Summary
Este manuscrito describe un método de criopreservación libre de hielo para grandes cantidades de hepatocitos de rata mediante el cual las células primarias son preincubante con agentes crioprotectores a baja concentración y vitrificadas en grandes gotas.
Abstract
La vitrificación es una alternativa prometedora sin hielo para la criopreservación clásica de muestras biológicas a cámara lenta (a aproximadamente 1 oC/min). La vitrificación requiere tasas de enfriamiento extremadamente rápidas para lograr la transición del agua a la fase de vidrio evitando la formación de hielo perjudicial. Aunque la preincubación con agentes crioprotectores (CPA) puede reducir la tasa de enfriamiento crítico de las muestras biológicas, generalmente se necesitan altas concentraciones para permitir la criopreservación sin hielo por vitrificación. Como resultado, la vitrificación se ve obstaculizada por la toxicidad del CPA y restringida a pequeñas muestras que se pueden enfriar rápidamente. Recientemente se demostró que estas limitaciones inherentes pueden ser superadas por la vitrificación de gotas masivas. Usando este método novedoso, las células se preincuban primero con una baja concentración de CPA intracelular. Aprovechando la deshidratación osmótica rápida, el CPA intracelular se concentra directamente antes de la vitrificación, sin la necesidad de equilibrar completamente las concentraciones tóxicas de CPA. La deshidratación celular se realiza en un dispositivo fluido e integrado con una generación continua de alto rendimiento de gotas de gran tamaño que se vitrifican en nitrógeno líquido. Este método de criopreservación sin hielo con una toxicidad mínima de CPA es adecuado para grandes cantidades de células y resulta en una mayor viabilidad de los hepatocitos y la función metabólica en comparación con la criopreservación clásica de congelación lenta. Este manuscrito describe los métodos para la vitrificación exitosa de gotas masivas en detalle.
Introduction
La pérdida de viabilidad celular y la función metabólica después de la criopreservación de hepatocitos sigue siendo un problema importante que limita las aplicaciones clínicas1,2,3. El método de referencia de criopreservación de hepatocitos es la congelación lenta, que se realiza preincubando los hepatocitos con CPA (dimetil sulfóxido [DMSO], glucosa y albúmina) y posterior congelación de la velocidad controlada (aproximadamente 1 oC/min) a temperaturas criogénicas4,5. A pesar de muchas optimizaciones reportadas, la toxicidad de CPA junto con los desequilibrios osmóticos perjudiciales durante la congelación y el estrés mecánico de la formación de hielo siguen siendo inconvenientes fundamentales de la congelación lenta6,7.
La vitrificación ofrece una ventaja sobre la congelación lenta en que la lesión debido a la formación de hielo se evita por completo por una transición de fase directa del agua al estado de vidrio6. Sin embargo, para alcanzar la temperatura de transición del vidrio del agua pura (-137 oC), el agua debe enfriarse a velocidades del orden de un millón de grados centígrados por segundo (es decir, la tasa de enfriamiento crítico) para evitar la formación de hielo por encima de la temperatura de transición del vidrio8 . La adición de CPAs puede reducir la tasa de enfriamiento crítico y aumentar la temperatura de transición del vidrio de las soluciones acuosas9. Sin embargo, incluso con altas concentraciones de CPA (por ejemplo, 40% v/v DMSO o superior) se requieren, no obstante, tasas de refrigeración rápida para la vitrificación exitosa8,9.
Las tasas de enfriamiento requeridas y las altas concentraciones de CPA dan lugar a dos grandes inconvenientes de la vitrificación. En primer lugar, para permitir un enfriamiento rápido, las muestras deben tener una masa térmica baja. En segundo lugar, para alcanzar altas concentraciones de CPA evitando lesiones osmóticas, los CPA deben introducirse lentamente y equilibrarse completamente entre los compartimentos intra yextracelulares 6. Esto aumenta el tiempo de exposición de las células a los CPA tóxicos. Juntos, esto hace que la vitrificación sea un proceso engorroso que se limita a unas pocas muestras de pequeño tamaño (microlitros) a la vez. La vitrificación de gotas se ha propuesto como una solución potencial a estas restricciones. Al exponer las gotas minúsculas de carga celular (nanolitros) al nitrógeno líquido, la tasa de enfriamiento se incrementa significativamente, lo que permite una reducción considerable de la concentración de CPA10,11,12 ,13,14. Aunque múltiples boquillas generadoras de gotas de alta frecuencia podrían utilizarse potencialmente simultáneamente, el tamaño de las gotas extremadamente pequeña limita el rendimiento a microlitros por minuto10,lo que impide la vitrificación eficiente de células grandes volúmenes con magnitudes mayores tasas de procesamiento en el orden de mililitros por minuto.
Recientemente se demostró que estas limitaciones inherentes de la vitrificación pueden ser superadas por la vitrificación de gotas masivas15. Este novedoso método aprovecha la deshidratación osmótica rápida para concentrar una concentración intracelular de CPA del 7,5% v/v de etilenglicol y DMSO inmediatamente anterior a la vitrificación, eliminando la necesidad de un equilibrio completo de las concentraciones tóxicas de CPA. La deshidratación celular se realiza en un dispositivo fluido mediante una breve exposición de los hepatocitos a una alta concentración de CPA extracelular. Aunque esta exposición causa deshidratación osmótica rápida, es demasiado corta para que la alta concentración de CPA se difunda en las células. Inmediatamente después de la deshidratación, las células se cargan en gotas que se vitrifican directamente en nitrógeno líquido. Este método elimina la necesidad de una aceptación intracelular completa de altas concentraciones de CPA, mientras que la alta concentración de CPA extracelular permite la vitrificación de gotas de gran tamaño, lo que resulta en volúmenes de alto rendimiento con una toxicidad mínima de CPA.
La vitrificación de gotas mejora la viabilidad directa y a largo plazo después de la preservación, así como la morfología y la función metabólica de los hepatocitos primarios de ratas en comparación con la criopreservación clásica por congelación lenta15. Este manuscrito proporciona los detalles metodológicos para la vitrificación de gotas a granel de hepatocitos de ratas primarias.
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Protocol
Los principales aislamientos de hepatocitos para este protocolo fueron realizados por el Núcleo de Recursos Celulares (CRC) en el Hospital General de Massachusetts, Boston, Massachusetts, EE. UU. El protocolo animal (#2011N000111) fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Hospital General de Massachusetts.
1. Vitrificación de gotas a granel
- Preparar las soluciones de vitrificación.
- Añadir 40 mg de albúmina sérica bovina (BSA) a 17,0 ml de la solución de la Universidad de Wisconsin (UW) para hacer la solución de vitrificación 1 (V1). Filtrar estérilmente la solución V1 utilizando un filtro de 0,22 m y almacenar a 4 oC.
NOTA: UW es una solución de conservación de órganos de uso común. Contiene 50 g/L de almidón de hidroxietilo, 35.83 g/L de ácido lactobiónico, fosfato de potasio 3,4 g/L monobásico, 1,23 g/L de sulfato de magnesio heptahidrato, 17,83 g/L de rafinensa pentahidrato, 1,34 g/L de adenosina, 0,136 g/L de alopurinol, 0,992 g/L glutatión total, 5,61 g /L hidróxido de potasio e hidróxido de sodio para ajustar el pH a 7.4. - Combinar 7,0 ml de UW, 6,5 ml de DMSO, 6,5 ml de etilenglicol (EG), 40 mg de BSA y 5,48 g de sacarosa para hacer la solución de vitrificación 2 (V2). Filtrar estérilmente la solución V2 utilizando un filtro de 0,22 m. Cargue 3,5 ml de solución estéril filtrada V2 en una jeringa de 3 ml y guárdela a 4 oC.
NOTA: Para facilitar la disolución de los CPA, las soluciones se preparan en cantidades mayores de las requeridas.
- Añadir 40 mg de albúmina sérica bovina (BSA) a 17,0 ml de la solución de la Universidad de Wisconsin (UW) para hacer la solución de vitrificación 1 (V1). Filtrar estérilmente la solución V1 utilizando un filtro de 0,22 m y almacenar a 4 oC.
- Prepare el aparato de vitrificación de gotas a granel.
- Para preparar la aguja de mezcla, primero corte a lo largo de un lado de la manga gris exterior de la aguja de mezcla, y luego doble el manguito abierto para retirarlo de la aguja de mezcla.
- Deslice dos secciones de tubos de silicona de 25 mm sobre las entradas de la aguja de mezcla y fije su posición con pegamento(Figura 1A).
- Corte la aguja a una longitud de 20 mm (es decir, la longitud de la hélice de mezcla interna) como se muestra en la Figura 1A.
NOTA: La longitud de la aguja de mezcla es proporcional al volumen dentro de la aguja y por lo tanto se puede modificar para controlar el tiempo de exposición de los hepatocitos a la solución de alta concentración de CPA. - Inserte la salida de corte de la aguja de mezcla en una aguja de inyección de 20 G(Figura 1B).
NOTA: El tamaño de la aguja de inyección influye en el tamaño de las gotas. - Esterilice el conjunto de la aguja de mezcla mediante autoclave.
- Llene un Dewar estéril con nitrógeno líquido. Esterilice el exterior de la Dewar con isopropanol antes de colocar el Dewar en una campana de cultivo de células de flujo laminar estéril.
NOTA: La contaminación es una consideración importante durante la exposición directa de las gotas al nitrógeno líquido. Aunque no hubo contaminación utilizando nitrógeno líquido no esterilizado en el protocolo actual, el nitrógeno líquido se puede filtrar o irradiar para asegurar la esterilidad si es necesario16. - Inserte un embudo con el mismo diámetro exterior que el diámetro interior del nitrógeno líquido Dewar en un tubo cónico de 50 ml para crear el dispositivo de recogida de gotas(Figura 1CaE).
- Sumerja el dispositivo de recogida de gotas en el nitrógeno líquido presionando lentamente hacia abajo en su posición vertical final utilizando fórceps grandes. Asegúrese de que el tubo cónico descansa en una posición vertical en la parte inferior de la Dewar(Figura 1DaE).
NOTA: El embudo debe permanecer insertado y descansando sobre el tubo cónico. El nivel de nitrógeno líquido debe ser 1 cm por debajo de la altura de entrada del embudo, como se muestra en la Figura 1D. - Monte una bomba de jeringa en una posición vertical en la pared de la campana de cultivo celular atando una cuerda de los pies de la bomba de la jeringa a tornillos que sobresoren de la pared de la campana de cultivo celular.
- Coloque el nitrógeno líquido Dewar con el dispositivo de recogida de gotas debajo de la bomba de jeringa montada verticalmente(Figura 1E).
- Preincubar con CPAs.
- Después de obtener hepatocitos de rata recién aislados, cuente la concentración de stock por exclusión azul Trypan y tome 40 millones de hepatocitos viables.
NOTA: El manejo suave de los hepatocitos en suspensión es fundamental para prevenir la muerte celular. - Centrífuga a 50 x g durante 5 min sin freno.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender los hepatocitos en 3,4 ml de solución V1.
- Incubar sobre hielo durante 3 min.
- Añadir 150 s de DMSO y 150 l de EG a los hepatocitos y mezclar suavemente.
- Incubar sobre hielo durante 3 min.
- Una vez más, añadir 150 s de DMSO y 150 l de EG a los hepatocitos y mezclar suavemente.
- Cargue 3,5 ml en una jeringa de 3 ml.
- Después de obtener hepatocitos de rata recién aislados, cuente la concentración de stock por exclusión azul Trypan y tome 40 millones de hepatocitos viables.
- Realizar vitrificación.
- Inserte la jeringa con hepatocitos preincubados y las jeringas de solución V2 en el adaptador de la bomba de jeringa.
- Coloque dos adaptadores de púas de la manguera de bloqueo Luer hembra a las jeringas y deslice el tubo de silicona del conjunto de la aguja de mezcla sobre los accesorios de la barba(Figura 1F).
- Coloque todo el conjunto en la bomba de la jeringa(Figura 1E).
- Tres minutos después de la última adición de DMSO y EG a los hepatocitos, iniciar la bomba a 2 ml/min.
- Detenga la bomba después de que todos los hepatocitos se hayan añadido al nitrógeno líquido.
2. Almacenamiento criogénico
- Perforar 10 pequeños agujeros en la tapa de un tubo cónico de 50 ml con una aguja de 20 G y envolver el exterior de la tapa con una película flexible, como se muestra en la Figura 1B. Esto crea una válvula que permite el escape del nitrógeno líquido sobrante evaporante.
- Para recoger las gotas de hepatocitos vitrificados, primero retire el embudo del nitrógeno líquido Dewar. A continuación, utilice fórceps largos para extraer el tubo cónico que contiene las gotas del nitrógeno líquido y verter lentamente el exceso de nitrógeno líquido del tubo cónico.
- Cierre el tubo cónico con la tapa perforada y coloque directamente el tubo cónico cerrado con gotas de hepatocitos vitrificados de nuevo en el nitrógeno líquido Dewar.
- Transfiera el tubo cónico del nitrógeno líquido a un criotanque de vapor de nitrógeno líquido.
3. Recalentamiento de las gotas de hepatocitos vitrificados
-
Prepare la solución de recalentamiento.
- Disolver 17,13 g de sacarosa en 100 ml de medios de cultivo de hepatocitos DMEM para crear la solución de recalentamiento. Filtrar estérilmente la solución de recalentamiento utilizando un filtro de 0,22 m y calentar a 37 oC.
-
Recalienta los hepatocitos.
- Tome el tubo cónico con hepatocitos vitrificados del criotanque y transporte en un dewar de nitrógeno líquido a la campana de cultivo celular.
- Afloje ligeramente la tapa y vuelva a colocar el tubo cónico en el nitrógeno líquido.
- Agregue las gotas de hepatocitos vitrificados a un vaso vacío, agregue instantáneamente la solución de recalentamiento caliente (37 oC) e revuelva inmediatamente durante 10 s.
NOTA: Es fundamental trabajar rápidamente para evitar la congelación durante elrecalentamiento. Dependiendo de los requisitos del estudio, algunas gotas vitrificadas se pueden recalentar a la vez.
-
Descargue la solución de recalentamiento.
- Divida la solución de recalentamiento con hepatocitos en dos tubos cónicos de 50 ml.
- Centrifugar los dos tubos cónicos durante 2 min a 100 x g a 4oC sin freno.
- Aspirar el sobrenadante para dejar un volumen total de 12,5 ml utilizando la marca de graduación del tubo cónico como referencia y añadir 12,5 ml de DMEM helado por tubo cónico para diluir la solución de recalentamiento al 50%.
- Resuspenda los hepatocitos e incuba rinde sobre hielo durante 3 min.
- Añadir 25 ml de DMEM frío por metro cónico para diluir la solución de recalentamiento al 25%.
- Centrífuga durante 5 min a 50 x g a 4oC sin freno.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender los hepatocitos en 2 ml del medio de cultivo deseado para su uso.
NOTA: La centrifugación de gradiente de densidad se puede utilizar para eliminar los hepatocitos muertos de la suspensión celular si se desea.
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Representative Results
Los hepatocitos primarios recién aislados de cinco hígados de rata diferentes se utilizaron para una comparación directa de la vitrificación de gotas a granel con la criopreservación clásica utilizando los protocolos preeminentes de congelación lenta reportados en la literatura4, 5. En resumen, los hepatocitos fueron suspendidos en UW complementados con BSA (2,2 mg/ml), glucosa (333 mM) y DMSO (10% v/v) y congelados utilizando un congelador de velocidad controlada. Después de almacenarlas a -196 oC, las muestras se descongelaron en un baño de agua caliente. Después de todo el hielo derretido, el DMSO se diluyó directamente mientras que la concentración de glucosa se redujo gradualmente durante múltiples pasos para reducir la lesión osmótica. El protocolo exacto se puede encontrar en detalle en otro lugar15. Las duraciones de conservación variaron de 2 a 8 días y se emparejaron entre la vitrificación de gotas a granel y la criopreservación de congelación para cada réplica biológica para garantizar una comparación equitativa. Aunque se probaron tiempos de conservación más cortos para consideraciones prácticas, cabe señalar que los hepatocitos primarios pueden almacenarse a -196 oC durante años sin pérdida de viabilidad5.
La vitrificación de gotas a granel da como resultado una viabilidad directa de los hepatocitos posteriores a la preservación del 79%, medida por las pruebas de exclusión de color azul de Trypan, que determina la integridad de la membrana(Figura 2A). Esto es significativamente mayor que la viabilidad del 68% después de la criopreservación optimizada clásica. El rendimiento de la vitrificación de gotas a granel es 56% que es 10% mayor, y lo que es importante más consistente, en comparación con la criopreservación clásica(Figura 2B).
La actividad metabólica de los hepatocitos, medida utilizando un ensayo de metabolización Presto Blue en cultivos de sándwiches de colágeno a largo plazo, fue significativamente mayor después de la vitrificación de gotas a granel que después de la criopreservación clásica. La síntesis de albúmina, que es el parámetro más utilizado de la función sintética de los hepatocitos, fue mayor por casi dos veces después de la vitrificación de gotas a granel en comparación con la criopreservación clásica(Figura 3A). La producción de urea es el parámetro más utilizado de la función de desintoxicación de hepatocitos. Después de un cultivo de una semana, la producción de urea de hepatocitos vitrificados de gotas a granel fue significativamente mayor que la de los hepatocitos crioconservados clásicos(Figura 3B).
En resumen, la vitrificación de gotas a granel mejora la viabilidad directa después de la preservación y la función metabólica a largo plazo de los hepatocitos primarios de rata en cultivos sándwich de colágeno, en comparación con la criopreservación por congelación lenta.
Figura 1: Configuración experimental de vitrificación de gotas a granel.
(A) Ilustración de cómo preparar la aguja de mezcla y fijar dos secciones de tubo de silicona a las entradas de la aguja de mezcla. (B) Ilustración de la inserción de la aguja de mezcla de corte en la aguja de inyección para completar el conjunto de la aguja de mezcla. (C) Ilustración del embudo y tubo cónico de 50 ml que constituyen el dispositivo de recogida de gotas. (D) Boceto que muestra la posición del tubo cónico, el embudo y el nivel de nitrógeno líquido en el Dewar. (E) Representación de la configuración experimental completa de vitrificación de gotas a granel de abajo a arriba: el nitrógeno líquido Dewar (gris); el dispositivo de recogida de gotas que se coloca dentro del nitrógeno líquido Dewar (claro); el conjunto de la aguja de mezcla (amarillo claro) unido a las jeringas que se colocan en la bomba de la jeringa (rojo). (F) Ilustración de las jeringas y montaje de la aguja de mezcla. Dos jeringas de 3 ml se sujetan al adaptador de la bomba de jeringa (azul); una jeringa debe llenarse con hepatocitos preincubados en la solución V1 y la otra con la solución de alta concentración de CPA (solución V2). El conjunto de la aguja de mezcla se une a las jeringas mediante dos adaptadores de púas de la manguera de bloqueo Luer hembra. (G) Ilustración de cómo crear la tapa del tubo cónico para el almacenamiento criogénico que permite que el nitrógeno líquido evaporador que quede escape del tubo cónico durante el almacenamiento de las gotas de hepatocitos vitrificados. Parte superior: tapa con orificios perforados. Abajo: la tapa perforada envuelta con película flexible. Barras de escala: 1 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Viabilidad y rendimiento de los hepatocitos después de la conservación.
(A) Viabilidad de hepatocitos frescos (grises), crioconservados (azul) y gotas a granel vitrificados (verdes). (B) Rendimiento de conservación de hepatocitos vitrificados crioconservados y gotas a granel. Estrellas: p < 0.05 (Wilcoxon matched-pairs signed rank test). Bigotes: mínimo a máx. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Actividad metabólica en cultivos de sándwiches de colágeno a largo plazo.
(A) Síntesis de albúmina de hepatocitos frescos (grises), crioconservados (azul) y gotas a granel vitrificados (verdes) en los días de cultivo 3, 5 y 7. (B) Producción de urea de hepatocitos vitrificados de gotas frescas, crioconservadas y a granel. Estrellas: p < 0.05 (ANOVA unidireccional emparejado seguido de la corrección de Tukey para pruebas múltiples). Barras de error: desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La criopreservación de hepatocitos por congelación lenta da como resultado una menor viabilidad y función metabólica. La vitrificación ofrece una alternativa prometedora para la criopreservación clásica, ya que la lesión por congelación se evita por completo9. Sin embargo, se requiere la preincubación con CPAs para reducir la velocidad de enfriamiento crítica8. En consecuencia, la vitrificación se ve obstaculizada por la toxicidad del CPA17 y limitada a pequeños volúmenes de muestra. En los esfuerzos por superar estas limitaciones, el método de vitrificación de gotas a granel presentado en este manuscrito fue desarrollado para permitir la vitrificación de grandes cantidades de células mientras se utiliza una baja concentración de CPA preincubada15. Esta vitrificación de gotas a granel conduce a una mayor viabilidad de los hepatocitos y la función metabólica en comparación con el método de criopreservación de congelación lenta más óptimo en la literatura. Aquí, se proporcionan los métodos completos de vitrificación de gotas masivas y conocimientos detallados sobre los aspectos prácticos de los procedimientos.
Múltiples pasos en el protocolo son críticos y requieren atención adicional. El llenado de la Dewar con nitrógeno líquido no esterilizado potencialmente conduce a condiciones semi-estériles. Utilizando las precauciones explicadas en el protocolo, no se reveló contaminación durante nuestros cultivos de sándwiches de colágeno a largo plazo. Sin embargo, se pueden tomar medidas de esterilización adicionales si se considera necesario. El nitrógeno líquido se puede esterilizar mediante radiación o filtrado16 y el sistema puede estar completamente cerrado con una tapa en el nitrógeno líquido Dewar con una chimenea conectada a la aguja de mezcla. Alternativamente, se pueden explorar métodos de vitrificación de gotas sin contacto, aunque esto puede limitar un mayor rendimiento de volumen14.
Otras partes esenciales del protocolo son las duraciones de precarga y descarga de incubación del CPA. Las duraciones más largas podrían resultar en lesiones tóxicas por CPA, mientras que las duraciones más cortas pueden causar lesiones osmóticas. Además, es importante asegurarse de que las gotas de hepatocitos vitrificados siempre permanezcan por debajo de la temperatura de transición del vidrio porque la nucleación de hielo microscópica y macro incontrolada a temperaturas más altas conduce a lesiones graves de hepatocitos y muerte celular. Desde una perspectiva práctica, el paso más crítico en la vitrificación de gotas a granel es el recalentamiento de las gotas de hepatocitos vitrificados. Cuando las gotas vitrificadas se eliminan del nitrógeno líquido, pueden congelarse en cuestión de segundos si no se recalientan rápidamente añadiendo instantáneamente la solución de recalentamiento en caliente.
La optimización futura de la vitrificación de gotas a granel podría mejorar aún más los resultados de conservación, como la viabilidad, el rendimiento y la función metabólica. Tanto los CPA permeables como los no permeables podrían ser probados para optimizar la deshidratación osmótica antes de la vitrificación. Esto podría reducir el shock osmótico durante la deshidratación y también podría permitir disminuir las concentraciones de CPA preincubadas. Además, fluida continua, en lugar de por lotes, la preincubación de CPA permitiría teóricamente la vitrificación de cantidades celulares ilimitadas. Debido a que sólo se necesita equipo de laboratorio general para la vitrificación de gotas a granel, es un método de preservación simple y rentable que potencialmente podría ser utilizado para la preservación de otros tipos de células.
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Disclosures
Los autores declaran intereses financieros en competencia. Los Doctores de Vries, Weng, Toner, Tessier y Uygun tienen solicitudes provisionales de patente pertinentes para este estudio. El Dr. Uygun tiene un interés financiero en Organ Solutions, una empresa enfocada en el desarrollo de tecnología de preservación de órganos. Todos los intereses del investigador son administrados por MGH y Partners HealthCare de acuerdo con sus políticas de conflicto de intereses.
Acknowledgments
La financiación de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos (R01DK096075, R01DK107875 y R01DK114506) y del Departamento de Defensa de los Estados Unidos (DoD RTRP W81XWH-17-1-0680) es muy reconocida.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Disposable 3 mL Syringes with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| Beaker | Sigma-Aldrich | CLS1000-250 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | BUW-001 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cole-Parmer Female Luer to 1/16" low-profile semi-rigid tubing barb, PP | Cole-Parmer | EW-45508-12 | |
| Cryogentic stroage tank / Cryotank | Chart Industries | MVE 800 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DMEM, powder, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 12800-082 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 107-21-1 | |
| Extra long forceps | Fisher Scientific | 10-316C | |
| Fisherbrand Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes - Flat top closure | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| Fishing line | Stren | SOFS4-15 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | 7727-37-9 | |
| Masterflex L/S Platinum-Cured Silicone Tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | |
| Mix Tips, For Use With 3HPW1 | Grainger | 3WRL7 | |
| Nalgene Polypropylene Powder Funnel | ThermoFisher | 4252-0100 | |
| Needle 20 ga | Becton Dickinson (BD) | 305175 | |
| Parafilm M - Flexible film | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| Razor Blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Spatula | Cole-Parmer | EW-06369-18 | |
| Steriflip sterile filter | Fisher Scientific | SE1M179M6 | |
| Sucrose (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Thermo-Flask Benchtop Liquid Nitrogen Container | ThermoFisher | 2122 |
References
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