Præsenteret her er en protokol til berigelse af pachytene spermatocytter, runde spermatids, og aflange spermatids fra voksne mus testiklerne ved hjælp af en diskontinuerlig kvægserum albumin tæthed gradient med Standardlaboratorieudstyr.
For at karakterisere hvert trin af spermatogenesen, skal forskerne adskille forskellige delpopulationer af kimceller fra testiklerne. Men isolerende diskrete populationer er udfordrende, fordi den voksne testikel indeholder en kompleks blanding af kimceller fra alle trin af spermatogenese sammen med visse populationer af somatiske celler. I løbet af de sidste par årtier, forskellige teknikker såsom centrifugal elutriation, fluorescens-aktiverede celle sortering (FACS), og STA-PUT er blevet anvendt med succes til isolering af kimceller. En ulempe er, at de alle kræver dedikerede enheder og specialiseret uddannelse. Følgende principper underliggende STA-PUT metode, en simpel protokol er blevet udviklet til isolering af pachytene spermatocytter, runde spermatids, og aflange spermatids fra mus testiklerne. Efter klargøring af en enkelt cellesuspension af testikel celler, er specifikke cellepopulationer beriget af tyngdekraften sedimentering gennem en diskontinuerlig kvægserum albumin (BSA) tæthed gradient. Celle brøker indsamles derefter manuelt og mikroskopisk analyseres. Denne modificerede tætheds gradient for rund spermatids (MDR) sedimenterings protokol kan anvendes bredt, fordi det kun kræver Standardlaboratorieudstyr. Desuden kræver protokollen minimale udgangsmaterialer, hvilket reducerer omkostningerne og brugen af forsøgsdyr.
Der er stadig meget ukendt for de molekylære og biologiske hændelser, der finder sted under pattedyrs spermatogenese, en kompleks proces, hvor sædceller omdannes til højt specialiserede spermatozoer1,2. Spermatogenesen finder sted inde i de seminiferøse tubuler af testierne. Tubuderne indeholder en blanding af kimceller fra hvert trin af differentiering, herunder spermatogoniale stamceller, mitotisk dividere spermatogonia, meiotiske spermatocytter, og postmeiotiske spermatids (som gennemgår haploide differentiering fra runde spermatids til langstrakt spermatids, og endelig til modne spermatozoer). Somatiske celler i testikel omfatter Sertoli celler, der er sammenblandet med kimceller inde i sædkanaler tubuler, peritubular myoid celler, der danner vægge af tubuler, og testosteron-producerende Leydig celler i den interstitielle rum mellem tubuler.
Studere molekylære og biokemiske processer under spermatogenese kræver ofte adskillelse af særskilte kimcelle populationer fra en kompleks blanding af testikel celler. Mange forskellige strategier er udviklet til celle berigelse. De mest vellykkede metoder er Sta-Put hastighed sedimentering efter enhed tyngdekraften3,4,5,6, centrifugal elutriation baseret på modstrøms centrifugering7,8, og fluorescens-aktiverede celle sortering (FACER), der adskiller cellerne efter DNA-indhold og/eller specifikke markører. Disse metoder er almindeligt anvendt blandt spermatogenesen forskere og give mulighed for en effektiv berigelse af specifikke kimcelle typer. Men, en begrænsning af disse teknikker er, at de kræver specialiseret, dyre hardware, der kræver ekspertise.
Præsenteret her er en enkel og billig protokol til at isolere beriget populationer af de tre mest rigelige cellepopulationer af mus testiklerne: runde spermatids, pachytene spermatocytter, og aflange spermatids. Denne protokol betegnes som den modificerede densitet gradient for runde spermatids (MDR), fordi det virker særligt godt for berigende runde spermatider. MDR-metoden er baseret på de samme principper som STA-PUT-hastigheds sedimentering, men kræver kun Standardlaboratorieudstyr. Levende celler får lov til at sediment gennem en manuelt forberedt diskontinuert kvægserum albumin (BSA) tæthed gradient inde i en standard 50 mL rør under jordens gravitationsfelt. Større celler bevæger sig hurtigere gennem gradienten, som adskiller forskellige populationer af kimceller. Efter sedimentering indsamles der manuelt berigede fraktioner af de tre celletyper. Renheden af disse berigede cellepopulationer kan sammenlignes med dem, der opnås ved STA-PUT og centrifugal elutriation.
Ud over at dække opførelsen og brugen af BSA gradient for hastighed sedimentering, protokollen også beskriver en fordøjelse metode til at frigive testikel celler fra sædkanaler tubuler. Protokollen blev ændret fra den, der er udviklet af romrell et al.9 og omfatter sekventiel digestions med kollagenase IV og trypsin. Sekventiel digestions kombineret med brug af en bicarbonat buffer (dvs., krebs opløsning) har vist sig at i høj grad øge adskillelsen og levedygtighed af kimceller9.
Under MDR-berigelse bruger cellerne omkring 4 timer sammen uden for miljøet i de seminiferøse tubuler og udsættes ikke for stressende mekaniske kræfter, hvilket giver mulighed for indsamling af meget levedygtige celle fraktioner til downstream-analyse. Derudover kræver MDR-protokollen, svarende til centrifugal elutriering og STA-PUT, ingen kemisk behandling eller mærkning af celler, hvilket også bidrager til at bevare deres levedygtighed. Vigtigere er, så lidt som to voksne mus testiklerne er tilstrækkelige til MDR isolation og derfor, en voksen mus giver nok berigede celler til både RNA og proteinanalyse. Standard STA-PUT-protokollen anbefaler brug af så mange som 12 voksne mus til celle isolation6; selv om, baseret på tidligere erfaring, det er kendt, at en vellykket isolation kan gøres fra tre til fire voksne mus. Den laveste mængde af udgangsmateriale rapporteret at være tilstrækkelig til centrifugal elutriation er seks mus testiklerne (tre mus)8. Ud over at eliminere behovet for dyrt specialiseret udstyr nedsætter MDR-protokollen derfor antallet af påkrævede forsøgsdyr.
Præsenteret her er en enkel og billig protokol til at isolere beriget populationer af runde spermatider, pachytene spermatocytter, og aflange spermatids ved hjælp af Standardlaboratorieudstyr (oversigt over den protokol, der er vist i figur 4). Selvom ingen ekspertise eller dyre maskiner er påkrævet, der er nogle kritiske trin, der skal overvejes under vævs fordøjelse, opførelse af gradient, og lastning af cellen suspension på gradient.
Kimceller frigives fra seminiferøse tubuler ved to på hinanden følgende enzymatiske digestions. Den første fordøjelse med kollagenase IV adskiller seminiferøse tubuler ved at fjerne interstitielle celler. Forlænget fordøjelsestid kan beskadige tubuderne og føre til tab af spermatid, som (hvis frigivet fra tubuderne i dette trin) de vil blive kasseret i de følgende trin. Det andet fordøjelses trin med trypsin frigiver kimceller fra seminiferøse tubuler. Der kan være lejlighedsvis cellelyse og typisk nogle klumper form på grund af frigivet genomisk DNA. Overskridelse af den foreslåede varighed eller temperatur af fordøjelsen ikke tilrådes, da dette kan føre til dårligere levedygtighed, øget cellelyse, og clumping. Hvis der opstår mild sammenklumpning, kan klumper ignoreres. I tilfælde af signifikant sammenklumpning og tab af celler bør trypsin fordøjelsestid eller koncentration dog nedsættes. Det skal også bemærkes, at trypsins enzymatiske aktivitet kan variere mellem batcher og under længere tids opbevaring. Mængden af DNase I under fordøjelsen af trypsin kan også øges for at fjerne overskydende klumper, men dette bør betragtes som en sekundær opløsning. Det er vigtigt at opnå en homogen enkelt cellesuspension i slutningen af forbehandlingen, da klumpede celler vil sediment hurtigere, kontaminere fraktioner og forstyrre gradient.
Opbygning af gradient kan kræve nogle praksis. Hvis der er ubehag ved hjælp af en 5 mL pipettespids med en pipette regulator, anbefales det at anvende en normal 1 mL mekanisk pipette med et glat stempel og derefter skære pipette spidserne til en blænde på ~ 3 mm i diameter (figur 1B). En større blændeåbning og problemfri indlæsning af BSA-opløsninger vil nedsætte risikoen for at blande forløbet. Når det er korrekt forberedt, er det muligt at se grænserne mellem tilstødende BSA-løsninger på grund af deres forskellige brydnings indekser. Gradient skal produceres direkte før brug. Det skal også bemærkes, at enhver lille rystelser eller vibration kan forstyrre gradient, så gradient bør indstilles i et miljø, hvor det ikke vil blive forstyrret.
Indlæsning af cellesuspensionen på gradient skal ske meget omhyggeligt. Efter lastning, bør cellesuspensionen forblive på toppen af gradient, hvorfra cellerne langsomt vil begynde at sediment gennem det første lag. Hvis store grupper af celler ses bevæger sig hurtigt gennem gradient, cellerne var sandsynligvis ikke resuspenderet omhyggeligt eller der er overskydende clumping. Hvis cellerne ikke forbliver på toppen af den diskontinuerlige BSA gradient ved lastning, men straks synke mellem 1% og 2% BSA lag (trin 3,6), cellesuspensionen er sandsynligvis for tæt. Denne protokol er blevet optimeret ved hjælp af to testiklerne af en voksen mus (80-120 mg/testis) som udgangsmateriale; Selvom der er udført vellykkede isoleringer med reducerede mængder af udgangsmateriale. For at opskalere protokollen og opnå mere berigede kimceller fra et højere antal testikler, bør der indføres mere 50 mL rør med gradient.
Protokollen blev oprindeligt udviklet og optimeret til at berige haploide runde spermatids fra voksne mus testiklerne, og renheden af runde spermatid fraktioner forventes at være mere end 90%. Ud over meget rene rund spermatik fraktioner blev der opnået tilfredsstillende resultater for tilsætning af pachytene spermatocytter og langstrakte spermatiker. Det skal bemærkes, at erythrocytter kan kontaminere den forlængede spermatid fraktioner, og yderligere skridt til at eliminere dem bør tages, hvis deres tilstedeværelse forventes at forstyrre downstream analyser. Vi har ikke været i stand til at berige andre celletyper såsom premeiotiske eller tidlige meiotiske celler (før pachytene fase) fra voksne mus ved hjælp af MDR-protokollen.
Desuden har Sta-Put sedimentering med succes været anvendt til at opnå berigede fraktioner af spermatogonier eller preleptoten, leptoten og zygotene spermatocytter ved hjælp af Juvenile testikler indsamlet på givne tidspunkter efter fødslen13. Denne fremgangsmåde udnytter udseendet af disse celletyper under den første bølge af spermatogenesen. Den samme fremgangsmåde kan sandsynligvis anvendes på MDR-berigelse, men den er endnu ikke afprøvet i praksis. En anden metode, der er en god mulighed for rensning af præmeiotiske og meiotiske celler på bestemte stadier af differentiering er FACS, som har den store fordel at tillade isolering af specifikke celler typer baseret på tilstedeværelsen specifikke markører14 ,15,16,17.
Samlet set, MDR hastighed sedimentering tjener som en nyttig metode til kimcelle berigelse. Selv om denne metode ikke er bedre end andre veletablerede metoder med hensyn til renheden eller mængden af berigede celler, er dens klare fordele dens enkelhed og lave opspændings omkostninger. Dette, sammen med den lave mængde af nødvendige udgangsmaterialer, gøre denne protokol en stor mulighed for forskere i spermatogenesen felt og dem i andre områder, der måske ikke ønsker at investere i specialiseret hardware eller store grupper af dyr.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke alle Kotaja Lab medlemmer for deres bidrag i løbet af udviklingen af protokollen, og den aktive brug og afprøvning af protokollen i deres forskningsprojekter. Især vi sætter pris på bidraget fra Jan Lindström for at hjælpe med at optimere protokollen. Denne undersøgelse blev støttet af det finske akademi, Sigrid Jusélius Foundation, og Turku doktorale program for Molekylær medicin.
4% Paraformaldehyde | Preference of researcher | ||
AlexaFluor488 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
AlexaFluor647 donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A-31571 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9647 | |
CaCl2·2H2O | Preference of researcher | ||
Collagenase IV | Sigma | C5138 | |
Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836145001 | |
DDX4 antibody | Abcam | ab13840 | |
Dextrose | Preference of researcher | ||
DNase I | Worthington | LS006355 | |
GAPDH | HyTest | 5G4 | |
HRP-linked anti-mouse IgG | GE Healthcare Life Sciences | NA931 | |
HRP-linked anti-rabbit IgG | GE Healthcare Life Sciences | NA934 | |
KCl | Preference of researcher | ||
KH2PO4 | Preference of researcher | ||
MgSO4·7H2O | Preference of researcher | ||
NaCl | Preference of researcher | ||
NaHCO3 | Preference of researcher | ||
NH4Cl | Preference of researcher | ||
Pierce BCA protein assay kit | Life Technologies | 23227 | |
PIWIL1 | Cell Signaling Technology | G82 | |
PIWIL2, clone 13E-3 | Millipore | MABE363 | |
Prolong Diamond Antidafe Mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36962 | for Alexa Fluor immunostainings |
rabbit IgG | Neomarkers | NC-100-P | |
Rhodamine-labelled Peanut agglutinin (PNA) | Vector Laboratories | RL-1072 | |
RIPA buffer | 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1% NP-40, 0.5% w/v sodium deoxycholate, 0.05% w/v SDS, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1x protease inhibitor cocktail, 0.2 mM PMSF and 1 mM DTT | ||
TRIsure | Bioline | BIO-38033 | |
Triton X-100 | Preference of researcher | nonionic surfactant | |
Trypsin | Worthington | LS003703 | |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | for standard DAPI analysis of cell fractions |
γH2AX antibody | Millipore | 05-636 | |
0.22 µm filter | Sartorius | Sartolab BT 180C6 | or equivalent |
1 ml mechanical pipette | Preference of researcher | ||
1.5 mL or 2 ml tubes | Preference of researcher | ||
40 µm cell sieves for 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 542040 | or equivalent cell strainer |
5 mL serological pipettes | Sarstedt | 86.1254.001 | or equivalent |
50 mL conical tubes | Preference of researcher | ||
6 cm Petri dishes | Preference of researcher | ||
cell culture incubator | Preference of researcher | ||
centrifuge for 50 mL tubes | Preference of researcher | ||
grease pen for microscopy glass slides | Preference of researcher | ||
HulaMixer Sample Mixer | Thermo Fisher Scientific | 15920D | or equivalent cell rotator |
microdissection forcepts | Preference of researcher | ||
microdissection scissors | Preference of researcher | ||
microscopy glass slides and coverslips | Preference of researcher | ||
Nanodrop 1000 | Thermo Scientific | ||
Pipetboy Acu 2 | Integra | 155 000 | or equivalent pipette controller |
refrigerated centrifuge for 1.5 mL tubes | Preference of researcher | ||
tips for 1 ml mechanical pipette | Preference of researcher | ||
water bath | Preference of researcher | ||
widefield fluorescence microscope | Preference of researcher |