Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Cancer Research

高分解能共焦点顕微鏡による3D腫瘍スフェロイド侵入に対する移動性阻害剤の効果の特徴

doi: 10.3791/60273 Published: September 16, 2019

Summary

ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤を用いた三次元(3D)侵入アッセイにおけるグリオーマ癌細胞移動に対する移行抑制剤の効果は、高分解能共焦点顕微鏡によって特徴付けられる。

Abstract

がん研究における創薬と開発は、3D形式の薬剤スクリーンに基づいてますます進んでいます。がん細胞の移動性および侵襲性を標的とする新規阻害剤、ひるま症などの高侵襲性癌における補完的な治療法として発見され、考えられている。したがって、薬剤の添加後の3D環境における細胞の詳細な分析を可能にするデータの生成が必要となる。ここで説明する方法論は、共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)による高解像度画像キャプチャーとデータ解析とスフェロイド侵入アッセイを組み合わせることで、潜在的な抗渡走阻害剤の効果の詳細な特徴付けを可能にした。グリオーマ細胞上のMI-192.スフェロイドは、低付着性96ウェルプレートの侵入アッセイ用の細胞株から生成され、CLSM分析のために調製された。記載されたワークフローは、容易さと再現性の両方に起因する他の一般的に使用されるスフェロイド生成技術よりも好まれていました。これは、従来の広視野アプローチと比較して共焦点顕微鏡によって達成される高められた画像分解能と組み合わせることで、次の3D環境における移動細胞における明確な形態変化の同定と分析を可能にした。移動性薬物MI-192による治療。

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

前臨床創薬と潜在的な癌薬の開発のための3次元スフェロイド技術は、従来の薬剤スクリーンよりもますます支持されています。したがって、移動性、すなわち移動と侵入防止—薬物の開発が増えている。がん治療におけるこれらの発展の背後にある根拠は明らかである:3Dスフェロイドアッセイは、細胞単層培養よりも忠実に3D腫瘍アーキテクチャを模倣する潜在的な抗癌剤をスクリーニングするためのより現実的なアプローチを表し、薬物と腫瘍の相互作用(動態)をより正確に要約し、腫瘍関連の設定における薬物活性の特徴付けを可能にする。さらに、がん細胞が遠方の腫瘍部位に移行する能力によって増強された転移による多くの癌タイプにおける化学毒性薬に対する耐性の上昇と癌患者の死亡率の高さは、化学療法剤の包含を支持する。将来の臨床癌試験におけるアジュバント治療としての癌細胞の渡り目の可能性を標的とする 1.これは特に、高品位神経膠芽腫(GBM)のような高侵襲性癌の場合に当てはまる。GBM管理には、手術、放射線療法、化学療法が含まれます。しかし、併用治療を行っても、ほとんどの患者は11〜15ヶ月2、3の中央値生存期間を有する初期診断の1年以内に再発する。3D技術の分野における大きな進歩は、ここ数年で行われてきました:腐敗システム、微細加工構造、3D足場、およびその他の個々のアッセイは、大規模な4で定期的なテストを可能にするために継続的に改善されています。 5,6,7.しかし、これらのアッセイから得られた結果は、2D画像解析システムを用いて3D生成データを解析する試みによってデータ解釈が妨げられることが多いため、有意義な方法で分析する必要があります。

画像取得速度と光毒性の低減の面で好ましいにもかかわらず、ほとんどの広視野システムは解像度8によって制限されたままです。したがって、薬物有効性に関するデータ読み出しとは別に、広視野システムを用いて画像化すれば、移動細胞の3D細胞構造に対する薬物作用の詳細な影響は必然的に失われる。逆に、共焦点レーザースキャニング顕微鏡(CLSM)は、コンピュータソフトウェアを使用して3D取得後に再構築およびレンダリングすることができる高品質の光学的に切り分けた画像をキャプチャします。したがって、CLSMは複雑な3D細胞構造のイメージングに容易に適用可能であり、それによって3D構造に対する抗移動性阻害剤の影響の調査および細胞移動機構の詳細な分析を可能にする。これは間違いなく将来の移住薬開発を導くでしょう。ここで、スフェロイド生成、薬物処理、染色プロトコル、および高解像度共焦点顕微鏡による特性評価の組み合わせワークフローについて説明する。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. 細胞スフェロイドの生成

1日目

  1. 調査中の細胞株で必要に応じて標準培養培地を調用意する。
  2. 無菌処理技術を用いて組織培養フード内のすべての組織培養関連ステップを行う。
  3. がん細胞をトリプシン化し、カウントします。プレートあたり20mLのセルサスペンションを使用します。細胞懸濁液は、明確にラベル付きの滅菌ユニバーサルチューブに保管してください。
  4. 各ウェルに所定の数のセルを追加します。必要な細胞の初期数と最終的なスフェロイドサイズの両方が、調査対象の細胞株の増殖速度に依存する。
    注:U251およびKNS429、10、5x 103細胞/mLのような確立された神経膠腫細胞株のために、インキュベーションの4日後に顕微鏡的に見える球体(200または800 μm)を作り出す。
  5. 細胞の束を避けるために穏やかな反転によって普遍的な管の細胞を再中断する。細胞懸濁液のピペット200μLを96ウェルプレートの各ウェルに入れた。すべての井戸が必要ない場合は、蒸発を避けるために、各空の井戸に1x PBSの200 μLを追加することをお勧めします。
  6. 細胞を通常どおり37°Cでインキュベーターでインキュベートします。
    注:グリオーマ癌細胞株などの細胞株は、24時間以内にスフェロイドを形成し、72時間のスフェロイドをインキュベートすることによって3D細胞構造を形成することを可能にする。

2日目

  1. 24時間後の明視野顕微鏡で細胞をチェックする 細胞株によっては、細胞が井戸の底部に検出可能なスフェロイドを形成している可能性がある。
    注:確立されたグリオーマ癌細胞株は24時間以内にスフェロイドを容易に形成し、患者由来のグリオーマ癌細胞株は最大1〜2週間かかることがある。

2. コラーゲン侵入アッセイ

3日目

  1. コラーゲン、5倍培養培地、1M NaOH、および氷の上に20mLチューブを1本置きます。
  2. 冷たい培養管に冷たいコラーゲンの10.4 mLを慎重かつゆっくりと追加します。気泡を避けてください。このコラーゲンの量は、1つの96ウェルプレートのために十分です。アップスケーリングは可能ですが、プレートごとに20mLチューブを1本ずつ用意することをお勧めします。
  3. 冷菌5x培養培地の1.52mLをゆっくりと加えます。気泡を避けてください。
  4. 使用直前に、冷間無菌1M NaOHの72μLを静かに加えます。氷の上に溶液を保管してください。
  5. ピペッティングで優しく混ぜます。気泡を避けてください。効率的な混合は、媒体の色の変化(赤からオレンジレッド(pH 7.4))につながります。使用するまで氷の上に混合物を残します。
  6. 重要なステップ:1日目に調製された96ウェルプレートから190μLの上清を取り除きます。井戸の底に形成されたスフェロイドを邪魔しないように非常に注意してください。ピペットは、井戸の中心ではなく、側面に向かって角度で使用します。
  7. 各ウェルにコラーゲンミックスの100 μLをゆっくりと加えます。任意のスフェロイドの乱れを防ぐために、井戸の側面にミックスをピペット。気泡を避けてください。重合を評価するために室温で20 mLチューブに残っているコラーゲンミックスを保ちます。
  8. インキュベーター内のプレートを少なくとも10分間インキュベートし、コラーゲンが重合することを可能にする。ガイドラインとして、残りのコラーゲンが設定されている場合、半固体およびスポンジ状になり、スフェロイドは阻害剤で処理する準備ができている。
  9. 培養剤に2倍濃度で薬剤または阻害剤を添加する。各ウェルに適当にミディアムを加えます(ウェルあたり100μL)。繰り返しますが、スフェロイドの乱れを避けるために、ウェルの側面に媒体をピペットします。
  10. T = 0 h、24 h、48 h、および 72 h の時間に明視野顕微鏡検査によって各スフェロイドを観察し、画像化し、薬物活性を評価します。その後、プレートをインキュベーターに戻します。
    注:細胞株の侵襲的挙動に応じて、元の球状コアからの離れた移動が24時間以降に観察されてもよい。

3. 共焦点顕微鏡のためのコラーゲン埋め込みスフェロイドと渡り細胞の調製

  1. プレートを組織培養フードに入れ、上清(200μL)を静かに取り除きます。繰り返しますが、これはコラーゲンプラグを妨げる可能性があるため、スフェロイドを邪魔しないように注意し、コラーゲンに触れないようにしてください。
  2. 上清を1x PBSの100 μLに置き換えます。この洗浄工程を3回繰り返します。
  3. 最終洗浄を取り除き、1x PBS(ウェルあたり100μL)で4%ホルムアルデヒドに置き換えます。
    注意:ホルムアルデヒドは発がんの可能性があります。健康と安全に関するガイドラインに従って、注意して取り扱ってください。
  4. 96ウェルプレートをラボベンチに置き、ホイルで覆い、室温で24時間放置します。
  5. 慎重にホルムアルデヒドを取り除き、1x PBSに置き換えます。この1x PBS洗浄3xを繰り返します。
  6. 1x PBSで0.1%トリトンX-100を準備します。1x PBS洗浄を取り外し、トリトンX-100溶液の100 μLに置き換えます。室温で30分間インキュベートします。その間、1x PBSと0.05%の脱脂粉乳でブロッキング溶液を準備し、完全に混ぜます。
  7. トリトンX-100を取り外し、1x PBSで3倍を洗います。各ウェルに100μLのブロッキング溶液を加え、15分間インキュベートします。
  8. 所定の濃度でブロッキングバッファーに必要な一次抗体を希釈する。ここで、抗マウスIgGアセチル化チューブリン抗体(1:100)を用いる。
  9. 15,682 x gで5分間の一次抗体遮断バッファーミックスを遠心分離する。ブロッキング溶液を慎重に取り外し、各ウェルに上清(25−50 μL)を加えます。室温で1時間暗くインキュベートする。
  10. 抗体溶液を取り出し、1x PBS(ウェル当たり100μL)で3xを洗浄します。
  11. 任意の追加の蛍光汚れに加えて、推奨または所定の濃度でブロッキングバッファー内の二次抗体を希釈する。ここでは、1:500抗マウスフルオロフォア-488共役抗体、ファロイジン-594(1:500)をアクチン染色、およびDNA染色(DAPI)に用いる。
  12. 繰り返しになりますが、13,000rpmで5分間二次抗体溶液を遠心分離します。
  13. 各ウェルからブロッキング溶液を取り出し、二次抗体/ファロイジン/DAPIミックスの25~50μLを添加します。室温で1.5時間暗闇の中でインキュベートします。
  14. 二次抗体染料溶液を取り出し、1x PBS(ウェル当たり100μL)で3倍を洗浄します。
  15. プラスチックピペット(200μL)を使用して、高品質のプレーンガラススライドの中心に吸引して個々のコラーゲンプラグを慎重に持ち上げます。
  16. コラーゲンプラグに適切なマウントを1滴加え、プラグが完全に覆われていることを確認します。気泡を避けてください。
  17. イメージングに使用され、一晩設定できるようにする顕微鏡目的のための最適な厚さのカバースリップを適用します。暗い所温でスライドを保管してください。

4. 蛍光顕微鏡

  1. 適切な共焦点顕微鏡を使用して蛍光画像をキャプチャします。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

3次元スフェロイド技術は、がん特異的な環境をより代表的に表しているため、薬物腫瘍相互作用の理解を進めています。スフェロイドの生成は、いくつかの方法で達成することができます。このプロトコルでは、低付着96ウェルプレートが使用されました。異なるメーカーからいくつかの製品をテストした後、彼らは一貫して成功したスフェロイドの生産と均一性の面で最高のパフォーマンスを発揮したので、ここで使用されるプレートが選ばれました。成長培地がコラーゲンマトリックスに置き換えられる置換工程は、プロトコルの重要なポイントです。スフェロイド自体を邪魔することなく、媒体のほとんどを取り除くために細い注意が必要です。広視野顕微鏡による薬物誘発効果の特性を特徴付ける自動イメージングは、任意のハンドラーバイアスを除去すると考えられるかもしれませんが、現在市販されている機器はイメージングアプローチよりもかなり高価なままです。ここで概説します。

広視野上蛍光顕微鏡は、細胞の移動および侵入に対する薬物活性の影響を調べることができる。しかし、広視野顕微鏡検査から得られた分解能は、細胞形態に対する薬物効果に関する結果の詳細な解釈を可能にするのに十分ではない(図1)。ここで、グリオーマ・スフェロイドの調製および細胞の移動を容易に再現可能な染色プロトコルを介して記載し、続いて共焦点顕微鏡を用いて画像化する。広視野顕微鏡画像解析から、MI-192阻害剤による治療後の神経膠腫細胞に異なる形態変化が生じていることは明らかであったが、明確に定義された詳細は欠けていた。共焦点顕微鏡検査は、初期の所見を確認し、これらの高解像度画像は、さらにMI-192の効果の評価を可能にしました。未処理(対照)スフェロイド、移動細胞(図2)、および処理されたスフェロイドと細胞(図3)との間に有意な差が明らかになった。成体神経膠腫細胞株U251は「スパイク」で移行するように見えたのに対し、単一細胞を取り離して元の球体コアから放射し、小児細胞株KNS42は、明確な細胞スパイクがほとんどないシート状の遊離パターンを採用した。以前は、異なる細胞株間の異なる移行パターン(ここでは成人神経膠腫細胞株U251および小児細胞株KNS42)が観察され、それらが生じた細胞型および腫瘍単離部位を反映する可能性がある。重要なことに、増え続ける阻害剤濃度(0.1−10 μMから)を伴う酢酸化チューブリンの増加は、移行細胞だけでなく、スフェロイド関連細胞においても明らかになった。これは、最初の広視野顕微鏡で取得された画像では明らかではなかった。さらなるイメージングは、移動性阻害剤による治療に対する細胞応答としてのタンパク質発現レベルの定量的分析も可能にする。

本研究では、治療に応じて細胞が形態的に変化することが実証された。細胞丸めは、最も高い阻害剤濃度(10μM)で阻害剤濃度と細胞死を増加させ、U251細胞で核断片化が明らかになり、KNS42で微小管および核断片化が明らかになった。これらの知見は、グリオーマ細胞株上のMI-192の抗移動活性が濃度依存性13,14であるという以前の観察と一致している。プロトコルの全体的なワークフローを図 4 に示します。

Figure 1
図1:広視野顕微鏡で画像化したコラーゲンへの球状細胞浸潤細胞株U251およびKNS42の代表的な画像は、1μMの抗移動濃度および24時間間隔で阻害剤MI-192で処理した後に示される。治療を受けのないコントロールスフェロイドも示されている。潜在的な反移動効果またはプロマイグラトリー効果は、強調表示(矢印)として検出されます。これは特にKNS42で顕著であり、コントロールまたは処理されたスフェロイドのいずれの移行も一見ありません。すべての画像は4倍で撮影されました。スケールバー = 1,000 μm. SF188 = 200 μm、KNS42 = 1,000 μm の拡大画像のスケールバーを表示するには、ここをクリックしてこの図の大きなバージョンを表示してください。

Figure 2
図2:共焦点顕微鏡で明らかになった神経膠腫細胞株U251に対するマイグラスタティック阻害剤MI-192の効果。固定および染色されたグリオーマスフェロイドおよび移動細胞は、明確な渡り目の型を表示します。元の球状のエッジに近い移動細胞が表示されます。U251細胞スフェロイドは、元のスフェロイドから放射するスパイクを特徴とし、阻害剤濃度の上昇に伴って明らかな細胞の細胞丸めを増加させる(矢印は細胞スパイクを示す)。スケールバー = 10 μm. ラベル: 赤 = アクチン、 緑 = アセチル化チューブリン、青 = DAPI.各画像について、単一の代表的な光学セクションが、比較目的で維持される前と後の両方の設定でキャプチャされました。すべての画像は、その後処理されました。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:共焦点顕微鏡で明らかになったグリオーマ細胞株KNS42に対するマイグラスタティック阻害剤MI-192の効果。KNS42の移行は、単一細胞スパイクを伴うシート状の突起によって特徴付けられます(矢印は細胞シートを示します)。最も低い阻害剤濃度では、この表現型は顕著に見えるが、阻害剤濃度の増加と共に失われる(スケールバー= 10 μm);。ラベル: 赤 = アクチン、緑 = アセチル化チューブリン、青 = DAPI.各画像について、単一の代表的な光学セクションがキャプチャされ、比較目的で画像前と後の両方のキャプチャを持つすべての設定が維持されました。すべての画像は、その後処理されました。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図 4: ワークフローの概要。このワークフローに組み込まれるのは、スフェロイドの生成であり、コラーゲンに埋め込み、薬物治療、固定、染色、および共焦点顕微鏡によるイメージングである。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

高解像度共焦点顕微鏡を用いて移動性薬物活性を同定するための癌細胞スフェロイドを作成する新しい方法が記載されている。ぶら下げ滴15などの他の技術に対する低付着板の使用は、コラーゲン移行および侵入アッセイで使用するための再現性と均一なスフェロイドを生成する手段を容易にした。このプロトコルの重要なポイントは、コラーゲンマトリックスに埋め込まれる細胞スフェロイドの前の96ウェルプレートからの成長培地の除去と、その後のスフェロイドを含むコラーゲンプラグの慎重な取り扱いである。デジタルマイクロ流体16などの新しい技術が利用可能になり、より高価であるが、メディアおよび流体の手動除去に代わる手段を提供する可能性がある。記載されたプロトコルの主な制限は、単一のスフェロイドを画像化し、阻害剤の薬物活性を評価するために明るい視野顕微鏡で手動で分析する場合に時間がかかることです。また、工程のすべての工程に必要な試薬は高価であり、高分解能共焦点顕微鏡という特殊な装置も必要です。播種に必要な最適な細胞数および必要なサイズの細胞スフェロイドを得るのに要する時間も、コラーゲン侵入アッセイの開始前に事前に決定されなければならない。

がん細胞を標的とする薬剤の開発、大規模な薬物スクリーニング、薬剤改変や改善のための薬物活性の特性評価は、ますます3D細胞アッセイと技術に依存しています。このプロトコルは、他の実験アッセイおよび他の疾患システムにおける重要な他の多数の細胞タイプとの使用のために最適化され、適合させることができる。現在までに、顕微鏡的に生成されたデータの解釈は、広視野顕微鏡の適用によって妨げられており、画像は限られた解像度を提供し、外部から発生する光から生じる固有の画像ぼかしに悩まされている。フォーカルプレーン。ここに示す広視野顕微鏡画像は、EVOSイメージングシステムを使用して手動で取得され、時間がかかり、ハンドラバイアスを引き起こす可能性があります。自動化されたワークステーションや分析プラットフォーム17、18などの新しい技術は現在利用可能ですが、コストがかかるため、多くの研究室では利用できません。さらに、さらなるソフトウェア開発は、高解像度の3Dレンダリング画像の解析に役立ち、ここで述べたような表現型の変化を正確に定量化し、したがって細胞移動に対する阻害剤の有効性を高めることができる。さらに、多くの研究室でますます標準化されつつある超解像蛍光イメージング技術の応用により、3Dスフェロイドで増殖した細胞の移動挙動や形態に関するさらなる洞察が得られます。構造と阻害薬で治療。

コラーゲンに埋め込むと、マイグラスタティック阻害剤による処理に続いて、スフェロイドを固定および染色することが可能であることを確立した。この方法は、96ウェルプレートで完了したすべてのステップで実行し、続いて、イメージング用のカバースリップにスフェロイドを含むコラーゲンプラグを取り付けて、実行が容易でした。癌細胞形態に対する阻害剤活性の効果を評価する際に、共焦点顕微鏡検査を用いて薬物活性を解明した。低分解能画像からの阻害剤MI-192の抗移動効果に関する初期所見は、高解像度共焦点顕微鏡によって確認された。この特定の阻害剤はヒストンデアセチラーゼ3(HDAC3)を標的とする。HDACは遺伝子発現のエピジェネティック調節に関与する酵素であり、最近ではがん創薬の潜在的な標的として関心が高まっています。MI-192の以前の経験は、低濃度では、チューブリンのアセチル化を調節し、微小管のハイプラセチル化および安定化につながることを示している。安定した微小管は、細胞の移動活動に潜在的な影響を及ぼす可能性のある、あまり動的ではありません。観察された効果は、代表的な小児および成人神経膠腫細胞株の両方に存在することが確認された。両方の神経膠腫細胞株のチューブリンアセチル化状態の濃度依存性の増加が明らかにされ、移動性薬物による相補的治療を検討する際に患者の事前選択に影響を及ぼすことが明らかになった。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

著者は利益相反を宣言しない。

Acknowledgments

KNS42細胞株に貢献してくださったクリス・ジョーンズ教授に感謝します。この作品で使用されるAiryScanとのツァイスLSM880共焦点顕微鏡は、リーズ市地域エンタープライズパートナーシップ(LEP)成長契約を通じて資金提供されたハダースフィールドイノベーションとインキュベーションプロジェクト(HIIP)の一部です。顕微鏡画像のクレジット図3:カールツァイス顕微鏡GmbH、microscopy@zeiss.com。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagen I, rat tail, 100 mg Corning 354236 for glioma invasion assay; this is offered by many distributors/manufacturers and will need to be determined for both the type of assay intended and cell lines used. For glioma cancer cell lines Collagen rat tail type 1 (e.g. Corning) is the preferred choice. Collagen should be stored at 4 °C, in the dark, until required. It is not advisable to mix collagen from different batches as this may affect the consistency of the polymerized collagen.   
Coverslips various various for microscopy imaging
DMEM powder Sigma D5648 needed at 5x concentration for collagen solution for glioma invasion assay;  this may be purchased in powdered form, made up in double distilled water and, depending upon final composition of the growth medium, completed with any additives required. The complete 5x solution should be filtered through a syringe filter system (0.22 μm) before use.
Foetal calf serum Sigma F7524-500ML needed for cell culture of glioma cell lines
Glass slides various various for microscopy imaging
High glucose DMEM Gibco 41965062 needed for cell culture of glioma cell lines
Inhibitor Tocris various various - according to experimental design; inhibitors can be purchased from manufacturers such as Selleckchem and Tocris. These manufacturers offer detailed description of inhibitor characteristics, links to associated references and suggestion of working concentrations. As with all inhibitors, they may be potentially toxic and should be handled according to health and safety guidelines. Inhibitors are prepared as stock solutions as recommended by the manufacturer. As an example we used the migrastatic inhibitor MI-192 to demonstrate the use of such inhibitors. We have tested a range of migrastatic inhibitors in this way with comparable results.
Mountant various various for microscopic imaging
NaOH (1 M) various  various NaOH can be either purchased at the required molarity or prepared from solid form. The prepared solution should be filter sterilized using a syringe filter system. One M NaOH is corrosive and care should be taken during solution preparation.
Paraformaldehyde  various various for fixing spheroids and cells; make up at 4%, caution health hazard, ensure that health and safety regulations are adhered to for collagen solution for invasion assay
Pastettes (graduated pipette, 3 mL) various various for invasion assay, solution removal
PBS, sterile for tissue culture Sigma D1408-500ML   needed for cell culture of glioma cell lines and washes for staining
Pen/strep (antibiotics) Sigma P4333 needed for cell culture of glioma cell lines
Primary antibody, secondary antibody, DAPI, Phalloidin various various there are many manufacturers for these reagents, for secondary labelled antibodies we recommend Alexa Fluor (Molecular Probes). Here we used for primary antibodies mouse anti-acetylated tubulin antibody (1/100, Abcam). For secondary antibodies we used 1/500 anti-mouse Alexa Fluor 488 conjugated antibody, Molecular Probes. For nuclear stain we used DAPI (many manufacturers) and the actin stain Phalloidin (many manufacturers) both used at recommended dilution of 1/500.
Sodium bicarbonate Sigma S5761 needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5x concentration
Sodium pyruvate Sigma P5280 needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5x concentration
Trypsin Sigma T4049 for trypsinisation
Ultra low attachment plates Sigma/Nunc CLS7007-24EA for glioma invasion assay; a low adherent plate is required, with 96-well plates preferred to allow for large-scale screening of compounds under investigation. There are several low adherence plates commercially available; it is advisable to test a variety of plates for optimum spheroid generation. In our experience Costar Ultra Low Cluster with lid, round bottom, works best for the generation of spheroids from glioma cancer cells in terms of 100% spheroid formation and reproducibility. These plates were also successfully used for the generation of glioma spheroids from patient-derived material, bladder and ovarian cancer cells in our laboratory. In addition, stem or progenitor neurospheres can be used in these plates to facilitate the generation of standardized neurosphere-spheroids
Stripettes (serological pipettes, sterile, 5 mL and 10 mL) various e.g. Costar CLS4488-50; CLS4487-50 for tissue culture and collagen preparation
Various multichannel (50 - 250 μL) and single channel pipettes (10 μL, 50 μL, 200 μL 1 mL) various various for cell and spheroid handling
Widefield microscopy various  various for observation of spheroid generation and spheroid imaging; here wide-field fluorescence images were captured using an EVOS FL cell imaging system (Thermo Fisher Scientific)
Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective Zeiss quote from manufacturer Confocal images were captured using a Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective. Diode 405nm, 458/488/514 nm argon multiline and HeNe 594nm lasers were used to excite Phalloidin 594, Alexa Fluor 488, and DAPI respectively. For each image a single representative optical section were captured, with all settings, both pre- and post-image capture, maintained for comparative purposes. All images were subsequently processed using the associated Zen imaging software and Adobe Photoshop.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gandalovičová, A., et al. Migrastatics-anti-metastatic and anti-invasion drugs: promises and challenges. Trends in Cancer. 3, (6), 391-406 (2017).
  2. Delgado-López, P. D., Corrales-García, E. M. Survival in glioblastoma: a review on the impact of treatment modalities. Clinical and Translational Oncology. 18, 1062 (2016).
  3. Foreman, P. M., et al. Oncolytic virotherapy for the treatment of malignant glioma. Neurotherapeutics. 14, 333 (2017).
  4. Rodrigues, T., et al. Emerging tumor spheroids technologies for 3D in vitro cancer modelling. Pharmacology and Therapeutics Technologies. 184, 201-211 (2018).
  5. Sirenko, O., et al. High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures. Assay and Drug Development Technologies. 13, (7), Mary Ann Liebert, Inc. (2015).
  6. Wu, Q., et al. Bionic 3D spheroids biosensor chips for high-throughput and dynamic drug screening. Biomedical Microdevices. 20, 82 (2018).
  7. Mosaad, E., Chambers, K. F., Futrega, K., Clements, J. A., Doran, M. R. The microwell-mesh: a high-throughput 3D prostate cancer spheroid and drug-testing platform. Scientific Reports. 8, 253 (2018).
  8. Jonkman, J., Brown, C. M. Any way you slice it-a comparison of confocal microscopy techniques. Journal of Biomolecular Techniques. 26, (2), 54-65 (2015).
  9. Pontén, J. Neoplastic human glia cells in culture. Human Tumor Cells in Vitro. Springer US. Boston. 175-206 (1975).
  10. Takeshita, I., et al. Characteristics of an established human glioma cell line, KNS-42. Neurologica Medico Chirurgica. 27, (7), 581-587 (1987).
  11. Bance, B., Seetharaman, S., Leduc, C., Boëda, B., Etienne-Manneville, S. Microtubule acetylation but not detyrosination promotes focal adhesion dynamics and cell migration. Journal of Cell Science. 132, (2019).
  12. Bacon, T., et al. Histone deacetylase 3 indirectly modulates tubulin acetylation. Biochemical Journal. 472, 367-377 (2015).
  13. Jackman, L., et al. Tackling infiltration in paediatric glioma using histone deacetylase inhibitors, a promising approach. Neuro-Oncology. 20, i19-i19 (2018).
  14. Bhandal, K., et al. Targeting glioma migration with the histone deacetylase inhibitor MI192. Neuro-Oncology. 19, i12-i12 (2017).
  15. Del Duca, D., Werbowetski-Ogilvie, T. E., Del Maestro, R. Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion. Journal of Neuro-oncology. 67, (3), 295-303 (2004).
  16. Bender, B. F., Aijian, A. P., Garrell, R. L. Digital microfluidics for spheroid-based invasion assays. Lab on a Chip. 16, (8), 1505-1513 (2016).
  17. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29 (2012).
  18. Härmä, V., et al. Quantification of dynamic morphological drug responses in 3D organotypic cell cultures by automated image analysis. PLOS ONE. 9, (5), e96426 (2014).
高分解能共焦点顕微鏡による3D腫瘍スフェロイド侵入に対する移動性阻害剤の効果の特徴
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Harmer, J., Struve, N., Brüning-Richardson, A. Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (151), e60273, doi:10.3791/60273 (2019).More

Harmer, J., Struve, N., Brüning-Richardson, A. Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (151), e60273, doi:10.3791/60273 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter