Summary
Este manuscrito descreve um método de criopreservação sem gelo para grandes quantidades de hepatócitos de ratos em que as células primárias são pré-incubadas com agentes crioprotetores em baixa concentração e vitrificadas em grandes gotículas.
Abstract
A vitrificação é uma alternativa promissora sem gelo para a criopreservação clássica de congelamento lento (a aproximadamente 1 °C/min) de amostras biológicas. A vitrificação requer taxas de resfriamento extremamente rápidas para alcançar a transição da água para a fase de vidro, evitando a formação de gelo prejudicial. Embora a pré-incubação com agentes crioprotetores (CPA) possa reduzir a taxa crítica de resfriamento de amostras biológicas, altas concentrações são geralmente necessárias para permitir a criopreservação sem gelo por vitrificação. Como resultado, a vitrificação é dificultada pela toxicidade do CPA e restrita a pequenas amostras que podem ser resfriadas rapidamente. Demonstrou-se recentemente que estas limitações inerentes podem ser superadas pela vitrificação da gota maioria. Usando este método novo, as pilhas são pre-incubadas primeiramente com uma baixa concentração intracelular do CPA. Aproveitando a desidratação osmótica rápida, o CPA intracelular está concentrado diretamente à frente da vitrificação, sem a necessidade de equilibrar totalmente as concentrações tóxicas de CPA. A desidratação celular é realizada em um dispositivo fluídico e integrada com a geração contínua de alta taxa de produção de gotículas de grande porte que são vitrificadas em nitrogênio líquido. Este método de criopreservação sem gelo com toxicidade mínima de CPA é adequado para grandes quantidades celulares e resulta em maior viabilidade hepatocito e função metabólica em comparação com a criopreservação clássica de congelamento lento. Este manuscrito descreve os métodos para vitrificação bem-sucedida de gotículas em massa em detalhes.
Introduction
Perda de viabilidade celular e função metabólica após criopreservação de hepatócitos ainda é uma questão importante que limita as aplicações clínicas1,2,3. O método de referência da criopreservação de hepatocitos é o congelamento lento, que é realizado por pré-incubação dos hepatócitos com CPA (dimetil sulfoxida [DMSO], glicose e albumina) e subsequente congelamento da taxa controlada (em aproximadamente 1 °C/min) para temperaturas criogênicas4,5. Apesar de muitas otimizações relatadas, a toxicidade do CPA, juntamente com desequilíbrios osmóticos injuriosos durante o congelamento e o estresse mecânico da formação de gelo, continuam a ser inconvenientes fundamentais de congelamento lento6,7.
Vitrificação oferece uma vantagem sobre o congelamento lento em que a lesão devido à formação de gelo é completamente evitado por uma transição de fase direta da água para o estado de vidro6. No entanto, para atingir a temperatura de transição de vidro da água pura (-137 °C), a água deve ser resfriada a taxas na ordem de um milhão de graus Celsius por segundo (ou seja, a taxa crítica de resfriamento) para evitar a formação de gelo acima da temperatura de transição de vidro8 . A adição de CPAs pode abaixar a taxa refrigerando crítica e aumentar a temperatura de transição de vidro de soluções aquosas9. No entanto, mesmo com altas concentrações de CPA (por exemplo, 40% v/v DMSO ou maiores) taxas de resfriamento rápido são necessárias para vitrificação bem-sucedida8,9.
As taxas de resfriamento necessárias e altas concentrações de CPA resultam em duas grandes desvantagens da vitrificação. Primeiro, para permitir o resfriamento rápido, as amostras devem ter uma baixa massa térmica. Em segundo lugar, para atingir altas concentrações de CPA, evitando lesões osmóticas, os CPAs devem ser lentamente introduzidos e totalmente equilibrados entre os compartimentos intra e extracelular6. Isso aumenta o tempo de exposição das células para CPAs tóxicos. Juntos, isso torna a vitrificação um processo complicado que se limita a algumas amostras de pequeno porte (microlitros) de cada vez. A vitrificação de gotículas foi proposta como uma solução potencial para essas restrições. Ao expor gotículas minúsculas carregadas de células (nanolitros) a nitrogênio líquido, a taxa de resfriamento é significativamente aumentada, o que, consequentemente, permite uma redução considerável na concentração de CPA10,11,12 13,14. Embora vários bicos geradores de gotículas de alta frequência possam ser usados simultaneamente, o tamanho das gotículas extremamente pequenalimita a taxa de produção a microlitros por minuto10,o que impede a vitrificação eficiente de grandes células volumes com magnitudes maiores taxas de processamento na ordem de mililitros por minuto.
Recentemente, foi demonstrado que essas limitações inerentes à vitrificação podem ser superadas pela vitrificação de gotículas em massa15. Este novo método aproveita a desidratação osmótica rápida para concentrar uma concentração intracelular de CPA de 7,5% v/v etilenoglicol e DMSO imediatamente precedendo a vitrificação, eliminando a necessidade de equilíbrio total das concentrações tóxicas de CPA. A desidratação celular é realizada em um dispositivo fluídico por uma breve exposição dos hepatócitos a uma alta concentração extracelular de CPA. Embora esta exposição cause a desidratação osmótica rápida, é demasiado curta para que a concentração elevada do CPA difunda nas pilhas. Imediatamente após a desidratação, as células são carregadas em gotículas que são diretamente vitrificadas em nitrogênio líquido. Este método elimina a necessidade de captação intracelular completa de altas concentrações de CPA, enquanto a alta concentração de CPA extracelular permite a vitrificação de gotículas de grande porte, resultando em altos volumes de taxa de rendimento com toxicidade mínima de CPA.
A vitrificação de gotículas melhora a viabilidade direta e de longo prazo após a preservação, bem como a morfologia e a função metabólica dos hepatócitos primários de ratos em comparação com a criopreservação clássica por15de congelamento lento. Este manuscrito fornece os detalhes metodológicos para vitrificação de gotículas em massa de hepatócitos primários de ratos.
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Protocol
Os principais isolamentos hepatocitos para este protocolo foram realizados pelo Cell Resource Core (CRC) no Massachusetts General Hospital, Boston, Massachusetts, EUA. O protocolo animal (#2011N000111) foi aprovado pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) do Massachusetts General Hospital.
1. Vitrificação de gotículas em massa
- Prepare as soluções de vitrificação.
- Adicione 40 mg de albumina de soro bovina (BSA) a 17,0 mL da solução da Universidade de Wisconsin (UW) para fazer a solução de vitrificação 1 (V1). Estéril filtra risto a solução V1 usando um filtro de 0,22 μm e armazenar a 4 °C.
NOTA: UW é uma solução de preservação de órgãos comumente usado. Contém 50 g/l amido hidroxyethyl, 35,83 g/l ácido lactobiônico, 3.4 g/L potassium phosphate monobasic, 1.23 g/L magnésio sulfato heptahydrate, 17.83 g/L raffinose pentahydrate, 1.34 g/L adenosine, 0.136 g/L allopurinol, 0.992 g/L glutatiatotal, 5.61 g /L hidróxido de potássio e hidróxido de sódio para ajustar o pH a 7,4. - Combine 7,0 mL de UW, 6,5 mL de DMSO, 6,5 mL de etilenoglicol (EG), 40 mg de BSA e 5,48 g de sacarose para fazer a solução de vitrificação 2 (V2). Estéril filtra risto a solução V2 usando um filtro de 0,22 μm. Carregue 3,5 mL de solução V2 filtrada estéril em uma seringa de 3 mL e guarde a 4 °C.
NOTA: Para facilitar a dissolução dos CPAs, as soluções são preparadas em quantidades maiores do que o necessário.
- Adicione 40 mg de albumina de soro bovina (BSA) a 17,0 mL da solução da Universidade de Wisconsin (UW) para fazer a solução de vitrificação 1 (V1). Estéril filtra risto a solução V1 usando um filtro de 0,22 μm e armazenar a 4 °C.
- Prepare o aparato de vitrificação de gotículas em massa.
- Para preparar a agulha de mistura, primeiro corte ao longo de um lado da luva cinza exterior da agulha de mistura, e, em seguida, dobre a manga aberta para removê-lo da agulha de mistura.
- Deslize duas seções de tubos de silicone de 25 mm sobre as enseadas da agulha de mistura e proteja sua posição com cola (Figura 1A).
- Corte a agulha a um comprimento de 20 milímetros (isto é, o comprimento da hélice de mistura interna) como mostrado na figura 1A.
NOTA: O comprimento da agulha de mistura é proporcional ao volume dentro da agulha e, portanto, pode ser alterado para controlar o tempo de exposição dos hepatócitos para a solução de concentração de CPA alta. - Insira a tomada de corte da agulha de mistura em uma agulha de injeção de 20 G(Figura 1B).
NOTA: O tamanho da agulha de injeção influencia o tamanho da gota. - Esterilizar a montagem da agulha de mistura por autoclismo.
- Encha um Dewar estéril com nitrogênio líquido. Esterilizar o lado de fora do Dewar com isopropanol antes de colocar o Dewar em um capuz estéril cultura de células de fluxo laminar.
NOTA: A contaminação é uma consideração importante durante a exposição direta das gotículas ao nitrogênio líquido. Embora não tenha havido contaminação por nitrogênio líquido não esterilizado no protocolo atual, o nitrogênio líquido pode ser filtrado ou irradiado para garantir a esterilidade, senecessário, 16. - Insira um funil com o mesmo diâmetro externo que o diâmetro interno do nitrogênio líquido Dewar em um tubo cônico de 50 mL para criar o dispositivo de coleta de gotículas(Figura 1C−E).
- Submergir o dispositivo de coleta de gotículas no nitrogênio líquido, pressionando-o lentamente para baixo em sua posição vertical final usando fórceps grandes. Certifique-se de que o tubo cônico repousa em uma posição vertical na parte inferior do Dewar (Figura 1D−E).
NOTA: O funil deve permanecer inserido e descansando no tubo cônico. O nível de nitrogênio líquido deve ser de 1 cm abaixo da altura da inseto do funil, como mostrado na Figura 1D. - Monte uma bomba de seringa em uma posição vertical na parede da capa da cultura celular, amarrando uma corda dos pés da bomba de seringa para parafusos salientes da parede da capa da cultura celular.
- Coloque o nitrogênio líquido Dewar com o dispositivo de coleta de gotículas a bomba de seringa montada verticalmente(Figura 1E).
- Pré-incubação com CPAs.
- Depois de obter hepatócitos de ratos recém-isolados, conte a concentração de estoque pela exclusão azul Trypan e pegue 40 milhões de hepatócitos viáveis.
NOTA: O manuseio suave de hepatócitos em suspensão é fundamental para prevenir a morte celular. - Centrífuga a 50 x g por 5 min sem freio.
- Assao o supernatant e resuspende os hepatócitos em 3.4 mL da solução V1.
- Incubar no gelo por 3 min.
- Adicione 150 μL de DMSO e 150 μL de EG aos hepatócitos e misture suavemente.
- Incubar no gelo por 3 min.
- Mais uma vez, adicione 150 μL de DMSO e 150 μL de EG aos hepatócitos e misture suavemente.
- Carregue 3,5 mL em uma seringa de 3 mL.
- Depois de obter hepatócitos de ratos recém-isolados, conte a concentração de estoque pela exclusão azul Trypan e pegue 40 milhões de hepatócitos viáveis.
- Realizar vitrificação.
- Insira a seringa com hepatócitos pré-incubados e as seringas da solução V2 no adaptador da bomba de seringa.
- Anexar dois adaptadores fêmeas Luer bloqueio mangueira barb para as seringas e deslize a tubulação de silicone da montagem agulha misturando sobre os acessórios barb(Figura 1F).
- Coloque toda a montagem na bomba de seringa(Figura 1E).
- Três min após a última adição de DMSO e EG aos hepatócitos, iniciar a bomba em 2 mL /min.
- Pare a bomba depois que todos os hepatócitos foram adicionados ao nitrogênio líquido.
2. Armazenamento criogênico
- Fura 10 furos pequenos na tampa de um tubo cónico de 50 mL usando uma agulha de 20 G e envolva a parte externa da tampa com uma película flexível, como mostrado na figura 1B. Isso cria uma válvula que permite a fuga de evaporação de sobras de nitrogênio líquido.
- Para recolher as gotículas de hepatócitovio, primeiro retire o funil do nitrogênio líquido Dewar. Em seguida, use fórceps longos para tomar o tubo cônico que contém as gotículas do nitrogênio líquido e lentamente derramar o excesso de nitrogênio líquido do tubo cônico.
- Feche o tubo cônico com a tampa perfurada e coloque diretamente o tubo cônico fechado com gotículas de hepatócito vitrificadas de volta no nitrogênio líquido Dewar.
- Transfira o tubo cônico do nitrogênio líquido para um criotanque de vapor de nitrogênio líquido.
3. Reaquecimento das gotículas de hepatócitovi
-
Prepare a solução de reaquecimento.
- Dissolva 17,13 g de sacarose em 100 mL de mídia de cultura hepatócito DMEM para fazer a solução de reaquecimento. Estéril filtra risto a solução de reaquecimento usando um filtro de 0,22 μm e quente para 37 °C.
-
Reaqueça os hepatócitos.
- Pegue o tubo cônico com hepatócitos vitrificados do criotanque e transportá-lo em um nitrogênio líquido Dewar para o capô da cultura celular.
- Solte levemente a tampa e coloque o tubo cônico de volta no nitrogênio líquido.
- Adicione as gotículas de hepatócitovio a um copo vazio, adicione instantaneamente a solução de reaquecimento quente (37 °C) e mexa imediatamente por 10 s.
NOTA: É fundamental trabalhar rapidamente para evitar o congelamento durante o reaquecimento. Dependendo dos requisitos do estudo, algumas gotículas vitrificadas podem ser reaquecidas de uma só vez.
-
Descarregar a solução de reaquecimento.
- Divida a solução de reaquecimento com hepatócitos sobre dois tubos cônicos de 50 mL.
- Centrífuga os dois tubos cônicos para 2 min a 100 x g a 4 °C sem freio.
- Ascute o supernatant para deixar um volume total de 12.5 mL usando a marca da graduação do tubo cónico como uma referência e adicione 12.5 mL do dmem frio do gelo por o tubo cónico para diluir a solução rewarming a 50%.
- Resuspenda os hepatócitos e incuba no gelo por 3 min.
- Adicione 25 mL de Gelo frio DMEM por tubo cônico para diluir a solução de reaquecimento para 25%.
- Centrífuga por 5 min a 50 x g a 4 °C sem freio.
- Aspirar o supernatant e resuspender os hepatócitos em 2 mL do meio de cultura desejado para uso.
NOTA: Centrifugação gradiente densidade pode ser usado para remover hepatócitos mortos da suspensão celular, se desejar.
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Representative Results
Hepatócitos primários recém-isolados de cinco fígados de rato diferentes foram usados para uma comparação direta da vitrificação de gotículas em massa com a criopreservação clássica usando os proeminentes protocolos de congelamento lento relatados na literatura4, 5.Em suma, os hepatócitos foram suspensos em UW complementados com BSA (2,2 mg/mL), glicose (333 mM) e DMSO (10% v/v) e congelados por meio de um congelador de taxa controlada. Após o armazenamento em -196 °C, as amostras foram descongeladas em um banho de água morna. Depois que todo o gelo derreteu, o DMSO foi diluído diretamente quando a concentração da glicose foi abaixada gradualmente durante etapas múltiplas para reduzir ferimento osmótico. O protocolo exato pode ser encontrado em detalhes em outros lugares15. As durações de preservação variaram de 2 a 8 dias e foram combinadas entre vitrificação de gotículas em massa e criopreservação congelante para cada réplica biológica para garantir a comparação igual. Embora tempos de preservação mais curtos foram testados para considerações práticas, deve-se notar que os hepatócitos primários podem ser armazenados a -196 °C por anos sem perda de viabilidade5.
Vitrificação de gotículas em massa resulta em uma viabilidade hepatocito de preservação direta de 79%, medida pelo teste de exclusão azul Trypan, que determina a integridade da membrana (Figura 2A). Isso é significativamente maior do que a viabilidade de 68% após a criopreservação otimizada clássica. O rendimento da vitrificação de gotículas em massa é de 56% que é 10% maior, e importante mais consistente, em comparação com a criopreservação clássica (Figura 2B).
A atividade metabólica dos hepatócitos, medida por meio de um ensaio de metabólito Presto Blue em culturas de sanduíche de colágeno de longo prazo, foi significativamente maior após a vitrificação de gotículas em massa do que após a criopreservação clássica. A síntese de albumina, que é o parâmetro mais utilizado da função sintética dos hepatócitos, foi maior em quase duas vezes após a vitrificação de gotículas em massa em comparação com a criopreservação clássica (Figura 3A). A produção de Urea é o parâmetro mais utilizado da função de desintoxicação de hepatocitos. Depois de uma cultura de uma semana, a produção de urea de hepatócitos vitrificados de gotículas em massa foi significativamente maior do que a dos hepatócitos criopreservados clássicos (Figura 3B).
Em resumo, a vitrificação de gotículas em massa melhora a viabilidade direta pós-preservação e a função metabólica de longo prazo dos hepatócitos de ratos primários nas culturas sanduíche de colágeno, em comparação com a criopreservação por congelamento lento.
Figura 1: Configuração experimental de vitrificação de gotículas em massa.
(A)Ilustração de como preparar a agulha de mistura e anexar duas seções de tubos de silicone para as entradas da agulha de mistura. (B) Ilustração da inserção da agulha de mistura cortada na agulha de injeção para completar a montagem da agulha de mistura. (C)Ilustração do funil e do tubo cônico de 50 mL que constituem o dispositivo de coleta de gotículas. (D)Esboço mostrando a posição do tubo cônico, o funil, eo nível de nitrogênio líquido no Dewar. (E)Representação da configuração experimental completa de vitrificação de gotículas a granel de baixo para cima: o nitrogênio líquido Dewar (cinza); o dispositivo de coleta de gotículas que é colocado dentro do nitrogênio líquido Dewar (claro); a montagem da agulha de mistura (amarelo-claro) anexado às seringas que são colocadas na bomba de seringa (vermelho). (F)Ilustração das seringas e mistura de montagem de agulhas. Duas seringas de 3 mL são fixadas no adaptador da bomba de seringa (azul); uma seringa deve ser preenchida com hepatócitos pré-incubados na solução V1 e a outra com a solução de concentração de CPA alta (solução V2). O conjunto da agulha de mistura é unido às seringas por dois adaptadores fêmeas da farpa da mangueira do fechamento de Luer. (G)Ilustração de como criar a tampa do tubo cônico para armazenamento criogênico que permite que a sobra de evaporação de nitrogênio líquido escape do tubo cônico durante o armazenamento das gotículas de hepatócitovias. Topo: tampa com furos perfurados. Abaixo: a tampa perfurada embrulhada com filme flexível. Barras de escala: 1 cm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Viabilidade hepatocito e rendimento após preservação.
(A)Viabilidade de hepatócitos frescos (cinza), criopreservados (azuis) e gotícitos em massa vitrificados (verdes). (B) Rendimento de preservação de criopreservada e gotícula sumida hepatocitos vitrificados. Estrelas: p < 0.05 (Wilcoxon matched-pairs assinado teste de classificação). Bigodes: min ao máximo. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 3: Atividade metabólica em culturas de sanduíche de colágeno de longo prazo.
(A)Albumina síntese de fresco (cinza), criopreservado (azul), e gotícula sumário vitrificado (verde) hepatocitos na cultura dias 3, 5 e 7. (B) Urea produção de fresco, criopreservado, e gotícula sitrificada hepatócitos. Estrelas: p < 0.05 (emparelhado ANOVA de sentido único seguido pela correção Tukey para vários testes). Barras de erro: desvio padrão. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
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Discussion
Criopreservação de hepatócitos por congelamento lento resulta em redução da viabilidade e função metabólica. Vitrificação oferece uma alternativa promissora para a criopreservação clássica, como lesão de congelamento é completamente evitado9. No entanto, a pré-incubação com CPAs é necessária para reduzir a taxa de resfriamento crítico8. Consequentemente, a vitrificação é dificultada pela toxicidadecpa 17 e limitada a pequenos volumes de amostra. Nos esforços para superar essas limitações, o método de vitrificação de gotículas em massa apresentado neste manuscrito foi desenvolvido para permitir a vitrificação de grandes quantidades de células, usando uma baixa concentração de CPA pré-incubada15. Esta vitrificação de gotículas em massa leva ao aumento da viabilidade hepatocito e função metabólica em comparação com o método de criopreservação de congelamento lento mais ideal na literatura. Aqui, os métodos abrangentes de vitrificação de gotículas em massa e insights detalhados sobre os aspectos práticos dos procedimentos são fornecidos.
Várias etapas no protocolo são críticas e exigem atenção adicional. O enchimento do Dewar com nitrogênio líquido não esterilizado potencialmente leva a condições semi-estéreis. Usando as precauções explicadas no protocolo, nenhuma contaminação foi revelada durante nossas culturas a longo prazo do sanduíche do colagénio. No entanto, medidas adicionais de esterilização podem ser tomadas se for necessário. O nitrogênio líquido pode ser esterilizado pela radiação ou pela filtragem16 e o sistema pode completamente ser fechado com uma tampa no nitrogênio líquido Dewar com uma chaminé conectada à agulha de mistura. Alternativamente, métodos de vitrificação de gotículas sem contato podem ser explorados, embora isso possa limitar a taxa de produção de volume maior14.
Outras partes essenciais do protocolo são as durações de pré-carregamento e descarregamento de incubação do CPA. Durações mais longas podem resultar em lesão tóxica do CPA, enquanto durações mais curtas podem causar lesões osmóticas. Além disso, é importante garantir que as gotículas de hepatocitovidiado sempre fiquem abaixo da temperatura de transição de vidro porque a nucleação de gelo macro e microscópica descontrolada em temperaturas mais altas leve a lesões hepatocitos graves e à morte celular. De uma perspectiva prática, o passo mais crítico na vitrificação de gotículas em massa é o reaquecimento das gotículas de hepatócitovi. Quando as gotículas vitrificadas são removidas do nitrogênio líquido, elas podem congelar em segundos se não forem rapidamente reaquecidas por adicionar instantaneamente a solução de reaquecimento quente.
A otimização futura da vitrificação de gotículas em massa pode melhorar ainda mais os resultados de preservação, como a viabilidade, o rendimento e a função metabólica. Tanto os CPAs permeáveis quanto os não permeáveis poderiam ser testados para otimizar a desidratação osmótica antes da vitrificação. Isso poderia reduzir o choque osmótico durante a desidratação e também pode permitir diminuir as concentrações de CPA pré-incubadas. Além disso, fluidífica contínua, em vez de batchwise, CPA pré-incubação teoricamente permitiria vitrificação de quantidades celulares ilimitadas. Como apenas o equipamento geral de laboratório é necessário para vitrificação de gotículas em massa, é um método de preservação simples e econômico que poderia ser usado para preservação de outros tipos de células.
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Disclosures
Os autores declaram interesses financeiros concorrentes. Drs. de Vries, Weng, Toner, Tessier e Uygun têm pedidos de patente provisória relevantes para este estudo. O Dr. Uygun tem um interesse financeiro na Organ Solutions, uma empresa focada no desenvolvimento de tecnologia de preservação de órgãos. Todos os interesses do pesquisador são gerenciados pelo MGH e Partners HealthCare de acordo com suas políticas de conflito de interesses.
Acknowledgments
Financiamento dos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA (R01DK096075, R01DK107875 e R01DK114506) e do Departamento de Defesa dos EUA (DoD RTRP W81XWH-17-1-0680) é muito reconhecido.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Disposable 3 mL Syringes with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| Beaker | Sigma-Aldrich | CLS1000-250 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | BUW-001 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cole-Parmer Female Luer to 1/16" low-profile semi-rigid tubing barb, PP | Cole-Parmer | EW-45508-12 | |
| Cryogentic stroage tank / Cryotank | Chart Industries | MVE 800 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DMEM, powder, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 12800-082 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 107-21-1 | |
| Extra long forceps | Fisher Scientific | 10-316C | |
| Fisherbrand Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes - Flat top closure | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| Fishing line | Stren | SOFS4-15 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | 7727-37-9 | |
| Masterflex L/S Platinum-Cured Silicone Tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | |
| Mix Tips, For Use With 3HPW1 | Grainger | 3WRL7 | |
| Nalgene Polypropylene Powder Funnel | ThermoFisher | 4252-0100 | |
| Needle 20 ga | Becton Dickinson (BD) | 305175 | |
| Parafilm M - Flexible film | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| Razor Blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Spatula | Cole-Parmer | EW-06369-18 | |
| Steriflip sterile filter | Fisher Scientific | SE1M179M6 | |
| Sucrose (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Thermo-Flask Benchtop Liquid Nitrogen Container | ThermoFisher | 2122 |
References
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