Summary
اختبارات التفاعل الثقافة المشتركة المقدمة في هذا البروتوكول غير مكلفه ، والانتاجيه العالية ، وبسيطه. ويمكن استخدام هذه المقايسات لمراقبه التفاعلات الميكروبية في الثقافة المشتركة ، وتحديد أنماط التفاعل ، وتوصيف الإمكانات المثبطة لسلاله جرثوميه من الفائدة ضد مسببات الامراض البشرية والبيئية.
Abstract
وقد أدت دراسة التفاعلات بين الكائنات المجهرية إلى اكتشافات عديده ، من ميكروبات الرواية إلى رؤى في الإيكولوجيا الميكروبية. العديد من النهج المستخدمة لدراسة التفاعلات الميكروبية تتطلب معدات متخصصة ومكلفه والوقت المكثف. تقدم هذه الورقة بروتوكولا لاختبارات تفاعل الثقافة المشتركة التي تكون غير مكلفه وقابله للتطوير إلى أرقام العينات الكبيرة وقابله للتكيف بسهوله مع العديد من التصاميم التجريبية. يتم استزراع الكائنات المجهرية معا ، مع كل بئر يمثل مزيجا واحدا من الكائنات المجهرية. يتم استزراع كائن الاختبار علي جانب واحد من كل بئر واحتضانه لأول مره في الزراعة الاحاديه. وفي وقت لاحق ، يتم تطعيم الكائنات المستهدفة في الوقت نفسه علي الجانب الآخر من كل بئر باستخدام طابع التلقيح المطبوع ثلاثي الابعاد. بعد المشاركة في الثقافة ، يتم تسجيل الاختبارات المكتملة للظاهريات المرئية ، مثل النمو أو التثبيط. ويمكن استخدام هذه المقايسات لتاكيد الأنماط الظاهرية أو تحديد النقوش بين العزلات ذات الفائدة. باستخدام هذه الطريقة البسيطة والفعالة ، يمكن للمستخدمين تحليل مجموعات من الكائنات المجهرية بسرعة وكفاءه. هذا النهج الثقافة المشتركة ينطبق علي اكتشاف المضادات الحيوية وكذلك البحوث القائمة علي الثقافة الميكروبيوم وقد تم بالفعل تطبيقها بنجاح علي كلا التطبيقات.
Introduction
في الطبيعة ، نادرا ما توجد الكائنات المجهرية في عزله ؛ التالي ، فانها تتفاعل باستمرار مع الكائنات الأخرى. لذلك ، دراسة كيفيه تفاعل الكائنات المجهرية مع بعضها البعض أمر ضروري لفهم العديد من السلوكيات الميكروبية1. التفاعلات الميكروبية يمكن ان تكون متنافرة ، المعلق ، أو عدائيه. هذه في ذكر يمكن ان تؤثر ليس فقط علي الكائنات المجهرية أنفسهم ولكن أيضا البيئات والمضيفين ان الكائنات المجهرية استعمار1,2.
العديد من العلماء دراسة التفاعلات الميكروبية لتحديد جزيئات مضادات الميكروبات الجديدة. تم العثور علي واحده من أول جزيئات مضادات الميكروبات الهامه سريريا من خلال دراسة التفاعلات الميكروبية. لاحظ السير الكسندر فليمينغ تلوث Penicillium spp. عزل التي أعاقت نمو سلاله المكورات العنقودية ، مما ادي إلى اكتشاف المضادات الحيوية التي يشيع استخدامها البنسلين3. ويظل توصيف أليات التي تستخدمها الكائنات المجهرية لمعاداه منافسيها موردا مثمرا لاكتشاف الجزيئات المضادة للميكروبات. علي سبيل المثال, وقد تبين مؤخرا ان العقديات sp. سلاله Mg1 تنتج المضادات الحيوية linearmycins, التي لديها النشاط التحلل هذه ضد عصيه رقيقه4.
وعلاوة علي ذلك ، تم مؤخرا اكتشاف الببتيد غير ريبوسموكالي المسمي lugdunin بعد الملاحظة ان الأنف المعلق المكورات العنقودية lugdunin يمنع المكورات العنقوديةالذهبية 5. وقد أظهرت الدراسات أيضا ان التفاعلات الثنائية بين الكائنات المجهرية هي بنفس قوه التفاعلات العدائية لاكتشاف جزيئات مضاده للميكروبات. علي سبيل المثال ، العديد من النمل الزراعة الفطريات في قبيله Attini ميناء البكتيريا التكافلية دعا بسيودونوكارديا علي هيكلها التي تنتج جزيئات مضاده لمنع الممرض الملزمة من محصولهم الفطرية6. ونظرا لان دراسة التفاعلات الميكروبية كانت مفيده لاكتشاف جزيئات مضادات الميكروبات ، فان استخدام شاشات عاليه الانتاجيه قد يؤدي إلى اكتشاف جزيئات جديده مضاده للميكروبات.
وفيما يتعلق بتكلفه الأداء وسهولته ، فان المنهجيات المستخدمة لدراسة التفاعلات الميكروبية تتراوح بين البسيطة والمعقدة. علي سبيل المثال ، المقايسة أجار المكونات هي طريقه غير مكلفه وبسيطه التي يمكن استخدامها للتحقيق العداء بين الكائنات المجهرية متعددة7. ومع ذلك ، فحص المكونات أجار ليس اجراء فعالا ، ويمكن ان تكون كثيفه العمالة للعديد من مجموعات الاقران. لتقييم الآثار الناتجة عن المنتجات المجهرية علي العزلات المستهدفة من الفائدة بطريقه إنتاجيه عاليه ، والعديد من المختبرات استخدام اختبارات نشر القرص8. هذه المقايسات هي سهله وغير مكلفه ويمكن ان تكون قابله للتطوير إلى عدد أكبر من العينات7. ومع ذلك ، يتطلب هذا الفحص توليد المستخلصات الميكروبية وقد ينتج نتائج مضلله لمجموعات معينه من الكائنات الحية المستهدفة والمضادات الحيوية ، مثل السالمونيلا والسيفالوسبونات9.
تعتمد الطرق السابقة علي المكونات المعزولة للحصول علي استجابه في الكائن المستهدف ، بدلا من السماح للكائنات المجهرية بالتفاعل مع بعضها البعض. وهذا أمر جدير بالملاحظة لان التفاعلات بين الميكروبات قد تثير إنتاج جزيئات مضاده للميكروبات "مبهمه" لا تنتج في الزراعة الاحاديه. علي سبيل المثال, وقد تبين مؤخرا ان يتم إنتاج keyicin مضادات الميكروبات فقط بواسطة البوغانه sp. عندما شارك في الاستزراع مع sp. التي يتم عزلها من نفس ميكروبيوم الإسفنج10. وهناك منهجيات تفاعل أكثر تعقيدا تلتف حول هذا العائق الأحادي المحتمل. علي سبيل المثال ، فان iChip مفيد لعزل نادره وصعبه لزراعه البكتيريا من العينات البيئية ويسمح لمراقبه التفاعلات الميكروبية من خلال النمو في الموقع11. وللتحقيق في التفاعلات بالتفصيل ، يمكن استخدام مقياس الطيف الكتلي للتصوير بالليزر/التاين بمساعده المصفوفة في وقت التحليق. ويوفر هذا النهج معلومات مفصله عن تكوين وتوزيع الجزيئات الصغيرة والالببتيدات التي تنتجها المستعمرات الميكروبية المتفاعلة ذات الاستبانة المكانية العالية. وقد استخدمت أيضا في دراسات متعددة من التفاعلات البكتيرية لتوصيف أليات المنافسة12،13،14،15. ومع ذلك ، فان النظام المتكامل للرصد والرصد في كثير من الأحيان يتطلب اعدادا مضنيا من العينات ، وخبره متخصصة لتشغيل المعدات ، ومقاييس طيفيه عاليه التكلفة ومتخصصة. لهذه الأسباب ، هو تقنيه صعبه لاستخدامها للدراسات الانتاجيه العالية. وهكذا ، فان اختبار الثقافة المشتركة البسيط والقابل للتطوير والانتاجيه العالية للتفاعلات الميكروبية التي تتغلب علي العديد من القيود علي النهج المذكورة أعلاه سيكون مفيدا.
هنا ، يتم عرض بروتوكول لارتفاع الانتاجيه الميكروبية المشتركة الثقافة. هذا الفحص بسيط وسهل الدمج في الدراسات الموجودة مسبقا للتفاعلات الميكروبية. علي النقيض من العديد من الطرق الشائعة الاستخدام لدراسة التفاعلات الميكروبية ، طريقتنا بسيطه ، غير مكلفه ، وقابله للتحقيق في اعداد كبيره من التفاعلات. وهذه المقايسات ليست سهله التنفيذ فحسب ، ولكن المواد متاحه علي نطاق واسع من معظم موردي المختبرات أو الموارد العامة (مثل المكتبات والمساحات المكانية). التالي ، هذا الفحص هو مفيد كخط الأول من التحقيق لتحديد وتحليل أنماط مثيره للاهتمام بين العديد من مجموعات الاقران من الكائنات المجهرية ، والتي قد تكون مفيده بشكل خاص للتحقيق في الإيكولوجيا الميكروبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وتم الحصول علي موافقه مستنيرة من والدي المتبرع ، ووافقت لجنه المواد البشرية في جامعه ويسكونسن-ماديسون علي الدراسة (مجلس المراجعة المؤسسية ، رقم الموافقة H-2013-1044).
1. عينه الثقافة
ملاحظه: يتم استخدام هذا الاجراء هنا لدراسة التفاعلات بين البكتيريا المعزولة من تجويف الأنف البشري. من حيث المبدا ، يتم تطبيق الطرق التالية علي اي شرط الثقافة. يتم استخدام مرق الدماغ القلب ضخ (BHI) للانتشار العام للبكتيريا الانفيه. وعززت جميع لوحات باستخدام 1.5 ٪ أجار. لهذه الدراسة ، تؤخذ عينات من محلول ملحي مسح في انف المتبرع (غسل الأنف) ، ونقلها إلى أنابيب الطرد المركزي الصغير ، والمجمدة في-80 درجه مئوية.
- استخدام تقنيات الثقافة القياسية للوحه 100 μL من كل من عينات غسل أذابه علي لوحات BHI.
- احتضان لوحات الهوائية في 37 درجه مئوية لمده 1 أسبوع.
- بعد الحضانة ، حدد ≥ 2 مستعمرات لكل لوحه واضحة لكل صحن ومرور العزلات الهوائية علي لوحات BHI عن طريق ينثر مستعمره من لوحه الاولي علي لوحه BHI جديده واحتضان لوحه في 37 درجه مئوية. كرر حتى الثقافات البكتيرية نقيه.
ملاحظه: يمكن تحديد العزلات البكتيرية من خلال المورفولوجية المستعمرة ، وتلطيخ الغرام ، والتسلسل الجيني rRNA 16S ، أو طريقه أخرى. ومع ذلك ، فان معرفه هويه العزل ليست ضرورية للاستمرار في البروتوكول. - بالتبريد جميع العزلات البكتيرية في-80 درجه مئوية بعد الجمع بين 1 مل من 50 ٪ الجلسرين مع 1 مل من الثقافة البكتيرية بين عشيه وضحيها (انظر القسم 3) في البرد.
2. طوابع الطباعة 3D
ملاحظه: تم اختيار البولي كماده ختم بسبب درجه حرارة الانتقال الزجاج العالي (147 درجه مئوية) التي تتجاوز درجات الحرارة الاوتوكلاف القياسية (121 درجه مئوية) ، مما يقلل من احتمال تشوه بعد الاستخدامات المتكررة.
- تحميل الطابعة 3D مع خيوط البولي.
- تطبيق الغراء المدرسة البيضاء (خلات البولي فينيل) إلى سرير الطباعة للمساعدة في التصاق والحد من تزييفها ختم التلقيح اثناء الطباعة.
- تحميل. STL نموذج ملف (ملف البيانات التكميلية) لختم التلقيح (الشكل 1) في برنامج الطابعة 3d.
- طباعه ختم التلقيح في درجه حرارة 290 درجه مئوية فوهه ، 60 درجه حرارة السرير °C ، وارتفاع طبقه 0.38 ملم.
- التفاف ختم في إحباط ألومنيوم وتعقيم عن طريق الاوتوكلاف ل 1.5 h علي دوره الجاذبية مع 15 دقيقه من التجفيف.
ملاحظه: علي الرغم من ان البولي هو المجهرية ، والطوابع تحتفظ فقط تقريبا 0.5 ٪ من وزن الماء بعد التعقيم.
3. اعداد الثقافات بين عشيه وضحيها
- باستخدام ماصه المصلية ، ماصه 3 مل من مرق BHI معقمه في أنابيب الثقافة 14 مل.
- باستخدام حلقه تطعيم معقمه 1 μL ، تطعيم مستعمره بكتيرية في المرق. دوامه حلقه لضمان المشتتات اجمه في مرق. دوامه الثقافة أنابيب لفتره وجيزة قبل الحضانة.
- احتضان أنابيب الثقافة في 37 درجه مئوية بين عشيه وضحيها (~ 16 ساعة) علي شاكر في 250 دوره في الدقيقة.
- دوامه لتفريق كتل من الخلايا مره واحده في الثقافات البكتيرية تصل إلى تعكر كافيه (OD600 ≥ 1).
4. اعداد لوحات الفحص البيولوجي
ملاحظه: يتم اعداد لوحات الفحص الإحيائي في غطاء التيار الصفحي للحفاظ علي العقم.
- اعداد BHI وسائل الاعلام مع 1.5 ٪ أجار وتعقيم عن طريق التعقيم وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- بعد التعقيم ، تبريد وسائل الاعلام BHI إلى 55 درجه مئوية في حمام المياه التي تسيطر عليها درجه الحرارة.
- باستخدام ماصه المصلية ، ماصه 3 مل من وسائل الاعلام BHI المنصهر في كل من الآبار 12 علي لوحه بئر 12. تاكد من ان الآبار الدقيقة وحتى ممكن. لتر واحد من وسائل الاعلام سوف تسفر عن ~ 27 لوحات الفحص الإحيائي.
- السماح أجار لتعيين بين عشيه وضحيها.
5. تطعيم لوحات الفحص البيولوجي مع كائن الاختبار
ملاحظه: يشير كائن الاختبار إلى الكائن الحي الذي يتم فيه تحديد إنتاج النشاط المثبط (مثل إنتاج المضادات الحيوية) باستخدام فحص تفاعل الثقافة المشتركة. النسبة لهذه التجربة ، فان الكائنات الاختبارية هي الاكاكتيباكتيريا المعزولة عن عينات الأنف.
- تطعيم الكائن الاختباري علي لوحه الفحص الإحيائي عن طريق إدخال حلقه تلقيح معقمه بمقدار 10 μL في الثقافة الليلية والتقشر بقطرات الثقافة علي الثلث الأيسر من الصفيحة جيدا.
ملاحظه: فمن المستحسن ان خط واحد فقط ثلث البئر ، والإفراط في البئر يمنع التلقيح في وقت لاحق من الكائنات المستهدفة. - كرر حتى يتم تطعيم جميع الآبار 12 علي لوحه مع الكائن الاختبار.
- احتضان لوحات راسا علي عقب في درجه الحرارة المناسبة لمده 7 أيام. في درجات حرارة اعلي (≥ 37 درجه مئوية) أو في المناخات الأكثر جفافا ، تخزين لوحات في وعاء رطب لمنع لوحات من التجفيف.
6-اعداد الكائنات المستهدفة
ملاحظه: ويشير الكائن المستهدف إلى الكائن الحي الذي يتحدد وضعه المثبط باستخدام مقايسة التفاعل بين الثقافة المشتركة. لهذه التجربة ، والكائنات الحية المستهدفة هي المكورات العنقودية . معزولة عن عينات الحياة الأنف.
- بعد احتضان لوحات الفحص الإحيائي لمده 6 أيام ، اعداد الثقافات بين عشيه وضحيها من الكائنات المستهدفة المحددة ، كما فعلت أعلاه (انظر القسم 3).
7. تلقيح الكائنات المستهدفة
ملاحظه: بعد الحضانة بين عشيه وضحيها ، وضمان ان الثقافات هي عكر (OD600 ≥ 1). بعض الثقافات البكتيرية قد تلبد في الجزء السفلي من أنبوب الثقافة. دوامه أنابيب الثقافة لتفريق كتل وتقييم تعكر الثقافة.
- اعداد لوحه الهدف عن طريق ملء كل بئر من لوحه فارغه 12 جيدا مع 1.8 مل من BHI و 200 μL من الثقافة المستهدفة بين عشيه وضحيها.
- إلغاء التفاف ووضع ختم التلقيح معقمه في لوحه الهدف. قم بتحريك الثقافات حول الآبار برفق ، مع الحرص علي ضمان عدم عبور الثقافات لتلوث الآبار المجاورة.
- رفع ختم التلقيح والتاكد من ان هناك قطره من الثقافة الهدف المخفف علي كل طرف الختم.
-
اعداد لوحه التحكم بالزراعة الاحاديه عن طريق وضع ختم التلقيح علي لوحه الفحص الإحيائي غير الملقح والصخور بلطف الطابع بحيث ثقافة قطره تطعيم كل بئر. وبمجرد أزاله ختم التلقيح ، ينبغي ان تكون قطره من الثقافة مرئية في ابار صفيحه الفحص الإحيائي.
- إذا لم يتم تطعيم اي الآبار مع ختم التلقيح بسبب مستويات متفاوتة من وسائل الاعلام ، بقعه 3 μL من الثقافة المخففة بين عشيه وضحيها علي الجانب الأيمن من الآبار باستخدام ماصه.
- تطعيم لوحات الفحص الحيوي كما فعلت أعلاه (انظر الخطوة 7.4.1) ، ولكن محاذاة الطابع بحيث محاذاة النصائح مع الجانب الأيمن من لوحه 12 جيدا. تاكد من عدم اتصال الختم بالمستعمرة البكتيرية الموجودة عند تلقيح الآبار.
- أزاله بعناية الطوابع ومكان العودة إلى لوحه الهدف.
- كررت التلقيح لكل [بيومقايسه] لوحه حتى كل اللوحات يكون تلقيحت.
- احتضان لوحات الفحص الإحيائي راسا علي عقب في درجه الحرارة المناسبة لمده 7 أيام.
8. تسجيل النقاط
-
بعد المشاركة في الاختبار والكائنات المستهدفة لمده أسبوع واحد ، يسجل التفاعلات استنادا إلى التقييم البصري التالي:
- يسجل الآبار مع نمو الكائنات المستهدفة التي يسلك النمو الذي لا يمكن تمييزه عن السيطرة علي الزراعة الاحاديه بأنها "0" (لا تثبيط) (الشكل 2ا ، ب).
- يسجل الآبار مع الكائن المستهدف الذي يسلك انخفاض النمو بالمقارنة مع السيطرة علي انها "1" (ضعف تثبيط) (الشكل 2ج).
- يسجل الآبار حيث لم ينمو الكائن المستهدف باعتباره "2" (تثبيط قوي) (الشكل 2د).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يمكن استخدام اختبارات تفاعل الثقافة المشتركة لفهم التفاعلات الميكروبية ، وتحديد أنماط الاهتمام ، والكشف عن العزلات الميكروبية مع الانشطه المثيرة للاهتمام. في هذه المقايسات ، يتم اجراء اختبار للكائن الحي علي جانب واحد من 12 لوحه أجار جيدا واحتضانه لمده 7 أيام. وبعد ذلك ، تم رصد كائن حي مستهدف بجانب الكائن الحي الاختباري وتم استزراع الميكروبين لمده 7 أيام قبل التسجيل للحصول علي النمط الظاهري لنمو الكائن الحي المستهدف. وسجلت اختبارات استنادا إلى التحليل البصري للنمو أو تثبيط الكائن المستهدف.
وقد استخدمت هذه الاختبارات في الثقافة المشتركة مؤخرا لتقييم النشاط المثبط لبكتيريا الاكاكتيباكتيريا (الكائنات الحيةالاختبارية ) نحو المكورات العنقودية (الكائنات المستهدفة) المعزولة عن تجويف الأنف البشري (الشكل 2)16. واستخدمت اختبارات الثقافة المشتركة لتحديد أنماط تثبيط محدده بين الاكاكتيباكتيريا (ن = 21) والمكورات العنقودية المعزولة (ن = 39) وأظهرت ان العزلات الاكاكتيبوتيريا أظهرت تباينا في قدرتها علي كبح تجلط التخثر-السلبية مكورات (سلبيات). وتم اختبار ما مجموعه 812 من مجموعات الاقران. [أين برتيكلر], [ كورنيجرثوم] [برونيسسوم ] بقوة يثبط سلبيات (شكل 2[د]), بشكل خاص يقارن إلى أخرى [ كورنيجرثوم ] ان [ول] [ول] سلبيات (شكل 2[ك]) أو تلقي ما من تاثير علي سلبيات ( الشكل 2 (ب) ، ومقارنه بالسيطرة علي الزراعة الاحاديه (الشكل 2ا)16.
وباستخدام الجينوم المقارن ، تم تحديد كتله جينيه اصطناعية للإنتاج الفلكي في الجينوم الجيني الذي كان غائبا في الجينوم الخاص بالبكتريا الأخرى التي تعزل البكتيريا 16. هي التي تنتجها الكائنات المجهرية لكنس الحديد من البيئة17. وقد تاكد إنتاج الفلكية من قبل c. propinquum وتم التعرف علي الفلكية علي انها ديهيدروكسيسينوكاردامين16. وأديت هذه النتيجة إلى فرضيه ان تثبيط السلبيات كان بسبب نضوب الحديد الذي توسط فيه الفلكيون. فيما بعد, ب ينجز [ك-كلتثر] تفاعل اختبارات بين [ ك. بروسينسوم ] و سلبيات علي كلا معياريه و [ايرون-كمل] [بمرحبا] متوسطه, هو كان حددت ان ال [فيتثايشن فير] تثبيط كان [ايرون-ول] (شكل 2[ا]). وتشير هذه النتائج معا إلى ان نضوب الحديد الذي توسطفيه الفلكيون كان مسؤولا عن التثبيط القوي للسلبيات بواسطة الدعامة16.
الشكل 1: صوره لختم التلقيح الإحيائي. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: اختبارات تفاعل الثقافة المشتركة تكشف عن تثبيط السلبيات التي تتم بوساطة Corynebacterium. (ا) الزراعة الاحاديه للسلبيات (الكائنات المستهدفة) الملقحة علي صفيحه الفحص الإحيائي bhi. (باء ، جيم ، دال) الثقافات المشتركة بين سلالات مختلفه من Corynebacterium spp. (كائنات الاختبار ، اليسار) ونفس سلاله من سلبيات (الكائن الحي المستهدف ، الحق) تطعيم علي لوحات الفحص الإحيائي bhi. كل لوحه هي صوره تمثيليه تظهر التفاعلات مع (ب) لا تثبيط (درجه = 0) ، (ج) تثبيط ضعيف (درجه = 1) ، أو (د) تثبيط قوي (درجه = 2). (ه) المقارنة بين التفاعلات بين corynebacterium بسيودوديفثيريتيكوم (المنتجة غير منتجه) أو corynebacterium propinal (منتج الفلكية) مع نفس السلالة من سلبيات علي وسائل الاعلام bhi (bhi) ووسائل الاعلام bhi تستكمل مع 200 μM الخصوبة3 (bhi + الحديد). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
ملف البيانات التكميلية. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
المضادات الحيوية والأيض الثانوية الأخرى التي توسط التفاعلات الميكروبية مفيده للعديد من التطبيقات, بما في ذلك اكتشاف المخدرات. هنا ، يتم تقديم بروتوكول لاختبارات الثقافة المشتركة لتقييم اعداد كبيره من التفاعلات الميكروبية. هذه الاختبارات تفاعل الثقافة المشتركة هي بسيطه, بأسعار معقولة, قابله للتطوير, وعاليه الانتاجيه يعني للتحقيق في العديد من مجموعات الاقران من الكائنات الدقيقة في ترادف. ويتم رصد الكائنات المستهدفة بجوار اختبار الكائنات الحية في بئر من 12 صفيحه بئر باستخدام ختم التلقيح ، ويتم تسجيل تثبيط الكائنات الحية المستهدفة استنادا إلى الفحص البصري للنمط الظاهري للكائن الحي المستهدف. ومعظم المواد المستخدمة في هذه المقايسات متاحه بسهوله من خلال معظم موردي المختبرات أو من خلال الموارد العامة. ولذلك ، يمكن ان تكون مصممه بسهوله اختبارات للعديد من البيئات المختبرية. في المختبر ، وقد نجحت هذه الاختبارات الثقافة المشتركة في التحقيق في التفاعلات من الكائنات الدقيقة المرتبطة بالعديد من المضيفين من مجموعه متنوعة من البيئات.
في حين ان هناك العديد من الفوائد لهذه التقنية ، وهناك أيضا بعض القيود. والقيد الأول الملحوظ هو ان الأنماط المستمدة من اختبارات الثقافة المشتركة يصعب تفسيرها بدون بيانات وصفيه أخرى. في ورقتين الاخيره التي استخدمت هذه الاختبارات الثقافة المشتركة16,18, تم تحديد أنماط تثبيط الفائدة فقط بالاقتران مع البيانات الوصفية الأخرى, مثل الهوية التصنيفية للكائنات الاختبار. ومع ذلك ، حتى بدون بيانات وصفيه مصاحبه ، فان الطرق المبينة في هذه الورقة قابله لتحديد العزلات البكتيرية مع النشاط المثبط تجاه مسببات الامراض المحددة أو الميكروبات المستهدفة ذات الاهميه.
وهناك قيد إضافي هو ان هذه المقايسات ليست متاحه تجاريا ، ويجب ان تكون لوحات الفحص الإحيائي معده يدويا ، والتي يمكن ان تحد من كفاءه الفحص. اعداد لوحه أمر بالغ الاهميه للتجربة ، وينبغي توخي الحذر اثناء اعداد لوحات. إذا كانت الآبار غير متساوية ، ثم ختم التلقيح قد لا تكون قادره علي تطعيم جميع الآبار. ومع ذلك ، فان الآبار الضائعة يمكن تطعيمها ببساطه عن طريق الأنابيب المباشرة لثقافة الكائنات المستهدفة علي الجانب الأيمن من كل بئر غير ملقح. في الواقع ، حتى لو غاب عن بعض الآبار علي كل لوحه من قبل الطوابع ، والاجراء لا يزال أكثر كفاءه من الأنابيب مباشره الجسم المستهدف في كل بئر واحده. بدلا من ذلك ، يمكن للمستخدمين التخلي عن ختم التلقيح وماصه الكائن المستهدف في كل بئر ، ولكن هذه العملية أكثر استهلاكا للوقت ، وخاصه بالمقارنة مع ختم 12 الآبار في وقت واحد.
وأخيرا ، قد تستهلك الكائنات الحية الاختبار العناصر الغذائية المتاحة في البئر اثناء الزراعة الاحاديه قبل تطعيم الكائن المستهدف. وعلي الرغم من ان نضوب المغذيات قد يؤثر علي أنماط التثبيط المرصودة ، الا انه يبدو غير شائع بين التركيبات الزوجية التي تم اختبارها حتى الآن. ومن الجدير بالاشاره ان نضوب الحديد في الآبار بواسطة الدعامة التي تسمح باكتشاف المنافسة التي تتم بوساطة الإنسان من أعضاء الاحياء الانفيه البشرية16.
هذه اختبارات تفاعل الثقافة المشتركة قابله للتخصيص عن طريق تعديل تكوين الوسائط ، التوقيت ، أو حتى بما في ذلك الكائنات الحية المتعددة أو اتحادات الميكروبات ككائن الاختبار. وعلاوة علي ذلك ، يمكن استخدام أنظمه تسجيل النقاط المختلفة اعتمادا علي المستوي المطلوب من التفاصيل المطلوبة لوصف النمط الظاهري للتفاعل. وتشمل الامثله علي جداول التهديف تلك من 0-2 المستخدمة لوصف التفاعلات التنافسية بين البكتيريا المعزولة من تجويف الأنف البشري16 (الشكل 2) ومن 0-3 المستخدمة لتقييم القدرات المضادة للميكروبات من العقديات معزولة من [ميكروبيومس] حشره18. ومع ذلك ، مع جداول أكثر دقه ، والتهديف يصبح من الصعب علي نحو متزايد. وهكذا ، يتم التعرف علي تثبيط بسهوله أكبر باستخدام نظام التهديف ثنائي (علي سبيل المثال ، يتم تعريف 0 علي انه لا تثبيط و 1 كما تثبيط) ، والتي يمكن القضاء علي اي التباس وتوحيد التهديف عبر العديد من الافراد. وعلاوة علي ذلك ، بالاضافه إلى التهديف لأنماط الظاهري تثبيط ، ويمكن أيضا ان سجل هذه المقايسات لأنماط الظاهري الأخرى ، بما في ذلك إنتاج الصباغ ، الرياضية ، أو اي النمط الظاهري الأخرى التي يمكن تقييمها بصريا. وبما ان هذه المقايسات قابله للتطوير بدرجه عاليه مع التحليل القائم علي الفحص البصري للكائن المستهدف ، يمكن إنشاء مجموعات تدريبيه لخوارزميات التعلم الألى لتسهيل تسجيل النمط الظاهري وزيادة إنتاجيه المقايسة.
ومن القوي الرئيسية لهذه الاختبارات الثقافة المشتركة قدرتها علي تسهيل فرز العديد من التوليفات من التفاعلات الزوجية بشكل غير مكلف وبسرعة للكشف عن الانشطه أو أنماط تثبيط الفائدة. وفي وقت لاحق ، يمكن استخدام أساليب أكثر تعقيدا وكثافة (اي التوصيف الجيني ، والخصائص الوراثية ، أو عزل المنتجات الطبيعية وتوصيفها) لتوصيف أعمق للميكروبات وتفاعلات الفائدة التي تحددها اختبارات الثقافة المشتركة. كمثال حديث ، استخدمت هذه الاختبارات تثبيط الثقافة المشتركة لإظهار ان العقديات المشتقة من الحشرات يمكن ان تمنع البكتيريا السالبة للجرام والفطريات أفضل من نظرائهم المستمدة من التربة. سمحت اختبارات تثبيط لتصور سريعة وفعاله من أنماط تثبيط بين 2,003 العزلات العقديات وأديت إلى اكتشاف مضاد للفطريات جديد يسمي cyphomycin ، والتي تنشط ضد مسببات الامراض الفطرية المقاومة للادويه 18-وهكذا ، فان اختبارات تفاعل الثقافة المشتركة هذه هي أداه قويه للبحوث الميكروبيوم ، واكتشاف مضادات الميكروبات ، واكتساب رؤى أعمق في أنماط التفاعلات الميكروبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن أصحاب البلاغ عن اي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر دانيال ماي ، ومارك شيفريت ، ودون هوانج علي القراءة الناقدة للمخطوطة. وقد دعم هذا العمل ، بما في ذلك جهود كاميرون ر. كوري ، من قبل جامعه ويسكونسن ماديسون ، مكتب نائب المستشار للبحوث والدراسات العليا بتمويل من مؤسسه بحوث الخريجين ويسكونسن ، والتمويل المقدم أيضا من قبل المعاهد الوطنية للمراكز الصحية للتميز للبحوث الانتقالية (U19-AI109673). تم دعم ريد م. ستوبندييك من قبل المكتبة الوطنية للتدريب الطب منحه لحساب والمعلوماتية في البيولوجيا والطب برنامج التدريب (NLM 5T15LM007359). ولم يكن للممولين دور في تصميم الدراسة ، وجمع البيانات ، والترجمة الشفوية ، أو القرار بتقديم العمل للنشر.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 μL disposable polystyrene inoculating loops, blue | VWR | 12000-806 | |
| 10 μL disposable polystyrene inoculating loops, yellow | VWR | 12000-810 | |
| 12-well cell culture plate, sterile with lid | Greiner bio-one | 665 180 | |
| 14 mL polystyrene round bottom tube, 17 x 100 mm 2style, nonpyrogenic, sterile | Falcon | 352057 | |
| 2.0 self standing screw cap tubes with caps, sterile | USA scientific | 1420-9710 | |
| 25 mL serological pipet | Cell Treat | 229225B | |
| Agar, bacteriological | VWR | J637 | |
| Brain Heart Infusion Broth | Dot Scientific | DSB11000-5000 | |
| Polycarbonate filament, white, 3 mm diameter | Keene Village Plastics | 12.1-3MM-WH-581.2-1KG-R | |
| School Glue | Elmer's | EPIE304 | |
| Taz 6 3D printer | Lulzbot |
References
- Stubbendieck, R. M., Vargas-Bautista, C., Straight, P. D. Bacterial Communities: Interactions to Scale. Frontiers in Microbiology. 7 (August), 1234 (2016).
- Green, J., Bohannan, B. J. M. Spatial scaling of microbial biodiversity. Trends in Ecology & Evolution. 21 (9), 501-507 (2006).
- Fleming, A. On the Antibacterial Action of Cultures of a Penicillium, with Special Reference to their Use in the Isolation of B. influenzæ. British Journal of Experimental Pathology. 10 (3), 226 (1929).
- Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. Escape from Lethal Bacterial Competition through Coupled Activation of Antibiotic Resistance and a Mobilized Subpopulation. PLoS Genetics. 11 (12), e1005722 (2015).
- Zipperer, A., et al. Human commensals producing a novel antibiotic impair pathogen colonization. Nature. 535 (7613), 511-516 (2016).
- Currie, C. R., Scott, J. A., Summerbell, R. C., Malloch, D. Fungus-growing ants use antibiotic-producing bacteria to control garden parasites. Nature. 398 (6729), 701-704 (1999).
- Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
- Heatley, N. G. A method for the assay of penicillin. The Biochemical Journal. 38 (1), 61-65 (1944).
- Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests; approved standard -11th ed. CLSI document M02-A11. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, Pennsylvania. (2012).
- Adnani, N., et al. Coculture of Marine Invertebrate-Associated Bacteria and Interdisciplinary Technologies Enable Biosynthesis and Discovery of a New Antibiotic, Keyicin. ACS Chemical Biology. 12 (12), 3093-3102 (2017).
- Nichols, D., et al. Use of iChip for high throughput in situ cultivation of "uncultivable" microbial species. Applied and Environmental Microbiology. 76 (8), 2445-2450 (2010).
- Gonzalez, D. J., et al. Microbial competition between Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus monitored by imaging mass spectrometry. Microbiology (Reading, England). 157 (Pt 9), 2485-2492 (2011).
- Hoefler, B. C., et al. Enzymatic resistance to the lipopeptide surfactin as identified through imaging mass spectrometry of bacterial competition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13082-13087 (2012).
- Hoefler, B. C., Straight, P. D. Imaging Mass Spectrometry, Metabolism, and New Views of the Microbial World. Natural Products Analysis. , 349-396 (2014).
- Yang, Y. L., Xu, Y., Straight, P., Dorrestein, P. C. Translating metabolic exchange with imaging mass spectrometry. Nature Chemical Biology. 5 (12), 885-887 (2009).
- Stubbendieck, R. M., et al. Competition among Nasal Bacteria Suggests a Role for Siderophore-Mediated Interactions in Shaping the Human Nasal Microbiota. Applied and Environmental Microbiology. 85 (10), 1-17 (2019).
- Winkelmann, G. Microbial siderophore-mediated transport. Biochemical Society transactions. 30 (4), 691-696 (2002).
- Chevrette, M. G., et al. The antimicrobial potential of Streptomyces from insect microbiomes. Nature Communications. 10 (1), 516 (2019).
