原発性肝細胞保存のためのバルク液滴ガラス化

Summary

この原稿は、一次細胞を低濃度で凍結保護剤で予インし、大きな液滴でガラス化するラット肝細胞を大量に採取する氷のない凍結保存法について説明する。

Abstract

ガラス化は、生物学的試料の古典的な低速凍結(約1°C/分)凍結のための有望な氷のない代替手段です。ガラス化は、有害な氷の形成を避けながら、ガラス相への水の移行を達成するために非常に高速な冷却速度を必要とします。凍結保護剤(CPA)によるプレインキュベーションは、生体試料の臨界冷却速度を低下させることができるが、ガラス化による氷のない凍結保存を可能にするためには、一般に高濃度が必要である。その結果、ガラス化はCPA毒性によって妨げられ、速く冷却することができる小さなサンプルに制限される。最近、これらの固有の制限はバルク液滴ガラス化によって克服できることが実証された。この新規な方法を用いて、細胞はまず低い細胞内CPA濃度でプレインキュベートされる。急速な浸透圧脱水を利用して、細胞内CPAは、完全に有毒なCPA濃度を平衡化する必要なしに、ガラス化の直接前に集中する。細胞脱水は流動装置で行われ、液体窒素中でガラス化される大きいサイズの液滴の連続的な高スループット生成と統合される。CPA毒性を最小限に抑えたこの氷のない凍結保存法は、大量の細胞に適しており、古典的な低速凍結凍結凍結保存と比較して肝細胞の生存率と代謝機能の増加をもたらす。この原稿は、バルク液滴ガラス化を成功させるための方法を詳細に説明する。

Introduction

肝細胞の凍結保存後の細胞生存率および代謝機能の喪失は、臨床応用を制限する大きな問題^{であり、1、2、3}である。肝細胞凍結保存のベンチマーク法は、CPA(ジメチルスルホキシド[DMSO]、グルコース、アルブミン)およびその後の制御速度凍結(約1°/分)を用いて肝細胞を事前にインキュベートすることによって行われる、ゆっくりと凍結する。極低温^4,5.多くの報告された最適化にもかかわらず、氷形成の凍結および機械的ストレス中の有害な浸透性不均衡と共にCPA毒性は、低速^凍結6、7の根本的な欠点のままである。

ガラス化は、氷形成による傷害がガラス^状態6への水の直接相転移によって完全に回避されるという点で、凍結が遅いよりも優位性を提供する。しかし、純水のガラス転移温度(-137°C)に達するには、水が毎秒100万°C(すなわち、臨界冷却速度)の速度で冷却され、ガラス転移温度を超える氷の形成を避ける必要^{があります。}.CPAを添加すると、臨界冷却速度を低下させ、水^溶液9のガラス転移温度を上昇させることができる。しかし、CPA濃度が高い場合でも(例えば、40%v/v DMSO以上)高速冷却速度は、それにもかかわらず、ガラス化^を成功させるために必要と^{される8、9}である。

必要な冷却速度と高いCPA濃度は、ガラス化の2つの主要な欠点をもたらす。まず、高速冷却を可能にするには、サンプルの熱質量が低い必要があります。第二に、浸透圧損傷を回避しながら高いCPA濃度に達するためには、CPAをゆっくりと導入し、細胞外^{コンパートメント6}の間で完全に平衡化しなければならない。これにより、細胞の有毒なCPAへの暴露時間が増加します。この結果、ガラス化は、一度に少数の小さなサイズのサンプル(マイクロリットル)に限定される面倒なプロセスになります。液滴ガラス化は、これらの制限に対する潜在的な解決策として提案されている。微小細胞を含む液滴(ナノリットル)を液体窒素に曝露することにより、冷却速度が著しく増加し、その結果、CPA^{濃度10、11、12}の大幅な低下が可能になる。^、13、14.複数の高周波液滴発生ノズルを同時に使用する可能性がありますが、非常に小さな液滴サイズ^は、10分あたりのマイクロリットルにスループットを制限し、大きなセルの効率的なガラス化を妨げます。毎分ミリリットルの順序で処理速度が大きい容積。

近年、これらの固有のガラス化の限界はバルク液滴ガラス^化15によって克服できることが実証された。この新しい方法は、急速な浸透圧脱水を利用して、ガラス化直前の7.5%v/v/vエチレングリコールおよびDMSOの細胞内CPA濃度を濃縮し、有毒CPA濃度の完全な平衡化の必要性を排除する。細胞脱水は、高い細胞外CPA濃度に肝細胞を短時間曝露することによって流体装置で行われる。この暴露は急速な浸透脱水を引き起こすが、高いCPA濃度が細胞に拡散するには短すぎる。脱水直後、細胞は液体窒素中で直接ガラス化された液滴にロードされる。この方法は、高い細胞外CPA濃度が大きなサイズの液滴のガラス化を可能にし、最小限のCPA毒性で高スループットボリュームをもたらす一方で、高いCPA濃度の完全な細胞内取り込みの必要性を排除します。

液滴ガラス化は、保存後の直接的および長期的な生存率を改善するだけでなく、遅^凍結15による古典的凍結保存と比較して原発性ラット肝細胞の形態および代謝機能を改善する。この原稿は、原発性ラット肝細胞のバルク液滴ガラス化のための方法論的詳細を提供する。

Protocol

このプロトコルの主要な肝細胞分離は、米国マサチューセッツ州ボストンのマサチューセッツ総合病院の細胞資源コア(CRC)によって行われた。動物プロトコル(#2011N000111)は、マサチューセッツ総合病院の動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認されました。

1. バルク液滴ガラス化

1. ガラス化ソリューションを準備します。
   1. ウィスコンシン大学溶液(UW)の17.0 mLにウシ血清アルブミン(BSA)40mgを加えて、ガラス化溶液1(V1)を作る。0.22μmフィルターを使用してV1溶液を滅菌し、4°Cで保管します。
      注:UWは、一般的に使用される臓器保存ソリューションです。50g/Lヒドロキシエチル澱粉が含まれています。 35.83 g/L ラクトリビン酸, 3.4 g/L リン酸カリウム 単塩基, 1.23 g/L 硫酸マグネシウムヘプタ水和物, 17.83 g/L ラフィノース五水和物, 1.34 g/L アデノシン, 0.136 g/L アロプリノール, 0.992 g/L/L水酸化カリウム、及び水酸化ナトリウムを7.4に調整する。
   2. UWの7.0 mL、DMSOの6.5 mL、エチレングリコール(EG)の6.5 mL、BSAの40 mg、および5.48 gのスクロースを組み合わせて、ガラス化溶液2(V2)を作ります。0.22μmフィルターを用いてV2溶液を滅菌する。3 mLシリンジに滅菌フィルターV2溶液を3.5mLロードし、4°Cで保存します。
      注:CPAの溶解を容易にするために、ソリューションは必要以上に大量に調製されます。
2. バルク液滴ガラス化装置を準備します。
   1. 混合針を準備するには、まず混合針の外側の灰色の袖の片側に沿ってカットし、次にスリーブを開いて混合針から取り外します。
   2. 混合針の入口に2つの25mmシリコーンチューブセクションをスライドさせ、接着剤でその位置を固定します(図1A)。
   3. 図1Aに示すように、針を20mmの長さ(すなわち、内側混合らせんの長さ)にカットします。
      注:混合針の長さは針の中の容積に比例するので、高いCPA濃度の解決への肝細胞の露出時間を制御するために変更することができる。
   4. 混合針のカットオフコンセントを20G注入針に差し込みます(図1B)。
      メモ:注射針のサイズは液滴のサイズに影響を与えます。
   5. オートクレーブ処理により混合針アセンブリを殺菌します。
   6. 液体窒素で無菌デュワーを充填します。滅菌層流細胞培養フードにデュワーを入れる前に、デュワーの外側をイソプロパノールで殺菌します。
      注:汚染は、液滴を液体窒素に直接さらす際の重要な考慮事項です。現在のプロトコルには非殺菌液体窒素を用いた汚染はなかったが、液体窒素を濾過または照射して、必要に応^じて16を確実に殺菌することができる。
   7. 液体窒素デュワーの内径と同じ外径のじょうごを50mL円錐管に挿入し、液滴回収装置を作成する(図1C−E)。
   8. 液性窒素に液滴回収装置を沈め、大きな鉗子を使用して最終的な垂直位置にゆっくりと押し下げる。円錐管がデュワーの下部の垂直位置にあることを確認します(図 1D-E)。
      注:漏斗は、円錐形チューブに挿入し、休んだままにする必要があります。液体窒素レベルは、図1Dに示すように、漏斗の入口高さより1cm下にある必要があります。
   9. シリンジポンプの足から細胞培養フードの壁から突き出たねじに弦を結びつけて、細胞培養フードの壁の壁の垂直位置にシリンジポンプを取り付けます。
   10. 液体窒素デュワーを、垂直に取り付けられたシリンジポンプの下に液滴回収装置で置きます(図1E)。
3. CPAを事前にインキュベートします。
   1. 単離したばかりのラット肝細胞を得た後、トリパンブルー除外によってストック濃度をカウントし、4000万の生存可能な肝細胞を取る。
      注:懸濁液中の肝細胞の穏やかな取り扱いは、細胞死を防ぐために重要です。
   2. ブレーキなしで50 x gで遠心分離。
   3. 上清を吸引し、V1溶液の3.4 mLで肝細胞を再中断する。
   4. 氷の上で3分間インキュベートする。
   5. 150 μL の DMSO と 150 μL の EG を肝細胞に加え、穏やかに混ぜます。
   6. 氷の上で3分間インキュベートする。
   7. ここでも、150μLのDMSOと150μLのEGを肝細胞に加え、穏やかに混ぜます。
   8. 3 mL シリンジに 3.5 mL をロードします。
4. ガラス化を実行します。
   1. 注射済み肝細胞とV2溶液注射器を入れた注射器をシリンジポンプアダプターに挿入します。
   2. 2つのメスのルアーロックホースバーブアダプタを注射器に取り付け、混合針アセンブリのシリコーンチューブをバーブ継手の上にスライドさせます(図1F)。
   3. アセンブリ全体をシリンジポンプに配置します(図1E)。
   4. DMSOおよびEGを肝細胞に最後に添加してから3分後、ポンプを2mL/分で開始する。
   5. すべての肝細胞が液体窒素に添加された後、ポンプを停止します。

2. 極低温貯蔵

1. 図1Bに示すように、20G針を用いて50mL円錐管の蓋に10個の小さな穴を穿刺し、蓋の外側をフレキシブルフィルムで包む。これは残った液体窒素を蒸発させるのを可能にする弁を作成する。
2. ガラス化された肝細胞液滴を回収するには、まず液体窒素デュワーから漏斗を除去する。次に、長い鉗子を使用して液体窒素から液滴を含む円錐管を取り出し、円錐管から余分な液体窒素をゆっくりと注ぎます。
3. 円錐形のチューブを穿刺した蓋で閉じ、液体窒素デュワーに戻すガラス状の肝細胞液滴で閉じた円錐管を直接置きます。
4. 液体窒素から液体窒素蒸気凍結タンクに円錐管を移します。

3. ガラス化肝細胞液滴の再温

1. 再温第 2 ソリューションを準備します。
   1. 17.13gのスクロースをDMEM肝細胞培養媒体の100mLに溶解し、再温暖化溶液を作る。滅菌フィルターは、0.22μmフィルターを使用して再温暖化溶液をフィルターし、37°Cに温めます。
2. 肝細胞を温める。
   1. クライオタンクからガラス化された肝細胞を含む円錐管を取り出し、液体窒素デュワーで細胞培養フードに輸送します。
   2. キャップを軽く緩め、円錐形のチューブを液体窒素に戻します。
   3. 硝子体にガラス化肝細胞液滴を加え、温かい(37°C)の再温直溶液を瞬時に加え、直ちに10個撹拌する。
      注:再温暖化中に凍結を避けるために迅速に作業することが重要です。研究要件に応じて、一度に少数からすべてのガラス化液滴を再温することができます。
3. 再温第 2 ソリューションをアンロードします。
   1. 2つの50 mL円錐管上の肝細胞でリウォーミング溶液を分割します。
   2. ブレーキなしで4°Cで100 x gで2分間2つの円錐形の管を遠心分離する。
   3. 円錐管の卒業マークを基準にして12.5mLの総容積を残し、円錐管あたり12.5mLの氷冷DMEMを加え、再温暖化溶液を50%に希釈するように上清を吸引する。
   4. 肝細胞を再サスペンドし、氷上で3分間インキュベートする。
   5. 円錐管あたり25mLの氷冷DMEMを加え、再温暖化溶液を25%に希釈します。
   6. ブレーキなしで4 °Cで50 x gで5分間遠心分離機。
   7. 上清を吸引し、使用するために所望の培養培地の2mLで肝細胞を再中断する。
      注:密度勾配遠心分離は、必要に応じて細胞懸濁液から死んだ肝細胞を除去するために使用することができます。

Representative Results

5つの異なるラット肝臓から単に単離された一次肝細胞は、^文献4で報告された優れた低速凍結プロトコルを用いた古典的な凍結保存に対するバルク液滴ガラス化の直接比較に使用^された。 要するに、肝細胞をBSA(2.2mg/mL)、グルコース(333mM)、およびDMSO(10%v/v)を補充したUWに懸濁し、制御レート冷凍庫を用いて凍結した。-196°で保存した後、試料を温水浴で解凍した。すべての氷が溶融した後、DMSOを直接希釈し、浸透性損傷を軽減するために複数の工程中にグルコース濃度を徐々に低下させた。正確なプロトコル^は、15の他の場所で詳細に見つけることができます。保存期間は2〜8日変化し、等しい比較を確実にするために、各生物学的複製のバルク液滴ガラス化と凍結凍結保存の間で一致させた。より短い保存時間は、実用的な考慮事項のために試験されたが、一次肝細胞は、生存率^の損失なしに何年も-196°Cで保存することができることに留意すべきである5.

バルク液滴ガラス化は、膜の完全性を決定するトリパンブルー除外試験によって測定された79%の直接ポスト保存肝細胞生存率をもたらす(図2A)。これは、古典的な最適化された凍結保存後の68%の生存率よりも有意に高い。バルク液滴ガラス化の収率は、従来の凍結保存と比較して、10%高く、より重要な一貫性を持つ56%である(図2B)。

長期コラーゲンサンドイッチ培養におけるプレストブルー代謝エッセイを用いて測定した肝細胞の代謝活性は、古典的凍結保存後よりもバルク液滴ガラス化後に有意に高かった。肝細胞の合成機能の最も広く使用されているアルブミン合成は、古典的な凍結保存と比較してバルク液滴ガラス化後にほぼ2倍大きかった(図3A)。尿素産生は肝細胞解毒機能の最も広く使用されるパラメータである。1週間培養後、バルク液滴ガラスガラスの尿素産生は、古典的な凍結保存肝細胞のそれよりも有意に高かった(図3B)。

要約すると、バルク液滴ガラス化は、コラーゲンサンドイッチ培養における原発性ラット肝細胞の直接的な保存後生存率および長期代謝機能を改善し、凍結が遅い凍結による凍結保存と比較して改善する。

図1:バルク液滴ガラス化実験セットアップ
(A)混合針を調製し、混合針の入口に2つのシリコーンチューブセクションを取り付ける方法の図。(B)注射針に切断混合針を挿入した図は、混合針アセンブリを完成させる。(C)液滴回収装置を構成する漏斗及び50mL円錐管の図。(D) デュワーにおける円錐管、漏斗、および液体窒素レベルの位置を示すスケッチ。(E)下から上への完全な実験的なバルク液滴ガラス化セットアップの表現:液体窒素デュワー(灰色);。液体窒素デュワー(クリア)の中に配置される液滴収集装置。シリンジポンプ(赤)に置かれる注射器に取り付けられた混合針アセンブリ(クリアイエロー)。(F) 注射器と混合針アセンブリの図。2つの3 mLシリンジは、シリンジポンプアダプタ(青)にクランプされています。一方の注射器は、V1溶液中にプレインキュベートされた肝細胞で満たされ、もう一方は高いCPA濃度溶液(V2溶液)で満たされるべきである。混合針アセンブリは2つの女性のルアーロックホースバーブアダプターによって注射器に取り付けられる。(G)硝子体液滴の貯蔵中に残り蒸発液体窒素を円錐管から脱出することを可能にする極低温貯蔵用円錐状の蓋を作成する方法の図。上:穿刺された穴が付いているふた。下:フレキシブルフィルムで包まれた蓋を穿刺。スケールバー: 1 cm.ここをクリックして、この図の大きなバージョンを表示してください。

図2:肝細胞の生存率と保存後の収率。
(A)新鮮な(灰色)、凍結保存(青)、バルク液滴ガラスガラス(緑色)肝細胞の生存率。(B)凍結保存およびバルク液滴の保存収率は、肝細胞をガラス化した。星: p < 0.05 (ウィルコクソンマッチペア署名ランクテスト).ウィスカー:最小から最大この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:長期コラーゲンサンドイッチ培養における代謝活性
(A)培養日3、5、7におけるフレッシュ(グレー)、凍結保存(青)、バルク液滴ガラスガラス(緑色)肝細胞のアルブミン合成。(B)尿素産生は、新鮮な、凍結保存、およびバルク液滴ガラスガラスをガラス化した。星: p < 0.05 (ペアの一方向 ANOVA の後に複数のテストの Tukey 補正が続きます)。誤差範囲: 標準偏差。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Discussion

凍結が遅い肝細胞の凍結保存は、生存率および代謝機能の低下をもたらす。凍結傷害は完全に避けられているので、ガラス化は、古典的な凍結保存のための有望な代替手段を提供しています^9.しかしながら、CPAによる事前インキュベーションは、臨界冷却^速度8を下げる必要がある。その結果、ガラス化はCPA^毒性17によって妨げられ、少量のサンプル容積に限定される。これらの制限を克服するために、この原稿に提示されたバルク液滴ガラス化法は、低いインキュベートCPA^濃度15を使用しながら大量の細胞のガラス化を可能にするために開発された。このバルク液滴ガラス化は、文献における最も最適な低速凍結凍結保存法と比較して肝細胞生存率および代謝機能の増加につながる。ここでは、バルク液滴ガラス化の包括的な方法と手順の実用的な側面における詳細な洞察を提供する。

プロトコルの複数の手順は重要であり、追加の注意が必要です。非殺菌された液体窒素とのデュワーの充填は、潜在的に半滅菌条件につながる。プロトコルで説明された予防措置を使用して、私たちの長期的なコラーゲンサンドイッチ培養中に汚染は明らかにされませんでした。ただし、必要に応じて追加の殺菌対策を講じることができます。液体窒素は、放射線または濾^過16によって殺菌することができ、システムは、混合針に接続された煙突と液体窒素デュワー上の蓋で完全に閉じてもよい。あるいは、非接触液滴ガラス化方法を検討してもよいが、これはより大きなボリューム^{スループット14}を制限するかもしれない。

プロトコルの他の重要な部分は、CPAのプリロードとアンロードインキュベーション持続時間です。持続時間が長いと有毒なCPA損傷を引き起こす可能性があり、期間が短いと浸透性損傷を引き起こす可能性があります。また、より高い温度での制御されていないマクロおよび顕微鏡的な氷核形成は重度の肝細胞損傷および細胞死につながるので、ガラス化された肝細胞液滴が常にガラス転移温度以下にとどまることを保証することが重要です。実用的な観点から、バルク液滴ガラス化の最も重要なステップは、ガラス化肝細胞液滴の再温である。ガラス化された液滴を液体窒素から除去すると、温かい再温暖化溶液を瞬時に添加して急速に再温化しなければ、数秒以内に凍結することができます。

バルク液滴ガラス化の将来の最適化は、生存率、歩留まり、代謝機能などの保存結果をさらに改善する可能性があります。透過性と非透過性の両方のCPAをテストして、ガラス化の前に浸透脱水を最適化することができます。これは脱水中の浸透性ショックを減らし、インキュベートされたCPA濃度を減少させる可能性もある。さらに、連続的な流体は、バッチワイズの代わりに、CPAプリインキュベーションは理論的に無制限の細胞量のガラス化を可能にするであろう。バルク液滴ガラス化には一般的な実験装置のみが必要なため、他の細胞タイプの保存に使用できる可能性のあるシンプルで費用対効果の高い保存方法です。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Disposable 3 mL Syringes with Luer-Lok Tips	Fisher Scientific	14-823-435
Beaker	Sigma-Aldrich	CLS1000-250
Belzer UW Cold Storage Solution	Bridge to Life	BUW-001
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Cole-Parmer Female Luer to 1/16" low-profile semi-rigid tubing barb, PP	Cole-Parmer	EW-45508-12
Cryogentic stroage tank / Cryotank	Chart Industries	MVE 800
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418
DMEM, powder, high glucose, pyruvate	Life Technologies	12800-082
Ethylene Glycol	Sigma-Aldrich	107-21-1
Extra long forceps	Fisher Scientific	10-316C
Fisherbrand Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes - Flat top closure	Fisher Scientific	06-443-18
Fishing line	Stren	SOFS4-15
Liquid nitrogen	Airgas	7727-37-9
Masterflex L/S Platinum-Cured Silicone Tubing, L/S 14	Cole-Parmer	EW-96410-14
Mix Tips, For Use With 3HPW1	Grainger	3WRL7
Nalgene Polypropylene Powder Funnel	ThermoFisher	4252-0100
Needle 20 ga	Becton Dickinson (BD)	305175
Parafilm M - Flexible film	Sigma-Aldrich	P7793-1EA
Razor Blade	Fisher Scientific	12-640
Spatula	Cole-Parmer	EW-06369-18
Steriflip sterile filter	Fisher Scientific	SE1M179M6
Sucrose (Crystalline/Certified ACS)	Fisher Scientific	S5-500
Syringe Pump	New Era Pump Systems Inc.	NE-1000
Thermo-Flask Benchtop Liquid Nitrogen Container	ThermoFisher	2122