Summary
Les effets des inhibiteurs migrastatiques sur la migration de cellules cancéreuses de glioma dans les essais tridimensionnels (3D) d'invasion utilisant un inhibiteur de l'histone deacetylase (HDAC) sont caractérisés par la microscopie confocale à haute résolution.
Abstract
La découverte et le développement de médicaments dans la recherche sur le cancer sont de plus en plus basés sur des écrans de médicaments dans un format 3D. De nouveaux inhibiteurs ciblant le potentiel migratoire et invasif des cellules cancéreuses, et par conséquent la propagation métastatique de la maladie, sont découverts et considérés comme des traitements complémentaires dans les cancers hautement invasifs tels que les gliomes. Ainsi, la génération de données permettant des analyses détaillées des cellules dans un environnement 3D après l'ajout d'un médicament est nécessaire. La méthodologie décrite ici, combinant des essais d'invasion sphéroïde avec la capture d'image à haute résolution et l'analyse des données par microscopie à balayage laser confocal (CLSM), a permis une caractérisation détaillée des effets de l'inhibiteur anti-migratoire potentiel MI-192 sur les cellules de gliome. Des sphéroïdes ont été produits à partir des lignées cellulaires pour des essais d'invasion dans les plaques de 96 puits adhérentes basses et ont ensuite préparé pour l'analyse de CLSM. Le flux de travail décrit a été préféré à d'autres techniques de production sphéroïde couramment utilisées en raison de la facilité et de la reproductibilité. Ceci, combiné à la résolution d'image améliorée obtenue par microscopie confocale par rapport aux approches conventionnelles à large champ, a permis l'identification et l'analyse des changements morphologiques distincts dans les cellules migratrices dans un environnement 3D suivant traitement avec le médicament migrastatique MI-192.
Introduction
Les technologies sphéroïdes tridimensionnelles pour la découverte de médicaments précliniques et le développement de médicaments anticancéreux potentiels sont de plus en plus favorisées par-dessus les écrans de médicaments conventionnels; ainsi, il y a plus de développement des drogues migrastatiques — migration et invasion — . La raison d'être de ces développements dans le traitement du cancer est claire : les essais sphéroïdes 3D représentent une approche plus réaliste pour le dépistage des médicaments anticancéreux potentiels, car ils imitent l'architecture tumorale 3D plus fidèlement que les cultures monocouches cellulaires, récapitulez les interactions médicament-tumeur (cinétique) avec plus de précision, et permettez la caractérisation de l'activité médicamenteuse dans un cadre lié à la tumeur. En outre, l'augmentation de la résistance aux médicaments chimiotoxiques dans de nombreux types de cancer et les taux de mortalité élevés chez les patients atteints de cancer en raison de métastes potentialisées par la capacité des cellules cancéreuses à migrer vers des sites tumoraux éloignés soutient l'inclusion d'agents chimiothérapeutiques ciblant le potentiel migratoire des cellules cancéreuses comme traitement adjuvant dans les futurs essais cliniques sur le cancer1. C'est particulièrement le cas dans les cancers très invasifs, tels que les glioblastomes à haute teneur (GBM). La gestion de GBM inclut la chirurgie, la radiothérapie, et la chimiothérapie. Cependant, même avec le traitement de combinaison, la plupart des patients rechutent dans un délai de 1 an du diagnostic initial avec une survie médiane de 11-15 mois2,3. D'énormes progrès dans le domaine de la technologie 3D ont été réalisés au cours des dernières années : systèmes rotatifs, structures microfabriquées et échafaudages 3D, et d'autres essais individuels sont continuellement améliorés pour permettre des essais de routine à grande échelle4, 5,6,7. Cependant, les résultats obtenus à partir de ces essais doivent être analysés de manière significative, car l'interprétation des données est souvent entravée par les tentatives d'analyse des données générées en 3D avec des systèmes d'analyse d'images 2D.
Bien qu'ils soient préférables en termes de vitesse d'acquisition d'images et de réduction de la toxicité de la photo, la plupart des systèmes à champ large restent limités par la résolution8. Ainsi, en dehors des données de lecture relatives à l'efficacité des médicaments, les effets détaillés de l'action médicamenteuse sur les structures cellulaires 3D des cellules migrantes sont inévitablement perdus s'ils sont représentés à l'aide d'un système à champ large. Inversement, la microscopie par balayage laser confocal (CLSM) capture des images de haute qualité, sectionnement optique qui peuvent être reconstruites et rendues en 3D après l'acquisition à l'aide d'un logiciel informatique. Ainsi, CLSM est facilement applicable à l'imagerie complexe structures cellulaires 3D, permettant ainsi l'interrogation des effets des inhibiteurs anti-migrastatic sur les structures 3D et des analyses approfondies des mécanismes de migration cellulaire. Cela guidera sans aucun doute le développement futur de médicaments migrastatiques. Ici, un flux de travail combiné de la génération sphéroïde, du traitement de drogue, du protocole de coloration, et de la caractérisation par microscopie confocale à haute résolution est décrit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Génération de sphéroïdes cellulaires
Jour 1
- Préparer le milieu de culture standard comme l'exige la ligne cellulaire faisant l'objet de l'enquête.
- Effectuer toutes les étapes associées à la culture tissulaire dans une hotte de culture tissulaire en utilisant des techniques de manipulation stériles.
- Trypsiniser et compter les cellules cancéreuses. Utiliser 20 ml de suspension cellulaire par assiette. Gardez les suspensions cellulaires dans des tubes universels stériles clairement étiquetés.
- Ajoutez un nombre prédéterminé de cellules à chaque puits. Le nombre initial de cellules et la taille ultime du sphéroïde requis dépendent du taux de prolifération de la lignée cellulaire à l'étude.
REMARQUE: Pour les lignées cellulaires de gliomes établies telles que U251 et KNS429,10, 5 x 103 cellules/mL produiront un sphéroïde microscopiquement visible (200 ou 800 m) après 4 jours d'incubation. - Resuspendre les cellules dans des tubes universels par inversion douce pour éviter l'agglutination cellulaire. Pipette 200 l de la suspension cellulaire dans chaque puits d'une plaque de 96 puits. Si tous les puits ne sont pas nécessaires, il est conseillé d'ajouter 200 L de 1x PBS à chaque puits vide pour éviter l'évaporation.
- Incuber les cellules dans un incubateur comme d'habitude à 37 oC.
REMARQUE: Les lignées cellulaires telles que les lignées cellulaires cancéreuses du gliome formeront des sphéroïdes dans les 24 h. Permettre à l'architecture cellulaire 3D de se former en couvant le sphéroïde pendant 72 h.
Jour 2
- Vérifier les cellules par microscopie de champ lumineux après 24 h. Selon la lignée cellulaire, les cellules peuvent avoir formé un sphéroïde détectable au fond du puits.
REMARQUE: Les lignées cellulaires cancéreuses établies de gliome forment facilement des sphéroïdes dans un délai de 24 h. Les lignées de cellules cancéreuses du gliome dérivées du patient peuvent prendre jusqu'à 1-2 semaines.
2. Collagen Invasion Assay
Jour 3
- Placer le collagène, le milieu de culture 5x, 1 M NaOH, et un tube de 20 ml sur la glace.
- Ajouter soigneusement et lentement 10,4 ml de collagène froid dans un tube de culture réfrigéré. Évitez les bulles. Cette quantité de collagène est suffisante pour une plaque de 96 puits. La mise à l'échelle est possible, mais il est recommandé qu'un tube de 20 ml par plaque soit préparé à la fois.
- Ajouter délicatement 1,52 ml de milieu de culture stérile froid 5x. Évitez les bulles.
- Juste avant l'utilisation, ajouter délicatement 72 'L de froid stérile 1 M NaOH. Gardez la solution sur la glace.
- Mélanger délicatement par pipetting. Évitez les bulles. Un mélange efficace entraîne un changement de couleur (du rouge au rouge orange (pH 7,4) dans le milieu. Laisser le mélange sur la glace jusqu'à l'utilisation.
- Étape cruciale : Retirez 190 l de supernatant de la plaque de 96 puits préparée le jour 1. Soyez très prudent de ne pas déranger les sphéroïdes qui se sont formés dans le fond du puits. Utilisez la pipette à un angle vers le côté, et non au centre, du puits.
- Ajouter délicatement 100 l du mélange de collagène à chaque puits. Pour éviter toute perturbation sphéroïde, pipette le mélange sur le côté du puits. Évitez les bulles. Conservez le reste du mélange de collagène dans le tube de 20 ml à température ambiante pour évaluer la polymérisation.
- Incuber la plaque dans l'incubateur pendant au moins 10 min pour permettre au collagène de polymériser. Comme ligne directrice, si le collagène restant a réglé, devenant semi-solide et éponge-comme, les sphéroïdes sont prêts à être traités avec l'inhibiteur.
- Ajouter les médicaments ou les inhibiteurs à la concentration 2x au milieu de la culture. Ajouter doucement le milieu à chaque puits (100 l par puits). Encore une fois, pipette le milieu sur le côté du puits pour éviter les perturbations sphéroïdes.
- Observez et imagez chaque sphéroïde par microscopie de champ lumineux à des moments T - 0 h, 24 h, 48 h, et 72 h pour évaluer l'activité de drogue. Puis remettez la plaque à l'incubateur.
REMARQUE: Selon le comportement invasif de la lignée cellulaire, la migration loin du noyau sphéroïde d'origine peut être observée à partir de 24 h.
3. Préparation de sphéroïdes incorporés au collagène et de cellules migratrices pour la microscopie confocale
- Placer la plaque dans une hotte de culture tissulaire et retirer délicatement le supernatant (200 l). Encore une fois, prendre soin de ne pas déranger le sphéroïde et éviter de toucher le collagène, car cela peut interférer avec le bouchon de collagène.
- Remplacer le supernatant par 100 OL de 1x PBS. Répétez cette étape de lavage 3x.
- Retirer le lavage final et remplacer par 4 % de formaldéhyde dans 1 x PBS (100 l par puits).
MISE EN GARDE: Le formaldéhyde est un cancérogène potentiel. Manipuler avec soin conformément aux directives de santé et de sécurité. - Placer la plaque de 96 puits sur un banc de laboratoire, couvrir de papier d'aluminium et laisser reposer 24 h à température ambiante.
- Retirez soigneusement le formaldéhyde et remplacez-le par 1x PBS. Répétez ce lavage 1x PBS 3x.
- Préparer 0,1% Triton X-100 en 1x PBS. Retirez le lavage 1x PBS et remplacez-le par 100 L de la solution Triton X-100. Incuber 30 min à température ambiante. En attendant, préparer la solution de blocage avec 1x PBS et 0,05% de lait écrémé en poudre et bien mélanger.
- Retirez Triton X-100 et lavez 3x avec 1x PBS. Ajouter 100 l de solution de blocage à chaque puits et incuber pendant 15 min.
- Diluer l'anticorps primaire requis pour bloquer le tampon à la concentration prédéterminée. Ici, utilisez l'anticorps anti-souris IgG acétylé tubulin (1:100).
- Centrifugeuse le mélange tampon principal de blocage d'anticorps pendant 5 min à 15 682 x g. Retirez soigneusement la solution de blocage et ajoutez le supernatant (25 à 50 l) à chaque puits. Incuber dans l'obscurité à température ambiante pendant 1 h.
- Retirez la solution d'anticorps et lavez 3x avec 1x PBS (100 l par puits).
- Diluer l'anticorps secondaire dans le tampon de blocage à la concentration recommandée ou prédéterminée en plus de toutes les taches fluorescentes supplémentaires. Ici, utilisez 1:500 anticorps conjugués anti-souris fluorophore-488, phalloidin-594 (1:500) pour la coloration d'actine, et la tache d'ADN (DAPI).
- Encore une fois, centrifuger la solution d'anticorps secondaire pour 5 min à 13.000 tr/min.
- Retirez la solution de blocage de chaque puits et ajoutez 25 à 50 L du mélange anticorps/phalloidin/DAPI secondaire. Incuber dans l'obscurité pendant 1,5 h à température ambiante.
- Enlever la solution secondaire de teinture d'anticorps et laver 3x avec 1x PBS (100 L par puits).
- Soulevez soigneusement les bouchons individuels de collagène par aspiration avec une pipette en plastique (200 l) sur le centre d'un toboggan en verre ordinaire de haute qualité.
- Ajouter une goutte d'un mondeur approprié à la prise de collagène, en veillant à ce que la fiche soit complètement recouverte. Évitez les bulles.
- Appliquer le bordereau de l'épaisseur optimale pour l'objectif du microscope qui sera utilisé pour l'imagerie et permettre de définir pendant la nuit. Conserver les toboggans à température ambiante dans l'obscurité.
4. Microscopie fluorescence
- Capturez des images fluorescentes à l'aide d'un microscope confocal approprié.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La technologie sphéroïde tridimensionnelle fait progresser la compréhension des interactions médicamenteuses parce qu'elle est plus représentative de l'environnement spécifique au cancer. La génération de sphéroïdes peut être réalisée de plusieurs façons; des plaques de 96 puits à faible adhérence ont été utilisées dans ce protocole. Après avoir testé plusieurs produits de différents fabricants, les plaques utilisées ici ont été choisies parce qu'elles ont toujours obtenu les meilleurs résultats en termes de production et d'uniformité sphéroïdes réussies. L'étape de remplacement, où le milieu de croissance est remplacé par la matrice de collagène, est un point critique du protocole; un grand soin doit être pris pour enlever la plupart du milieu sans déranger le sphéroïde lui-même. L'imagerie automatisée pour la caractérisation des effets induits par les médicaments par microscopie à champ large peut être considérée comme éliminant tout biais de gestionnaire, mais les instruments actuellement disponibles sur le marché demeurent beaucoup plus chers que les approches d'imagerie décrit ici.
La microscopie à grande échelle permet d'examiner l'effet de l'activité des drogues sur la migration et l'invasion cellulaires. Cependant, la résolution obtenue à partir de la microscopie à champ large n'est pas suffisante pour permettre une interprétation détaillée des résultats en ce qui concerne l'effet médicamenteux sur la morphologie cellulaire (figure 1). Ici, la préparation des sphéroïdes de gliome et des cellules de migration par des protocoles facilement reproductibles de coloration est décrite, suivie d'image à l'aide d'un microscope confocal. De l'analyse d'image de microscopie de large champ, il était évident que différents changements morphologiques s'étaient produits dans les cellules de gliome suivant le traitement avec l'inhibiteur de MI-192, mais les détails clairement définis manquaient. La microscopie confocale a confirmé les résultats initiaux, et ces images de résolution plus élevée ont permis l'évaluation de l'effet du MI-192 encore plus loin. Des différences significatives entre les sphéroïdes non traités (contrôle), les cellules migratrices (figure 2), et les sphéroïdes et les cellules traités (figure 3) sont devenues évidentes. Alors que la lignée cellulaire de gliome adulte U251 semblait migrer en « pointes », rayonnant loin du noyau sphéroïde d'origine avec des cellules individuelles se détachant, la lignée cellulaire pédiatrique KNS42 a adopté un modèle de migration en feuille avec peu de pics cellulaires distincts. Auparavant, différents modèles de migration entre différentes lignées cellulaires (ici la lignée cellulaire de gliome adulte U251 et la lignée cellulaire pédiatrique KNS42) ont été observés, reflétant potentiellement le type de cellules dont ils sont issus et le site de l'isolement tumoral. Essentiellement, une augmentation de la tubuline acétylée avec une concentration croissante d'inhibiteurs (de 0,1 à 10 M) a également été découverte, non seulement dans les cellules migratrices, mais aussi dans les cellules sphéroïdes associées. Cela n'était pas évident dans les premières microscopies acquises. Une autre imagerie permettrait également l'analyse quantitative des niveaux d'expression des protéines comme réponse cellulaire au traitement avec des inhibiteurs migrastatiques.
Dans cette étude, il a été démontré que les cellules ont changé morphologiquement en réponse au traitement ; l'arrondi cellulaire est devenu évident avec des concentrations croissantes d'inhibiteurs et la mort cellulaire à la concentration d'inhibiteurs la plus élevée (10 M), avec une fragmentation nucléaire évidente dans les cellules U251 et des microtubules effondrés et la fragmentation nucléaire dans KNS42. Ces résultats sont en accord avec les observations précédentes que l'activité anti-migratoire de MI-192 sur les lignées cellulaires de gliomes est dépendante de la concentration13,14. Le flux de travail global du protocole est représenté à la figure 4.
Figure 1 : Invasion de cellules sphéroïdes dans le collagène représenté par microscopie à champ large. Des images représentatives des lignées cellulaires U251 et KNS42 sont montrées après traitement avec l'inhibiteur MI-192 à la concentration anti-migratoire de 1 M et à des intervalles de 24 heures. Un sphéroïde de contrôle sans traitement est également montré. Les effets anti- ou pro-migrateurs potentiels sont détectés comme mis en évidence (flèches). Ceci est particulièrement perceptible dans KNS42 avec apparemment aucune migration dans les sphéroïdes témoins ou traités. Toutes les images ont été prises à 4x. Barre d'échelle de 1 000 m. Barre d'échelle en images agrandies pour SF188 et 200 m, KNS42 et 1 000 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : L'effet de l'inhibiteur migrastatique MI-192 sur la lignée cellulaire de gliome U251 révélé par microscopie confocale. Les sphéroïdes de gliome fixes et tachés et les cellules migratrices présentent des phénotypes migrateurs distincts. Les cellules migratrices proches des bords sphéroïdes d'origine sont montrées. Les sphéroïdes cellulaires U251 sont caractérisés par des pointes rayonnant loin du sphéroïde d'origine avec l'augmentation de l'arrondi cellulaire dans les cellules apparentes avec une concentration croissante d'inhibiteurs (flèche indique la pointe cellulaire). Barre d'échelle de 10 m. Étiquettes : rouge, actine, vert, tubuline acétée, bleu et DAPI. Pour chaque image, une seule section optique représentative a été capturée avec tous les paramètres avec la capture pré- et post-image maintenue à des fins comparatives. Toutes les images ont ensuite été traitées. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : L'effet de l'inhibiteur migrastatique MI-192 sur la lignée cellulaire de gliome KNS42 révélé par microscopie confocale. La migration KNS42 est caractérisée par des saillies en feuille avec des pointes de cellules uniques (la flèche indique la feuille cellulaire). À la plus faible concentration d'inhibiteurs, ce phénotype semble prononcé, mais il est perdu avec une concentration croissante d'inhibiteurs (barre d'échelle de 10 m); étiquettes : rouge et actine, vert, tubuline acétylée, bleu et DAPI. Pour chaque image, une seule section optique représentative a été capturée, avec tous les paramètres avec la capture pré- et post-image maintenue à des fins comparatives. Toutes les images ont ensuite été traitées. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Résumé du flux de travail. Incorporé dans ce flux de travail est la génération de sphéroïdes, l'intégration dans le collagène, le traitement médicamenteux, la fixation, la coloration, et l'imagerie par microscopie confocale. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Une nouvelle manière de créer des sphéroïdes de cellules cancéreuses pour identifier l'activité migrastatique de drogue utilisant la microscopie confocale de haute résolution est décrite. L'utilisation de plaques adhérentes faibles sur d'autres techniques, telles que les gouttes suspendues15, a facilité un moyen de générer des sphéroïdes reproductibles et uniformes pour une utilisation dans la migration du collagène et les essais d'invasion. Les points critiques dans ce protocole sont l'enlèvement du milieu de croissance de la plaque de 96 puits avant l'intégration sphéroïde cellulaire dans une matrice de collagène et la manipulation soigneuse des bouchons de collagène contenant les sphéroïdes par la suite. De nouvelles technologies telles que la microfluidique numérique16 sont maintenant disponibles et, bien que plus coûteuses, pourraient fournir une alternative à l'élimination manuelle des médias et des fluides. La principale limitation du protocole décrit est qu'il prend beaucoup de temps lorsque des sphéroïdes simples sont photographiés puis analysés manuellement par microscopie lumineuse afin d'évaluer l'activité des inhibiteurs. En outre, les réactifs requis pour toutes les étapes du processus sont coûteux, et l'équipement spécialisé, à savoir un microscope confocal haute résolution, est également nécessaire. Les nombres optimaux de cellules exigés pour l'ensemencement et le temps pris pour obtenir un sphéroïde de cellules de la taille exigée doivent également être prédéterminés avant le commencement de l'assay d'invasion de collagène.
Le développement de médicaments ciblant les cellules cancéreuses, le dépistage à grande échelle des médicaments et la caractérisation de l'activité des médicaments pour la modification et l'amélioration des médicaments reposent de plus en plus sur les essais et la technologie des cellules 3D. Ce protocole peut être optimisé et adapté pour une utilisation avec d'autres essais expérimentaux et de nombreux autres types de cellules d'importance dans d'autres systèmes de maladie. Jusqu'à présent, l'interprétation des données générées au microscope a été entravée par l'application de la microscopie à champ large, les images acquises offrant une résolution limitée et en proie à un flou d'image inhérent résultant de la lumière provenant de l'extérieur de la plan focal. Les images de microscopie à champ large montrées ici ont été acquises manuellement à l'aide d'un système d'imagerie EVOS, un processus qui prenait beaucoup de temps et pouvait potentiellement introduire un biais de gestionnaire. Les nouvelles technologies, y compris les postes de travail automatisés et les plates-formes d'analyse17,18, sont maintenant disponibles mais restent coûteuses et ne sont donc toujours pas disponibles pour de nombreux laboratoires de recherche. En outre, d'autres développements logiciels pourraient faciliter l'analyse d'images 3D à haute résolution pour quantifier avec précision les changements phénotypiques tels que ceux mentionnés ici, et donc l'efficacité des inhibiteurs de la migration cellulaire. En outre, l'application de techniques d'imagerie fluorescente à super résolution qui deviennent de plus en plus standard dans de nombreux laboratoires de recherche permettra de mieux comprendre le comportement migratoire et la morphologie des cellules cultivées en sphéroïde 3D. structures et traités avec des médicaments inhibiteurs.
Il a été établi qu'il est possible de fixer et de tacher les sphéroïdes, après traitement avec un inhibiteur migrastatique, lorsqu'il est incorporé dans le collagène. Cette méthode a été facile à exécuter, avec toutes les étapes complétées dans des plaques de 96 puits, suivie par le montage des bouchons de collagène contenant les sphéroïdes sur des couvertures pour l'imagerie. En évaluant l'effet de l'activité d'inhibiteur sur la morphologie de cellules cancéreuses, la microscopie confocale a été employée pour élucider l'activité de drogue. Les premières conclusions sur l'effet anti-migratoire de l'inhibiteur MI-192 à partir d'images à basse résolution ont été confirmées par microscopie confocale à haute résolution. Cet inhibiteur particulier cible la deacetylase histone 3 (HDAC3). Les HAC sont des enzymes impliquées dans la régulation épigénétique de l'expression génique et ont récemment été de plus en plus intéressés en tant que cibles potentielles dans le développement de médicaments contre le cancer. Des expériences antérieures avec MI-192 ont montré que, à de faibles concentrations, il régule l'acétylation de la tubuline, conduisant à l'hyperacétylation et la stabilisation des microtubules. Les microtubules stabilisés sont moins dynamiques, avec un effet potentiel sur les activités migratoires des cellules. On a constaté que l'effet observé était présent dans les lignées cellulaires pédiatriques et adultes représentatives de gliome. Une augmentation concentration-dépendante de l'état d'acétylation de tubulin des deux lignées de cellules de glioma a été découverte, une conclusion qui a des implications pour la présélection des patients en considérant le traitement complémentaire avec des drogues migrastatic.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier le professeur Chris Jones d'avoir contribué à la lignée cellulaire KNS42. Le microscope confocal Zeiss LSM880 avec AiryScan utilisé dans ce travail fait partie du Huddersfield Innovation and Incubation Project (HIIP) financé par le Leeds City Region Enterprise Partnership (LEP) Growth Deal. Crédit pour l'image de microscope Figure 3: Carl Zeiss Microscopy GmbH, microscopy@zeiss.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagen I, rat tail, 100 mg | Corning | 354236 | for glioma invasion assay; this is offered by many distributors/manufacturers and will need to be determined for both the type of assay intended and cell lines used. For glioma cancer cell lines Collagen rat tail type 1 (e.g. Corning) is the preferred choice. Collagen should be stored at 4 °C, in the dark, until required. It is not advisable to mix collagen from different batches as this may affect the consistency of the polymerized collagen. |
| Coverslips | various | various | for microscopy imaging |
| DMEM powder | Sigma | D5648 | needed at 5x concentration for collagen solution for glioma invasion assay; this may be purchased in powdered form, made up in double distilled water and, depending upon final composition of the growth medium, completed with any additives required. The complete 5x solution should be filtered through a syringe filter system (0.22 μm) before use. |
| Foetal calf serum | Sigma | F7524-500ML | needed for cell culture of glioma cell lines |
| Glass slides | various | various | for microscopy imaging |
| High glucose DMEM | Gibco | 41965062 | needed for cell culture of glioma cell lines |
| Inhibitor | Tocris | various | various - according to experimental design; inhibitors can be purchased from manufacturers such as Selleckchem and Tocris. These manufacturers offer detailed description of inhibitor characteristics, links to associated references and suggestion of working concentrations. As with all inhibitors, they may be potentially toxic and should be handled according to health and safety guidelines. Inhibitors are prepared as stock solutions as recommended by the manufacturer. As an example we used the migrastatic inhibitor MI-192 to demonstrate the use of such inhibitors. We have tested a range of migrastatic inhibitors in this way with comparable results. |
| Mountant | various | various | for microscopic imaging |
| NaOH (1 M) | various | various | NaOH can be either purchased at the required molarity or prepared from solid form. The prepared solution should be filter sterilized using a syringe filter system. One M NaOH is corrosive and care should be taken during solution preparation. |
| Paraformaldehyde | various | various | for fixing spheroids and cells; make up at 4%, caution health hazard, ensure that health and safety regulations are adhered to for collagen solution for invasion assay |
| Pastettes (graduated pipette, 3 mL) | various | various | for invasion assay, solution removal |
| PBS, sterile for tissue culture | Sigma | D1408-500ML | needed for cell culture of glioma cell lines and washes for staining |
| Pen/strep (antibiotics) | Sigma | P4333 | needed for cell culture of glioma cell lines |
| Primary antibody, secondary antibody, DAPI, Phalloidin | various | various | there are many manufacturers for these reagents, for secondary labelled antibodies we recommend Alexa Fluor (Molecular Probes). Here we used for primary antibodies mouse anti-acetylated tubulin antibody (1/100, Abcam). For secondary antibodies we used 1/500 anti-mouse Alexa Fluor 488 conjugated antibody, Molecular Probes. For nuclear stain we used DAPI (many manufacturers) and the actin stain Phalloidin (many manufacturers) both used at recommended dilution of 1/500. |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5x concentration |
| Sodium pyruvate | Sigma | P5280 | needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5x concentration |
| Trypsin | Sigma | T4049 | for trypsinisation |
| Ultra low attachment plates | Sigma/Nunc | CLS7007-24EA | for glioma invasion assay; a low adherent plate is required, with 96-well plates preferred to allow for large-scale screening of compounds under investigation. There are several low adherence plates commercially available; it is advisable to test a variety of plates for optimum spheroid generation. In our experience Costar Ultra Low Cluster with lid, round bottom, works best for the generation of spheroids from glioma cancer cells in terms of 100% spheroid formation and reproducibility. These plates were also successfully used for the generation of glioma spheroids from patient-derived material, bladder and ovarian cancer cells in our laboratory. In addition, stem or progenitor neurospheres can be used in these plates to facilitate the generation of standardized neurosphere-spheroids |
| Stripettes (serological pipettes, sterile, 5 mL and 10 mL) | various e.g. Costar | CLS4488-50; CLS4487-50 | for tissue culture and collagen preparation |
| Various multichannel (50 - 250 μL) and single channel pipettes (10 μL, 50 μL, 200 μL 1 mL) | various | various | for cell and spheroid handling |
| Widefield microscopy | various | various | for observation of spheroid generation and spheroid imaging; here wide-field fluorescence images were captured using an EVOS FL cell imaging system (Thermo Fisher Scientific) |
| Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective | Zeiss | quote from manufacturer | Confocal images were captured using a Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective. Diode 405nm, 458/488/514 nm argon multiline and HeNe 594nm lasers were used to excite Phalloidin 594, Alexa Fluor 488, and DAPI respectively. For each image a single representative optical section were captured, with all settings, both pre- and post-image capture, maintained for comparative purposes. All images were subsequently processed using the associated Zen imaging software and Adobe Photoshop. |
References
- Gandalovičová, A., et al. Migrastatics-anti-metastatic and anti-invasion drugs: promises and challenges. Trends in Cancer. 3 (6), 391-406 (2017).
- Delgado-López, P. D., Corrales-García, E. M. Survival in glioblastoma: a review on the impact of treatment modalities. Clinical and Translational Oncology. 18, 1062 (2016).
- Foreman, P. M., et al. Oncolytic virotherapy for the treatment of malignant glioma. Neurotherapeutics. 14, 333 (2017).
- Rodrigues, T., et al. Emerging tumor spheroids technologies for 3D in vitro cancer modelling. Pharmacology and Therapeutics Technologies. 184, 201-211 (2018).
- Sirenko, O., et al. High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures. Assay and Drug Development Technologies. 13 (7), Mary Ann Liebert, Inc. (2015).
- Wu, Q., et al. Bionic 3D spheroids biosensor chips for high-throughput and dynamic drug screening. Biomedical Microdevices. 20, 82 (2018).
- Mosaad, E., Chambers, K. F., Futrega, K., Clements, J. A., Doran, M. R. The microwell-mesh: a high-throughput 3D prostate cancer spheroid and drug-testing platform. Scientific Reports. 8, 253 (2018).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any way you slice it-a comparison of confocal microscopy techniques. Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54-65 (2015).
- Pontén, J. Neoplastic human glia cells in culture. Human Tumor Cells in Vitro. , Springer US. Boston. 175-206 (1975).
- Takeshita, I., et al. Characteristics of an established human glioma cell line, KNS-42. Neurologica Medico Chirurgica. 27 (7), 581-587 (1987).
- Bance, B., Seetharaman, S., Leduc, C., Boëda, B., Etienne-Manneville, S. Microtubule acetylation but not detyrosination promotes focal adhesion dynamics and cell migration. Journal of Cell Science. 132, (2019).
- Bacon, T., et al. Histone deacetylase 3 indirectly modulates tubulin acetylation. Biochemical Journal. 472, 367-377 (2015).
- Jackman, L., et al. Tackling infiltration in paediatric glioma using histone deacetylase inhibitors, a promising approach. Neuro-Oncology. 20, i19-i19 (2018).
- Bhandal, K., et al. Targeting glioma migration with the histone deacetylase inhibitor MI192. Neuro-Oncology. 19, i12-i12 (2017).
- Del Duca, D., Werbowetski-Ogilvie, T. E., Del Maestro, R. Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion. Journal of Neuro-oncology. 67 (3), 295-303 (2004).
- Bender, B. F., Aijian, A. P., Garrell, R. L. Digital microfluidics for spheroid-based invasion assays. Lab on a Chip. 16 (8), 1505-1513 (2016).
- Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29 (2012).
- Härmä, V., et al. Quantification of dynamic morphological drug responses in 3D organotypic cell cultures by automated image analysis. PLOS ONE. 9 (5), e96426 (2014).
