Summary
Detta manuskript beskriver en isfri cryopreservations metod för stora mängder råtta hepatocyter där primära celler är förinkuberas med kryoprotektiva medel vid en låg koncentration och förglasat i stora droppar.
Abstract
Förglasning är ett lovande isfritt alternativ för klassisk långsam frysning (vid ca 1 ° c/min) kryopreservation av biologiska prover. Förglasning kräver extremt snabba kylningshastigheter för att uppnå en övergång av vatten till glas fasen och samtidigt undvika skadlig isbildning. Även om pre-inkubering med kryoprotektiva medel (CPA) kan minska den kritiska kylningen av biologiska prover, är höga koncentrationer i allmänhet behövs för att möjliggöra isfri kryopreservation genom förglasning. Som ett resultat hämmas vitrifiering av CPA toxicitet och begränsas till små prover som kan kylas snabbt. Det var nyligen visat att dessa inneboende begränsningar kan övervinnas genom bulk dropp vitrifiering. Med denna nya metod, celler är först förinkuberas med en låg intracellulär CPA koncentration. Hävstångseffekt snabb osmotisk uttorkning, den intracellulära CPA är koncentrerad direkt före förglasning, utan behov av att helt jämvikt giftiga CPA koncentrationer. Den cellulära dehydrering utförs i en fluidic enhet och integreras med kontinuerlig hög genomströmning generation av stora stora droppar som förglasat i flytande kväve. Denna ice-free frysförvaring metod med minimal CPA toxicitet är lämplig för stora cell mängder och resulterar i ökad hepatocyte lönsamhet och metabolisk funktion jämfört med klassisk långsam frysning frysförvaring. Detta manuskript beskriver metoderna för lyckad bulk dropp vitrifiering i detalj.
Introduction
Förlust av cellernas lönsamhet och metabolisk funktion efter kryopreservation av hepatocyter är fortfarande en viktig fråga som begränsar kliniska tillämpningar1,2,3. Benchmark-metoden för hepatocyte frysförvaring är långsam frysning, som utförs genom förinkuberande hepatocyterna med CPA (dimetylsulfoxid [DMSO], glukos och albumin) och efterföljande kontrollerad hastighet frysning (vid ca 1 ° c/min) till kryogena temperaturer4,5. Trots många rapporterade optimeringar, CPA toxicitet tillsammans med skadliga osmotiska obalanser under frysning och mekanisk stress av isbildning förbli grundläggande nackdelar med långsam frysning6,7.
Förglasning erbjuder en fördel över långsam frysning i att skada på grund av isbildning är helt undvikas genom en direkt fasövergång av vatten i glaset tillstånd6. Men för att nå glaset övergångstemperatur av rent vatten (-137 ° c), måste vattnet kylas med hastigheter i storleksordningen 1 000 000 grader Celsius per sekund (dvs. den kritiska kylningen) för att undvika isbildning över glaset övergångstemperatur8 . Tillägg av CPAs kan sänka den kritiska kylningshastigheten och öka glas övergångstemperaturen för vattenlösningar9. Men även med höga CPA koncentrationer (t. ex. 40% v/v DMSO eller högre) snabb kylning är ändå krävs för framgångsrik förglasning8,9.
De erforderliga kylnings-och höga CPA-koncentrationerna leder till två stora nackdelar med förglasning. Först, för att möjliggöra snabb kylning, proverna måste ha en låg termisk massa. För det andra, för att nå höga CPA-koncentrationer samtidigt som man undviker osmotisk skada, måste CPAs långsamt införas och helt jämställas mellan de intra-och extracellulära fack6. Detta ökar exponeringstiden för celler till giftiga CPAs. Tillsammans gör detta förglasning en besvärlig process som är begränsad till några små stora prover (mikroliter) i taget. Förglasning av DROPP har föreslagits som en potentiell lösning på dessa restriktioner. Genom att exponera miniscule cell-Laden droppar (nanoliters) till flytande kväve kylningen är betydligt högre, vilket följaktligen möjliggör en avsevärd minskning av CPA koncentrationen10,11,12 ,13,14. Även om flera munstycken som genererar högfrekventa droppar potentiellt kan användas samtidigt, begränsar den extremt lilla droppstorleken dataflödet till mikroliter per minut10, vilket utesluter effektiv förglasning av stora cell volymer med magnitud högre bearbetningshastigheter i storleksordningen milliliter per minut.
Nyligen visades att dessa inneboende begränsningar av förglasning kan övervinnas genom bulk dropp vitrifiering15. Denna nya metod utnyttjar snabb osmotisk uttorkning för att koncentrera en intracellulär CPA koncentration av 7,5% v/v etylenglykol och DMSO omedelbart före förglasning, vilket eliminerar behovet av full jämvikt av giftiga CPA koncentrationer. Den cellulära dehydrering utförs i en fluidic enhet genom en kort exponering av hepatocyterna till en hög extracellulär CPA koncentration. Även om denna exponering orsakar snabb osmotisk uttorkning, det är för kort för den höga CPA koncentrationen att sprida sig in i cellerna. Omedelbart efter uttorkning, cellerna lastas i droppar som är direkt förglasad i flytande kväve. Denna metod eliminerar behovet av fullt intracellulärt upptag av höga CPA koncentrationer medan den höga extracellulära CPA koncentrationen möjliggör vitrifiering av stora stora droppar, vilket resulterar i hög genomströmning volymer med minimal CPA toxicitet.
DROPP vitrifiering förbättrar direkt och långsiktig lönsamhet efter konservering, samt morfologi och metabolisk funktion av primära råtta hepatocyter jämfört med klassisk kryopreservation av långsam frysning15. Detta manuskript ger metodologiska Detaljer för bulk dropp vitrifiering av primära råtta hepatocyter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De primära hepatocyteisolationerna för detta protokoll utfördes av cell Resource Core (CRC) vid Massachusetts General Hospital, Boston, Massachusetts, USA. Animal Protocol (#2011N000111) godkändes av den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) i Massachusetts General Hospital.
1. förglasning av bulkdroppar
- Förbered förglasnings lösningarna.
- Tillsätt 40 mg bovint serumalbumin (BSA) till 17,0 mL av University of Wisconsin Solution (UW) för att göra vitrifikation lösning 1 (v1). Sterilt filter v1-lösningen med ett 0,22 μm filter och förvara vid 4 ° c.
Obs: UW är en vanligt förekommande organ bevarande lösning. Den innehåller 50 g/l hydroxietyl stärkelse, 35,83 g/l och Acid, 3,4 g/l kalium fosfat monobasic, 1,23 g/l magnesiumsulfat heptahydrat, 17,83 g/l raffinos pentahydrat, 1,34 g/l adenosin, 0,136 g/l allopurinol, 0,992 g/l total Glutathione, 5,61 g /L kaliumhydroxid och natriumhydroxid för att justera pH-värdet till 7,4. - Kombinera 7,0 mL av UW, 6,5 mL DMSO, 6,5 mL etylenglykol (t. ex.), 40 mg BSA, och 5,48 g sackaros för att göra vitrifiering lösning 2 (v2). Sterilt filter v2-lösningen med ett 0,22 μm filter. Ladda 3,5 mL steril filtrerad v2-lösning i en 3 mL spruta och förvara vid 4 ° c.
Anmärkning: för att underlätta upplösning av CPAs, lösningar bereds i större mängder än vad som krävs.
- Tillsätt 40 mg bovint serumalbumin (BSA) till 17,0 mL av University of Wisconsin Solution (UW) för att göra vitrifikation lösning 1 (v1). Sterilt filter v1-lösningen med ett 0,22 μm filter och förvara vid 4 ° c.
- Förbered Mass förglasnings utrustningen för dropp.
- För att förbereda blandningskanylen, först skära längs ena sidan av blandningen nålen yttre grå ärm, och sedan böja hylsan öppna för att ta bort den från blandningskanylen.
- Skjut 2 25 mm Silikonrör sektioner över inlopp av blandningskanylen och säkra deras position med lim (figur 1A).
- Skär nålen till en längd av 20 mm (dvs. längden på den inre blandnings spiralen) som visas i figur 1a.
Obs: blandnings nålens längd är proportionell mot volymen inuti nålen och kan därför ändras för att kontrollera exponeringstiden för hepatocyterna till den höga CPA-koncentrationslösningen. - För in blandnings kanylens cutoff-uttag i en 20 G injektionsnål (figur 1B).
Obs: injektionsnålens storlek påverkar droppstorleken. - Sterilisera blandnings nålmonteringen genom autoklavering.
- Fyll en steril Dewar med flytande kväve. Sterilisera utsidan av Dewar med isopropanol innan du placerar Dewar i ett sterilt laminärt flöde cell Culture Hood.
Anmärkning: kontaminering är en viktig faktor vid direkt exponering av droppar till flytande kväve. Även om det inte fanns någon förorening med icke-steriliserat flytande kväve i det nuvarande protokollet, kan flytande kväve filtreras eller bestrålas för att säkerställa sterilitet vid behov16. - Sätt i en tratt med samma ytterdiameter som den inre diametern hos det flytande kvävets Dewar i ett 50 ml koniskt rör för att skapa dropp samlings anordningen (figur 1C−E).
- Sänk ned dropp insamlings enheten i det flytande kvävet genom att sakta trycka ned den i sitt slutliga vertikala läge med hjälp av stora pinuper. Se till att det koniska röret vilar i vertikalt läge längst ned i Dewar (figur 1D−E).
Observera: tratten ska vara isatt i och vila på det koniska röret. Den flytande kväve nivån bör vara 1 cm under tratten inlopps höjd, som visas i figur 1D. - Montera en spruta pumpen i ett vertikalt läge på väggen i cellen kultur huva genom att binda en sträng från sprutan pumpens fötter till skruvar utskjutande från cell Culture Hood väggen.
- Placera flytande kväve Dewar med dropp uppsamlingsanordningen under den vertikalt monterade sprutpumpen (figur 1E).
- Förinkubera med CPAs.
- Efter att ha fått färskt isolerade råtta hepatocyter, räkna beståndet koncentrationen av Trypan blå uteslutning och ta 40 000 000 livskraftiga hepatocyter.
Obs: skonsam hantering av hepatocyter i suspensionen är avgörande för att förhindra celldöd. - Centrifugera vid 50 x g i 5 min utan broms.
- Aspirera på supernatanten och Omsuspendera hepatocyterna i 3,4 mL v1-lösning.
- Inkubera på isen i 3 min.
- Tillsätt 150 μL av DMSO och 150 μL av t ex till hepatocyterna och blanda försiktigt.
- Inkubera på isen i 3 min.
- Återigen, tillsätt 150 μL av DMSO och 150 μL av t. ex till hepatocyter och blanda försiktigt.
- Fyll på 3,5 mL i en 3 mL spruta.
- Efter att ha fått färskt isolerade råtta hepatocyter, räkna beståndet koncentrationen av Trypan blå uteslutning och ta 40 000 000 livskraftiga hepatocyter.
- Utför förglasning.
- Sätt i sprutan med förinkuberade hepatocyter och v2-lösningssprutor på sprutpumpadaptern.
- Fäst två kvinnliga luer lock slang Barb adaptrar till sprutor och skjut Silikonrör av blandningen nålen församlingen över Barb rördelar (figur 1F).
- Placera hela enheten i sprutpumpen (figur 1E).
- Tre minuter efter den sista tillsatsen av DMSO och t. ex till hepatocyter, starta pumpen på 2 mL/min.
- Stoppa pumpen efter alla hepatocyter har lagts till flytande kväve.
2. kryogen förvaring
- Punktera 10 små hål i locket på ett 50 mL koniskt rör med en 20 G nål och Linda utsidan av locket med en flexibel film, som visas i figur 1B. Detta skapar en ventil som möjliggör flykt av avduntande överblivna flytande kväve.
- För att samla in den förglasade hepatocyte droppar, först ta bort tratten från flytande kväve Dewar. Använd sedan långa tång för att ta det koniska röret som innehåller dropparna ur det flytande kvävet och Häll långsamt ut överflödigt flytande kväve från det koniska röret.
- Stäng det koniska röret med det punkterade locket och placera direkt det slutna koniska röret med förglasade hepatocyte droppar tillbaka i flytande kväve Dewar.
- Överför det koniska röret från det flytande kvävet till ett flytande kväve ång kryotank.
3. snabb av de förglasade hepatocyte dropparna
-
Förbered snabb-lösningen.
- Lös 17,13 g sackaros i 100 mL DMEM hepatocyte kultur media för att göra snabb lösning. Sterilt filter snabblösningen med ett 0,22 μm filter och varm till 37 ° c.
-
Värm upp hepatocyterna.
- Ta det koniska röret med vitrifierade hepatocyter från kryotanken och transportera den i ett flytande kväve Dewar till cell Culture Hood.
- Lossa lätt locket och sätt tillbaka det koniska röret i det flytande kvävet.
- Tillsätt den förglasade hepatocyte droppar till en tom bägare, omedelbart tillsätt den varma (37 ° c) snabb lösning, och omedelbart rör om 10 s.
Obs: det är viktigt att arbeta snabbt för att undvika frysning under snabb. Beroende på studie kraven kan ett fåtal till alla förglasade droppar rewarmed på en gång.
-
Lossa snabb-lösningen.
- Dela upp snabblösningen med hepatocyter över 2 50 mL koniska rör.
- Centrifugera de två koniska rören i 2 min vid 100 x g vid 4 ° c utan broms.
- Aspirera supernatanten att lämna en total volym på 12,5 mL med hjälp av det koniska rörets graderingsmärke som referens och tillsätt 12,5 mL iskallt DMEM per koniskt rör för att späda ut snabblösningen till 50%.
- Omsuspendera hepatocyterna och inkubera på isen i 3 min.
- Tillsätt 25 mL iskall DMEM per koniskt rör för att späda ut snabblösningen till 25%.
- Centrifugera i 5 min vid 50 x g vid 4 ° c utan broms.
- Aspirera på supernatanten och Omsuspendera hepatocyterna i 2 mL av önskat odlingsmedium för användning.
Anmärkning: Densitetsgradientcentrifugering kan användas för att avlägsna döda hepatocyter från cellsuspensionen om så önskas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nyligen isolerade primära hepatocyter från fem olika råtta lever användes för en direkt jämförelse av bulk dropp förglasning till klassiska frysförvaring med hjälp av de framstående långsam frysning protokoll som rapporteras i litteraturen4, 5. i korthet, de hepatocyter avbröts i UW kompletteras med BSA (2,2 mg/ml), glukos (333 mm), och DMSO (10% v/v) och frysta med hjälp av en kontrollerad hastighet frys. Efter förvaring vid-196 ° c upptinades proverna i ett varmt vattenbad. Efter alla isen smält, var DMSO direkt utspädd medan glukos koncentrationen sänktes gradvis under flera steg för att minska osmotisk skada. Det exakta protokollet finns i detalj någon annanstans15. Bevarande varaktigheter varierade från 2 till 8 dagar och matchades mellan bulk dropp förglasning och frysning frysförvaring för varje biologisk replikat för att säkerställa en likvärdig jämförelse. Även om kortare konserverings tider testades för praktiska överväganden, bör det noteras att primära hepatocyter kan lagras vid-196 ° c i år utan förlust av livskraft5.
Bulk dropp vitrifiering resulterar i en direkt efter bevarande hepatocyte livskraft på 79%, mätt med Trypan blå uteslutnings test, som bestämmer membranets integritet (figur 2a). Detta är betydligt högre än 68% lönsamhet efter klassisk optimerad kryopreservation. Avkastningen av bulk dropp vitrifiering är 56% som är 10% högre, och viktigare mer konsekvent, jämfört med klassiska frysförvaring (figur 2B).
Den metaboliska aktiviteten av hepatocyter, mätt med en Presto blå metabolisering uppsats i långsiktiga kollagen Sandwich kulturer, var signifikant högre efter bulk dropp förglasning än efter klassisk cryopreservation. Albumin syntes, som är den mest använda parametern av syntetisk funktion av hepatocyter, var större av nästan två gånger efter bulk dropp förglasning jämfört med klassiska frysförvaring (figur 3A). Urea produktion är den mest använda parametern av hepatocyte avgiftning funktion. Efter en veckas kultur var ureaproduktionen av bulk droppar vitrifierade hepatocyter signifikant högre än för klassiska kryopreserverade hepatocyter (figur 3B).
Sammanfattnings, förbättrar bulk dropp vitrifiering direkt efter bevarande lönsamhet och långsiktig metabolisk funktion av primära råtta hepatocyter i kollagen Sandwich kulturer, jämfört med kryopreservation av långsam frysning.
Figur 1: experimentellt installation av bulk dropp-förglasning.
(A) illustration av hur man förbereder blandningskanylen och fäster två Silikonrör sektioner på blandarinjektionsnålens inlopp. (B) illustration av införing av skär blandningskanylen i injektionsnålen för att slutföra blandnings nålmonteringen. C) illustration av tratten och 50 ml koniskt rör som utgör dropp samlings anordningen. Dskiss som visar det koniska rörets position, tratten och vätske kväve nivån i Dewar. E) återgivningen av den kompletta experimentella förglasnings inställningen från botten till toppen: det flytande kvävet Dewar (grått). DROPP uppsamlingsanordningen som är placerad inne i det flytande kvävdewar (klar); blandnings nålmonteringen (klar-gul) fästs på sprutorna som är placerade i sprutpumpen (röd). F) illustration av sprutorna och blandnings nålmonteringen. Två 3 mL sprutor är fastklämda i sprutpumpadaptern (blå); en spruta ska fyllas med förinkuberade hepatocyter i v1-lösningen och den andra med den höga CPA-koncentrationslösningen (v2-lösning). Blandningssnållenheten fästs på sprutorna med två honluerlåsningsslangaradaptrar. (G) illustration av hur man skapar det koniska rör locket för kryogen förvaring som gör det möjligt att avlägsna avdunsterande flytande kväve från det koniska röret under lagringen av de förglasade hepatocytdropparna. Ovansida: lock med punkterade hål. Nedan: det punkterade locket insvept med flexibel film. Skala staplar: 1 cm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Hepatocytviabilitet och avkastning efter konservering.
A) livskraft hos färska (gråa), kryopreserverade (blå) och bulk dropp vitrifierade (gröna) hepatocyter. B) bevarande av frys reserver och förglasade hepatocyter i bulk. Stars: p < 0,05 (Wilcoxon matchade-par undertecknat rank test). Whiskers: min till max. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: metabolisk aktivitet i långsiktiga kollagen Sandwich kulturer.
(A) albumin syntes av färskt (grått), kryopreserverat (blått), och bulk dropp vitrifierade (gröna) hepatocyter på kulturen dag 3, 5, och 7. B) ureaproduktion av färska, kryopreserverade och bulk droppar vitrifierade hepatocyter. Stars: p < 0,05 (Parade enkelriktad ANOVA följt av Tukey korrigering för flera tester). Felstaplar: standardavvikelse. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kryopreservation av hepatocyter genom långsam frysning resulterar i minskad lönsamhet och metabolisk funktion. Vitrification erbjuder ett lovande alternativ för Classic cryopreservation, som frysning skada är helt undvikas9. Före inkubering med CPAs krävs dock för att sänka den kritiska kylningshastigheten8. Följaktligen hindras förglasning av CPA-toxicitet17 och begränsad till små provvolymer. I arbetet med att övervinna dessa begränsningar utvecklades Mass dropp metoden som presenterades i detta manuskript för att möjliggöra en förglasning av stora mängder celler medan den låg för-inkuberad CPA-koncentration15. Denna bulk dropp vitrifiering leder till ökad hepatocyte lönsamhet och metabolisk funktion jämfört med den mest optimala långsam frysning frysförvaring metod i litteraturen. Här finns de omfattande metoderna för förglasning i bulk och detaljerade insikter i de praktiska aspekterna av förfarandena.
Flera steg i protokollet är kritiska och kräver ytterligare uppmärksamhet. Fyllning av Dewar med icke-steriliserat flytande kväve potentiellt leder till semi-sterila förhållanden. Med hjälp av de försiktighetsåtgärder som beskrivs i protokollet avslöjades ingen kontaminering under våra långsiktiga Collagen Sandwich-kulturer. Ytterligare steriliserings åtgärder kan dock vidtas om det bedöms som nödvändigt. Flytande kväve kan steriliseras genom strålning eller filtrering16 och systemet kan vara helt stängd med ett lock på flytande kväve Dewar med en skorsten ansluten till blandningskanylen. Alternativt kan icke-kontaktdroplet-förglasnings metoder undersökas, även om detta kan begränsa större volym genomströmning14.
Andra väsentliga delar av protokollet är CPA-tiderna för förlastning och lossning. Längre löptider kan resultera i giftiga CPA skada medan kortare löptider kan orsaka osmotisk skada. Dessutom är det viktigt att se till att de förglasade hepatocyte dropparna alltid hålla sig under glaset övergångstemperatur eftersom okontrollerad makro-och mikroskopisk is kärnbildning vid högre temperaturer leder till svår hepatocyte skada och celldöd. Ur ett praktiskt perspektiv, det mest kritiska steget i bulk dropp vitrifiering är snabb av de förglasade hepatocyte droppar. När de förglasade dropparna avlägsnas från det flytande kvävet kan de frysa inom några sekunder om inte snabbt rewarmed genom att omedelbart lägga till den varma snabblösningen.
Framtida optimering av bulk dropp vitrifiering kan ytterligare förbättra bevarande resultat, såsom lönsamhet, avkastning, och metabolisk funktion. Både permeabla och icke-permeabla CPAs kan testas för att optimera osmotiska uttorkning inför förglasning. Detta kan minska osmotiska chock under uttorkning och kan också göra det möjligt att minska förinkuberade CPA koncentrationer. Dessutom, kontinuerlig fluidic, i stället för batchwise, CPA pre-inkubation skulle teoretiskt tillåta vitrifiering av obegränsade cell mängder. Eftersom endast Allmän laboratorieutrustning behövs för bulk dropp vitrifiering är det en enkel och kostnadseffektiv konserveringsmetod som potentiellt kan användas för att bevara andra celltyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerar konkurrerande ekonomiska intressen. DRS. de Vries, Weng, toner, Tessier, och Uygun har provisoriska patentansökningar relevanta för denna studie. Dr Uygun har ett ekonomiskt intresse för organ lösningar, ett företag fokuserat på att utveckla organ bevarande teknik. Alla forskares intressen förvaltas av MGH och partners HealthCare i enlighet med deras policy för intressekonflikter.
Acknowledgments
Finansiering från US National Institutes of Health (R01DK096075, R01DK107875 och R01DK114506) och US Department of Defense (DoD RTRP W81XWH-17-1-0680) är mycket erkänt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Disposable 3 mL Syringes with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| Beaker | Sigma-Aldrich | CLS1000-250 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | BUW-001 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cole-Parmer Female Luer to 1/16" low-profile semi-rigid tubing barb, PP | Cole-Parmer | EW-45508-12 | |
| Cryogentic stroage tank / Cryotank | Chart Industries | MVE 800 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DMEM, powder, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 12800-082 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 107-21-1 | |
| Extra long forceps | Fisher Scientific | 10-316C | |
| Fisherbrand Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes - Flat top closure | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| Fishing line | Stren | SOFS4-15 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | 7727-37-9 | |
| Masterflex L/S Platinum-Cured Silicone Tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | |
| Mix Tips, For Use With 3HPW1 | Grainger | 3WRL7 | |
| Nalgene Polypropylene Powder Funnel | ThermoFisher | 4252-0100 | |
| Needle 20 ga | Becton Dickinson (BD) | 305175 | |
| Parafilm M - Flexible film | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| Razor Blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Spatula | Cole-Parmer | EW-06369-18 | |
| Steriflip sterile filter | Fisher Scientific | SE1M179M6 | |
| Sucrose (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Thermo-Flask Benchtop Liquid Nitrogen Container | ThermoFisher | 2122 |
References
- Carpentier, B., Gautier, A., Legallais, C. Artificial and bioartificial liver devices: present and future. Gut. 58 (12), 1690-1702 (2009).
- Fox, I. J., Chowdhury, J. R.
- Hughes, R. D., Mitry, R. R., Dhawan, A.
- Stéphenne, X., Najimi, M., Sokal, E. M. Hepatocyte cryopreservation: is it time to change the strategy. World Journal of Gastroenterology. 16 (1), 1-14 (2010).
- Terry, C., Dhawan, A., Mitry, R. R., Lehec, S. C., Hughes, R. D. Optimization of the cryopreservation and thawing protocol for human hepatocytes for use in cell transplantation. Liver Transplantation. 16 (2), 229-237 (2010).
- Pegg, D. E.
- Baust, J. G., Gao, D., Baust, J. M. Cryopreservation: An emerging paradigm change. Organogenesis. 5 (3), 90-96 (2009).
- Hopkins, J. B., Badeau, R., Warkentin, M., Thorne, R. E. Effect of common cryoprotectants on critical warming rates and ice formation in aqueous solutions. Cryobiology. 65 (3), 169-178 (2012).
- Fahy, G. M., MacFarlane, D. R., Angell, C. A., Meryman, H. T. Vitrification as an approach to cryopreservation. Cryobiology. 21 (4), 407-426 (1984).
- Demirci, U., Montesano, G.
- El Assal, R., et al. Bio-Inspired Cryo-Ink Preserves Red Blood Cell Phenotype and Function During Nanoliter Vitrification. Advanced Materials. 26 (33), 5815-5822 (2014).
- Dou, R., Saunders, R. E., Mohamet, L., Ward, C. M., Derby, B. High throughput cryopreservation of cells by rapid freezing of sub-μl drops using inkjet printing--cryoprinting. Lab on a Chip. 15 (17), 3503-3513 (2015).
- Samot, J., et al.
- Shi, M., et al. High-Throughput Non-Contact Vitrification of Cell-Laden Droplets Based on Cell Printing. Scientific Reports. 5 (1), (2016).
- de Vries, R. J., et al. Bulk Droplet Vitrification: An Approach to Improve Large-Scale Hepatocyte Cryopreservation Outcome. Langmuir. , (2019).
- Parmegiani, L., et al. Sterilization of liquid nitrogen with ultraviolet irradiation for safe vitrification of human oocytes or embryos. Fertility and Sterility. 94 (4), 1525-1528 (2010).
- Best, B. P. Cryoprotectant Toxicity: Facts, Issues, and Questions. Rejuvenation Research. 18 (5), 422-436 (2015).
