Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

التصور من المبيضات الbicans في الجهاز الهضمي Murine باستخدام التهجين في الموقع الفلورسنت

Published: November 5, 2019 doi: 10.3791/60283
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Microbiology and Immunology, University of California, San Francisco, 2Department of Medicine, Division of Infectious Disease, University of California, San Francisco

Summary

الغرض من هذا البروتوكول هو تصور شكل خليه المبيضات الbicans والتعريب في الجهاز الهضمي الثدييات.

Abstract

المبيضات الbicans هو عنصر فطري من الجراثيم الأمعاء في البشر والعديد من الثدييات الأخرى. علي الرغم من ان c. مبيض لا يسبب اعراضا في معظم المضيفين المستعمرين ، والخزان المعلق لا يعمل كمستودع للامراض المعدية ، ويرتبط وجود الطفيليات الفطرية العالية في الأمعاء مع مرض التهاب الأمعاء. هنا ، ونحن وصف طريقه لتصور c. مبيض الشكل الخلية والتعريب في نموذج الماوس من الاستعمار المعدي المعوي مستقره. يتم تاسيس الاستعمار باستخدام جرعه واحده من c. مبيض في الكائنات التي عولجت مع المضادات الحيوية عن طريق الفم. يتم إصلاح شرائح من انسجه الأمعاء بطريقه تحافظ علي الهندسة المعمارية لمحتويات الاناره (الكائنات الحية المجهرية والمخاط) وكذلك الغشاء المخاطي المضيف. وأخيرا ، يتم تنفيذ التهجين الفلورسنت في الموقع باستخدام مجسات ضد rrna الفطرية إلى وصمه عار ل c. مبيض و هيبهاي. ومن المزايا الرئيسية لهذا البروتوكول انه يسمح بالمراقبة المتزامنة لتشكل خليه c. مبيض وارتباطها المكاني مع الهياكل المضيفة اثناء الاستعمار الهضمي.

Introduction

المبيضات الbicans هو المعلق الفطرية ، فضلا عن الممرض البشري الانتهازي. هذه الخميرة تفتقر إلى المكانة البيئية المحددة وتنتشر بدلا من ذلك داخل الجهاز الهضمي (GI) المسالك ، والجلد ، والمسالك البولية التناسلية للبشر وغيرها من الثدييات1. في حين ركزت البحوث المبكرة علي c. مبيض في المقام الأول علي إمكاناتها ضراوة, وتشير العديد من التقارير الاخيره ان المعلقين نشر الكائنات داخل الأمعاء قد تلعب أدوارا هامه في الصحة الطبيعية, بما في ذلك التنمية المناعية لل المضيف2،3،4. لتسهيل التحقيقات في c. مبيض المعلقة داخل الأمعاء الثدييات ، وضعنا نموذج الماوس من الاستعمار الهضمي مستقره والتهجين في الموقع (الأسماك) القائم علي طريقه لتصور خلايا الخميرة الفطرية و هيبوهاي داخل التجويف المعوي.

مع بعض الاستثناءات5، الفئران المختبرة التي ولدت عاده ما تظهر مقاومه للاستعمار الفطرية في الجهاز الهضمي. ويعتقد ان المقاومة الاستعمار ان توسط من قبل الأنواع البكتيرية محدده; ومع ذلك ، يمكن التغلب علي هذا عن طريق العلاج من الحيوانية مع المضادات الحيوية6،7 أو استخدام نظامغذائي محدد كيميائيا التي يفترض ان يغير تكوين الأنواعالبكتيرية 8 ،9. المثل ، في البشر ، ارتبط استخدام المضادات الحيوية واسعه الطيف مع الإفراط في c. مبيض ونشر10. لدينا نموذج الاستعمار murine يستخدم المضادات الحيوية واسعه الطيف لإنشاء الاستعمار c. مبيض من الفئران المناعية ، تربي تقليديا. يتم توفير البنسلين والسستربتومايسين في مياه الشرب للحيوانات لمده أسبوع واحد قبل أنبوبي مع 108 مستعمره تشكيل وحدات (cfus) من c. albicans. طالما استمرت المياه التي غرست المضادات الحيوية, c. مبيض سوف تنتشر من خلال الجهاز الهضمي, الوصول إلى البراز من 106− 108 cfus/g. وعلي الرغم من ارتفاع مستوي الاستعمار الفطري ، تبقي الماشية صحية وتكتسب الوزن بنفس معدل التحكم غير المصاب. وقد استخدم هذا النموذج بنجاح لفحص وتوصيف العوامل المعلقة ج. مبيض المتعددة11,12.

مثل الأعضاء الآخرين في المملكة الفطرية ، c. مبيض قادر علي اللدونة المورفولوجية هائله13. تحت الظروف المختبرية, وقد ثبت ان الانتقال بين ما لا يقل عن سته أنواع الخلايا الخميرة أحاديه الخلية, فضلا عن هيبوهاي متعدد الخلايا و سودوهيهايهاي. الانتقال من الخميرة إلى حيفا هي واحده من سماتها الأكثر تميزا في الضراوة ، وتسود في معظم نماذج امراض الثدييات ، وكذلك في الانسجه البشرية المصابة. لتحديد التعريب c. مبيض والمورفولوجية الخلية داخل الجهاز الهضمي murine ، وضعنا تقنيه الأسماك لتلطيخ الخمائر و هيبوهاي في الأقسام النسيجية الثابتة. التحقيقات تتكون من فلوريسسينتلي المسمية الحمض النووي قله كريات الديك التي التهجين إلى الفطرية 23S ريبوسومال RNA (rRNA) ، والتي يتم توزيعها في جميع انحاء سيتوتوبلاسما الفطرية. لان يتم إصلاح الانسجه المضيف بطريقه تحافظ علي الهندسة المعمارية ثلاثية الابعاد من الأمعاء ، بما في ذلك الغشاء المخاطي المضيف ، والمواد الهضمية ، والجراثيم الجرثومية ، والمخاط داخل تجويف الأمعاء ، وهذه التقنية تسمح توطين الفطرية الخلايا فيما يتعلق بهذه المعالم عندما ملطخه. تقنيه الأسماك يقارن بشكل إيجابي إلى البقع النسيجية التقليدية للفطريات ، مثل الدوري حمض شيف (PAS) أو جوموري ميثينامين الفضة (GMS) ، فضلا عن الأجسام المضادة للفطريات المتاحة تجاريا ، لان هذه الكواشف ليست محدده C. albicans. وعلاوة علي ذلك ، فان المثبتات القياسية تزيل طبقه المخاط وتعطل المحتويات الأخرى لتجويف الأمعاء14،15.

في هذه المقالة ، ونحن نقدم تعليمات مفصله لإنشاء عاليه الجودة c. مبيض الاستعمار من الجهاز الهضمي الماوس ، لتشريح الجهاز الهضمي من الرحيم الحيوانية ، لتثبيت الانسجه بطريقه تحافظ علي الاناره الهندسة المعمارية ، والكشف عن c. مبيض داخل الانسجه المضيفة باستخدام الأسماك. بالاضافه إلى أنواع البرية وسلالات متحولة من c. albicans ، يمكن استخدام تقنيه أنبوبي لتسليم الكائنات المجهرية الأخرى. تقنيه التثبيت ستكون مفيده لأي دراسة فيها الحفاظ علي محتويات الأمعاء هو المطلوب. ويمكن الانتهاء من اجراء الأسماك في غضون يوم واحد ، ويمكن استخدامها لتوطين الأنواع الفطرية متعددة باستخدام متعددة ، والمسمي بشكل مختلف التحقيقات.

Protocol

وقد تمت الموافقة علي الخطوات المبينة أدناه من قبل لجنه الرعاية الحيوانية والاستخدام المؤسسية UCSF (IACUC).

1. استعمار الاجهزه الهضمية من الفئران مع c. مبيض باستخدام الفم gavage

  1. توفير السكن ل 18 − 21 غرام من الذكور أو الإناث الفئران (8 − 10 أسابيع القديمة) كما وافق عليه IACUC المحلية. استخدم الطعام المعقم والماء بدءا من اليوم الأول.
    ملاحظه: استخدام الأقفاص المعقمة ، والفراش ، والغذاء ، والماء يقلل من خطر التلوث مع البكتيريا البيئية المقاومة للمضادات الحيوية التي يمكن ان تحل محل المحتملين c. مبيض من الأمعاء. وعلاوة علي ذلك ، واعتمادا علي السؤال التجريبي ، ينبغي النظر في السكن الفردي للحيوانات لان الفئران هي coنبوءه سيتم تقاسم محتويات الأمعاء بين الكائنات المسكنة.
  2. في اليوم التالي ، واستبدال مياه الشرب الاوتوكلاف مع المياه المعقمة التي تحتوي علي 5 ٪ الجلوكوز ، 1,500 U/mL البنسلين G ، و 2 ملغ/مل ستربتومايسين.
  3. للراحة ، واعداد 200x المضادات الحيوية الأسهم الحلول (الجدول 1) مقدما ، تصفيه تعقيم ، وتجميد عند-20 درجه مئوية.
  4. الحفاظ علي الماشية علي المضادات الحيوية لمده أسبوع واحد.
    1. في الأيام 3 و 6 بعد بدء المضادات الحيوية ، وتقييم البراز كل الحيوانية للتلوث مع البكتيريا الهوائية المقاومة للمضادات الحيوية. عقد الحيوانية مع يد واحده ، ووضع أنبوب الطارد المجهري غير المغطية بالقرب من فتحه الشرج وجمع ما لا يقل عن واحد بيليه البراز.
    2. أعاده تعليق كل بيليه البراز في 1 مل من الماء المعقم ولوحه 100 μl علي مرق لوريا (LB) ، الخميرة استخراج ببتون سكر العنب (yepd) ، أو ضخ قلب الدماغ (bhi) بالاضافه إلى لوحات أجار الدم. احتضان لوحات بين عشيه وضحيها في حاضنه القياسية (وليس لاهوائية) في 37 درجه مئوية وتقييم لنمو البكتيريا.
      ملاحظه: وينبغي ان تظهر لوحات النمو الحد الأدنى (0 − 20 مستعمرات). إذا تم انتشال > 20 مستعمره من البكتيريا من الكائنات المعالجة بالبنسلين والسستربتومايسين ، فمن غير المرجح ان يتم إنشاء الاستعمار عالي المستوي مع c. مبيض ويجب ان يتم إحباط التجربة.
  5. ثلاثه أيام قبل gavage ، خط c. مبيض من مخزونات الجلسرين المجمدة إلى yepd + 2 ٪ لوحات أجار واحتضان في 30 درجه مئوية لمده 2 أيام.
  6. يوم واحد قبل gavage ، تطعيم مستعمره واحده من كل سلاله c. مبيض ليتم اختبارها في 5 مل من yepd السائل. احتضان في 30 درجه مئوية بين عشيه وضحيها مع الاهتزاز.
  7. الصباح من gavage ، تمييع الثقافة المشبعة من c. مبيض إلى كثافة بصريه في 600 نانومتر (OD600) من 0.1 في 100 مل من yepd يسخن إلى 30 درجه مئوية. يهز في شاكر المداري في 200 لفه في الدقيقة في 30 درجه مئوية لمده تتراوح بين 4 h و 5 ساعة حتى OD600 يصل إلى 1 (متوسط النمو سجل).
  8. نقل كل ثقافة مل 100 إلى 2 50 mL أنابيب مخروطيه وأجهزه الطرد المركزي في 3,000 x g لمده 5 دقائق في درجه حرارة الغرفة (RT).
    ملاحظه: c. مبيض ينشر ببطء نسبيا في RT. وإذا ما تم تكييف هذا البروتوكول بالنسبة للأنواع الأخرى ، فقد يلزم إبقاء التطعيم علي الجليد للحيلولة دون استمرار النمو.
  9. تجاهل supernatant ، أعاده تعليق الخلايا التي تغلف في 20 مل من المحلول الملحي المعقم لكل 50 مل من الثقافة ، وتجمع الكريات مكرره أعاده تعليق في أنابيب مخروطيه واحده. الطرد المركزي في 3,000 x g لمده 5 دقائق.
  10. تجاهل ماده طافي وأعاده التعليق في 20 مل من المحلول الملحي المعقم. دوامه لفتره وجيزة وأزاله 20 μL ل OD600 القياس. تمييع 1:50 في المحلول الملحي المعقم العادي. الطرد المركزي المتبقية الخلايا المعلقة في 3,000 x g لمده 5 دقائق.
  11. تجاهل الخارقة. لحجم العين من 1 × 108 كفو ، أعاده التعليق علي الخلايا المغلفة إلى ما يقرب من 5 × 108 cfus/mL في المالحة العادية المعقمة علي أساس التركيز المقدر تحديد من OD600 القياس.
    ملاحظه: عاده ، يتوافق OD600 من 1 إلى ~ 1 × 107 خلايا الخميرة/مل. قد تختلف هذه القيمة بمقياس الطيف الطيفي ويجب التحقق منها. إذا كان المطلوب تغيير في التركيز للعدوى مع الكائنات المجهرية مختلفه ، خطه لحجم الداخل ≤ 10 μL/g الماوس لتقليل الانزعاج للحيوان.
  12. التحقق من تركيز الاجنه عن طريق عد 1:1000 التخفيف مع مقياس الكريات الدموية. ضبط حجم الخلايا لتكون gavaged استنادا إلى تركيز تحديد باستخدام الكريات الدموية.
  13. باستخدام ابره التغذية الحيوانية (الشكل 1ا) ، أنبوبي كل الحيوانية مع الحجم المحسوب للعين معينه. راجع الخطوات 1.13.1 − 1.13.8 لاجراء الأنبوبي.
    ملاحظه:     يجب الحصول علي التدريب للحصول علي أنبوبي من ممارس من ذوي الخبرة ، وينبغي ان يتقن الاجراء مقدما. الاجراء الناجح للحيوان الواحد عاده لا يستغرق أكثر من دقيقه واحده.
    1. إرفاق ابره التغذية الحيوانية معقمه لحقنه 1 مل وملء حقنه مع حجم واحد أنبوبي ، وأزاله اي فقاعات الهواء لتجنب جرعه غير دقيقه. يوضع علي سطح معقم.
    2. تامين الحيوانية لل gavage. عقد الحيوانية في قاعده الذيل مع اليد المهيمنة والشريحة غير المهيمنة اليد حتى يعود الحيوانية إلى الجلد فضفاضة فقط وراء الاذنين.
    3. باستخدام السبابة والإبهام من اليد غير المهيمنة ، وجمع الجلد فضفاضة معا باحكام. هذا هو "الوازع". تلتقط الحيوانية من قبل الوازع وحلقه اصبع صغير من نفس (غير مسيطر) اليد حول الذيل لشل الحيوانية ضد كف اليد. تمديد بلطف راس الحيوانية بحيث راسه والجسم (التالي الرقبة والمريء) هي في خط مستقيم.
      ملاحظه: وقد يؤدي محاولة القيام بذلك في الوقت الذي يتم فيه ثني جسم الحيواني أو التواءه إلى مضاعفات مثل انثقاب المريء وموت الحيوانية.
    4. التقاط الحقنه مع اليد المهيمنة وعقد عمودي علي الحيوانية ، مع الابره المنحنية مشيرا إلى أسفل (الشكل 1ب). باستخدام الكره من الابره ، وربط بلطف داخل الزاوية من الفم ، وتقدم بلطف الابره علي طول الجانب من الفم إلى الجزء الخلفي من الحلق ، وأخيرا نقل الابره إلى المركز.
      ملاحظه: إدخال الابره علي طول المسار الجانبي يساعد علي تجنب المقاومة من أسنان الحيوانية واللسان.
    5. مره واحده في الكره من الابره في الجزء الخلفي من الحلق ، أماله الابره حتى انه مواز مع خط الجسم الحيوانية (الشكل 1ج).
      ملاحظه: عند هذه النقطة ، فان الحيوانية تظهر منعكس هفوة. هذا هو علامة جيده تشير إلى ان يتم وضع الابره بشكل صحيح ، والحركة الإسكات يساعد علي توجيه الابره أسفل المريء. إذا لم يكن هناك منعكس الكمامة ، قد تكون الابره في القصبة الهوائية بدلا من المريء. سحب برفق الابره والعودة إلى الخطوة 1.13.1.
    6. السماح للحيوان لابتلاع العجان حتى بضعة ملليمترات لا تزال مرئية (الشكل 1د). تقدم الابره بسلاسة.
      ملاحظه: إذا كانت الابره لا تقدم ، وتجنب استخدام القوه ، والتي يمكن ان تضر المريء. في بعض الأحيان المضي قدما في النصف الأخير من السنتيمتر سوف تتطلب هفوة كبيره جدا من الحيوانية. إذا كان يبدو ان الابره عالقه ، وسحب ببطء وحاول مره أخرى من الخطوة 1.13.4.
    7. اختبار ان الكره من ابره في المكان الصحيح (المعدة) عن طريق النهوض بلطف الغطاس. إذا لم يكن هناك مقاومه ، والاستمرار في تقديم البويضة. بمجرد ان تدار البويضة ، وسحب ببطء الابره.
    8. استبدال الحيوانية في قفصها والاستمرار في مراقبه الحيوانية لمده 5 − 10 دقيقه لعلامات التنفس الكادح أو الكرب. تحقق من ان الحيوانية تستانف النشاط العادي بعد فتره وجيزة من غاجي.
    9. إذا كان سيتم استخدام نفس العينة مع الحيوانية القادمة ، وتنظيف الابره مع مسح الكحول. العودة إلى الخطوة 1.13.1. إذا كان سيتم استخدام الحقن المختلفة ، واستخدام ابره جديده والعودة إلى الخطوة 1.13.1.
      ملاحظه: من المهم لفحص الماشية في اليوم بعد gavage. الحيوانية تظهر علامات الاستغاثة (علي سبيل المثال ، الوضع الأحدب ، التنفس الكادح) يجب ان تكون انسانيه رحيم ، لأنها قد عانت من تمزق المريء ، والاضرار التي لحقت الرئتين ، أو أصابه داخلية أخرى من الذي من غير المحتمل الانتعاش.
  14. بعد أنبوبي من الحيوانية ، والمخففات لوحه من التطعيم للتحقق من الجرعة.
    1. اعداد الموسعات التسلسلية 10 اضعاف تصل إلى 1:105. لوحه واحده حجم أنبوبي من 1:105 التخفيف علي لوحه 100 مم من أجار سكر العنب sabouraud.
    2. احتضان لوحه لمده 2 أيام في 30 درجه مئوية. الكونت CFUs لتاكيد جرعه البويضة.

2. اعداد الانسجه المعدية المعوية للانسجه

ملاحظه: هذا القسم من البروتوكول مقتبس من يوهانسون وهانسون16.

  1. اعداد 500 مل من محلول ميثاكارن (60 ٪ الميثانول ، 30 ٪ كلوروفورم ، 10 ٪ حمض الخليك الجليدية) في جره كبيره من البلاستيك غطاء المسمار لكل 2 الحيوانية تشريحها.
    تحذير: الميثانول والكلوروفورم ضاران إذا استنشقا وينبغي التلاعب به في غطاء كيميائي. حمض الخليك الجليدية يمكن ان تكون قابله للتاكل وينبغي التعامل معها مع معدات الحماية الشخصية المناسبة. وينبغي التخلص من الميثانول ، وكلوروفورم ، وحمض الخليك الجليدي كنفايات خطره.
  2. في نقطه النهاية التجريبية ، موت ببطء الحيوانية بشكل انساني وفقا لبروتوكول وافق عليه IACUC المحلية.
    ملاحظه: في المعاملات المضادة للمضادات الحيوية ، والاستعمار c. مبيض يتراوح عاده من ~ 10 cfus/g في اليوم 5 تصل إلى ~ 5 × 107 cfus /g في اليوم 25.
  3. تعقيم أدوات تشريح مع 10 ٪ التبييض وشطف مع 70 ٪ الايثانول.
  4. تامين كل الحيوانية إلى سطح التشريح ، مع مواجهه الجانب البطني حتى. استخدام الابر 30 G لتامين الأطراف إلى سطح التشريح (الشكل 2ا). رش الحيوانية مع 70 ٪ الايثانول لتنظيف الفراء وتقليل التصاق إلى الاداات.
  5. باستخدام ملقط غير حاد ، قرصه جزء من جلد البطن مع اليد غير المهيمنة. باستخدام مقص مع اليد المهيمنة ، شق الجلد واللفافة الكامنة بالقرب من قاعده الحوض. توسيع الشق في شكل U علي طول كل جانب من التجويف البريتوني وتصل إلى القفص الصدري. ارفع الجلد بعيدا عن الطريق.
  6. باستخدام قلم رصاص ، وأشرطه الانسجه قبل التسمية لشرائح المعهد الهضمي ليتم تقييمها. علي سبيل المثال ، بالنسبة لكل الحيوانية ، تسميه أشرطه منفصلة ك "المعدة" ، "الأمعاء الصغيرة القريبة" ، "الأمعاء الصغيرة المتوسطة" ، "الأمعاء الصغيرة البعيدة" ، "الأعور" ، و "الأمعاء الغليظة". وضع وساده رغوة علي الجزء السفلي من كل كاسيت (الشكل 2ا).
    ملاحظه: يبين الشكل 2باء الأجزاء المقترحة لوضعها في الكاسيت.
  7. باستخدام ملقط غير المنتهية ، واستخراج بلطف الأعور من التجويف البريتوني. استخدام مقص لقطع الاتصالات بين الأعور والأمعاء الصغيرة والكبيرة.
    ملاحظه: نسيج cecal حساس جدا وسهل التمزق. انتبه عند التلاعب.
  8. وضع الأعور بأكمله في كاسيت الانسجه بحيث يكون غير الملتوية ويضع شقه (الشكل 2ج). ضع وساده رغوة ثانيه في الأعلى واغلق الكاسيت. وضع الكاسيت في جره غطاء المسمار التي تحتوي علي methacarn.
  9. المكوس قسم من الأمعاء الغليظة التي تحتوي علي 1 − 2 الكريات البراز ، مع طول اقل من الكاسيت.
  10. وضع القسم الانسجه في الكاسيت ، والحفاظ علي الانسجه المسطحة وغير الملتوية. تراكب مع وساده رغوة الثانية وإغلاق الكاسيت. ضع الكاسيت في الميثاكارن.
  11. لكل مقطع من الأمعاء الصغيرة ليتم أخذ عينات ، والمكوس قطعه 1 − 2 سم التي تحتوي علي بعض المواد الهضمية.
  12. وضع الجزء في شريط الانسجه ، والحفاظ علي الانسجه المسطحة وغير الملتوية. تراكب مع وساده رغوة الثانية وإغلاق الكاسيت. ضع الكاسيت في الميثاكارن.
  13. للمعدة ، يقطع الاتصالات إلى المريء والأمعاء الصغيرة. وضع في كاسيت ، والحفاظ علي الانسجه المسطحة وغير الملتوية. تراكب مع وساده رغوة الثانية وإغلاق الكاسيت. ضع الكاسيت في الميثاكارن.
  14. اترك الكاسيت في محلول ميثاكارن في RT لمده 3 ساعات علي الأقل واقل من أسبوعين.
    ملاحظه: هناك العديد من النقاط التي يمكن خلالها نقل قطاعات الجهاز الهضمي الثابتة إلى خدمه الانسجه التجارية. هذه الانسجه يمكن ان يكون من الصعب القسم دون تعطيل محتويات الاناره ، سيتم الحصول علي النتائج المثلي من قبل فني من ذوي الخبرة. إذا كانت الخدمة التجارية علي استعداد لأداء يغسل قبل تضمين الانسجه في البارافين ، يمكن إرسال أشرطه الكاسيت في هذه المرحلة مع تعليمات للخطوة 2.16.
  15. تبدا ذوبان ما يكفي من شمع البارافين لتغطيه جميع الاشرطه الانسجه في كوب كبير في فرن مسخن 70 درجه مئوية التهجين.
  16. بعد التثبيت ، وأزاله منصات رغوة وأعاده كل قسم الانسجه سليمه مره أخرى في كاسيت لها. غسل الانسجه مع الحلول التالية في RT مع الاهتزاز: مرتين لمده 35 دقيقه في 100 ٪ الميثانول ، مرتين لمده 25 دقيقه في الايثانول 100 ٪ ، مرتين لمده 20 دقيقه في اكسيلين.
    تحذير: اكسيلين هو القابلة للاشتعال ، والسامة ، ويمكن ان يسبب ضررا إذا استنشقت. استخدمه في غطاء كيميائي مع الحماية المناسبة. التخلص من اكسيلين عن طريق إجراءات النفايات الخطرة.
  17. بات الشرائط الجافة علي منشفه ورقيه ومكان في شمع البارافين المذاب لمده 2 ساعة في 70 درجه مئوية في فرن التهجين. تاكد من ان يتم تعبئة الكاسيت مع البارافين ولا تبقي فقاعات.
    ملاحظه: هذه الخطوة تسمح الشمع للتسلل الجزء GI وتحقيق الاستقرار في الانسجه والمحتويات.
  18. أزاله الكاسيت من الشمع ، والسماح لل الشمع الزائد لاستنزاف ، وتخزين في RT حتى يتم تضمينها في كتل الشمع. تخلص من الشمع الذي يحتوي علي كميات نزره من الزيينات كنفايات خطره.
    ملاحظه: يستخدم المختبر النبيل خدمه الانسجه التجارية لدمج وتقطيع الانسجه. لتصور القياسية من c. مبيض الخمائر و هيبوهاي ، وتستخدم 4 ميكرومتر المقاطع. لتقييم الاتصال من شرائح خوطي ، والتي تمتد عاده من خلال طائرات متعددة ، ويمكن استخدام 8 ميكرومتر المقاطع. اعتمادا علي قدره تحقيقات الأسماك لاختراق العينة ، قد يكون من الممكن استخدام مقاطع أكثر سمكا.

3. التحقق من صحة المجسات المصممة حديثا

ملاحظه: تم تكييف البروتوكول التالي للتحقق من صحة التحقيقات c. مبيض من swidsinski et al.17.

  1. خط c. مبيض SC5314 ويرتبط ارتباطا وثيقا الأنواع المتخذة أساسا للمقارنة (علي سبيل المثال ، المبيضات dubliniensis ، المبيضات الاستوائية) إلى yepd + 2 ٪ لوحات أجار. احتضان لمده 1 − 2 أيام عند 30 درجه مئوية.
  2. تطعيم 5 مل من متوسط YEPD السائل مع مستعمره واحده.
  3. ماصه 1 مل من الخلايا المعلقة إلى أنبوب الطرد المركزي والطاردة المركزية في 3,000 x g لمده 5 دقائق تجاهل supernatant.
  4. أعاده تعليق بيليه في 100 μL من الفوسفات-مخزنه المالحة (تلفزيوني).
  5. ماصه 5 − 10 μL من الخلايا المعاد تعليقها وبقعه علي شريحة زجاجيه. تنتشر في دائره أكبر والسماح لتجف.
    ملاحظه: إذا لم تكن الخلايا ملتصقة ، استخدم الشرائح المغلفة بولي L-ليسين.
  6. دائره بقعه الخلية مع قلم PAP وتغطيه مع 50 μL من 2.5 ٪ بارافورمالدهيد (PFA) في الاذاعه التلفزيونية. احتضان في RT لمده 10 دقيقه.
    تحذير: PFA هو قابل للاشتعال ويمكن ان يسبب مشاكل صحية إذا استنشقت أو علي اتصال مع الجلد. وينبغي التخلص من المواد الملوثة بالنفايات الخطرة.
  7. غسل 3x مع تلفزيوني. الحنفية السائل قباله علي منشفه ورقيه وتغطيه مع 100 μL من برنامج تلفزيوني. كرر مرتين. تخلص من الغسيل النهائي.
  8. اعداد الشرائح للتخزين متعدد الأيام. في حاله تنفيذ السمك في نفس اليوم ، انتقل إلى الخطوة 3.9 دون الخطوات المذكورة في هذا القسم.
    ملاحظه:     فمن الأفضل لتنفيذ التهجين علي الفور ولكن إذا قصيرة في الوقت المحدد اتبع الخطوة 3.8 قبل تخزين. يمكن تخزين الشرائح لعده أيام في 4 درجه مئوية.
    1. تغطيه البقعة مع 60 ٪ الايثانول. احتضان في RT لمده 3 دقائق. تجاهل الحل.
    2. تغطيه البقعة مع 80 ٪ الايثانول. احتضان في RT لمده 3 دقائق. تجاهل الحل.
    3. تغطيه البقعة مع 100 ٪ الايثانول. احتضان في RT لمده 3 دقائق. تجاهل الحل. انتقل إلى الخطوة 3.9.
  9. ضع الشرائح المكشوفة في فرن التهجين عند 50 درجه مئوية لمده 1 ساعة. إذا تم اتباع الخطوة 3.8 ، قم بتخزين الشرائح في 4 درجه مئوية. إذا لم يكن الأمر كذلك ، انتقل إلى الخطوة 4.2 لتنفيذ بروتوكول التهجين.

4. تلطيخ الأسماك في انسجه الجهاز الهضمي

  1. ديواكس البارافين-المقاطع النسيجية المضمنة.
    1. في فرن التهجين ، يسخن جره الكوبلين المليءه بالزسلين إلى 60 درجه مئوية.
    2. ادخل الشرائح في الجرة المملوءة بالزسلين. ضعيه عند 60 درجه مئوية لمده 10 دقائق. تخلصي من غسول اليدين. الحفاظ علي الشرائح في جره وتصب قباله اكسيلين في حاويه النفايات.
    3. صب الطازجة RT الزيلين في الجرة واحتضان في 60 درجه مئوية لمده 10 دقيقه. تخلصي من الغسيل الثاني
    4. ملء جره مع 100 ٪ الايثانول واحتضان في RT لمده 5 دقائق. أزاله الشرائح من الجرة والهواء الجاف.
    5. تعيين الفرن التهجين إلى 50 درجه مئوية للخطوات في القسم 4.2.
  2. وصمه عار c. مبيض مع المسبار الأسماك.
    1. اعداد 1 مل من محلول التهجين الطازجة (20 مم تريس – HCl, pH 7.4, 0.9 M كلوريد الصوديوم, 0.1% كبريتات دوديسيل [SDS], 1% فوراميد في المياه الخالية من RNase). انظر الجدول 1 لحسابات العينة.
    2. مزيج معا 50 μl من محلول التهجين مع 1 μl من c. مبيض التحقيق (5 ' Cy3-acagcagaagccgtgcc 3 ' ؛ 50 ميكروغرام/مل في rnase-المياه الحرة) لتحقيق النهائي مبلغ 0.5 ميكروغرام لكل شريحة.
      ملاحظه: العديد من الفئران المختبرة التي ولدت لا تحتوي علي اي الفطريات بين الكائنات المجهرية. في هذه الحالة ، فمن الممكن ان تحل محل المسبار عموم الفطرية (5 ' Cy3-ctctggcttcaccctattc 3 ') الذي يعترف rrna 23s من معظم الأنواع الفطرية ، وليس فقط c. مبيض. في تجربه المؤلفين ، فان المسبار الفطري ينتج تلطيخ أكثر إشراقا من المسبار الخاص ب c. albicans.
    3. حماية المحلول من الضوء والتسخين إلى 50 درجه مئوية.
    4. باستخدام قلم PAP ، ارسم دائره حول قسم الانسجه من القسم 4.1.
    5. ماصه 50 μL من محلول التهجين الذي يحتوي علي المسبار علي الانسجه الثابتة وينتشر بلطف فوق قسم الانسجه بطرف ماصه. تراكب السائل مع كوفيرسليب التهجين مما يجعل من المؤكد لمنع فقاعات.
    6. ختم الشرائح في غرفه التهجين للماء واحتضان الأقسام ل 3 ح في 50 درجه مئوية في الظلام في فرن التهجين.
    7. وفي الوقت نفسه ، اعداد 50 مل من محلول غسل الأسماك (20 مم تريس-HCl ، pH 7.4 ، 0.9 M NaCl في المياه الخالية من RNase). انظر الجدول 1 لحسابات العينة.
    8. نقل محلول الغسيل إلى 50 درجه مئوية لتسخينها.
    9. بعد 3 ساعات ، أضف محلول الغسيل إلى جره الكوبلين. ثم ، بعناية أزاله كوفيرسليب من الشريحة مع ملقط ووضع الشريحة في محلول الغسيل.
    10. تغطيه الجرة مع رقائق ألومنيوم واحتضان في 50 درجه مئوية لمده 20 دقيقه.
    11. خلال هذه الحضانة ، واعداد الحل موبين نوى تلطيخ (20 نانوغرام/مل 4 ′ ، 6-diamidino-2-فينيلانديول [DAPI] ، 1.6 ميكروغرام/مل فلوريسئين ايزوثيسيانات [FITC]-لكتين في تلفزيوني). انظر الجدول 1 لحسابات العينة. للمعدة والأمعاء الغليظة ، استخدم FITC-Ulex يوروريوس راصات 1 (UEA-1). للأمعاء الصغيرة والأعور ، استخدم مزيجا من الراصات الجرثومية FITC-UEA-1 و FITC-القمح (WGA).
      ملاحظه: Lectins من الأنواع المختلفة تعترف التعديلات السكر المختلفة من البروتينات السكرية مثل mucin. تركيبات لكتين الموصي بها هنا تم تحديدها تجريبيا لتلطيخ الأمثل من المخاط في مقصورات GI مختلفه.
    12. اغسل الشرائح عن طريق سكب الحل غسل الأسماك وأعاده تعبئة الجرة مع RT تلفزيوني. صب قباله التلفزيونية علي الفور وأعاده ملء مع تلفزيوني. صب قباله التلفزيونية لما مجموعه 2 يغسل.
    13. ويك بعيدا عن العمل التلفزيوني مع الانسجه ممسحة مهمة حساسة ودائره قسم الانسجه المعوية مع قلم PAP. ضع الشرائح في حاويه بلاستيكية معتمة وأضف 50 μL من محلول تلطيخ النوى المخاطي إلى قسم الانسجه. تغطيه الحاوية مع رقائق ألومنيوم لحماية من الضوء. احتضان في 4 درجه مئوية ل 45 دقيقه.
    14. وضع الشرائح في جره Coplin ويغسل بسرعة مرتين في الاذاعه التلفزيونية في RT.
    15. اضغط بعيدا برنامج تلفزيوني الزائدة علي منشفه ورقيه ، ومن ثم الفتيل بعيدا قطرات النهائية من برنامج تلفزيوني مع الانسجه.
    16. وضع قطره واحده من المتوسطة المتصاعدة علي كل قسم وتراكب مع الزجاج coverslip ، ومنع فقاعات. دع الوسط المتصاعد ينتشر تحت الشفة الكاملة. للتصوير الفوري ، ضعي المشبك في مكانه مع طلاء الأظافر في الزوايا. للتخزين علي المدى الطويل ، وختم حول كوفيرسليب مع طلاء الأظافر.
    17. صوره الشرائح باستخدام المجهر الفلورسنت.

Representative Results

ووفقا للتعليمات المقدمة ، ستكون نتيجة هذه التقنية هي الوسم الفلوري لنوى في ظهاره المضيف ، والمخاط ، و c. مبيض في انسجه GI المقسمة. يجب ان تظهر خلايا المبيضات الbicans نوع البرية اما المستديرة ، خلايا الخميرة أحاديه الخلية أو ممدود للغاية ، والمتفرعة في بعض الأحيان ، الخلية الخلوية ، والانقسامات الخلايا لا تكون واضحة في هيبوهاي). المسوخ من c. مبيض قد تظهر بالاضافه إلى ذلك أصغر, ممدود قليلا "الرمادي" الخمائر أو أكبر, ممدود قليلا "القناة الهضمية" (الانتقالية التي يسببها المعدة) أو "مبهمه" الخمائر.

ويصور الشكل 1 ابره التغذية المستخدمة في الحقن عن طريق الفم ، فضلا عن المواضع الرئيسية للابره اثناء إجراءات الحقن. الشكل 2 يوفر الاعداد النموذجية المستخدمة لتشريح الجهاز وظهور شرائح GI من الماوس.

الشكل 3 يعرض الأسماك تلطيخ أنواع مختلفه من الخلايا c. مبيض بعد الانتشار في المختبر وداخل نموذج الماوس. الشكل 3A يظهر الفلورية والصور المرحلة من الثابتة ، تتخللها ، في المختبر-التي تروج لها هيبوهاي. هيفات تشكيل كان مع سائل [لي] متوسطه18 مع 2% ن-اسيتيل الجلوكوزامين, pH 6.8 في 37 [ك.]. ويبين الشكل 3ب الفلورية والصور المرحلة من الثابتة ، تتخللها ، في خلايا الخميرة الانبوبيه المنتشرة. الشكل 3ج ، D يظهر ثابته ، تتخللها ، في المختبر-الخلايا المعوية المنتشرة والخلايا غير الشفافة ، علي التوالي. الأمعاء وأنواع الخلايا غير الشفافة يمكن تمييزها شكليا الا عندما تصور عن طريق مسح المجهر الكتروني. يرجى ملاحظه ان تلطيخ الأسماك من الخلايا المنتشرة في المختبر سيكون دون الأمثل إذا كانت الخلايا ليست جيدا تتخلل. ويرد مثال علي تلطيخ الضعيفة ومنتشر في الشكل 3ج. للحصول علي أفضل النتائج ، يجب تحديد ظروف تثبيت الخلايا والتغلغل بشكل تجريبي لكل نوع خليه والأنواع التي سيتم التحقيق فيها. ولحسن الحظ ، فان البروتوكول الموصي به لتصور c. مبيض في الانسجه المقطوعة ينتج يتخلله أكثر اتساقا.

الشكل 3e-G تصور c. مبيض في الفئران الأمعاء الغليظة ، ملطخه المسبار c. مبيض محدده(الشكل 3ه) أو المسبار الفطرية (الشكل 3و ، ز). C. مبيض يظهر الأحمر في هذه الصور ، نوى الخلية المضيفة زرقاء ، وطبقه المخاط الأخضر. كلا الخمائر المستديرة والممدودة جدا (نصال الأبيض) تحدث في الأمعاء الغليظة. يرجى ملاحظه ان تلطيخ هو أكثر إشراقا مع المسبار الفطرية. الشكل 3(ز ) يصور ume6 متحولة في نفس المقصورة ، ملطخه بالمسبار الفطري ume6 ترميز عامل النسخ المطلوب لتشكيل هيفا تحت الظروف المختبرية19 . ومن المثير للاهتمام ، لم يتم تلخيص النمط الظاهري الخميرة مقفله التي عرضها هذا المتحول تحت الظروف في المختبر داخل القناة الهضمية ، مما يوحي بأنه يجب تنشيط عامل زائده داخل المضيف12. ويصور الشكل 4 ظهور النوع البري c. مبيض في أجزاء مختلفه من القناة الهضمية murine ، بما في ذلك المناطق المتاخمة مباشره إلى الغشاء المخاطي المضيف والمناطق المركزية أكثر من تجويف الأمعاء.

Figure 1
الشكل 1: وضع ابره التغذية الرئيسية اثناء العصر الجاف. (ا) تغذيه الابره. (ب) تغذيه الكره ابره ادراجها إلى جانب اللسان. (ج) تغذيه ابره في وضع تستقيم مع الادراج في المريء. (د) إدخال ابره التغذية في المعدة مع بضعة ملليمترات مرئية فوق الأنف. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: مخطط تشريح المثال. (ا) وساده التشريح والاداات. (ب) القناة الهضمية التي تم الاعفاء منها. القريب (المريء) إلى الأقسام البعيدة (الشرج): المعدة. ثانيا-الأمعاء الصغيرة القريبة. III. الأمعاء الصغيرة الوسطي. رابعا-الأمعاء الصغيرة البعيدة. V. Cecum. سادسا-الأمعاء الغليظة. تشير مربعات الحدود المتقطعة الوردية إلى الانسجه التي سيتم إصلاحها. (ج) الانسجه التي توضع في الكاسيت. الأرقام الرومانية هي نفسها كما في لوحه b. الرجاء انقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: صور تمثيليه من الأسماك الملطخة c. مبيض. (ا) اسماك c. مبيض هيهاينمتفي وسائل الاعلام لي السائل18 مع 2 ٪ ن-اسيتيل الجلوكوزامين ، pH 6.8. (ب) الأسماك من c. مبيض الخلايا الخميرة المستديرة نمت علي yepd + 2 ٪ لوحات أجار. (ج) الأسماك من الخلايا المعوية c. مبيض (ySN1045) نمت علي لوحات أجار yepd + 2 ٪. (د) سمك الخلايا المبهمة من c. مبيض نمت علي لوحات الاجار yepd + 2 ٪. (ه) النوع البري c. مبيض (ySN250) في الأمعاء الغليظة ، ملطخه المسبار c. مبيض الخاصة. (و) النوع البري c. مبيض في الأمعاء الغليظة ، ملطخه المسبار الفطري. (ز) Ume6 متحولة (ySN1479) في الأمعاء الغليظة ، ملطخه المسبار الفطرية: الأحمر هو c. مبيض، الأزرق هو نواه الظهاريه المضيف ، والأخضر هو mucin. نصال تشير إلى هيهاي الأسهم تشير إلى الخميرة. قضبان المقياس = 20 μm. تم تكييف الصورتين F و G من ويدلي وآخرون12. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: ظهور الأسماك الملونة c. مبيض في مقصورات الأمعاء مختلفه. ويظهر نوع البرية c. مبيض في الأجزاء المشار اليها من الجهاز الهضمي الماوس. داخل كل مقصوره ، تصور الصور المنطقة المجاورة لغشاء المخاطية المضيف والمنطقة الوسطي من تجويف الأمعاء. تم تنفيذ تلطيخ مع المسبار الفطرية. شريط مقياس = 20 ميكرومتر. وقد تم تكييف الصور من ويدلي وآخرون12. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

مخزون المضادات الحيوية (200x)
البنسلين G 181 ملغ/مل
الستربتومايسين 400 mg/μL
ميثاكارن
الاسهم التركيز النهائي حجم وحدات
الميثانول 60 في المائة 300 مل
كلوروفورم 30 150 مل
حمض الخليك الجليدي 10 50 مل
التهجين الحل
الاسهم التركيز النهائي حجم وحدات
1 متر تريس-HCl ، pH 7.4 20 مم 20 ميكرولتر
5 م كلوريد الصوديوم 0.9 M 180 ميكرولتر
10% SDS 0.10 في المائة 10 ميكرولتر
100% فورماميد 1.00 في المائة 10 μL (الاحتفاظ بها في الارصفه الصغيرة عند-20 درجه مئوية بين الاستخدامات)
المياه الخالية من RNase 780 ميكرولتر
حل غسل الأسماك
1 متر تريس-HCl ، pH 7.4 20 مم 1 مل
5 م كلوريد الصوديوم 0.9 M 9 مل
المياه الخالية من RNase 40 مل
محلول لتلطيخ النوى المخاطية
DAPI ، 10 ميكروغرام/مل 20 نانوغرام/مل 2 ميكرولتر
لكتين ، 40 ميكروغرام/مل 1.6 ميكروغرام/مل 40 ميكرولتر
ال7.4 التلفزيوني ، pH 958 ميكرولتر

الجدول 1: الاحجام والتركيزات النموذجية للحلول المستخدمة في هذا البروتوكول.

Discussion

الطريقة الموصوفة هنا يسمح لتصور c. مبيض الخمائر و هيبوهاي في مساحات GI من الفئران التي استعمرت المعلقين من اي جنس أو سلاله. المسبار الأسماك التهجين إلى rRNA 23S ، والتي يتم توزيعها في جميع انحاء سيتوتوبلاسما الفطرية. وقد تم تكييف طريقتنا من بروتوكول سبق الإبلاغ عنه لتصور بكتيريا الأمعاء20. لان c. مبيض يغير المورفولوجية في المضيف ، والأسلوب هو مفيد لرصد شكل الخلية الفطرية ، فضلا عن التعريب. علي سبيل المثال ، لقد استخدمنا هذه الطريقة لدحض فرضيه ان الخمائر تسود في جميع انحاء الجهاز الهضمي ، وفضح التناقضات بين في الجسم المجري والظاهري في المختبر من بعض "المسوخ-معيبه" طفرات12.

يوجد العديد من نماذج الماوس ل c. مبيض الاستعمار المعلق. والكائنات المجهرية لفئران المختبرات والبشر متميزة ، وفي الفئران ، يلزم استخدام المضادات الحيوية أو اتباع نظام غذائي متخصص لأقامه استعمار مستقر. العلاج بالمضادات الحيوية يعزز أيضا c. مبيض الاستعمار من البشر وهو عامل خطر كبير لنشر المرض10. المضادات الحيوية المستخدمة في هذه الدراسة غير مكلفه نسبيا وتسفر عن انخفاضات موثوقه في الجراثيم الجرثومية. لاحظ انه يتم استخدام المضادات الحيوية لإنقاص عبء الأنواع البكتيرية العدائية ، وليس للقضاء علي جميع البكتيريا من الكائنات. إذا كان الباحثون يرغبون في دراسة c. albicans-التفاعلات المضيف في غياب البكتيريا أو لتجنب استخدام المضادات الحيوية أو نظام غذائي خاص ، يمكن ان تحل محل الحيوانية الخالية من الجراثيم للحيوانات تربي تقليديا. ومع ذلك ، الفئران gnotobiotic تظهر بعض التشوات المناعية والتشريحية ، التالي قد لا تكون مناسبه لجميع الأغراض.

العديد من الخطوات الهامه لتلطيخ الأسماك الناجحة: طريقه التثبيت الموصي بها أمر بالغ الاهميه للحفاظ علي السلامة الهيكلية للانسجه الهضمية ، وخاصه المحتويات الهشة لتجويف الأمعاء ، مثل طبقه المخاط والثلاثية الابعاد تنظيم الفطريات والبكتيريا16. يرجى ملاحظه ان العديد من حلول التثبيت الشائعة الاستخدام التي تحتوي علي المياه تضر بشكل كبير بهندسة الاناره. المثبتات والحلول لغسل ما بعد التثبيت الموصي بها في هذا البروتوكول لا تحتوي علي الماء ، ومن المهم تجنب التلوث بالماء. خطوه حاسمه أخرى هي خطوه التهجين ، حيث انه من المهم تجنب تبخر محلول التهجين اثناء احتضان الشرائح في الفرن التهجين. نقترح وضع الشرائح في وعاء ماء لتجنب هذه المشكلة. بدلا من ذلك ، يمكن للمرء استخدام غرف التهجين للماء مثل تلك التي تستخدم في الأصل لتهجين ميكروصفائف.

ويرد في هذا البروتوكول وصف لمسبار خاص بالأسماك من طراز c. مبيض. ومع ذلك ، لان العديد من الفئران التي تربي في المختبر لا تحتوي علي c. مبيض أو الفطريات الأخرى كجزء من الميكروبات المعوية الطبيعية ، والمسبار الفطري قد وصمه عار علي وجه التحديد c. مبيض في الكائنات المستعمرة بالتجربة. قد يكون من المرغوب فيه استبدال مسبار الفطرية بسبب خصائصه التهجين متفوقة واعلي نسبه الاشاره إلى الضوضاء. إذا تم استخدام المسبار الفطري كمسبار زائف لل c. مبيض، فمن المهم لتوثيق عدم وجود تلطيخ في الكائنات غير المصابة (اي ، التعامل مع المضادات الحيوية ولكن ليس c. مبيض). تلطيخ الحيوانية السيطرة غير المستعمرة هو أيضا مفيد لتقييم تلطيخ الخلفية التي قد تنجم عن التزام بتحقيقات الأسماك إلى الجسيمات الغذائية. وعموما ، فان استخدام تحقيقات الأسماك يوفر خصوصية محسنه علي معظم الطرق الأخرى لتلطيخ الفطريات ، مثل Calcofluor الأبيض (الذي البقع كيتين ، مكون جدار الخلية التي قد تختلف بين أنواع الخلايا) ، GMS ، أو الأجسام المضادة المضادة للفطريات المتاحة تجاريا. وعلاوة علي ذلك ، تلطيخ الأسماك يسمح لتكلفه الكائنات الحية المتعددة باستخدام بشكل مختلف المسمية تحقيقات الأسماك إلى الأنواع المحددة.

واحد التحذير من هذه التقنية هو ان بعض أنواع الخلايا الخميرة c. مبيض تظهر مشابهه جدا من قبل الأسماك (علي سبيل المثال ، وأنواع الخلايا غير الشفافة والأمعاء). للتمييز بين هذه الأنواع من الخلايا ، سيكون من المفيد تطوير تحقيقات التهجين إلى الخلية mRNAs الفطرية نوع محدد. ومع ذلك ، في شكله الحالي ، وقد كشفت تقنيه الأسماك بالفعل الاختلافات المفاجئة بين السلوكيات المجرية وفي المختبر من المسوخ c. مبيض تقييمها في اطار كلا الشرطين12، مشيرا إلى التفاعلات المعقدة في بيئة المعلق الطبيعية التي لا تحاكي بشكل كاف من قبل الموجودة في اختبارات المختبر. المزيد من الدراسات من البقع c. مبيض مختلفه في الأنواع البرية اضافيه والمضيفين متحولة من المرجح ان تسفر عن رؤى اضافيه في التفاعلات الفطرية المضيف. وعلي وجه الخصوص ، فانه سيكون من المفيد لتوصيف c. مبيض في نماذج من مرض التهاب الأمعاء ، والذي يرتبط مع فكسانال عاليه من c. مبيض في البشر21، وغيرها من نماذج c. مبيض فرط النمو والمرض. ويمكن أيضا الجمع بين تقنيه FISH مع مناعي لتلطيخ خلايا المضيف محدده. وعموما ، فان الطريقة المعروضة هنا توفر وسيله سريعة وموثوق بها إلى حد معقول لتحديد التوطين c. مبيض والتشكل داخل القناة الهضمية الثدييات.

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgments

ويود المؤلفون ان يشكروا كارولينا تروتيني ، كاثرين نغ ، جوستين سوننبرغ ، وكيه كاي هوانغ للتوجيه في تطوير تقنيه الأسماك. قدمت تيريزا O'Meara تعليقات مفيده علي المخطوطة ، وساعدت ميريام ليفي في التصوير الفوتوغرافي. وقد دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة منح R01AI108992 ، R01DK113788 ، وجائزه الترحيب Burخشونه في التسبب في الامراض المعدية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe BD 309659 can be substituted from any vendor
BHI blood agar can be substituted from any vendor
C. albicans FISH probe IDT DNA Technologies custom order
Chamber for hybridization incubation watertight chamber meant to reduce evaporation
Chloroform Sigma C2432 >=99.5%
DAPI Roche 10236276001 can be substituted from any vendor
Delicate task wiper tissues Kimberley-Clark 34256CT Kimwipes
D-glucose Sigma G7021-5KG can be substituted from any vendor
Ethanol Sigma E7023 molecular biology grade
Feeding needles Cadence, Inc. 7910 metal; 20 X1-1/2" W/2-1/4; can be autoclaved to sterilize
FITC-UEA-1 Sigma L9006-1MG other fluorophores available
FITC-WGA Sigma L4895-2MG other fluorophores available
Foam pads Fisher 22038221 Order foam pads that will fit within cassettes
Formamide Sigma 47671 molecular biology grade
Glacial acetic acid Macron Fine Chemicals MK881746 ACS reagent, >=99.5%
Glass Coplin jar Fisher 08-815 hold up to 10 slides back to back
Histology cassettes Simport M512 Deep cassettes so cecum is not squished
Hybridization coverslips Sigma GBL712222 RNase-free
Hybridization oven can be substituted from any vendor
LB can be substituted from any vendor
Lee's media prepared as described in Lee et al. 1975
Methanol Sigma 179337 ACS reagent, >=99.8%
Mice Charles River Laboratories 028 adult BALB/c; 18-21 grams (8-10 weeks)
Paraformaldehyde Fisher 50-980-487 16% solution
Parrafin wax Sigma P3558-1KG Paraplast for tissue embedding
PBS, pH 7.4 UCSF Cell Culture Facility Media Production Unit CCFAL003 calcium, magnesium-free; can be substituted from any vendor
Penicillin G Sigma PENNA-100MU
Sabouraud dextrose agar can be substituted from any vendor
Saline Baxter 2F7123 sterile, can be substituted from any vendor
Sodium chloride (NaCl) Sigma S3014 can be substituted from any vendor; maintain RNase-free
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma L3771 can be substituted from any vendor; maintain RNase-free
Streptomycin Sigma S9137-100G
Super PAP pen Life Technologies 8899 can be substituted from any vendor
Tris-HCl Sigma T3253 can be substituted from any vendor; maintain RNase-free
Vectashield Vector Laboratories H-1000 does not contain DAPI
Xylenes Sigma 214736 reagent grade
YEPD can be substituted from any vendor

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Noble, S. M., Gianetti, B. A., Witchley, J. N. Candida Albicans Cell-Type Switching and Functional Plasticity in the Mammalian Host. Nature Reviews in Microbiology. 15 (2), 96-108 (2017).
  2. Bacher, P., et al. Human Anti-fungal Th17 Immunity and Pathology Rely on Cross-Reactivity against Candida albicans. Cell. 176 (6), 1340-1355 (2019).
  3. Shao, T. Y., et al. Commensal Candida albicans Positively Calibrates Systemic Th17 Immunological Responses. Cell Host and Microbe. 25 (3), 404-417 (2019).
  4. Jiang, T. T., et al. Commensal Fungi Recapitulate the Protective Benefits of Intestinal Bacteria. Cell Host and Microbe. 22 (6), 809-816 (2017).
  5. Iliev, I. D., et al. Interactions Between Commensal Fungi and the C-Type Lectin Receptor Dectin-1 Influence Colitis. Science. 336 (6086), 1314-1317 (2012).
  6. Fan, D., et al. Activation of HIF-1 alpha and LL-37 by Commensal Bacteria Inhibits Candida Albicans Colonization. Nature Medicine. 21 (7), 808-814 (2015).
  7. Koh, A. Y., Kohler, J. R., Coggshall, K. T., Van Rooijen, N., Pier, G. B. Mucosal Damage and Neutropenia Are Required for Candida Albicans Dissemination. PLoS Pathogens. 4 (2), e35 (2008).
  8. Yamaguchi, N., et al. Gastric Colonization of Candida Albicans Differs in Mice Fed Commercial and Purified Diets. Journal of Nutrition. 135 (1), 109-115 (2005).
  9. Kadosh, D., et al. Effect of Antifungal Treatment in a Diet-Based Murine Model of Disseminated Candidiasis Acquired via the Gastrointestinal Tract. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (11), 6703-6708 (2016).
  10. Perlroth, J., Choi, B., Spellberg, B. Nosocomial Fungal Infections: Epidemiology, Diagnosis, and Treatment. Medical Mycology. 45 (4), 321-346 (2007).
  11. Pande, K., Chen, C., Noble, S. M. Passage Through the Mammalian Gut Triggers a Phenotypic Switch That Promotes Candida Albicans Commensalism. Nature Genetics. 45 (9), 1088-1091 (2013).
  12. Witchley, J. N., et al. Candida Albicans Morphogenesis Programs Control the Balance between Gut Commensalism and Invasive Infection. Cell Host and Microbe. 25 (3), 432-443 (2019).
  13. Noble, S. M., Gianetti, B. A., Witchley, J. N. Candida Albicans Cell-Type Switching and Functional Plasticity in the Mammalian Host. Nature Reviews in Microbiology. 15 (2), 96-108 (2017).
  14. Balish, E., Filutowicz, H., Oberley, T. D. Correlates of Cell-Mediated Immunity in Candida Albicans-Colonized Gnotobiotic Mice. Infection and Immunity. 58 (1), 107-113 (1990).
  15. Guarner, J., Brandt, M. E. Histopathologic Diagnosis of Fungal Infections in the 21st Century. Clinical Microbiology Reviews. 24 (2), (2011).
  16. Johansson, M. E., Hansson, G. C. Preservation of Mucus in Histological Sections, Immunostaining of Mucins in Fixed Tissue, and Localization of Bacteria with FISH. Methods in Molecular Biology. 842, 229-235 (2012).
  17. Swidsinski, A., Weber, J., Loening-Baucke, V., Hale, L. P., Lochs, H. Spatial Organization and Composition of the Mucosal Flora in Patients with Inflammatory Bowel Disease. Journal of Clinical Microbiology. 43 (7), 3380-3389 (2005).
  18. Lee, K. L., Buckley, H. R., Campbell, C. C. An Amino Acid Liquid Synthetic Medium for the Development of Mycelial and Yeast Forms of Candida Albicans. Sabouraudia. 13 (2), 148-153 (1975).
  19. Banerjee, M., et al. UME6, a Novel Filament-Specific Regulator of Candida Albicans Hyphal Extension and Virulence. Molecular Biology of the Cell. 19 (4), 1354-1365 (2008).
  20. Earle, K. A., et al. Quantitative Imaging of Gut Microbiota Spatial Organization. Cell Host and Microbe. 18 (4), 478-488 (2015).
  21. Sokol, H., et al. Fungal Microbiota Dysbiosis in IBD. Gut. 66 (6), 1039-1048 (2017).

Tags

المناعة والعدوى ، الإصدار 153 ، المبيضات الbicans، المعلق الأمعاء ، الفلورسنت في الموقع التهجين (الأسماك) ، الغشاء المخاطي ، التعريب ، المورفولوجية
التصور من <em>المبيضات الbicans</em> في الجهاز الهضمي Murine باستخدام التهجين في الموقع الفلورسنت
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Witchley, J. N., Penumetcha, P. M.,… More

Witchley, J. N., Penumetcha, P. M., Noble, S. M. Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (153), e60283, doi:10.3791/60283 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter