여기에 제시된 것은 표준 실험실 장비와 불연속 소 혈청 알부민 밀도 그라데이션을 사용하여 성인 마우스 고환에서 파키틴 정자 세포, 둥근 정자 및 길쭉한 정자를 풍부하게하기위한 프로토콜입니다.
정자 발생의 각 단계를 특성화하기 위해, 연구원은 고환에서 세균 세포의 다른 하위 집단을 분리해야합니다. 그러나, 성인 고환은 체세포의 특정 인구와 더불어 정자 발생의 모든 단계에서 생식 세포의 복잡한 혼합을 포함하기 때문에, 분리인구를 고립시키는 것은 도전적입니다. 지난 수십 년 동안 원심 용해, 형광 활성화 세포 선별(FACS) 및 STA-PUT과 같은 다양한 기술이 생식 세포의 격리에 성공적으로 적용되었습니다. 단점은 모두 전용 장치와 전문 교육이 필요하다는 것입니다. STA-PUT 방법의 기초가 되는 원리에 따라, 간단한 프로토콜은 마우스 고환에서 파키텐 정자 세포, 둥근 정자 및 길쭉한 정자의 격리를 위해 개발되었습니다. 고환 세포의 단일 세포 현탁액을 준비 한 후, 특정 세포 집단은 불연속 소 혈청 알부민을 통해 중력 침전에 의해 풍부 (BSA) 밀도 구배. 그런 다음 셀 분획을 수동으로 수집하고 현미경으로 분석합니다. 둥근 정자 (MDR) 침전 프로토콜에 대한이 수정 된 밀도 구배는 표준 실험실 장비만 필요하기 때문에 널리 적용 될 수 있습니다. 또한, 프로토콜은 최소한의 시작 재료가 필요, 비용과 실험실 동물의 사용을 감소.
포유류 정자 형성 중에 일어나는 분자 및 생물학적 사건에 대해서는 아직 알려지지 않았으며, 정자 줄기 세포가 고도로 전문화된 정자1,2로변하는 복잡한 과정. 정자 발생은 고환의 반분부 관 내부에서 일어난다. 관은 정자 줄기 세포, 유사하게 분할 정자, meiotic 정자 세포 및 후 meioiotic 정자 (라운드에서 haploid 분화를 겪는)를 포함하여 분화의 각 단계에서 세균 세포의 혼합물을 포함합니다 정자를 길쭉하게 하고, 마침내 정자를 성숙시게 한다). 고환의 체세포는 유월성 관 안쪽에 세균 세포와 섞여 있는 Sertoli 세포, 관의 벽을 형성하는 경막 하 근체 세포, 및 tubules 사이 간질 공간에 있는 테스토스테론 생산 Leydig 세포를 포함합니다.
정자 발생 동안 분자 및 생화학 적 과정을 연구하는 것은 종종 고환 세포의 복잡한 혼합물에서 별개의 생식 세포 집단의 분리를 필요로한다. 세포 농축을 위해 많은 다른 전략이 개발되었습니다. 가장 성공적인 방법은 단위중력에의해 STA-PUT 속도 침전3,4,5,6,역류 원심 분리7,8에따라 원심 용해, DNA 함량 및/또는 특정 마커에 따라 세포를 분리하는 형광 활성화 세포 선별(FACS). 이 방법은 정자 발생 연구원 중 일반적으로 사용되 고 특정 생식 세포 유형의 효율적인 농축을 허용. 그러나 이러한 기술의 한계는 전문지식이 필요한 고가의 특수 하드웨어가 필요하다는 것입니다.
여기에 제시된 마우스 고환의 3개의 가장 풍부한 세포 인구의 풍부하게 한 인구를 격리하는 간단하고 저렴한 프로토콜입니다: 둥근 정자, pachytene 정자 세포, 및 길쭉한 정자. 이 프로토콜은 둥근 정자를 풍부하게 하는 데 특히 잘 작동하기 때문에 둥근 정자 (MDR)에 대한 수정 된 밀도 구배로 불립니다. MDR 방법은 STA-PUT 속도 침전과 동일한 원리를 기반으로하지만 표준 실험실 장비만 필요합니다. 살아있는 세포는 지구의 중력장 하에서 표준 50 mL 튜브 내부의 수동으로 제조 된 불연속 혈청 알부민 (BSA) 밀도 그라데이션을 통해 퇴적할 수 있습니다. 더 큰 세포는 배아 세포의 다른 인구를 분리하는 그라데이션을 통해 더 빨리 움직입니다. 침전 후, 세 가지 세포 유형의 농축 분획이 수동으로 수집됩니다. 이러한 농축 된 세포 집단의 순도는 STA-PUT 및 원심 용활화에 의해 수득 된 것과 비교된다.
속도 침전을 위한 BSA 그라데이션의 구성 및 사용을 덮는 것 외에도, 프로토콜은 또한 반분엽 관에서 고환 세포를 방출하는 소화 방법을 기술한다. 이 프로토콜은 Romrell et al.9에 의해 개발된 것으로부터 수정되었으며 콜라게나아제 IV 및 트립신을 함유한 순차적 소화를 포함한다. 중탄산염 완충제(즉, 크렙스 용액)의 사용과 결합된 순차적 소화는 배아 세포의 분리 및 생존능력을 크게 향상시키는 것으로나타났다(9)
MDR 농축 동안, 세포는 반분부 관의 환경 밖에서 함께 약 4 시간을 보내고 하류 분석을위한 매우 실행 가능한 세포 분획의 수집을 허용하는 스트레스가 많은 기계적 힘을 받지 않습니다. 또한, 원심 용해 및 STA-PUT과 유사하게, MDR 프로토콜은 세포의 어떠한 화학적 처리 또는 라벨링을 필요로 하지 않으며, 이는 또한 그들의 생존가능성을 유지하는 데 도움이 된다. 중요한 것은, 2개의 성인 마우스 고환이 MDR 격리를 위해 충분하고 그러므로, 1개의 성인 마우스는 RNA와 단백질 분석 둘 다를 위한 충분한 농축된 세포를 제공합니다. 표준 STA-PUT 프로토콜은 세포 격리를 위해 12명의 성인 마우스를 사용하는 것을권장합니다 6; 비록, 이전 경험에 따라, 그것은 성공적인 격리 3 ~ 4 성인 쥐에서 수행 될 수 있는 것으로 알려져 있다. 원심용해수기에 충분하다고 보고된 최저 자극물질은 6개의 마우스 고환(3마우스)이다8. 따라서 MDR 프로토콜은 고가의 특수 장비에 대한 필요성을 제거하는 것 외에도 필요한 실험실 동물의 수를 줄입니다.
여기에 제시된 것은 표준 실험실 장비를 사용하여 둥근 정자, 파키텐 정자 세포 및 길쭉한 정자의 농축 인구를 격리하는 간단하고 저렴한 프로토콜입니다(그림 4에표시된 프로토콜 개요). 전문 지식이나 고가의 기계류가 필요하지 않지만 조직 소화, 그라데이션 구성 및 구배에 세포 현탁액을 로딩하는 동안 고려해야 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다.
생식 세포는 2개의 연속적인 효소 소화에 의해 반분면 관에서 풀어 놓입니다. 콜라게나아제 IV를 함유한 첫 번째 소화는 간질 세포를 제거하여 반분부 관을 분리합니다. 장기간 된 소화 시간 수 있습니다 tubules 손상 하 고 정자의 손실로 이어질 수 있습니다., 로 (이 단계 동안 tubules에서 해제 하는 경우) 그들은 다음 단계에서 폐기 될 것 이다. 트립신을 가진 두 번째 소화 단계는 반분 회 에서 생식 세포를 풀어 놓습니다. 때때로 세포 포해가 있을 수 있고 전형적으로 몇몇 덩어리 는 풀어 놓인 게놈 DNA 때문에 양식합니다. 소화의 제안된 기간 또는 온도를 초과하는 것은, 이것은 나쁜 생존력, 증가한 세포 용해 및 응집으로 이끌어 낼 수 있기 때문에, 조언되지 않습니다. 온화한 응집이 발생하는 경우, 덩어리를 무시할 수 있습니다. 그러나, 상당한 응집 및 세포의 손실의 경우, 트립신 소화 시간 또는 농도 감소 한다. 또한 트립신의 효소 활성 배치 와 저장의 장기간 된 시간 동안 다를 수 있습니다 주목 해야 한다. 트립신 소화 시 DNase I의 양은 또한 과잉 덩어리를 제거하기 위해 증가 될 수있다, 그러나 이것은 보조 솔루션으로 간주되어야한다. 응집된 세포가 더 빨리 침전되어 분획을 오염시키고 그라데이션을 방해하기 때문에 전처리가 끝날 때 균일 한 단일 세포 현탁액을 얻는 것이 중요합니다.
그라데이션을 작성하려면 몇 가지 연습이 필요할 수 있습니다. 파이펫 컨트롤러가 있는 5mL 파이펫 팁을 사용하는 데 불편함이 있는 경우, 매끄러운 피스톤이 있는 일반 1mL 기계식 파이펫을 사용한 다음 피펫 팁을 직경 ~3mm의 조리개로 잘라내는 것이좋습니다(그림 1B). BSA 솔루션의 더 넓은 조리개와 부드러운 로딩은 그라데이션혼합의 위험을 감소시게 됩니다. 제대로 준비되면 서로 다른 굴절 지수로 인해 인접한 BSA 솔루션 사이의 경계를 볼 수 있습니다. 그라데이션은 사용하기 전에 직접 생성해야 합니다. 또한 작은 흔들림이나 진동이 그라데이션을 방해할 수 있으므로 그라데이션이 방해받지 않는 환경에서 설정해야 합니다.
그라데이션에 셀 서스펜션의 로딩은 매우 신중하게 수행해야합니다. 로딩 후 셀 서스펜션은 그라데이션 위에 유지되어야하며, 세포는 천천히 첫 번째 층을 통해 퇴적되기 시작합니다. 세포의 큰 그룹이 그라데이션을 통해 빠르게 움직이는 것을 볼 수 있는 경우에, 세포는 아마 주의깊게 중단되지 않았거나 과잉 응집이 있습니다. 세포가 로딩 시 불연속 BSA 그라데이션의 상단에 머무르지 않고 즉시 1% 및 2% BSA 층(단계 3.6) 사이에서 가라앉는 경우, 셀 서스펜션은 너무 조밀할 가능성이 높습니다. 이 프로토콜은 성인 마우스의 두 고환 (80-120 mg /testis)을 시작 재료로 사용하여 최적화되었습니다. 비록, 시작 재료의 감소 된 양을 사용하여 성공적인 격리가 수행되었습니다. 프로토콜을 업스케일링하고 고환의 높은 숫자에서 더 농축 된 생식 세포를 얻으려면 그라데이션이있는 50 mL 튜브를 더 도입해야합니다.
프로토콜은 처음에 개발 및 성인 마우스 고환에서 haploid 둥근 정자를 풍부하게하기 위해 최적화되었으며, 둥근 정자 분획의 순도는 90 % 이상이 될 것으로 예상된다. 매우 순수한 둥근 정자 분획 이외에, 파키틴 정자 세포의 농축과 길쭉한 정자의 농축에 대한 만족스러운 결과를 얻었다. 적혈구가 길쭉한 정자 분획을 오염시킬 수 있으며, 그들의 존재가 다운스트림 분석을 방해 할 것으로 예상되는 경우 이를 제거하기위한 추가 단계를 취해야한다는 점에 유의해야합니다. 우리는 MDR 프로토콜을 사용하여 성인 마우스에서 premeiotic 또는 초기 meiotic 세포 (파시텐 단계 이전)와 같은 그밖 세포 모형을 풍부하게 할 수 없었습니다.
또한, STA-PUT 침전은 성공적으로 출생 후 주어진 시점에서 수집 된 청소년 고환을 사용하여 정자 또는 preleptotene, 렙토텐, 및 zygotene 정자 세포의 풍부한 분획을 얻기 위해 사용되었습니다13. 이 접근은 정자 발생의 첫번째 파동 도중 이 세포 모형의 외관을 이용합니다. 동일한 접근 방식이 MDR 보강에 적용될 수 있지만 실제로는 아직 테스트되지 않았습니다. 분화의 특정 단계에서 premeiotic 및 meiotic 세포의 정제를 위한 좋은 선택권인 또 다른 방법은 존재 특정 마커에 근거를 둔 특정 세포 모형의 격리를 허용하는 중요한 이점이 있는 FACS입니다14 ,15,16,17.
전반적으로, MDR 속도 침전은 배아 세포 농축을 위한 유용한 방법역할을 한다. 이 방법은 농축 된 세포의 순도 또는 양면에서 다른 잘 확립 된 방법보다 우수하지 않지만 명확한 장점은 단순성과 낮은 설정 비용입니다. 이것은, 필요한 시작 물자의 낮은 양과 더불어, 이 프로토콜은 정자 발생 필드에 있는 연구원 및 그밖 필드에 있는 그(것)들에 있는 사람들을 위한 중대한 선택권을 렌더링합니다 전문화한 하드웨어 또는 동물의 큰 단에 투자하고 싶지 않을 지도 모릅니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 프로토콜의 개발 동안 자신의 기여에 대한 모든 Kotaja 실험실 회원에게 감사하고, 자신의 연구 프로젝트에서 프로토콜의 적극적인 사용및 테스트. 특히 우리는 프로토콜을 최적화하는 데 도움을 주어 Jan Lindström의 기여에 감사드립니다. 이 연구는 핀란드 아카데미, 시그리드 주셀리우스 재단, 그리고 분자 의학의 투르쿠 박사 프로그램에 의해 지원되었다.
4% Paraformaldehyde | Preference of researcher | ||
AlexaFluor488 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
AlexaFluor647 donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A-31571 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9647 | |
CaCl2·2H2O | Preference of researcher | ||
Collagenase IV | Sigma | C5138 | |
Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836145001 | |
DDX4 antibody | Abcam | ab13840 | |
Dextrose | Preference of researcher | ||
DNase I | Worthington | LS006355 | |
GAPDH | HyTest | 5G4 | |
HRP-linked anti-mouse IgG | GE Healthcare Life Sciences | NA931 | |
HRP-linked anti-rabbit IgG | GE Healthcare Life Sciences | NA934 | |
KCl | Preference of researcher | ||
KH2PO4 | Preference of researcher | ||
MgSO4·7H2O | Preference of researcher | ||
NaCl | Preference of researcher | ||
NaHCO3 | Preference of researcher | ||
NH4Cl | Preference of researcher | ||
Pierce BCA protein assay kit | Life Technologies | 23227 | |
PIWIL1 | Cell Signaling Technology | G82 | |
PIWIL2, clone 13E-3 | Millipore | MABE363 | |
Prolong Diamond Antidafe Mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36962 | for Alexa Fluor immunostainings |
rabbit IgG | Neomarkers | NC-100-P | |
Rhodamine-labelled Peanut agglutinin (PNA) | Vector Laboratories | RL-1072 | |
RIPA buffer | 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1% NP-40, 0.5% w/v sodium deoxycholate, 0.05% w/v SDS, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1x protease inhibitor cocktail, 0.2 mM PMSF and 1 mM DTT | ||
TRIsure | Bioline | BIO-38033 | |
Triton X-100 | Preference of researcher | nonionic surfactant | |
Trypsin | Worthington | LS003703 | |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | for standard DAPI analysis of cell fractions |
γH2AX antibody | Millipore | 05-636 | |
0.22 µm filter | Sartorius | Sartolab BT 180C6 | or equivalent |
1 ml mechanical pipette | Preference of researcher | ||
1.5 mL or 2 ml tubes | Preference of researcher | ||
40 µm cell sieves for 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 542040 | or equivalent cell strainer |
5 mL serological pipettes | Sarstedt | 86.1254.001 | or equivalent |
50 mL conical tubes | Preference of researcher | ||
6 cm Petri dishes | Preference of researcher | ||
cell culture incubator | Preference of researcher | ||
centrifuge for 50 mL tubes | Preference of researcher | ||
grease pen for microscopy glass slides | Preference of researcher | ||
HulaMixer Sample Mixer | Thermo Fisher Scientific | 15920D | or equivalent cell rotator |
microdissection forcepts | Preference of researcher | ||
microdissection scissors | Preference of researcher | ||
microscopy glass slides and coverslips | Preference of researcher | ||
Nanodrop 1000 | Thermo Scientific | ||
Pipetboy Acu 2 | Integra | 155 000 | or equivalent pipette controller |
refrigerated centrifuge for 1.5 mL tubes | Preference of researcher | ||
tips for 1 ml mechanical pipette | Preference of researcher | ||
water bath | Preference of researcher | ||
widefield fluorescence microscope | Preference of researcher |