Skyddet av sötvatten musslan är beroende av övervakning av reproduktions mönster och art processer. Denna studie standardiserar ett icke-dödligt protokoll för provtagning av Gills innehåll, karaktäriserande larv utveckling och tillhandahållande av en digital databas för insamlade data. Detta protokoll-databas paket kommer att vara ett viktigt verktyg för mus SEL forskare i återhämtningen av imperiled arter.
Att aktivt övervaka de utrotningshotade arternas timing, utveckling och reproduktions mönster är avgörande när det gäller att hantera befolknings återhämtning. Sötvatten musslor är bland de mest imperiled organismer i världen, men information om tidig larv (glochidial) utveckling och rusnings perioder är fortfarande saknas för många arter. Tidigare studier har fokuserat på den komplexa livshistoria skede när kvinnliga musslor är redo att snylta värd fisk, men få studier har fokuserat på grubbler period och tidpunkten för larv utveckling. Det protokoll som beskrivs här gör det möjligt för forskare att icke-lethally utvärdera tillståndet för graviditet för kvinnliga musslor. Resultaten av denna studie visar att denna metod inte påverkar en kvinnlig mussla förmåga att stanna dräktig eller bli gravid igen efter provtagning har utförts. Fördelen med denna metod kan tillåta dess användning på federalt hotade eller utrotningshotade arter eller andra populationer av hög bevarande oro. Detta protokoll kan anpassas för användning på både konserverade eller levande individer och testades på en mängd olika musselarter. Den databas som tillhandahålls är en databas för en mängd information om tidpunkten för reproduktiva vanor och kommer att underlätta framtida sötvatten mus SEL forskning, bevarande, och återhämtningsinsatser.
Populationernas persistens i sötvattensystem beror på framgången för reproduktion och rekrytering. För parasitära organismer, identifiera krångligheter i livscykeln (t. ex. stadier av larv utveckling och värd attraktion strategier) kan ge insikt i en organism ‘ s reproduktiva vanor och kritiska processer som påverkar rekrytering. Sådan information blir viktig när arter är imperiled, och lyckad rekrytering behövs för att upprätthålla kvarvarande populationer, eller om återhämtning kräver användning av fångenskap förökning för återupprättandet utrotade populationer.
Sötvatten musslor (Bivalvia: unionida) anses vara en av de mest imperiled grupper av organismer i världen och en sammanställning av artspecifika reproduktiva vanor kan stöd i forskningsinsatser1,2,3 ,4,5. Med över 800 för närvarande erkända arter spridda över hela världen, sötvatten musslor har hotspots av mångfald i Nord-och Sydamerika, och sydöstra Asien men grundläggande livshistoria information är okänd för många arter2, 5,6,7. Familjer inom denna ordning kännetecknas av att ha parasitiska larvstadier som komplett metamorfos till fritt levande juvenila under fastsättning till en värd7,8. Denna unika livshistoria skede bidrar till den biologiska mångfalden i sötvattensystem, som för närvarande i kris9. Höga nivåer av imperilment kan hänföras till många antropogena hot, inklusive förorening av vattenvägar, förändring av livsmiljöer och förstörelse, minskning av överflöd och mångfald av värd fiskar, och införande av invasiva arter1, 10. Som bentiska filter matare, musslor håla in i underlaget och är mottagliga för föroreningar och föroreningar som rinner ut i vattendelare11. Återvinning av musselarter är relevant eftersom de erbjuder ett brett utbud av ekosystemtjänster, inklusive kolupptagning, en livsmedelskälla, och vattenrening genom filtrering utfodring11. Dessutom har man funnit musslor för att indikera ekosystemens hälsa, främja biologisk mångfald och i sin tur öka återhämtningsförmågan hos ett ekosystem12.
Många sötvatten mus SEL studier har fokuserat på att utreda tidiga livshistoria krav för att bättre informera artstatus bedömningar och förvaltningsstrategier. De sötvatten mus SEL familjer som är relevanta för denna studie (t. ex. Hyriidae, Margaritiferidae, Unionidae) har en unik livshistoria strategi där honor Brood larver (glochidia) i sina pungdjur gälar8. Genom en mängd olika strategier, den kvinnliga musslan utvisar mogna glochidia från pungdjur gälar att parasitisera en ryggradsdjur värd med glochidia13. Forskning om glochidial utveckling inom gälarna ändrades från en teknik som använder Hypodermic sprutor för att prova gonadala vätska från levande musslor och utvärdera könscell produktion14,15,16. Som forskare validerat denna icke-dödliga metod för gonad provtagning, var det anpassas för pungprov Gill provtagning för att utvärdera häcknings utveckling15,16. Brood utveckling kan användas för att dechiffrera fylogenetiska relationer som vissa musselarter kan grubbla glochidia i endast de yttre två gälar (ektobranchus), endast de inre två gälar (endobranchus), eller i alla fyra gälar (tetrabranchus) men denna egenskap är inte känd för varje art17. Brooding mönster har tidigare använts för att klassificera mussla arter av om kvinnliga musslor grubbla glochidia över vintern (bradytictic) eller under en kort period i sommar (tachytictic)18. Över övervintring av mussla kullar stöddes när den reproduktiva cykeln av anodonta studerades19. Men grundläggande reproduktionsbiologi studerades mer grundligt under årens lopp och fann denna dikotomi var en grov generalisering och rusnings perioder av vissa arter är mycket mer komplexa än ursprungligen förmodade20,21. Till exempel, arter av släktet hyridella (familj Hyriidae), glebula, och Elliptio (familj unionidae) har observerats med uppemot tre kullar per häckningssäsong22,23, 24. Komplexiteten i artspecifika, och ibland även befolkningsspecifika20, reproduktiva vanor har lett till en brist på kunskap om tidpunkten och varaktigheten av grubling, och antalet kullar en kvinnlig mussla kan producera.
Även om Hypodermiska sprutor har använts för att extrahera Gills innehåll, är rapporteringen av resultaten komplicerad på grund av bristande standardisering för att säkerställa jämförbara resultat i alla studier. Tidigare har fyra utvecklingsstadier av glochidia (dvs. ägg, embryo, omogna, fullt utvecklade) identifierats i unionidae men har inte antagits till standardförfarande16,25,26. Andra studier som observerade medlemmar av margaritiferidae har ersatt klassificeringen av “omogen glochidia” med “utveckla glochidia”, vilket leder till potentiell förvirring27,28. Bristen på konsekvens i att karakterisera de olika larv utvecklingsstadierna har lämnat många forskare för att generellt beskriva rusande honor som “dräktig”, vilket inte omfattar krångligheter larv utveckling. Livs historiska studier som genomför värd-Fish prövningar har prioriterat behovet av dräktiga honor med fullt utvecklad glochidia, men denna information är spridda över publicerad och opublicerad litteratur29,30. För närvarande saknas uppgifter om reproduktiva vanor hos många musselarter, inklusive tidpunkten för övergången mellan ägg, omogna glochidia, och fullt utvecklad glochidia redo för fastsättning till värdar. För de flesta arter är det oklart hur länge honor grubbla glochidia och hur snabbt befruktade ägg utvecklas fullt ut. Kunskapsluckorna är ofta bredare för arter av bevarande oro, som presenterar behovet av en standardiserad metod för att utvinna Gills innehåll som har testats för icke-dödliga effekter och kan främjas till det vetenskapliga samfundet att komplettera traditionella metoder för insamling av uppgifter, utan att utgöra ett hot mot de skyddade befolkningarna24,31,32.
Denna studie hade tre mål: 1) formalisera en Gill provtagningsteknik och testa den för dödliga och icke-dödliga effekter på kvinnliga musslor in situ, 2) karakterisera olika stadier av glochidial utveckling och beskriva en standardiserad metod för att identifiera och rapportera olika larvstadier, och 3) skapa en offentlig lagringsplats för insamlade data. Fältundersökningar, långsiktiga övervakningsprojekt och museisamlingar representerar alla möjligheter för det protokoll som beskrivs här att implementeras och ytterligare uppgifter som ska samlas in för ett bredare intresse. Den formaliserade protokoll innehåller visuella och tecken beskrivningar för att differentiera varje steg av larv utveckling. Genom att standardisera kategorierna kan de insamlade resultaten jämföras mellan alla förekomster och arter. När uppgifter har samlats in, kan alla lämnas till sötvatten mus SEL graviditet almanacka (FMGA), som är en databas för graviditet information som samlats in med hjälp av detta protokoll. En slutprodukt för att lagra och sammanställa all graviditet information som samlas in kommer att ge ett forskningsverktyg för att underlätta framtida forskning, bevarande, och återhämtning insatser. Införlivandet av denna metod i olika mus SEL projekt och inlämning av uppgifter till FMGA skulle öka bredden på kunskapen om mus SEL arternas graviditet under hela året. Som en mycket imperiled grupp av organismer, detta protokoll och resulterande databas om reproduktiva vanor sötvatten musslor är viktigt att förstå populationsdynamik och underlätta bevarandet av dessa arter.
Betydelse
Bevarandet av imperiled arter beror på framgångsrik rekrytering inom bevarade populationer. I vissa fall kan artificiell förökning behövas för att öka rekryteringen av dessa riskpopulationer. Detta kräver att forskare informeras om tidpunkten för aktiv reproduktion för varje art och eventuellt tillämpar olika metoder eller förvaltningsmetoder för att mildra effekterna på rekryteringen. Som en imperiled grupp av organismer, är det av största vikt att etablera en standardiserad och icke-dödlig strategi för att studera reproduktiva vanor, och att tillhandahålla en plattform för att sammanställa och visualisera data för att informera det vetenskapliga samfundet med de mest up-to-date information som finns tillgänglig. Denna studie ger ett steg-för-steg-protokoll för att säkerställa försiktighetsåtgärder vidtas, och Gills innehåll kan vara adekvat provtagning och utvärderas från kvinnliga musslor. Detta protokoll testades för dödliga och icke-dödliga effekter, vilket gör det möjligt för forskare och chefer att ansvarsfullt genomföra denna metod. Vi utvecklade också en uppsättning databas hanteringsverktyg och program för att underlätta sammanställning av graviditet information på en allmänt tillgänglig, användarvänlig instrumentpanel. Studier om epidemiologi, glochidia morfologi, livshistoria, Phylogenetics, förökning, och translokationer kan alla gynna och utnyttja denna databas av temporala graviditet information för alla arter av sötvatten musslor.
Denna studie stödde enbart tidigare studier ‘ fynd av vissa arter reproduktiva vanor men också avslöjade ny information om andra. Även om v. vibex samlades in i färre antal än v. lienosa, kan man hitta likheter mellan de två baserat på graviditet data. Båda arterna av villosa verkar grubbla helt utvecklade glochidia under en stor del av året, som kännetecknar dem som en övervintrande brooder. Detta är förenligt med tidigare studier på andra villosa arter43,44,45. Resultaten av denna studie tyder H. australis kan hittas dräktig från oktober och övervintrande i juni, utom inga fångar hittades dräktig i december. En tidigare publicerad studie identifierade kongen H. altilis med en graviditet period på fyra månader, mars till46juni,47. Denna slutsats illustrerar en längre graviditet period än man tidigare trott och i allmänhet grupper H. australis som en övervintrande brooder. Som federalt skyddade arter, varierande grubblande perioder för h. altilis och h. australis kan påverka ledningens beslut att bättre skydda populationer under reproducerbara aktiva tider. Elliptio Auktor hittades endast dräktig med ägg i maj och juni vilket motsvarar deras karakterisering som en tachytictic art med en mycket kort grubling period24,48,49, 50. Eftersom data sammanställs på Elliptio arter som använder detta protokoll, kan detaljerad information göra fältarbete effektivare när vissa glochidial utvecklingsstadier är riktade, eftersom glochidia bara finns några månader av året. Inferens från andra arter med lägre urval storlekar är begränsad, men eftersom data sammanställs i databasen, högre urvalsstorlekar kommer att ge insikt i reproduktiva vanor av ytterligare musselarter.
Procedurmässiga kommentarer
Sötvatten musslor och deras glochidia är kända för att vara mottagliga för antropogena stressorer10,35. Under graviditet inspektion, mussla ventiler kan inte vara lätt att öppna, och slarvigt tvingar ventilerna öppna kan orsaka oavsiktlig skada och resultera i stress eller dödlighet. Vissa bräckliga-skalade arter (t. ex. arter av anodonta, leptodea, utterbackia, etc.) och mindre stora individer kan ha mycket bräckliga skal och svaga adductor muskler som kan bryta och riva lätt. Gill sampling kan betraktas som en stressfaktor om hanteringen inte görs ansvarsfullt och med försiktighet. En tidigare studie visade att hantering och luft exponering av musslor under reproducerbara aktiva tider kan orsaka olika fysiologiska påfrestningar, inklusive förtida frisättning av Gills innehåll34. Men en studie som utnyttjar en liknande metod som beskrivs här, fann hantering dräktiga kvinnliga musslor under Gills provtagning inte avbryta den nuvarande barnaskaran eller orsaka för tidig frisättning i både kort och lång sikt grubbla arter16. Dessutom måste en steril spruta användas under detta protokoll för att förhindra oavsiktlig infektion eller korskontaminering när punktera gälar av flera individer. Dessutom är glochidia bräckliga och kullar kan mognas och betonas men inte utvisas. Mogna glochidia i dålig hälsa kan resultera i färre individer reagerar på salt tester35. När man gör distinktionen mellan GD (T) och FDG (T) är det viktigt att salt test med stor urvalsstorlek gör anteckningar om observationer för att noggrant identifiera distinktioner mellan GD och FDG glochidia med hjälp av beskrivningarna i denna studie. När ordentlig vård tas, den minimala stress som induceras av detta förfarande kan möjliggöra för kvinnliga musslor att fortsätta ruinera glochidia naturligt och minska effekterna på rekrytering i befolkningen.
Ytterligare uppgifter kan registreras för att komplettera databasen och ge ett brett sammanhang för reproduktiva vanor sötvatten musslor. Vissa arter (t. ex. arter av Fusconaia), har observerats för att ha gälar av olika färger baserat på utvecklingsstadiet av glochidia51. Under en inledande graviditet kontroll av honan, en beskrivning av Gill färg kan ingå i de rapporterade uppgifterna för att möjliggöra framtida utredning. Dessutom, vid denna punkt i protokollet, kan forskarna notera om grubbedande kvinnliga hittades grubterlighet glochidia i de två yttre gälarna (ektobranchus), två inre gälar (endobranchus), eller alla fyra gälar (tetragenous)17. Denna information kan läggas till FMGA och bidra till att fylla i dataluckor när det gäller ruvar för varje undersökta arter. Miljöförhållanden, särskilt vattentemperatur, kan samlas in och registreras på fältet för en mer heltäckande observation av graviditet status och timing av arter vid olika latituder områden. Forskning visar att miljöparametrar, såsom temperatur, fotoperiod, flödeshastighet och tillgång till livsmedel, kan framkalla reproduktiva händelser i sötvatten musslor52,53,54,55 ,56. Ytterligare fält kan läggas till databasen som de lämnas in för att främja framtida forskning om abiotiska faktorer som påverkar graviditet. En modifiering av Capture-mark-recapture modellerad efter vår studie kan också läggas till detta protokoll, vilket skulle göra det möjligt för forskare att övervaka en specifik musslans reproduktiva vanor och avslöja information om flera kullar per år.
Riktigheten av informationen i FMGA beror på källan. Till exempel är felidentifiering av sötvatten musslor vanligt på grund av att många arter har liknande yttre egenskaper som gör det svårt att skilja mellan arter57. Ett Gill prov från en felidentifierad individ skulle kunna skapa förvirring och falsk information för en arternas häckningsperiod. Om en Gill prov tas, fotografier bör tas av inuti båda ventilerna (om individen inte är vid liv), utanför höger ventil, och umbo (gångjärn där två ventiler ansluta) och in med graviditet data via skrivbordet webbplats eller mobil applikation. Vi välkomnar också bilder av Gills innehåll. Inom inlämnings formulären finns en nedrullningsbar meny som gör det möjligt för insamlaren att ange sin förtroendenivå när det gäller artidentifiering. Innan posten har validerats kommer denna information att beaktas vid kontroll av insamlare identifiering mot sannolik distribution, etc. På grund av den höga graden av intraspecifika morfologisk variation hos arter av unionidae uppmuntras inlämning av vävnadsprover och kan behövas för att underlätta molekylär identifiering.
Framtida konsekvenser
Som en icke-dödlig metod, detta protokoll kan tillämpas på både vanliga och imperiled arter. Graviditet kalendrar för imperiled arter kan hjälpa bevarande chefer som arbetar med utrotningshotade arter lagstiftning och återhämtningsplanering genom att ge information om tidsperioder när arter är reproduktivt aktiva. De statliga och federala myndigheter som förvaltar at-risk arter kan bättre råda tillstånd tilldelningar för tider då arten inte är sårbara och reproducera, och även begränsa skörden av värd fisk under tider musslor är grubverande fullt utvecklad glochidia. Dessutom kan fältundersökningar inriktas på arter under icke-reproduktiva perioder för att minimera påverkan på rekryteringsprocesser. Den allmänt tillgängliga databasen, FMGA, tillhandahåller ett verktyg för forskare och chefer att få viktig reproduktiva information om alla mål sötvatten mussla arter. Databasen kommer också att belysa dataluckor och uppmuntra till ytterligare forskning om artspecifika brooderande mönster. Eftersom förstå en art reproduktions mönster möjliggör lämpliga förvaltningsbeslut som skall genomföras, vi hoppas att vårt protokoll och databas underlätta framtida sötvatten mussla forskning, bevarande, och återhämtning.
The authors have nothing to disclose.
Författarna skulle vilja tacka finansieringskällorna: U.S. Fish and Wildlife Service och US Geological Survey. Ett särskilt tack till Andrew hartzog och Sandra Pursifull för att organisera fält besättningar och datainsamling, tillsammans med Lauren Patterson och Chris Anderson för deras värdefulla bidrag till databas utveckling. Vi vill också tacka alla som hjälpte till på området och laboratoriet inklusive Sherry Bostick, mark Cantrell, Sahale Casebolt, Jordan Holcomb, Howard Jelks, Gary Mahon, John McLeod, Kyle Moon, Cayla Morningstar, Emma Pistole, Matt Rowe, Channing St. Aubin och Jim Williams. All användning av handels-, firma-eller produktnamn är endast för beskrivande ändamål och innebär inte godkännande av den amerikanska regeringen.
1.5 mL snap cap centrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5510 | Snap cap tubes are important in the field so the loose screw cap is not lost. |
20 G needle on 10 mL disposable syringe | Exelint International | 26255 | sterile 10 mL disposable syringe with needle Model: 10ml Luer Lock Tip W/20G X 1 1/2" |
Dissecting Microscope | any | any | |
Marking Pen | Fisher Scientific | 13-379-4 | This is what we used but any marker that can write on small plastic tubes will do. This one is fairly ethanol and water proof. |
Molecular grade ethanol | any | any | Needed if preserving gill contents. Non-denatured 95% is needed for genetic work, 70% is needed for SEM imaging work. |
Paper | any | any | Needed to record information on samples collected. |
Pen/pencil | any | any | If in the field, better to write on waterproof paper with pencil so it doesn't smear. If in the museum/lab, any writing utensil is fine. |
Petri dish | DWK Life Sciences (Kimble) | 23000-9050 | This is what we used but any petri dish available is fine. It is nicer to have the taller walls in case too much water is used. |
Sodium Chloride | any | any | Needed for NaCl test for reactive glochidia. Preserved samples do not need this. |
Speculum | any | any | Only needed if you want help opening the valves of a live mussel. |
Sterile water | any | any | Added to gill samples to be evaluated for reactivity within 24 hours of collection. |
Super glue | Gorilla | Gorilla super glue gel | Used to apply tags and only needed if conducting a capture-mark-recapture study. |
Tags | Hallprint | FPN 8×4 | Only needed if conducting a capture-mark-recapture study. |
Transfer Pipet | Thermo Scientific Samco | 225 | This is what we use but any transfer pipet or squirt bottle is applicable. |
Tweezers | any | any | Needed to move crystals of NaCl for salt test. Preserved samples do not need this. |
Waterproof paper | RainWriter | any | Only needed if conducting work in the field. This allows you to record information on each individual gill contents are extracted from. |
Wooden pick | any | any | Only needed if you want help opening the valves of a live mussel. |