn）、 七月 （Jl） 8 月 （A）、10 月 （O）、11 月 （N） 和 12 月 （D） 的缩写。请点击此处查看此图的较大版本。
Discussion
意义
濒危物种的保护取决于在现存种群中成功招募。在某些情况下，人工繁殖可能是必要的，以扩大这些高危人群的招募。这就要求研究人员了解每个物种积极繁殖的时间，并可能采用不同的方法或管理做法，以减轻对招募工作的影响。作为一个濒危的生物群，最重要的是建立一种标准化和非致命性的方法，研究生殖习惯，并提供一个平台，汇编和可视化数据，向科学界提供最新的最新信息信息。这项研究提供了一个分步协议，以确保采取预防措施，并可以从雌贝中充分取样和评估刺含量。该协议已测试致命和非致命效果，使研究人员和管理人员能够负责任地实施这种方法。我们还开发了一套数据库管理工具和应用程序，以方便在公开、用户友好的仪表板上编译重力信息。关于流行病学、球状形态学、生命史、植物遗传学、繁殖和易位的研究都可以有益于和利用所有淡水贝类物种的时间引力信息库。
这项研究本身支持了先前对一些物种繁殖习惯的研究结果，但也揭示了关于其他物种的新颖信息。虽然V.vibex的收集数量比V.lienosa少，但根据重力数据可以发现两者之间的相似性。这两种Villosa似乎在一年中有很大一部分完全发育成的球菌，这使它们被描述为越冬的育雏。这与先前对其他维洛萨物种43、44、45的研究是一致的。这项研究的结果表明，从10月到6月，除了在12月没有发现肉汁外，可以发现澳大利人。先前发表的一项研究确定同系H.altilis的重度期为4个月，即3月46日至47日。这一发现表明，比之前认为的更长的重力期，通常将H.澳斯特拉利人分组为越冬的育雏者。作为联邦保护的物种，H. altilis和H. a.a.a.a.a.的育雏期不同可能会影响管理决策，从而在繁殖活跃时期更好地保护种群。Elliptio pullata仅在5月和6月被发现与EGG的肉汁，这相当于其特征为一个触觉物种与很短的育雏期24，48，49， 50.由于使用该协议对Elliptio物种的数据进行汇编，当某些球状发育阶段被定位时，详细的信息可以使现场工作更有效率，因为球菌在一年中只有几个月的时间被发现。其他样本数量较低的物种的推断是有限的，但随着数据汇编到数据库中，样本数量越高，就会深入了解其他贝类的繁殖习惯。
程序性评论
众所周知，淡水贝类及其球菌容易受到人为压力因素的影响。在重力检查期间，贝类阀门可能不容易打开，不小心迫使阀门打开可能会导致意外伤害，并导致压力或死亡。一些易碎的壳物种（例如，阿诺多塔、莱普托迪亚、乌特巴基亚等物种）和较小的个体可能有非常脆弱的贝壳和虚弱的加法肌肉，很容易断裂和撕裂。如果处理不负责任和谨慎，吉尔采样可被视为压力。先前的研究发现，在生殖活跃时期处理和空中暴露贝类可能导致各种生理压力，包括过早释放刺含量34。然而，一项采用类似方法的研究发现，在刺取样过程中处理肉体雌贝并没有中断目前的育雏，也没有导致短期和长期育雏物种16过早释放。此外，在该协议期间需要使用无菌注射器，以防止在多次刺穿刺刺时出现任何意外感染或交叉污染。此外，球基迪亚是脆弱的，育雏可以成熟和强调，但不能驱逐。健康不佳的成熟球基迪亚会导致对盐测试反应更少的人35。在区分 DG（T） 和 FDG（T） 时，使用大样本量进行盐测试非常重要，请记下来，使用本研究中提供的描述仔细识别 DG 和 FDG 球基体之间的区别。当采取适当的护理时，这个程序引起的最小压力可以允许雌贝继续自然育雏，并减少对人群招募的影响。
可以记录更多的数据，以补充数据库，并为淡水贝类的繁殖习惯提供广泛的背景。根据51的发育阶段，观察到一些物种（如Fusconaia物种）具有不同颜色的刺。在对女性进行初始重力检查期间，报告的数据中可能会包含刺色的描述，以便将来进行调查。此外，在协议中的这一点，研究人员可以注意到，是否发现育雏雌性在两个外刺（叶头），两个内刺（内刺），或所有四个刺（四种）17。这些信息可以添加到FMGA中，帮助填补每个被调查物种的育雏数据空白。环境条件，特别是水温，可以在现场收集和记录，以便更全面地观察不同纬度范围内物种的重力状况和时间。研究表明，环境参数，如温度、光周期、流速和食物供应，可能诱发淡水贝类52、53、54、55的繁殖活动。， 56.在提交其他字段时，可以向数据库添加其他字段，以促进今后对影响重力性非生物因素的研究。在我们的研究之后，也可以将捕获标记-捕获修饰添加到该协议中，使研究人员能够监测特定贝类的繁殖习惯，并揭示每年多个育雏的信息。
FMGA 中信息的准确性取决于来源。例如，由于许多物种具有相似的外部特征，因此对淡水贝类的误认很常见，因此很难区分57种。从被误认的个体的刺样本可能会造成混淆和虚假信息的物种的育雏期。如果采集了刺样本，则应在两个阀内部（如果个体不是活动）和 umbo（两个阀门连接的铰链）内拍摄照片，并通过桌面站点或移动应用程序提交重力数据。我们也欢迎照片的刺内容。在提交表格中，有一个下拉菜单，使收集器能够表明他们对物种识别的信心水平。在验证记录之前，在检查收集器识别是否合理分布时，将考虑此信息。由于Unionidae物种的特异性形态变异程度很高，因此鼓励提交组织样本，并可能有必要进行分子鉴定。
今后的影响
作为一种非致命方法，该协议可适用于普通物种和濒危物种。濒危物种的重力日历可以帮助参与濒危物种立法和恢复规划的保护管理人员，提供有关物种繁殖活动时间的信息。管理危险鱼种的州和联邦机构可以更好地建议，当该物种不脆弱和繁殖时，允许分配，甚至限制宿主鱼的收获，在贝类正在育雏完全发育的球菌。此外，实地调查可以针对非生殖期的物种，以尽量减少对征聘过程的影响。可公开访问的数据库FMGA为研究人员和管理人员提供了一个工具，以便获得关于任何目标淡水贝类物种的重要生殖信息。该数据库还将突出数据差距，鼓励对特定物种的育雏模式进行进一步研究。由于了解物种繁殖模式可以实施适当的管理决策，我们希望我们的协议和数据库有助于未来的淡水贝类研究、养护和恢复。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者要感谢资金来源：美国鱼类和野生动物管理局和美国地质调查局。特别感谢安德鲁·哈特佐格和桑德拉·珀西富组织现场工作人员和数据收集，以及劳伦·帕特森和克里斯·安德森对数据库开发的宝贵贡献。我们还要感谢在实地和实验室中提供帮助的每一个人，包括雪莉·博斯蒂克、马克·坎特雷尔、萨海尔·凯斯博尔特、乔丹·霍尔科姆、霍华德·耶尔克斯、加里·马洪、约翰·麦克劳德、凯尔·穆恩、凯拉·晨星、艾玛·皮斯托莱、马特·罗、钱宁·圣。奥宾和吉姆·威廉姆斯任何使用贸易、公司名称或产品名称仅供描述性目的，并不意味着美国政府的认可。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL snap cap centrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5510 | Snap cap tubes are important in the field so the loose screw cap is not lost. |
| 20 G needle on 10 mL disposable syringe | Exelint International | 26255 | sterile 10 mL disposable syringe with needle Model: 10ml Luer Lock Tip W/20G X 1 1/2" |
| Dissecting Microscope | any | any | |
| Marking Pen | Fisher Scientific | 13-379-4 | This is what we used but any marker that can write on small plastic tubes will do. This one is fairly ethanol and water proof. |
| Molecular grade ethanol | any | any | Needed if preserving gill contents. Non-denatured 95% is needed for genetic work, 70% is needed for SEM imaging work. |
| Paper | any | any | Needed to record information on samples collected. |
| Pen/pencil | any | any | If in the field, better to write on waterproof paper with pencil so it doesn't smear. If in the museum/lab, any writing utensil is fine. |
| Petri dish | DWK Life Sciences (Kimble) | 23000-9050 | This is what we used but any petri dish available is fine. It is nicer to have the taller walls in case too much water is used. |
| Sodium Chloride | any | any | Needed for NaCl test for reactive glochidia. Preserved samples do not need this. |
| Speculum | any | any | Only needed if you want help opening the valves of a live mussel. |
| Sterile water | any | any | Added to gill samples to be evaluated for reactivity within 24 hours of collection. |
| Super glue | Gorilla | Gorilla super glue gel | Used to apply tags and only needed if conducting a capture-mark-recapture study. |
| Tags | Hallprint | FPN 8x4 | Only needed if conducting a capture-mark-recapture study. |
| Transfer Pipet | Thermo Scientific Samco | 225 | This is what we use but any transfer pipet or squirt bottle is applicable. |
| Tweezers | any | any | Needed to move crystals of NaCl for salt test. Preserved samples do not need this. |
| Waterproof paper | RainWriter | any | Only needed if conducting work in the field. This allows you to record information on each individual gill contents are extracted from. |
| Wooden pick | any | any | Only needed if you want help opening the valves of a live mussel. |
References
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