Summary
신경교종 암 세포 이동에 대한 신경교암 억제제의 효과는 히스톤 탈아세틸라제(HDAC) 억제제를 이용한 3차원(3D) 침입 분석에 대한 고해상도 공초점 현미경검사법을 특징으로 한다.
Abstract
암 연구의 약물 발견 및 개발은 점점 더 3D 형식으로 약물 스크린을 기반으로하고 있습니다. 암세포의 철새 및 침습적 잠재력을 표적으로 하는 새로운 억제제, 그리고 결과적으로 질병의 전이성 퍼짐은, gliomas와 같은 고침성 암에 있는 상보적인 처리로 발견되고 고려되고 있습니다. 따라서, 약물을 첨가한 후 3D 환경에서 세포의 상세한 분석을 가능하게 하는 데이터를 생성하는 것이 요구된다. 여기서 설명한 방법론은 공초점 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)에 의한 고해상도 이미지 캡처 및 데이터 분석과 스페로이드 침입 분석법을 결합하여 잠재적인 항철 억제제의 효과에 대한 상세한 특성 분석을 가능하게 했습니다. 신경교종 세포에 MI-192. 스페로이드는 낮은 부착 성 96 웰 플레이트에서 침략 분석세포주에서 생성된 다음 CLSM 분석을 위해 제조하였다. 설명된 워크플로우는 용이성과 재현성 모두로 인해 일반적으로 사용되는 다른 스페로이드 생성 기술보다 선호되었습니다. 이는 기존의 광시야 접근법에 비해 공초점 현미경 검사법에 의해 달성된 향상된 이미지 해상도와 결합하여 3D 환경에서 철새 세포의 뚜렷한 형태학적 변화를 식별하고 분석할 수 있었습니다. mi-192 의 제과약물로 치료할 수 있습니다.
Introduction
전임상 신약 발견 및 잠재적인 항암제 개발을 위한 3차원 스페로이드 기술이 기존의 약물 스크린보다 점점 더 선호되고 있다; 따라서, migrastatic의 더 많은 개발이있다 ―이주 및 침략 방지 - 마약. 암 치료에 있는 이 발달의 뒤에 근거는 분명합니다: 3D spheroid 어설아지는 세포 단층 배양 보다는 더 충실하게 3D 종양 건축을 모방하기 때문에 잠재적인 항암약을 검열을 위한 보다 현실적인 접근을 나타냅니다, 약물-종양 상호 작용(역학)을 보다 정확하게 재구성하고 종양 관련 설정에서 약물 활성의 특성화를 허용한다. 또한, 많은 암 유형에서 화학 독성 약물에 대한 내성의 증가와 암 세포가 먼 종양 부위로 이동하는 능력에 의해 전이에 의한 높은 사망률은 화학 요법 제의 포함을 뒷받침합니다. 향후 임상시험에서 보조치료제로 암세포의 철새전위를 표적으로1. 이것은 고도로 침략적인 암에 있는, 고급 교모세포종 (GBM)와 같은 경우에 특히 입니다. GBM 관리에는 수술, 방사선 요법 및 화학요법이 포함됩니다. 그러나, 조합 처리로조차, 대부분의 환자는 11-15 달의중간 생존을 가진 초기 진단의 1 년 안에 재발2,3. 3D 기술 분야의 거대한 발전은 지난 몇 년 동안 이루어졌다 : 회전 시스템, 미세 제작 구조 및 3D 스캐폴드, 및 기타 개별 실험은 지속적으로 대규모4에서일상적인 테스트를 허용하기 위해 개선되고있다4 , 5,6,7. 그러나 이러한 분석에서 얻은 결과는 2D 이미지 분석 시스템으로 3D 생성 데이터를 분석하려는 시도로 인해 데이터 해석이 종종 방해되기 때문에 의미 있는 방식으로 분석되어야 합니다.
이미지 수집 속도와 광 독성 감소 측면에서 바람직함에도 불구하고 대부분의 광시야 시스템은 해상도8에의해 제한됩니다. 따라서, 약물 효능과 관련된 데이터 판독과는 별개로, 광시야 시스템을 사용하여 이미지화하면 이동 세포의 3D 세포 구조에 대한 약물 작용의 상세한 효과는 필연적으로 손실됩니다. 반대로 공초점 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)은 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 3D 후 수집으로 재구성및 렌더링할 수 있는 고품질의 광학 섹션 이미지를 캡처합니다. 따라서 CLSM은 복잡한 3D 세포 구조에 쉽게 적용가능하여 3D 구조에 대한 항미정 억제제의 영향과 세포 이동 메커니즘의 심층 분석을 가능하게 합니다. 이것은 의심 할 여지없이 미래의 신경질성 약물 개발을 안내 할 것입니다. 여기서, 고분해능 공초점 현미경에 의한 스페로이드 생성, 약물 치료, 염색 프로토콜 및 특성화의 결합된 워크플로우가 설명된다.
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Protocol
1. 세포 스페로이드의 생성
1일차
- 조사 중인 세포주에서 요구하는 표준 배양 배지를 준비한다.
- 멸균 처리 기술을 사용하여 조직 배양 후드에서 모든 조직 배양 관련 단계를 수행합니다.
- 트립시니화 하고 암 세포를 계산합니다. 플레이트당 20 mL의 셀 서스펜션을 사용하십시오. 셀 현탁액을 명확하게 라벨이 부착된 멸균 범용 튜브에 보관하십시오.
- 각 웰에 미리 정해진 수의 셀을 추가합니다. 필요한 세포의 초기 수와 궁극적인 스페로이드 크기는 조사중인 세포강의 증식 속도에 달려 있습니다.
참고: U251 및 KNS429,10,5 x 103 세포/mL과 같은 확립된 신경교종 세포주들의 경우 4일간의 배양 후 현미경으로 보이는 스페로이드(200 또는 800 μm)를 생성합니다. - 세포 응집을 피하기 위해 부드러운 반전으로 범용 튜브의 세포를 다시 중단하십시오. 피펫 200 μL의 셀 현탁액을 96웰 플레이트의 각 웰내로. 모든 웰이 필요하지 않은 경우 증발을 피하기 위해 각 빈 우물에 200 μL의 1x PBS를 추가하는 것이 좋습니다.
- 37 °C에서 정상적으로 인큐베이터에서 세포를 배양합니다.
참고: 신경교종 암 세포주와 같은 세포주들은 24시간 내에 스페로이드를 형성할 것입니다. 72 시간 동안 스페로이드를 배양하여 3D 세포 아키텍처를 형성할 수 있습니다.
2일차
- 24 시간 후에 밝은 필드 현미경 검사법에 의하여 세포를 검사하십시오. 세포주에 따라, 세포는 우물의 바닥에 검출 가능한 스페로이드를 형성할 수 있습니다.
참고: 확립된 신경교종 암 세포주는 24시간 이내의 스페로이드를 쉽게 형성합니다.
2. 콜라겐 침공 분석
3일차
- 콜라겐, 5x 배양 배지, 1 M NaOH, 얼음 에 20 mL 튜브 1개를 놓습니다.
- 차갑게 차가운 콜라겐 10.4 mL을 차가운 배양 튜브에 조심스럽게 천천히 넣습니다. 거품을 피하십시오. 이 양의 콜라겐은 96웰 플레이트 한 개에 충분합니다. 업 스케일링은 가능하지만 플레이트 당 20 mL 튜브 1 개를 한 번에 준비하는 것이 좋습니다.
- 1.52 mL의 차가운 멸균 5x 배양 매체를 부드럽게 첨가하십시오. 거품을 피하십시오.
- 사용 직전에 72 μL의 차가운 멸균 1 M NaOH를 부드럽게 첨가하십시오. 얼음에 솔루션을 유지합니다.
- 파이펫팅하여 부드럽게 섞으세요. 거품을 피하십시오. 효율적인 혼합은 배지에서 적색에서 주황색-빨간색(pH 7.4)까지의 색상 변화를 유도합니다. 혼합물을 얼음에 넣고 사용할 때까지 그대로 둡니다.
- 결정적인 단계: 1일째에 제조된 96웰 플레이트에서 상급190 μL을 제거합니다. 우물의 바닥에 형성 된 스페로이드를 방해하지 않도록 매우주의하십시오. 파이펫을 우물의 중심이 아닌 측면을 향한 각도로 사용하십시오.
- 콜라겐 혼합물 100 μL을 각 웰에 부드럽게 넣습니다. 어떤 spheroid 방해를 방지하기 위해, 파이펫 우물의 측면 아래로 믹스. 거품을 피하십시오. 남은 콜라겐 혼합물을 20 mL 튜브에 실온에서 보관하여 중합을 평가합니다.
- 인큐베이터에서 적어도 10분 동안 인큐베이터 플레이트를 배양하여 콜라겐이 중합되도록 하였다. 지침으로, 남은 콜라겐이 설정된 경우, 반고체 및 스폰지 같은되고, 스페로이드는 억제제로 처리 될 준비가되어 있습니다.
- 배양 배지에 2배 농도로 약물 또는 억제제를 첨가한다. 각 우물에 부드럽게 매체를 추가합니다 (잘 당 100 μL). 다시, 피펫 은 스페로이드 교란을 피하기 위해 우물의 측면 아래로 매체.
- 관찰 및 시간 T = 0 시간, 24 시간, 48 시간, 및 72 시간에 밝은 필드 현미경 검사법에 의해 각 스페로이드를 관찰하고 약물 활동을 평가하기 위해. 그런 다음 접시를 인큐베이터로 되돌려 놓습니다.
참고: 세포주의 침략적 거동에 따라, 원래의 스페로이드 코어로부터의 이동은 24시간 이후부터 관찰될 수 있다.
3. 공초점 현미경 검사법을 위한 콜라겐 내장된 구형 및 철새 세포의 준비
- 플레이트를 조직 배양 후드에 놓고 상판(200 μL)을 부드럽게 제거한다. 다시 말하지만, 스페로이드를 방해하지 않도록주의하고 콜라겐을 만지지 않도록주의하십시오.
- 상급체를 1x PBS의 100 μL로 교체하십시오. 이 세척 단계를 3x 반복합니다.
- 최종 세척을 제거하고 1x PBS (웰 당 100 μL)에서 4 % 포름 알데히드로 교체하십시오.
주의 사항: 포름알데히드는 잠재적인 발암 물질입니다. 건강 및 안전 지침에 따라 주의하십시오. - 실험실 벤치에 96 웰 플레이트를 놓고 호일로 덮고 실온에서 24 시간 동안 둡니다.
- 조심스럽게 포름알데히드를 제거하고 1x PBS로 교체하십시오. 이 1x PBS 세척을 3배 반복합니다.
- 1x PBS에서 0.1% 트리톤 X-100을 준비합니다. 1x PBS 세척을 제거하고 트리톤 X-100 용액의 100 μL로 교체하십시오. 실온에서 30 분 동안 배양하십시오. 그 동안, 1x PBS와 0.05 % 탈지 분유로 차단 용액을 준비하고 철저히 혼합하십시오.
- 트리톤 X-100을 제거하고 1x PBS로 3x를 씻으소서. 각 웰에 100 μL의 차단 용액을 추가하고 15 분 동안 배양하십시오.
- 소정의 농도에서 완충액 차단에 필요한 1차 항체를 희석한다. 여기서, 항마우스 IgG 아세틸화 투불린 항체(1:100)를 사용한다.
- 원심분리기 15,682 x g에서5분 동안 1차 항체 차단 완충제 혼합. 조심스럽게 차단 용액을 제거하고 각 우물에 상급 (25−50 μL)을 추가하십시오. 1 시간 동안 실온에서 어둠 속에서 배양하십시오.
- 항체 용액을 제거하고 1 x PBS (웰 당 100 μL)로 3 x를 씻으하십시오.
- 임의의 추가형광 얼룩 이외에 권장 또는 소정의 농도에서 차단 완충액에서 이차 항체를 희석한다. 여기서, 1:500 항마우스 플루오로포어-488 공액항체, 팔로이드-594(1:500) 액틴 염색, 및 DNA 얼룩(DAPI)을 사용한다.
- 다시, 13,000 rpm에서 5 분 동안 이차 항체 용액을 원심 분리.
- 각 우물에서 차단 용액을 제거하고 보조 항체 / 판지로이드 / DAPI 혼합물의 25-50 μL을 추가하십시오. 실온에서 1.5 시간 동안 어둠 속에서 배양하십시오.
- 이차 항체 염료 용액을 제거하고 1 x PBS (잘 당 100 μL)로 3 x씻어.
- 플라스틱 파이펫(200 μL)으로 흡입하여 개별 콜라겐 플러그를 고품질 일반 유리 슬라이드의 중앙에 조심스럽게 들어 올립니다.
- 콜라겐 플러그에 적합한 마운트를 한 방울 추가하여 플러그가 완전히 덮여 있는지 확인합니다. 거품을 피하십시오.
- 이미징에 사용될 현미경 목표에 대한 최적의 두께의 커버슬립을 적용하고 하룻밤 사이에 설정할 수 있습니다. 슬라이드를 어두운 실내 온도에서 보관하십시오.
4. 형광 현미경 검사법
- 적절한 공초점 현미경을 사용하여 형광등 이미지를 캡처합니다.
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Representative Results
3차원 스페로이드 기술은 암 특이적 환경을 보다 대표하기 때문에 약물-종양 상호작용에 대한 이해를 증진시키고 있다. 스페로이드의 생성은 여러 가지 방법으로 달성 될 수있다; 낮은 준수 96 웰 플레이트는이 프로토콜에 사용되었다. 다른 제조업체의 여러 제품을 테스트 한 후, 여기에서 사용되는 플레이트는 성공적인 스페로이드 생산 및 균일성 측면에서 일관되게 최고의 성과를 보였기 때문에 선택되었습니다. 성장 배지가 콜라겐 매트릭스로 대체되는 대체 단계는 프로토콜의 중요한 점입니다. 세심한주의는 스페로이드 자체를 방해하지 않고 매체의 대부분을 제거하기 위해 주의해야합니다. 광시야 현미경 검사법에 의한 약물 유발 효과의 특성화를 위한 자동 이미징은 처리기 편향을 제거하는 것으로 간주될 수 있지만, 현재 시판되는 기기는 이미징 접근법보다 상당히 더 비쌉처리됩니다. 여기에 설명되어 있습니다.
넓은 필드 epifluorescence 현미경 검사법은 세포 이동 및 침략에 대한 약물 활동의 효력의 검사를 허용합니다. 그러나, 광시야 현미경 검사법에서 달성된 해결책은 세포 형태에 대한 약물 효과에 관하여 결과의 상세한 해석을 허용하기에 충분하지 않습니다(그림 1). 여기서, 쉽게 재현 가능한 염색 프로토콜을 통해 신경교종 스페로이드 및 이동 세포의 제조가 기술되고, 공초점 현미경을 사용하여 이미징이 뒤따랐다. 광시야 현미경 심상 분석에서, MI-192 억제제로 처리한 후 신경교종 세포에서 다른 형태학적 변화가 일어났지만 명확하게 정의된 세부 사항이 부족했다는 것이 명백했습니다. 공초점 현미경 검사법은 초기 사실 인정을 확인하고, 이 고해상도 심상MI-192의 효력의 평가를 더욱 허용했습니다. 치료되지 않은(대조군) 스페로이드, 이동세포(도 2),및 처리된 스페로이드 및 세포(그림3)사이의 유의한 차이가 명백해졌다. 성인 신경교종 세포주 U251은 단일 세포분리를 통해 원래의 스페로이드 코어에서 멀리 방사되는 '스파이크'에서 이동하는 것으로 나타났지만, 소아 세포주 KNS42는 뚜렷한 세포 스파이크가 거의 없는 시트 유사 이동 패턴을 채택했다. 이전에는 상이한 세포주 들(여기서 성인 신경교종 세포주 U251 및 소아 세포주 KNS42)간에 상이한 이동 패턴이 관찰되었고, 잠재적으로 종양 격리 부위로부터 발생된 세포 유형과 부위를 반영하였다. 결정적으로, 억제제 농도 (0.1-10 μM에서)를 증가시키는 아세틸화 된 tubulin의 증가는 또한 이동 세포뿐만 아니라 스페로이드 관련 세포에서도 발견되었습니다. 이것은 초기 광시야 현미경 검사법 취득 한 심상에서 분명하지 않았습니다. 추가 화상 진찰은 또한 migrastatic 억제제로 처리에 세포 반응으로 단백질 발현 수준의 정량적인 분석을 허용할 것입니다.
본 연구에서, 세포가 치료에 반응하여 형태학적으로 변화한다는 것이 입증되었다; 세포 반올림은 가장 높은 억제제 농도 (10 μM)에서 억제제 농도 및 세포 사멸을 증가시키고, U251 세포에서 핵 단편화가 분명하고 KNS42에서 미세 소관 및 핵 분열이 축소됨에 따라 명백해졌습니다. 이러한 발견은 신경교종 세포주에 대한 MI-192의 항철 활성이 농도의존도 13,14라는이전의 관찰과 일치한다. 프로토콜의 전체 워크플로는 그림 4에설명되어 있습니다.
그림 1: 광시야 현미경으로 심상한 콜라겐으로 의한 스페로이드 세포 침공. 세포주 U251 및 KNS42의 대표적인 이미지는 1 μM 및 24시간 간격으로 1 μM의 항철 농도에서 억제제 MI-192로 처리한 후에 도시된다. 아무 처리도 없는 대조군 스페로이드도 표시됩니다. 잠재적인 반대로 또는 프로 마이그레이션 효과는 강조 표시된 것으로 감지됩니다(화살표). 이는 KNS42에서 특히 두드러지며 제어 또는 처리된 스페로이드에서 마이그레이션이 없는 것처럼 보입니다. 모든 이미지는 4배로 촬영되었습니다. 배율 막대 = 1,000 μm. SF188 = 200 μm, KNS42 = 1,000 μm에 대한 확대 된 이미지의 배율 막대. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 공초점 현미경검사법에 의해 밝혀진 신경교종 세포주 U251에 대한 mi-192의 진압억제제의 효과. 고정 및 염색 된 신경교종 스페로이드 및 철새 세포는 뚜렷한 철새 표현형을 표시합니다. 원래 스페로이드 가장자리에 가까운 철새 세포가 도시됩니다. U251 세포 스페로이드는 억제제 농도가 증가하는 것으로 보이는 세포에서 세포 반올림이 증가하는 원래의 스페로이드에서 멀리 방사되는 스파이크를 특징으로 합니다(화살표는 세포 스파이크를 나타낸다). 배율 막대 = 10 μm. 라벨: 빨간색 = 액틴, 녹색 = 아세틸화 된 튜불린, 파란색 = DAPI. 각 이미지에 대해 비교 를 위해 사전 및 사후 이미지 캡처가 유지되는 모든 설정으로 단일 대표 광학 섹션이 캡처되었습니다. 이후 모든 이미지가 처리되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 공초점 현미경으로 밝혀진 신경교종 세포주 KNS42에 대한 mi-192의 신경증 억제제의 효과. KNS42 마이그레이션은 단일 셀 스파이크가 있는 시트모양 돌출부가 특징입니다(화살표는 셀 시트를 나타냅니다). 가장 낮은 억제제 농도에서이 표현형은 발음될 것으로 보이지만 억제제 농도가 증가함에 따라 손실됩니다 (스케일 바 = 10 μm); 라벨: 빨간색 = 액틴, 그린 = 아세틸화 된 튜불린, 파란색 = DAPI. 각 이미지에 대해 하나의 대표적인 광학 섹션이 캡처되었으며, 사전 및 사후 이미지 캡처가 모두 비교 목적으로 유지되는 모든 설정이 캡처되었습니다. 이후 모든 이미지가 처리되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 워크플로요약입니다. 이 워크플로우에 통합된 것은 구형 의 생성으로, 콜라겐에 포함, 약물 치료, 고정, 염색 및 공초점 현미경 검사법에 의한 이미징입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
고분해능 공초점 현미경을 사용하여 경화약 활성을 식별하기 위한 암세포 스페로이드를 만드는 새로운 방법이 기술되어 있다. 매달려 방울(15)과같은 다른 기술에 낮은 부착 플레이트의 사용은 콜라겐 이동 및 침략 검정에 사용하기 위해 재현 가능하고 균일 한 스페로이드를 생성하는 수단을 용이하게하고있다. 이 프로토콜의 중요한 점은 콜라겐 매트릭스에 세포 스페로이드가 포함되기 전에 96 웰 플레이트로부터 성장 배지를 제거하고 그 후 스페로이드를 함유하는 콜라겐 플러그를 주의 깊게 취급하는 것이다. 디지털 미세 유체 공학16과 같은 새로운 기술을 사용할 수 있으며, 더 비싸지 만 미디어 및 유체의 수동 제거에 대한 대안을 제공 할 수 있습니다. 기술된 프로토콜의 주요 한계는 억제제 약물 활성을 평가하기 위해 단일 스페로이드를 이미지화한 다음 밝은 필드 현미경검사법에 의해 수동으로 분석할 때 시간이 많이 걸린다는 것입니다. 또한, 공정의 모든 단계에 필요한 시약은 고가이며, 특수 장비, 즉 고해상도 공초점 현미경도 필요합니다. 파종에 필요한 최적 세포 수와 필요한 크기의 세포 스페로이드를 얻기 위해 소요되는 시간 또한 콜라겐 침입 분석의 개시 전에 미리 결정되어야 한다.
암세포를 표적으로 하는 약물의 개발, 대규모 약물 스크리닝, 약물 개량 및 개선을 위한 약물 활성의 특성화는 점점 더 3D 세포 세포 검법 및 기술에 의존하고 있다. 이 프로토콜은 다른 실험 분석 및 다른 질병 시스템에서 중요한 수많은 다른 세포 유형과 함께 사용하기 위해 최적화되고 적응될 수 있습니다. 현재까지 현미경으로 생성된 데이터의 해석은 광시야 현미경 검사법의 적용에 의해 방해를 받았으며, 제한된 해상도를 제공하는 이미지가 획득되어 외부에서 발생하는 빛으로 인한 내재된 이미지 흐림에 시달렸습니다. 초점면. 여기에 표시된 광시야 현미경 이미지는 시간이 많이 걸리고 잠재적으로 핸들러 편향을 유발할 수 있는 EVOS 이미징 시스템을 사용하여 수동으로 획득했습니다. 자동화된 워크스테이션 및 분석 플랫폼17,18을포함한 새로운 기술은 현재 사용 가능하지만 비용이 많이 들기 때문에 많은 연구 실험실에서 여전히 사용할 수 없습니다. 또한, 추가 소프트웨어 개발은 고해상도 3D 렌더링 이미지의 분석에 도움이 될 수 있습니다 정확하게 여기에 언급 된 것과 같은 표현형 변화를 정량화, 따라서 세포 이동에 억제제의 효능. 또한, 많은 연구 실험실에서 점점 표준이되고있는 초고해상도 형광 이미징 기술의 적용은 3D 스페로이드에서 자란 세포의 철새 행동 및 형태에 대한 추가 통찰력을 제공 할 것입니다. 억제제 약물로 처리.
콜라겐에 내장 된 경우, migrastatic 억제제와 함께 치료 후 스페로이드를 수정하고 얼룩이 있을 수 있다는 것이 확립되었습니다. 이 방법은 96 웰 플레이트에서 모든 단계를 완료한 다음 이미징을 위해 스페로이드를 포함하는 콜라겐 플러그를 커버립에 장착하여 쉽게 수행할 수 있었습니다. 억제제 활성이 암 세포 형태에 미치는 영향을 평가할 때, 공초점 현미경 검사법은 약물 활성을 해명하는 데 사용되었다. 저해상도 이미지로부터 억제제 MI-192의 항철 효과에 대한 초기 연구 결과는 고해상도 공초점 현미경으로 확인되었다. 이 특정 억제제는 히스톤 디아세틸라제 3(HDAC3)를 표적으로 한다. HDACs는 유전자 발현의 후생유전학적 조절에 관여하는 효소이며 최근 암 약물 개발의 잠재적인 표적으로서 관심이 높아지고 있다. MI-192에 대한 이전의 경험에 따르면, 낮은 농도에서, 그것은 과세틸화와 미세 소관의 안정화로 이어지는, tubulin의 아세틸화를 조절합니다. 안정화된 미세소관은 세포의 철새 활동에 잠재적인 영향을 미치면서 덜 역동적입니다. 관찰된 효과가 대표적인 소아 및 성인 신경교종 세포주 모두에서 존재한다는 것이 확인되었다. 두 신경교종 세포주의 tubulin 아세틸화 상태에 있는 농도 의존적인 증가는 발견되었습니다, migrastatic 약으로 상보적인 처리를 고려할 때 환자의 사전 선택에 대한 연루가 있는 발견.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
KNS42 세포주에 기여한 크리스 존스 교수님께 감사드립니다. 이 작업에 사용되는 AiryScan을 갖춘 Zeiss LSM880 공초점 현미경은 리즈 시 지역 기업 파트너십 (LEP) 성장 거래를 통해 자금을 조달 한 허더즈필드 혁신 및 인큐베이션 프로젝트 (HIIP)의 일부입니다. 현미경 이미지에대한 신용 그림 3 : 칼 자이스 현미경 GmbH, microscopy@zeiss.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagen I, rat tail, 100 mg | Corning | 354236 | for glioma invasion assay; this is offered by many distributors/manufacturers and will need to be determined for both the type of assay intended and cell lines used. For glioma cancer cell lines Collagen rat tail type 1 (e.g. Corning) is the preferred choice. Collagen should be stored at 4 °C, in the dark, until required. It is not advisable to mix collagen from different batches as this may affect the consistency of the polymerized collagen. |
| Coverslips | various | various | for microscopy imaging |
| DMEM powder | Sigma | D5648 | needed at 5x concentration for collagen solution for glioma invasion assay; this may be purchased in powdered form, made up in double distilled water and, depending upon final composition of the growth medium, completed with any additives required. The complete 5x solution should be filtered through a syringe filter system (0.22 μm) before use. |
| Foetal calf serum | Sigma | F7524-500ML | needed for cell culture of glioma cell lines |
| Glass slides | various | various | for microscopy imaging |
| High glucose DMEM | Gibco | 41965062 | needed for cell culture of glioma cell lines |
| Inhibitor | Tocris | various | various - according to experimental design; inhibitors can be purchased from manufacturers such as Selleckchem and Tocris. These manufacturers offer detailed description of inhibitor characteristics, links to associated references and suggestion of working concentrations. As with all inhibitors, they may be potentially toxic and should be handled according to health and safety guidelines. Inhibitors are prepared as stock solutions as recommended by the manufacturer. As an example we used the migrastatic inhibitor MI-192 to demonstrate the use of such inhibitors. We have tested a range of migrastatic inhibitors in this way with comparable results. |
| Mountant | various | various | for microscopic imaging |
| NaOH (1 M) | various | various | NaOH can be either purchased at the required molarity or prepared from solid form. The prepared solution should be filter sterilized using a syringe filter system. One M NaOH is corrosive and care should be taken during solution preparation. |
| Paraformaldehyde | various | various | for fixing spheroids and cells; make up at 4%, caution health hazard, ensure that health and safety regulations are adhered to for collagen solution for invasion assay |
| Pastettes (graduated pipette, 3 mL) | various | various | for invasion assay, solution removal |
| PBS, sterile for tissue culture | Sigma | D1408-500ML | needed for cell culture of glioma cell lines and washes for staining |
| Pen/strep (antibiotics) | Sigma | P4333 | needed for cell culture of glioma cell lines |
| Primary antibody, secondary antibody, DAPI, Phalloidin | various | various | there are many manufacturers for these reagents, for secondary labelled antibodies we recommend Alexa Fluor (Molecular Probes). Here we used for primary antibodies mouse anti-acetylated tubulin antibody (1/100, Abcam). For secondary antibodies we used 1/500 anti-mouse Alexa Fluor 488 conjugated antibody, Molecular Probes. For nuclear stain we used DAPI (many manufacturers) and the actin stain Phalloidin (many manufacturers) both used at recommended dilution of 1/500. |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5x concentration |
| Sodium pyruvate | Sigma | P5280 | needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5x concentration |
| Trypsin | Sigma | T4049 | for trypsinisation |
| Ultra low attachment plates | Sigma/Nunc | CLS7007-24EA | for glioma invasion assay; a low adherent plate is required, with 96-well plates preferred to allow for large-scale screening of compounds under investigation. There are several low adherence plates commercially available; it is advisable to test a variety of plates for optimum spheroid generation. In our experience Costar Ultra Low Cluster with lid, round bottom, works best for the generation of spheroids from glioma cancer cells in terms of 100% spheroid formation and reproducibility. These plates were also successfully used for the generation of glioma spheroids from patient-derived material, bladder and ovarian cancer cells in our laboratory. In addition, stem or progenitor neurospheres can be used in these plates to facilitate the generation of standardized neurosphere-spheroids |
| Stripettes (serological pipettes, sterile, 5 mL and 10 mL) | various e.g. Costar | CLS4488-50; CLS4487-50 | for tissue culture and collagen preparation |
| Various multichannel (50 - 250 μL) and single channel pipettes (10 μL, 50 μL, 200 μL 1 mL) | various | various | for cell and spheroid handling |
| Widefield microscopy | various | various | for observation of spheroid generation and spheroid imaging; here wide-field fluorescence images were captured using an EVOS FL cell imaging system (Thermo Fisher Scientific) |
| Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective | Zeiss | quote from manufacturer | Confocal images were captured using a Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective. Diode 405nm, 458/488/514 nm argon multiline and HeNe 594nm lasers were used to excite Phalloidin 594, Alexa Fluor 488, and DAPI respectively. For each image a single representative optical section were captured, with all settings, both pre- and post-image capture, maintained for comparative purposes. All images were subsequently processed using the associated Zen imaging software and Adobe Photoshop. |
References
- Gandalovičová, A., et al. Migrastatics-anti-metastatic and anti-invasion drugs: promises and challenges. Trends in Cancer. 3 (6), 391-406 (2017).
- Delgado-López, P. D., Corrales-García, E. M. Survival in glioblastoma: a review on the impact of treatment modalities. Clinical and Translational Oncology. 18, 1062 (2016).
- Foreman, P. M., et al. Oncolytic virotherapy for the treatment of malignant glioma. Neurotherapeutics. 14, 333 (2017).
- Rodrigues, T., et al. Emerging tumor spheroids technologies for 3D in vitro cancer modelling. Pharmacology and Therapeutics Technologies. 184, 201-211 (2018).
- Sirenko, O., et al. High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures. Assay and Drug Development Technologies. 13 (7), Mary Ann Liebert, Inc. (2015).
- Wu, Q., et al. Bionic 3D spheroids biosensor chips for high-throughput and dynamic drug screening. Biomedical Microdevices. 20, 82 (2018).
- Mosaad, E., Chambers, K. F., Futrega, K., Clements, J. A., Doran, M. R. The microwell-mesh: a high-throughput 3D prostate cancer spheroid and drug-testing platform. Scientific Reports. 8, 253 (2018).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any way you slice it-a comparison of confocal microscopy techniques. Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54-65 (2015).
- Pontén, J. Neoplastic human glia cells in culture. Human Tumor Cells in Vitro. , Springer US. Boston. 175-206 (1975).
- Takeshita, I., et al. Characteristics of an established human glioma cell line, KNS-42. Neurologica Medico Chirurgica. 27 (7), 581-587 (1987).
- Bance, B., Seetharaman, S., Leduc, C., Boëda, B., Etienne-Manneville, S. Microtubule acetylation but not detyrosination promotes focal adhesion dynamics and cell migration. Journal of Cell Science. 132, (2019).
- Bacon, T., et al. Histone deacetylase 3 indirectly modulates tubulin acetylation. Biochemical Journal. 472, 367-377 (2015).
- Jackman, L., et al. Tackling infiltration in paediatric glioma using histone deacetylase inhibitors, a promising approach. Neuro-Oncology. 20, i19-i19 (2018).
- Bhandal, K., et al. Targeting glioma migration with the histone deacetylase inhibitor MI192. Neuro-Oncology. 19, i12-i12 (2017).
- Del Duca, D., Werbowetski-Ogilvie, T. E., Del Maestro, R. Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion. Journal of Neuro-oncology. 67 (3), 295-303 (2004).
- Bender, B. F., Aijian, A. P., Garrell, R. L. Digital microfluidics for spheroid-based invasion assays. Lab on a Chip. 16 (8), 1505-1513 (2016).
- Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29 (2012).
- Härmä, V., et al. Quantification of dynamic morphological drug responses in 3D organotypic cell cultures by automated image analysis. PLOS ONE. 9 (5), e96426 (2014).
