इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य कैंडा albicans सेल आकार और स्तनधारी जठरांत्र संबंधी मार्ग में स्थानीयकरण कल्पना है.
Candida albicans मनुष्य और कई अन्य स्तनधारियों में आंत microbiota का एक कवक घटक है. हालांकि सी albicans सबसे उपनिवेश मेजबान में लक्षण का कारण नहीं है, commensal जलाशय संक्रामक रोग के लिए एक भंडार के रूप में सेवा करता है, और पेट में उच्च कवक titers की उपस्थिति सूजन आंत्र रोग के साथ जुड़ा हुआ है. यहाँ, हम स्थिर जठरांत्र उपनिवेशन के एक माउस मॉडल में सी albicans सेल आकृति विज्ञान और स्थानीयकरण कल्पना करने के लिए एक विधि का वर्णन. उपनिवेशन जानवरों है कि मौखिक एंटीबायोटिक दवाओं के साथ इलाज किया गया है में सी albicans की एक खुराक का उपयोग कर स्थापित किया गया है. आंत के ऊतकों के खंड ों को इस तरह से तय किया जाता है जो चमकदार सामग्री (माइक्रोजीवा और बलगम) के साथ-साथ मेजबान श्लेष्म की वास्तुकला को बरकरार रखता है। अंत में, सिटू संकरीकरण में फ्लोरोसेंट सी albicans और hyphae के लिए दाग के लिए कवक rRNA के खिलाफ जांच का उपयोग किया जाता है। इस प्रोटोकॉल का एक प्रमुख लाभ यह है कि यह सी albicans सेल आकारिकी और जठरांत्र उपनिवेशन के दौरान मेजबान संरचनाओं के साथ अपने स्थानिक सहयोग के एक साथ अवलोकन के लिए अनुमति देता है.
Candida albicans एक कवक commensal के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक अवसरवादी मानव रोगज़नक़ है. इस खमीर एक परिभाषित पर्यावरण आला का अभाव है और इसके बजाय जठरांत्र (जीआई) पथ, त्वचा, और मनुष्यों और अन्य स्तनधारियों1के genitourinary पथ के भीतर प्रचार. जबकि सी albicans पर प्रारंभिक अनुसंधान मुख्य रूप से अपनी उग्र क्षमता पर ध्यान केंद्रित, कई हाल की रिपोर्टों का सुझाव है कि आम आदमी के भीतर जीवों का प्रचार सामान्य स्वास्थ्य में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं, की प्रतिरक्षा विकास सहित मेजबान2,3,4. स्तनधारी आंत के भीतर सी albicans commensalism की जांच की सुविधा के लिए, हम स्थिर जीआई उपनिवेशन के एक माउस मॉडल और situ संकरीकरण में एक फ्लोरोसेंट (फिश) आधारित विधि कवक खमीर कोशिकाओं कल्पना करने के लिए विकसित की है और भीतर hyphae आंत्र लुमेन.
कुछ अपवादों के साथ5, प्रयोगशाला नस्ल चूहों आम तौर पर पाचन तंत्र के कवक उपनिवेशन के लिए प्रतिरोध प्रदर्शन. उपनिवेशन प्रतिरोध को विशिष्ट जीवाणु प्रजातियों द्वारा मध्यस्थता माना जाता है; हालांकि, यह एंटीबायोटिक दवाओं के साथ जानवरों के उपचार से दूर किया जा सकताहै 6,7 या एक रासायनिक परिभाषित आहार है कि संभवतः जीवाणु प्रजातियों संरचना8,9बदल के उपयोग इसी प्रकार, मनुष्यों में, व्यापक स्पेक्ट्रम एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग सी एल्बिकन्स अतिवृद्धि और प्रसार10के साथ जुड़ा हुआ है। हमारे murine उपनिवेशन मॉडल व्यापक स्पेक्ट्रम एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग करता है सी albicans उपनिवेशन प्रतिरक्षा, पारंपरिक रूप से पाला चूहों की स्थापना के लिए. पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन को सी एल्बिकन्स की 108 कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) के साथ गाव से पहले एक सप्ताह के लिए जानवरों के पीने के पानी में प्रदान किया जाता है। जब तक एंटीबायोटिक-संक्रमित पानी जारी रखा जाता है, सी एल्बिकन्स जीआई पथ के माध्यम से प्रचार करेगा, 106के मल titers तक पहुंच जाएगा $ 108 CFUs / कवक उपनिवेशन के उच्च स्तर के बावजूद, जानवरों को स्वस्थ रहते हैं और uninfected नियंत्रण के रूप में एक ही दर पर वजन हासिल. इस मॉडल का सफलतापूर्वक उपयोग कई सी एल्बिकन्स कॉमेन्सलिज्मकारकों 11,12के लिए स्क्रीन और विशेषता के लिए किया गया है .
कवक राज्य के अन्य सदस्यों की तरह, सी albicans विशाल रूपात्मक प्लास्टिक13में सक्षम है. इन विट्रो स्थितियों में, यह कम से कम छह unicellular खमीर सेल प्रकार के बीच संक्रमण के लिए दिखाया गया है, साथ ही साथ multicellular hyphae और pseudohyphae. खमीर-टू-हाइफा संक्रमण इसकी सबसे अच्छी विशेषता उग्रता विशेषताओं में से एक है, और अधिकांश स्तनधारी रोग मॉडल में हाइफे और छद्म हाइफे प्रबल है, साथ ही संक्रमित मानव ऊतकों में भी। Murine पाचन तंत्र के भीतर सी albicans स्थानीयकरण और सेल आकृति विज्ञान निर्धारित करने के लिए, हम निश्चित हिस्टोलॉजिकल वर्गों में खमीर और हाइफे धुंधला करने के लिए एक मछली तकनीक विकसित की है। जांच में फ्लोरोसेंट लेबल डीएनए ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स शामिल होते हैं जो कवक 23एस राइबोसोमल आरएनए (आरआरएनए) को हाइब्रिड करते हैं, जो फंगल कोशिकाद्रव्य भर में वितरित किया जाता है। क्योंकि मेजबान ऊतकों को एक तरीके से तय किया जाता है जो आंत के तीन आयामी वास्तुकला को बरकरार रखता है, जिसमें मेजबान श्लेष्म, पाचन सामग्री, आंत लुमेन के भीतर बैक्टीरियल माइक्रोबायोटा, और बलगम शामिल हैं, यह तकनीक कवक के स्थानीयकरण की अनुमति देती है इन स्थलों के संबंध में कोशिकाओं जब दाग. FISH तकनीक इस तरह के आवधिक एसिड Schiff (पास) या गोमोरी के Methenamine-सिल्वर (जीएमएस), साथ ही व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीफंगल एंटीबॉडी के रूप में, के रूप में इस तरह के आवधिक एसिड Schiff (पास) के रूप में पारंपरिक हिस्टोलॉजिकल दाग के लिए अनुकूल तुलना करता है, क्योंकि इन अभिकर्मकों के लिए विशिष्ट नहीं हैं C. एल्बिकन्स। इसके अलावा, मानक fixatives बलगम परत को हटाने और आंत लुमेन14,15की अन्य सामग्री को बाधित .
इस लेख में, हम उच्च ग्रेड सी albicans चूहा जीआई पथ के उपनिवेशकी स्थापना के लिए विस्तृत निर्देश प्रदान करते हैं, euthanized जानवरों से पाचन तंत्र के विच्छेदन के लिए, ऊतक निर्धारण के लिए एक तरीके से है कि luminal को बरकरार रखता है वास्तुकला, और FISH का उपयोग कर मेजबान ऊतकों के भीतर सी albicans का पता लगाने के लिए. सी albicans के जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती उपभेदों के अलावा, gavage तकनीक अन्य सूक्ष्मजीवों देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। निर्धारण तकनीक किसी भी अध्ययन में पेट की सामग्री के संरक्षण वांछित है के लिए उपयोगी होगा. FISH प्रक्रिया एक दिन के भीतर पूरा किया जा सकता है और कई कवक प्रजातियों कई, अंतर लेबल जांच का उपयोग करके स्थानीयकरण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
यहाँ वर्णित विधि किसी भी सेक्स या तनाव के जीआई ट्रैक्ट में सी एल्बिकन्स खमीर और हाइफे के दृश्य के लिए अनुमति देता है। FISH जांच 23S rRNA, जो कवक कोशिका द्रव्य भर में वितरित किया जाता है संकर. हमारी विधि आंत बैक्टीरिया20visualizing के लिए एक पहले की सूचना प्रोटोकॉल से अनुकूलित किया गया था . क्योंकि C. albicans मेजबान के भीतर अपनी आकृति विज्ञान में परिवर्तन, विधि कवक सेल आकार के रूप में के रूप में अच्छी तरह से स्थानीयकरण की निगरानी के लिए उपयोगी है. उदाहरण के लिए, हमने इस विधि का उपयोग इस परिकल्पना को साबित करने के लिए किया है कि यीस्ट पाचन तंत्र में हावी है, और विवो में और कुछ “फिलामेंटेशन-दोषपूर्ण” म्यूटेंट12के विट्रो फीनोटाइप के बीच विसंगतियों को उजागर करने के लिए।
कई माउस मॉडल सी albicans commensal उपनिवेशन के लिए मौजूद हैं. प्रयोगशाला चूहों और मनुष्यों के microbiota अलग हैं और, चूहों में, एंटीबायोटिक दवाओं या एक विशेष आहार के उपयोग के लिए स्थिर उपनिवेशन स्थापित करने की आवश्यकता है. एंटीबायोटिक दवाओं के साथ उपचार भी मनुष्य के सी एल्बिकन्स उपनिवेशन को बढ़ाता है और प्रसारित रोग10के लिए एक प्रमुख जोखिम कारक है . इस अध्ययन में इस्तेमाल एंटीबायोटिक दवाओं अपेक्षाकृत सस्ती हैं और बैक्टीरियल माइक्रोबायोटा में विश्वसनीय कम हो जाती है। ध्यान दें कि एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग विरोधी जीवाणु प्रजातियों के बोझ को कम करने के लिए किया जाता है, जानवरों से सभी बैक्टीरिया को खत्म करने के लिए नहीं। यदि शोधकर्ताओं ने बैक्टीरिया की अनुपस्थिति में सी albicans-मेजबान बातचीत का अध्ययन करना चाहते हैं या एंटीबायोटिक दवाओं या एक विशेष आहार के उपयोग से बचने के लिए, रोगाणु मुक्त जानवरों पारंपरिक रूप से पाले जानवरों के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है; हालांकि, gnotobiotic चूहों कुछ प्रतिरक्षा और शारीरिक असामान्यताओं का प्रदर्शन और इसलिए सभी प्रयोजनों के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है.
कई कदम सफल FISH धुंधला के लिए महत्वपूर्ण हैं: जीआई ऊतकों की संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखने के लिए अनुशंसित निर्धारण विधि महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से आंत लुमेन की नाजुक सामग्री, जैसे बलगम परत और तीन आयामी कवक और बैक्टीरिया का संगठन16| कृपया ध्यान दें कि कई आमतौर पर इस्तेमाल किया निर्धारण समाधान है कि पानी होते हैं अत्यधिक luminal वास्तुकला के लिए हानिकारक हैं. इस प्रोटोकॉल में अनुशंसित पोस्ट-फिक्सेशन washes के लिए फिक्सेटिव और समाधान में पानी नहीं होता है, और पानी के साथ संदूषण से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। एक अन्य महत्वपूर्ण कदम संकरीकरण कदम है, जहां हाइब्रिडाइजेशन ओवन में स्लाइड्स के ऊष्मायन के दौरान हाइब्रिडाइजेशन समाधान के वाष्पीकरण से बचना महत्वपूर्ण है। हम इस समस्या से बचने के लिए स्लाइड को एक वाटरटाइट कंटेनर में रखने का सुझाव देते हैं। वैकल्पिक रूप से, एक ऐसे मूल रूप से microarrays के संकरीकरण के लिए इस्तेमाल किया उन लोगों के रूप में watertight संकरीकरण कक्षों का उपयोग कर सकते हैं.
इस प्रोटोकॉल में सी एल्बिकन्स-विशिष्ट फिश जांच का वर्णन किया गया है. हालांकि, क्योंकि कई प्रयोगशाला reared चूहों सी albicans या उनके प्राकृतिक आंत microbiota के भाग के रूप में अन्य कवक शामिल नहीं है, एक panfungal जांच विशेष रूप से प्रयोगात्मक उपनिवेशित जानवरों में सी albicans दाग हो सकता है. एक पैनफंगल जांच का प्रतिस्थापन इसकी बेहतर संकरण विशेषताओं और उच्च संकेत-से-शोर अनुपात के कारण वांछनीय हो सकता है। यदि पैनफंगल जांच का उपयोग सी एल्बिकन्सके लिए एक छद्म विशिष्ट जांच के रूप में किया जाता है , तो यह असंक्रमित जानवरों में दाग की कमी का दस्तावेजीकरण करना महत्वपूर्ण है (यानी , एंटीबायोटिक दवाओं के साथ इलाज किया जाता है लेकिन सी एल्बिकननहीं ). एक noncolonized नियंत्रण जानवर के दाग भी पृष्ठभूमि धुंधला है कि खाद्य कण के लिए FISH जांच के पालन से परिणाम हो सकता है का आकलन करने के लिए उपयोगी है. कुल मिलाकर, FISH जांच का उपयोग दाग कवक के अधिकांश अन्य तरीकों पर बढ़ाया विशिष्टता प्रदान करता है, ऐसे Calcofluor सफेद के रूप में (जो चिटिन दाग, एक सेल दीवार घटक है कि सेल प्रकार के बीच भिन्न हो सकते हैं), जीएमएस, या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीफंगल एंटीबॉडी. इसके अलावा, FISH धुंधला प्रजातियों-विशिष्ट RRNAs के लिए अंतर लेबल FISH जांच का उपयोग कर कई जीवों के costaining के लिए अनुमति देता है.
इस तकनीक का एक चेतावनी यह है कि कुछ सी albicans खमीर सेल प्रकार FISH द्वारा बहुत समान दिखाई देते हैं (उदाहरण के लिए, अपारदर्शी और GUT सेल प्रकार). इन सेल प्रकारों के बीच भेद करने के लिए, सेल प्रकार-विशिष्ट कवक MRNAs के लिए हाइब्रिडाइजेशन जांच विकसित करने के लिए उपयोगी होगा। फिर भी, अपने वर्तमान रूप में, FISH तकनीक पहले से ही दोनों स्थितियों12के तहत मूल्यांकन सी albicans उत्परिवर्ती के विट्रो व्यवहार में विवो और इन विट्रो व्यवहार के बीच आश्चर्य की बात विसंगतियों का पता चला है, में जटिल बातचीत का संकेत प्राकृतिक commensal वातावरण है कि पर्याप्त रूप से इन विट्रो परख में मौजूदा द्वारा नकल नहीं कर रहे हैं. अतिरिक्त जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती मेजबान में विभिन्न सी albicans दाग के आगे के अध्ययन कवक मेजबान बातचीत में अतिरिक्त अंतर्दृष्टि उपज की संभावना है. विशेष रूप से, यह सूजन आंत्र रोग के मॉडल में सी albicans प्रोफ़ाइल करने के लिए शिक्षाप्रद हो जाएगा, जो मनुष्यों में सी albicans के उच्च titers के साथ जुड़ा हुआ है21, और सी albicans अतिवृद्धि और रोग के अन्य मॉडल. FISH तकनीक भी विशिष्ट मेजबान कोशिकाओं दाग करने के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के साथ जोड़ा जा सकता है। कुल मिलाकर, यहाँ प्रस्तुत विधि स्तनधारी सैनिक पथ के भीतर सी albicans स्थानीयकरण और आकृति विज्ञान निर्धारित करने के लिए एक काफी जल्दी और विश्वसनीय साधन प्रदान करता है.
The authors have nothing to disclose.
लेखकों के लिए कैरोलिना Tropini, Katharine एनजी, जस्टिन Sonnenburg, और केसी Huang FISH तकनीक के विकास में मार्गदर्शन के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा. टेरेसा O’Meara पांडुलिपि पर उपयोगी टिप्पणी प्रदान की है, और मरियम लेवी फोटोग्राफी के साथ सहायता प्रदान की. यह काम NIH अनुदान R01AI108992, R01DK113788, और संक्रामक रोग के रोगजनन में एक Burroughs स्वागत पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था.
1 mL syringe | BD | 309659 | can be substituted from any vendor |
BHI blood agar | can be substituted from any vendor | ||
C. albicans FISH probe | IDT DNA Technologies | custom order | |
chamber for hybridization incubation | watertight chamber meant to reduce evaporation | ||
chloroform | Sigma | C2432 | >=99.5% |
DAPI | Roche | 10236276001 | can be substituted from any vendor |
delicate task wiper tissues | Kimberley-Clark | 34256CT | Kimwipes |
D-glucose | Sigma | G7021-5KG | can be substituted from any vendor |
ethanol | Sigma | E7023 | molecular biology grade |
feeding needles | Cadence, Inc. | 7910 | metal; 20 X1-1/2" W/2-1/4; can be autoclaved to sterilize |
FITC-UEA-1 | Sigma | L9006-1MG | other fluorophores available |
FITC-WGA | Sigma | L4895-2MG | other fluorophores available |
Foam pads | Fisher | 22038221 | Order foam pads that will fit within cassettes |
formamide | Sigma | 47671 | molecular biology grade |
glacial acetic acid | Macron Fine Chemicals | MK881746 | ACS reagent, >=99.5% |
glass Coplin jar | Fisher | 08-815 | hold up to 10 slides back to back |
Histology cassettes | Simport | M512 | Deep cassettes so cecum is not squished |
hybridization coverslips | Sigma | GBL712222 | RNase-free |
hybridization oven | can be substituted from any vendor | ||
LB | can be substituted from any vendor | ||
Lee's media | prepared as described in Lee et al. 1975 | ||
methanol | Sigma | 179337 | ACS reagent, >=99.8% |
mice | Charles River Laboratories | 028 | adult BALB/c; 18-21 grams (8-10 weeks) |
paraformaldehyde | Fisher | 50-980-487 | 16% solution |
parrafin wax | Sigma | P3558-1KG | Paraplast for tissue embedding |
PBS, pH 7.4 | UCSF Cell Culture Facility Media Production Unit | CCFAL003 | calcium, magnesium-free; can be substituted from any vendor |
penicillin G | Sigma | PENNA-100MU | |
Sabouraud dextrose agar | can be substituted from any vendor | ||
saline | Baxter | 2F7123 | sterile, can be substituted from any vendor |
sodium chloride (NaCl) | Sigma | S3014 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
streptomycin | Sigma | S9137-100G | |
super PAP pen | Life Technologies | 8899 | can be substituted from any vendor |
Tris-HCl | Sigma | T3253 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | does not contain DAPI |
xylenes | Sigma | 214736 | reagent grade |
YEPD | can be substituted from any vendor |