Summary
Данная рукопись описывает метод криоконсервации для больших количеств крысиных гепатоцитов, при котором первичные клетки предварительно инкубируются криопротекторными агентами при низкой концентрации и отрифицируются в крупных каплях.
Abstract
Витрификация является перспективной безледной альтернативой классической медленной заморозке (приблизительно при температуре 1 кв/мин) криоконсервации биологических образцов. Витрификация требует чрезвычайно быстрых скоростей охлаждения для достижения перехода воды в стеклянную фазу, избегая при этом вредного образования льда. Хотя прединкубация криопротекторными средствами (CPA) может снизить критическую скорость охлаждения биологических образцов, высокие концентрации, как правило, необходимы для обеспечения свободного ото льда криоконсервации путем витрификации. В результате, витрификация затрудняется токсичностью CPA и ограничивается небольшими образцами, которые могут быть охлаждены быстро. Недавно было продемонстрировано, что эти присущие ограничения могут быть преодолены путем витрификации капель. Используя этот новый метод, клетки сначала предварительно инкубируются с низкой внутриклеточной концентрацией CPA. Используя быстрое осмотическое осмотическое обезвоживание, внутриклеточная CPA концентрируется непосредственно перед витрификации, без необходимости полностью уравновесить токсичные концентрации CPA. Обезвоживание клеток осуществляется в жидком устройстве и интегрируется с непрерывным высоким генерикцией больших размеров капель, которые витрифицированы в жидком азоте. Этот метод криоконсервации без оледочного льда с минимальной токсичностью CPA подходит для больших количеств клеток и приводит к повышению жизнеспособности гепатоцитов и метаболической функции по сравнению с классической медленной замораживанием криоконсервации. В данной рукописи подробно описаны методы успешного витрификации капель.
Introduction
Потеря жизнеспособности клеток и метаболической функции после криоконсервации гепатоцитов по-прежнему является серьезной проблемой, которая ограничивает клинические применения1,2,3. Эталонным методом криоконсервации гепатоцитов является медленное замораживание, которое осуществляется путем предварительного инкубации гепатоцитов cpA (диметилсульфид (DMSO), глюкозы и альбумина) и последующего контролируемого замораживания скорости (приблизительно при температуре 1 кВ/мин) до криогенные температуры4,5. Несмотря на многие сообщения об оптимизации, токсичность CPA вместе с вредными осмотическими дисбалансами во время замораживания и механическим напряжением образования льда остаются фундаментальными недостатками медленного замораживания6,7.
Vitrification предлагает преимущество над медленным замораживанием в том ушибе из-за образования льда вполне во избежание сразу переходом участка воды в положение стекла6. Однако, чтобы достичь температуры перехода стекла чистой воды (-137 градусов по Цельсию), вода должна охлаждаться со скоростью порядка одного миллиона градусов по Цельсию в секунду (т.е. критическая скорость охлаждения), чтобы избежать образования льда над температурой перехода стекла8 . Добавление CPA может снизить критическую скорость охлаждения и увеличить температуру перехода стекла aqueous решений9. Однако, даже при высокой концентрации CPA (например, 40% v/v DMSO или выше) быстрые скорости охлаждения, тем не менее, необходимы для успешного витрификации8,9.
Требуемые темпы охлаждения и высокая концентрация CPA приводят к двум основным недостаткам витрификации. Во-первых, для обеспечения быстрого охлаждения образцы должны иметь низкую тепловую массу. Во-вторых, для достижения высоких концентраций CPA, избегая при этом осмотических травм, CPAs должны быть медленно введены и полностью уравновешивать между внутри- и внеклеточными отсеками6. Это увеличивает время воздействия клеток на токсичные CPAs. Вместе это делает витрификацию громоздким процессом, который ограничивается несколькими небольшими образцами (микролитрами) за один раз. Витрификация droplet была предложена в качестве потенциального решения этих ограничений. Путем подвергать подвергать действию миниатюрные клетк-нагруженные капли (нанолитры) к жидкому азоту скорость охлаждения значительно увеличена, которая следовательно позволяет значительно уменьшение в концентрации CPA10,11,12 ,13,14. Хотя несколько высокочастотных капель генерирующих сопла потенциально могут быть использованы одновременно, очень небольшой размер капли ограничивает пропускную мощность до микролитров в минуту10, что исключает эффективное стеклоизацию больших клеток объемы с величинами более высокие темпы обработки на порядок миллилитров в минуту.
Недавно было продемонстрировано, что эти присущие ограничения витрификации могут быть преодолены с помощью объемной витрификации капель15. Этот новый метод использует быстрое осмотическое обезвоживание, чтобы сконцентрировать внутриклеточную концентрацию CPA 7,5% v/v этиленгликоль и DMSO непосредственно предшествующие витрификации, устраняя необходимость полного равновесия токсичных концентраций CPA. Клеточное обезвоживание осуществляется в жидком устройстве путем краткого воздействия гепатоцитов на высокую внеклеточное концентрацию CPA. Хотя это воздействие вызывает быстрое осмотическое обезвоживание, это слишком короткий для высокой концентрации CPA, чтобы диффундировать в клетки. Сразу после обезвоживания клетки загружаются в капли, которые непосредственно витрифицированы в жидком азоте. Этот метод устраняет необходимость полного внутриклеточного поглощения высоких концентраций CPA, в то время как высокая внеклеточное концентрация CPA позволяет витрификации крупных размеров капель, в результате чего высокие объемы пропускной способностью с минимальной токсичностью CPA.
Капля витрификация улучшает прямую и долгосрочную жизнеспособность после сохранения, а также морфологию и метаболическую функцию первичных крысиных гепатоцитов по сравнению с классической криоконсервацией путем медленного замораживания15. Данная рукопись содержит методологические детали для оплошной витрификации первичных крысиных гепатоцитов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Первичные изоляции гепатоцитов для этого протокола были выполнены Cell Resource Core (CRC) в Массачусетской больнице общего профиля, Бостон, штат Массачусетс, США. Протокол о животных (#2011N000111) был одобрен Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Массачусетской больницы общего профиля.
1. Массовая витрификация капель
- Подготовьте решения для витрификации.
- Добавьте 40 мг бычьего сывороточки (BSA) в раствор 17,0 мл раствора Университета Висконсина (UW), чтобы сделать стеклоификационный раствор 1 (V1). Стерильный фильтр V1 раствор с помощью фильтра 0,22 мкм и хранить при 4 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: UW является широко используемым решением сохранения органов. Содержит 50 г/л гидроксиэтил крахмала, 35,83 г/л лактобионической кислоты, 3,4 г/л моноосновных, 1,23 г/л магния сульфат гептагидрат, 17,83 г/л раффиноза пентагидрат, 1,34 г/л аденозин, 0,136 г/л аллопуринол, 0,992 г/л общий клейтатион, 5,61 г глютятиона, 5,61 г глютятиона, 5,61 г. /L гидроксид калия и гидроксид натрия для регулировки рН до 7,4. - Комбинат 7,0 мл UW, 6,5 мл DMSO, 6,5 мл этиленгликоль (EG), 40 мг BSA, и 5,48 г сахарозы, чтобы сделать стекловидное решение 2 (V2). Стерильный фильтр V2 раствор с помощью фильтра 0,22 мкм. Загрузите 3,5 мл стерильного фильтрованного раствора V2 в шприц объемом 3 мл и храните при 4 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для облегчения роспуска CPA, решения готовятся в больших количествах, чем требуется.
- Добавьте 40 мг бычьего сывороточки (BSA) в раствор 17,0 мл раствора Университета Висконсина (UW), чтобы сделать стеклоификационный раствор 1 (V1). Стерильный фильтр V1 раствор с помощью фильтра 0,22 мкм и хранить при 4 градусах Цельсия.
- Подготовьте объемкапли витрификационный аппарат.
- Для подготовки смешивания иглы, сначала вырезать вдоль одной стороны внешнего серого рукава микширования иглы, а затем согните рукав открытым, чтобы удалить его из микширования иглы.
- Сдвиньте две 25-мм силиконовые трубки разделов над входами микширования иглы и закрепите их положение клеем(рисунок 1A).
- Разрежьте иглу до длины 20 мм (т.е. длина внутренней сракаки), как показано на рисунке 1А.
ПРИМЕЧАНИЕ: Длина иглы смешивания пропорциональна объему внутри иглы и поэтому может быть изменена для контроля времени воздействия гепатоцитов к высокому раствору концентрации CPA. - Вставьте выход отсечки иглы смешивания в 20 G инъекционной иглы(рисунок 1B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Размер иглы впрыска влияет на размер капли. - Стерилизовать смешивания иглы сборки с помощью автоклавирования.
- Заполните стерильный Dewar жидким азотом. Стерилизовать за пределами Dewar с изопропанола до размещения Dewar в стерильных ламинарных клеточных клеток капот.
ПРИМЕЧАНИЕ: Загрязнение является важным фактором при непосредственном воздействии капель на жидкий азот. Хотя в текущем протоколе не было загрязнения с использованием нестерилизованного жидкого азота, жидкий азот может быть отфильтроваемым или облученным, чтобы принеобходимостиобеспечить стерильность. - Вставьте воронку с тем же внешним диаметром, что и внутренний диаметр жидкого азота Dewar, в коническую трубку мощностью 50 мл для создания устройства сбора капель(рисунок 1СиE).
- Погрузите устройство сбора капель в жидкий азот, медленно нажимая его в своем окончательном вертикальном положении с помощью больших щипц. Убедитесь, что коническая трубка лежит в вертикальном положении в нижней части Dewar (Рисунок 1DиE).
ПРИМЕЧАНИЕ: Воронка должна оставаться вставленной и опираться на коническую трубку. Уровень жидкого азота должен быть на 1 см ниже высоты впускной воронки, как показано на рисунке 1D. - Установите шприц насос атакжем в вертикальном положении на стене капота клеточной культуры, связывая строку с ног шприца насоса к винтам, выступающим от стены капота клеточной культуры.
- Поместите жидкий азот Dewar с устройством сбора капель под вертикально установленный шприц насос(рисунок 1E).
- Предварительно инкубировать с CPAs.
- После получения свежеисзолев крысиных гепатоцитов, подсчитайте концентрацию запасов трипансиний исключение и принять 40 миллионов жизнеспособных гепатоцитов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нежная обработка гепатоцитов в подвеске имеет решающее значение для предотвращения смерти клеток. - Центрифуга при 50 х г в течение 5 мин без тормоза.
- Приготовьте супернатант и отрепримите гепатоциты в 3,4 мл раствора V1.
- Инкубировать на льду 3 мин.
- Добавьте 150 кЛ ДМСО и 150 л ЭГ к гепатоцитам и аккуратно перемешайте.
- Инкубировать на льду 3 мин.
- Опять же, добавить 150 л ДМСО и 150 л EG к гепатоцитов и аккуратно перемешать.
- Загрузите 3,5 мл шприца 3 мл.
- После получения свежеисзолев крысиных гепатоцитов, подсчитайте концентрацию запасов трипансиний исключение и принять 40 миллионов жизнеспособных гепатоцитов.
- Выполните витрификацию.
- Вставьте шприц с предварительно инкубированными гепатоцитами и шприцы раствора V2 на адаптер шприца.
- Прикрепите две женщины Luer замок шланг колючка адаптеры для шприцев и слайд силиконовые трубки смешивания иглы сборки над колючка фитинги (Рисунок 1F).
- Поместите всю сборку в шприц насос(Рисунок 1E).
- Через три минуты после последнего добавления DMSO и EG к гепатоцитам, запустите насос на 2 мл/мин.
- Остановить насос после того, как все гепатоциты были добавлены в жидкий азот.
2. Криогенное хранение
- Прокол 10 небольших отверстий в крышке конической трубки 50 мл с использованием иглы 20 G и оберните внешнюю крышку гибкой пленкой, как показано на рисунке 1B. Это создает клапан, который позволяет избежать испарения остатков жидкого азота.
- Для сбора витрифицированных капель гепатоцитов сначала удалите воронку из жидкого азота Dewar. Далее, используйте длинные щипцы, чтобы взять коническую трубку, которая содержит высыхает из жидкого азота и медленно вылить избыток жидкого азота из конической трубки.
- Закройте коническую трубку проколотой крышкой и непосредственно поместите закрытую коническую трубку с унциями витрифицированного гепатоцита обратно в жидкий азот Dewar.
- Перенос конической трубки из жидкого азота в криотанк паров жидкого азота.
3. Регрев капель взвития гепатоцитов
-
Подготовьте решение для разогрева.
- Растворите 17,13 г сахарозы в 100 мл средств массовой информации культуры гепатоцитов DMEM, чтобы сделать решение для разогрева. Стерильный фильтр разогрева раствора с помощью фильтра 0,22 мкм и прогрейте до 37 градусов по Цельсию.
-
Разогрейте гепатоциты.
- Возьмите коническую трубку с витрофифицированными гепатоцитами из криотака и транспортите ее в жидком азоте Dewar в капот клеточной культуры.
- Слегка ослабить крышку и положить конические трубки обратно в жидкий азот.
- Добавить витрифицированные капли гепатоцитов в пустой стакан, мгновенно добавить теплый (37 градусов по Цельсию) разогревающий раствор, и сразу же перемешать в течение 10 с.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно работать быстро, чтобы избежать замораживания во время повторногопотепления. В зависимости от требований к исследованию, несколько всех витрифицированных капель могут быть разогреты одновременно.
-
Разгрузите раствор разогрева.
- Разделите раствор для разогрева гепатоцитами на две конические трубки 50 мл.
- Centrifuge две конические трубки в течение 2 мин при 100 х г при 4 градусах без тормоза.
- Прибавьте супернатант, чтобы оставить общий объем 12,5 мл, используя градационную отметку конической трубки в качестве эталона и добавить 12,5 мл ледяного льда DMEM на коническую трубку, чтобы разбавить раствор разогрева до 50%.
- Отдохните гепатоциты и инкубировать на льду в течение 3 мин.
- Добавьте 25 мл ледяного DMEM на коническую трубку, чтобы разбавить раствор разогрева до 25%.
- Центрифуга в течение 5 мин при 50 х г при 4 градусах без тормоза.
- Аспирировать супернатант и resuspend гепатоцитов в 2 мл желаемой среды культуры для использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Центрифугирование градиента плотности может быть использовано для удаления мертвых гепатоцитов из клеточной подвески при желании.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Свежеизолированные первичные гепатоциты из пяти различных крысиных печени были использованы для прямого сравнения витрификации капель к классической криоконсервации с использованием выдающихся протоколов медленного замораживания, о которых сообщается в литературе4, 5. Короче говоря, гепатоциты были приостановлены в UW дополнены BSA (2,2 мг/мл), глюкозы (333 мм) и DMSO (10% v/v) и заморожены с помощью морозильной камеры контролируемой скорости. После хранения при -196 градусов по Цельсию образцы размораживались в теплой водяной бане. После того, как весь лед растаял, DMSO был непосредственно разбавлен в то время как концентрация глюкозы постепенно снижается в течение нескольких шагов, чтобы уменьшить осмотических травм. Точный протокол можно найти подробно в другом месте15. Продолжительность консервации варьировалась от 2 до 8 дней и сопоставлялась между витрификации капли и замораживанием криоконсервации для каждой биологической репликации для обеспечения равного сопоставления. Хотя более короткие сроки консервации были проверены на практические соображения, следует отметить, что первичные гепатоциты могут храниться при -196 градусов по Цельсию в течение многих лет без потери жизнеспособности5.
Массовая витрификация капли приводит к непосредственному после сохранению гепатоцитов жизнеспособности 79%, измеряется Trypan синий исключение тестирования, которое определяет целостность мембраны (Рисунок 2A). Это значительно выше, чем 68% жизнеспособности после классического оптимизированного криоконсервации. Доходность витрификации капельных капель составляет 56%, что на 10% выше, и, что немаловажно, более последовательно, по сравнению с классической криоконсервацией(рисунок 2В).
Метаболическая активность гепатоцитов, измеренная с помощью эссе presto Blue метаболизации в долгосрочных культурах сэндвичколлена, была значительно выше после витрификации капли капли, чем после классической криоконсервации. Альбумин синтез, который является наиболее широко используемым параметром синтетической функции гепатоцитов, был больше почти в два раза после объемной витрификации капли по сравнению с классической криоконсервации (Рисунок 3A). Производство мочевины является наиболее широко используемым параметром функции детоксикации гепатоцитов. После недельной культуры, производство карбамида навалочных капель витрифицированных гепатоцитов было значительно выше, чем у классических криоконсервированных гепатоцитов(рисунок 3B).
Таким образом, оптовая витрификация капель улучшает прямую жизнеспособность после сохранения и долгосрочную метаболическую функцию первичных крысиных гепатоцитов в культурах коллагена сэндвич, по сравнению с криоконсервацией путем медленного замораживания.
Рисунок 1: Экспериментальная установка витрификации капли.
(A) Иллюстрация того, как подготовить смешивания иглы и прикрепить два силиконовых труб разделев в бухтах смешивания иглы. (B) Иллюстрация вставки разреза смешивания иглы в инъекционных иглы для завершения смешивания иглы сборки. (C) Иллюстрация воронки и 50 мл конической трубки, которые составляют устройство сбора капель. (D) Эскиз, показывающий положение конической трубки, воронки и уровня жидкого азота в Dewar. (E) Представление полной экспериментальной установки витрификации капли снизу вверх: жидкий азот Dewar (серый); устройство для сбора капель, которое помещается внутри жидкого азота Dewar (ясно); смешивания иглы сборки (ясно-желтый) прилагается к шприцы, которые помещаются в шприц насос (красный). (F) Иллюстрация шприцев и смешивания иглы сборки. Два шприца 3 мл зажаты в адаптер насоса шприца (синий); один шприц должен быть заполнен предварительно инкубированными гепатоцитами в растворе V1, а другой с высоким раствором концентрации CPA (раствор V2). Смешивание иглы сборки прилагается к шприцев двумя женщинами Luer замок шланг колючий адаптеры. (G) Иллюстрация того, как создать коническую крышку трубки для криогенного хранения, который позволяет остатки испаряется жидкий азот, чтобы вырваться из конической трубки во время хранения витрифицированных капель гепатоцитов. Вверху: крышка с проколотыми отверстиями. Внизу: проколотая крышка, обернутая гибкой пленкой. Шкала баров: 1 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Жизнеспособность гепатоцитов и выход после консервации.
(A) Жизнеспособность свежих (серых), криоконсервированных (синих) и капли витрифицированных (зеленых) гепатоцитов. (B) Сохранение выход криоконсервированных и объемных капель vitrified гепатоцитов. Звезды: стр. 0;л.; 0,05 (Уилкоксон совпал с парами, подписанными рейтинговым тестом). Усы: от мин до максимума. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Метаболическая активность в долгосрочных культурах сэндвича коллагена.
()Альбумин синтез свежих (серый), криоконсервированный (синий), и объемкапли vitrified (зеленый) гепатоцитов на культуре дней 3, 5 и 7. (B) Уреа производства свежих, криоконсервированных и сыпучих капель vitrified гепатоцитов. Звезды: р/т; 0,05 (парная односторонняя ANOVA, за которой следует коррекция Tukey для нескольких испытаний). Бары ошибок: стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Криоконсервация гепатоцитов путем медленного замораживания приводит к снижению жизнеспособности и метаболической функции. Витрификация предлагает перспективную альтернативу классической криоконсервации, так как замораживания травмы полностью избежать9. Тем не менее, предварительной инкубации с CPAs требуется для снижения критической скорости охлаждения8. Следовательно, витрификация затрудняется токсичностью CPA17 и ограничивается небольшими объемами выборки. В усилиях по преодолению этих ограничений метод витрификации капель, представленный в данной рукописи, был разработан для обеспечения витрификации больших количеств клеток при использовании низкой предварительно инкубантной концентрации CPA15. Эта оптовая витрификация капель приводит к повышению жизнеспособности гепатоцитов и метаболической функции по сравнению с наиболее оптимальным методом медленного замораживания криоконсервации в литературе. Здесь предоставляются комплексные методы витрификации капель и подробные сведения о практических аспектах процедур.
Несколько шагов в протоколе имеют решающее значение и требуют дополнительного внимания. Заполнение Dewar нестерилизовавого жидкого азота потенциально приводит к полустериловому состоянию. Используя меры предосторожности, поясненными в протоколе, не было выявлено загрязнения во время наших долгосрочных культур сэндвича коллагена. Однако в случае необходимости могут быть приняты дополнительные меры по стерилизации. Сжиженный азот может быть стерилизован путем излучения или фильтрации16 и система может быть полностью закрыта крышкой на жидкий азот Dewar с дымоходом, подключенным к игле смешивания. Кроме того, бесконтактные методы витрификации капель могут быть изучены, хотя это может ограничить большую пропускную связь14.
Другими важными частями протокола являются предзагрузка cpA и разгрузка инкубационных длительности. Более длительные сроки могут привести к токсичным травмы CPA в то время как более короткие продолжительности могут привести к осмотической травмы. Кроме того, важно обеспечить, чтобы капли витрифицированного гепатоцита всегда оставались ниже температуры перехода стекла, потому что неконтролируемое макро- и микроскопическое ядро льда при более высоких температурах приводит к тяжелой травме гепатоцитов и гибели клеток. С практической точки зрения, наиболее важным шагом в оптовой витрификации капель является повторное потепление витрифицированных капель гепатоцитов. Когда стекловидные капли удаляются из жидкого азота, они могут замерзнуть в течение нескольких секунд, если не быстро нагреваться, мгновенно добавляя теплый раствор потепления.
Будущая оптимизация витрификации капля может еще больше улучшить результаты консервации, такие как жизнеспособность, урожайность и метаболическая функция. Как проницаемые, так и непроницаемые CPA могут быть протестированы для оптимизации осмотического обезвоживания перед витрификации. Это может уменьшить осмотический шок во время обезвоживания, а также может позволить уменьшить предварительно инкубированные концентрации CPA. Кроме того, непрерывная текучесть, вместо batchwise, CPA предварительной инкубации теоретически позволит витрификации неограниченного количества клеток. Поскольку для витрификации капель требуется только общее лабораторное оборудование, это простой и экономически эффективный метод сохранения, который потенциально может быть использован для сохранения других типов клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют о конкурирующих финансовых интересах. Доктора де Врис, Венг, Тонер, Тессье и Уйгун имеют предварительные патентные заявки, имеющие отношение к данному исследованию. Д-р Uygun имеет финансовый интерес в Organ Solutions, компании, специализирующейся на разработке технологии сохранения органов. Все интересы исследователя управляются MGH и Partners HealthCare в соответствии с их политикой конфликта интересов.
Acknowledgments
Финансирование со стороны Национальных институтов здравоохранения США (R01DK096075, R01DK107875 и R01DK114506) и Министерства обороны США (DoD RTRP W81XWH-17-1-0680) является весьма признанным.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Disposable 3 mL Syringes with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| Beaker | Sigma-Aldrich | CLS1000-250 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | BUW-001 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cole-Parmer Female Luer to 1/16" low-profile semi-rigid tubing barb, PP | Cole-Parmer | EW-45508-12 | |
| Cryogentic stroage tank / Cryotank | Chart Industries | MVE 800 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DMEM, powder, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 12800-082 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 107-21-1 | |
| Extra long forceps | Fisher Scientific | 10-316C | |
| Fisherbrand Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes - Flat top closure | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| Fishing line | Stren | SOFS4-15 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | 7727-37-9 | |
| Masterflex L/S Platinum-Cured Silicone Tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | |
| Mix Tips, For Use With 3HPW1 | Grainger | 3WRL7 | |
| Nalgene Polypropylene Powder Funnel | ThermoFisher | 4252-0100 | |
| Needle 20 ga | Becton Dickinson (BD) | 305175 | |
| Parafilm M - Flexible film | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| Razor Blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Spatula | Cole-Parmer | EW-06369-18 | |
| Steriflip sterile filter | Fisher Scientific | SE1M179M6 | |
| Sucrose (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Thermo-Flask Benchtop Liquid Nitrogen Container | ThermoFisher | 2122 |
References
- Carpentier, B., Gautier, A., Legallais, C. Artificial and bioartificial liver devices: present and future. Gut. 58 (12), 1690-1702 (2009).
- Fox, I. J., Chowdhury, J. R.
- Hughes, R. D., Mitry, R. R., Dhawan, A.
- Stéphenne, X., Najimi, M., Sokal, E. M. Hepatocyte cryopreservation: is it time to change the strategy. World Journal of Gastroenterology. 16 (1), 1-14 (2010).
- Terry, C., Dhawan, A., Mitry, R. R., Lehec, S. C., Hughes, R. D. Optimization of the cryopreservation and thawing protocol for human hepatocytes for use in cell transplantation. Liver Transplantation. 16 (2), 229-237 (2010).
- Pegg, D. E.
- Baust, J. G., Gao, D., Baust, J. M. Cryopreservation: An emerging paradigm change. Organogenesis. 5 (3), 90-96 (2009).
- Hopkins, J. B., Badeau, R., Warkentin, M., Thorne, R. E. Effect of common cryoprotectants on critical warming rates and ice formation in aqueous solutions. Cryobiology. 65 (3), 169-178 (2012).
- Fahy, G. M., MacFarlane, D. R., Angell, C. A., Meryman, H. T. Vitrification as an approach to cryopreservation. Cryobiology. 21 (4), 407-426 (1984).
- Demirci, U., Montesano, G.
- El Assal, R., et al. Bio-Inspired Cryo-Ink Preserves Red Blood Cell Phenotype and Function During Nanoliter Vitrification. Advanced Materials. 26 (33), 5815-5822 (2014).
- Dou, R., Saunders, R. E., Mohamet, L., Ward, C. M., Derby, B. High throughput cryopreservation of cells by rapid freezing of sub-μl drops using inkjet printing--cryoprinting. Lab on a Chip. 15 (17), 3503-3513 (2015).
- Samot, J., et al.
- Shi, M., et al. High-Throughput Non-Contact Vitrification of Cell-Laden Droplets Based on Cell Printing. Scientific Reports. 5 (1), (2016).
- de Vries, R. J., et al. Bulk Droplet Vitrification: An Approach to Improve Large-Scale Hepatocyte Cryopreservation Outcome. Langmuir. , (2019).
- Parmegiani, L., et al. Sterilization of liquid nitrogen with ultraviolet irradiation for safe vitrification of human oocytes or embryos. Fertility and Sterility. 94 (4), 1525-1528 (2010).
- Best, B. P. Cryoprotectant Toxicity: Facts, Issues, and Questions. Rejuvenation Research. 18 (5), 422-436 (2015).
