Summary
이 프로토콜의 목적은 포유류 위장관에서 칸디다 알비칸스 세포 모양 및 국소화를 시각화하는 것입니다.
Abstract
칸디다 알비칸스는 인간과 다른 많은 포유류에서 장내 미생물의 곰팡이 성분입니다. C. albicans는 대부분의 식민지 호스트에 있는 현상을 일으키는 원인이 되지 않더라도, 공생 저장소는 전염병을 위한 저장소역할을 하고, 창자에 있는 높은 진균 역가의 존재는 선동적인 장 질병과 연관됩니다. 여기서, 우리는 안정적인 위장 식민지의 마우스 모델에서 C. albicans 세포 형태및 국소화를 시각화하는 방법을 설명한다. 식민지는 경구 항생제로 처리 된 동물에서 C. 알비 칸의 단일 복용량을 사용하여 설립된다. 창자 조직의 세그먼트는 발광 내용체 (미생물 및 점액)뿐만 아니라 숙주 점막의 구조를 보존하는 방식으로 고정됩니다. 마지막으로, 실화에서 형광은 C. 알비칸및 하이픈에 대한 얼룩을 진균 rRNA에 대하여 프로브를 사용하여 수행된다. 이 프로토콜의 주요 장점은 C. albicans 세포 형태와 위장 식민지 동안 숙주 구조와의 공간 협회의 동시 관찰을 허용 한다는 것입니다.
Introduction
칸디다 알비칸스는 곰팡이 공생뿐만 아니라 기회 인간 병원체입니다. 이 효모는 정의된 환경 틈새 시장이 결여되고 대신 인간과 그밖 포유동물의 위장관 (GI) 관, 피부 및 비뇨 생식기 내의전파1. C. albicans에 초기 연구는 그것의 독성 잠재력에 주로 초점을 맞춘 반면, 몇몇 최근 보고서는 창 자 내에서 유기 체를 전파 하는 것이 정상적인 건강에 중요 한 역할을 할 수 있습니다 제안, 의 면역 개발을 포함 하 여 호스트2,3,4. 포유류 장 내의 C. albicans 의 기원에 대한 조사를 용이하게 하기 위해, 우리는 안정적인 GI 식민지화의 마우스 모델을 개발하고 현장 혼성화 (FISH) 기반 의 형광 을 통해 곰팡이 효모 세포와 하이픈을 시각화하는 방법 장 내강자.
몇 가지예외5,실험실 에서 자란 마우스는 일반적으로 소화관의 곰팡이 식민지화에 대한 저항성을 나타낸다. 식민지 저항은 특정 세균성 종에 의해 중재 될 것으로 생각 된다; 그러나, 이것은 항생제6,7 또는 아마도 세균 종 조성물을 변경하는 화학적으로 정의 된 식이요법의 사용으로 동물의 치료에 의해 극복 될 수있다8,9. 유사하게, 인간에서, 광범위한 항생제의 사용은 C. albicans 과성장 및 보급 과성장과 연관되었습니다10. 우리의 뮤린 식민지 화 모델은 광범위한 항생제를 사용하여 C. albicans 면역 적격, 종래의 사육 된 마우스의 식민지화를 확립합니다. 페니실린과 스트렙토마이신은 C. 알비칸스의 108 개의 식민지 형성 단위 (CFUs)로 위장하기 전에 일주일 동안 동물의 식수에 제공됩니다. 항생제 주입 물이 계속되는 한, C. albicans는 10 6-108 CFU/g의 대변역가에 도달하여 위장관을 통해 전파됩니다. 곰팡이 식민지의 높은 수준에도 불구하고, 동물은 건강하게 유지하고 감염되지 않은 대조군과 같은 속도로 체중을 얻는다. 이 모델은 여러 C. albicans 의 비열성 요인11,12를스크리닝하고 특성화하는 데 성공적으로 사용되었습니다.
곰팡이 왕국의 다른 구성원과 마찬가지로, C. albicans는 엄청난 형태 학적 가소성13할 수있다 . 시험관내 조건하에서, 적어도 6개의 단세포 효모 세포 유형들 사이에서 전이하는 것으로 나타났으며, 다세포 하이페 및 가성하이파뿐만 아니라. 효모-하이파 전이는 가장 잘 특징지어지는 독성 속성 중 하나이며, 대부분의 포유류 질병 모델뿐만 아니라 감염된 인간 조직에서 하이페와 슈도하이파가 우세하다. Murine 소화관 내의 C. albicans 현지화 및 세포 형태학을 결정하기 위하여, 우리는 고정된 조직학 단면도에 효모 및 hyphae를 염색하기 위한 FISH 기술을 개발했습니다. 프로브는 곰팡이 세포질 에 걸쳐 분포되는 곰팡이 23S 리보소말 RNA (rRNA)에 혼성화형형으로 표지된 DNA 올리고뉴클레오티드로 구성됩니다. 숙주 조직은 숙주 점막, 소화 물질, 세균성 미생물 및 장 내 점액을 포함한 장의 3 차원 구조를 보존하는 방식으로 고정되기 때문에이 기술은 곰팡이의 국소화를 허용합니다. 얼룩이 있을 때 이러한 랜드마크와 관련하여 세포를 제거합니다. FISH 기술은 주기산 Schiff (PAS) 또는 고모리의 메테나민 실버 (GMS)와 같은 곰팡이에 대한 전통적인 조직 학적 얼룩뿐만 아니라 시판되는 항진균 항체와 유리하게 비교됩니다. C. 알비칸스. 또한, 표준 고정제는 점액 층을 제거하고 창자 루멘14,15의다른 내용을 방해한다.
이 문서에서는, 우리는 마우스 위장관의 고급 C. albicans 식민지를 확립하기위한 자세한 지침을 제공합니다, 안락사 동물에서 소화 관의 해부, 발광을 보존하는 방식으로 조직 고정에 대한 FISH를 사용하여 숙주 조직 내에서 C. 알비칸스를 검출할 수 있습니다. C. albicans의 야생 모형 그리고 돌연변이 긴장 이외에, gavage 기술은 그밖 미생물을 전달하기 위하여 이용될 수 있습니다. 고정 기술은 창자 내용물의 보존이 요구되는 모든 연구에 유용 할 것입니다. FISH 절차는 하루 안에 완료될 수 있으며 여러 개의 차별화된 프로브를 사용하여 여러 곰팡이 종을 현지화하는 데 사용할 수 있습니다.
Protocol
아래에 설명된 단계는 UCSF 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1. 경구 가비지를 사용하여 C. 알비칸스와 마우스의 위장 식민지화
- 현지 IACUC의 승인을 받은 18-21 g의 수컷 또는 암컷 마우스(8-10주)에 대한 하우징을 제공합니다. 첫날부터 오토클레이브 음식과 물을 사용하십시오.
참고: 멸균 된 케이지, 침구, 음식 및 물을 사용하면 잠재적으로 C. 알비칸스를 창자에서 대체 할 수있는 항생제 내성 환경 박테리아로 오염 될 위험이 줄어 듭니다. 또한, 실험 적 질문에 따라, 마우스는 coprophagic 및 창 자 내용 공동 동물 간에 공유 될 것 이다 때문에 동물의 개별 주택 고려 되어야 한다. - 다음 날, 오토클레이브식수를 5% 포도당, 1,500 U/mL 페니실린 G, 2 mg/mL 스트렙토마이신을 함유한 오토클레이브 수로 교체하십시오.
- 편의를 위해 200x 항생제 재고 용액(표1)을미리 준비하고, 필터 멸균을 하고, -20°C에서 동결하십시오.
- 1 주일 동안 항생제에 동물을 유지합니다.
- 항생제가 시작된 후 3일과 6일에는 항생제 내성 호기성 박테리아로 오염된 동물의 대변을 평가합니다. 한 손으로 동물을 잡고 항문 근처에 뚜껑이 없는 마이크로 퍼지 튜브를 놓고 적어도 하나의 배설물 펠릿을 수집합니다.
- 루리아 국물 (LB), 효모 추출물 펩톤 덱스트로스 (YEPD) 또는 뇌 심장 주입 (BHI) 플러스 혈액 한천 플레이트에 멸균 수와 플레이트 100 μL의 1 mL에 각 대변 펠릿을 다시 일시 중단. 37°C에서 표준 인큐베이터(혐기성 아님)에서 밤새 플레이트를 배양하고 박테리아 성장을 평가합니다.
참고: 플레이트는 최소한의 성장 (0-20 콜로니)을 나타내야합니다. >20 박테리아의 식민지페니실린과 연쇄상 구균으로 처리 된 동물에서 회복하는 경우, C. albicans와 높은 수준의 식민지가 설립될 가능성이 낮고 실험을 중단해야합니다.
- 3일 전에, 동결글리세롤 스톡으로부터 의 C. 알비칸스를 YEPD + 2% 한천 플레이트로, 2일 동안 30°C에서 배양하였다.
- 위하기 하루 전에, 각 C. 알비칸스 균주의 한 콜로니를 접종하여 액체 YEPD 5 mL로 시험하였다. 30°C에서 밤새 흔들어 서 배양합니다.
- 위관의 아침, 30°C로 미리 온지어 예드의 100 mL에서 0.1의 광학 밀도로 C. 알비칸스의 포화 배양을 희석시켰다. OD 600이 1(중간 로그 성장)에 도달할 때까지 4시간에서 5시간 동안 30°C에서200rpm에서 궤도 셰이커를 흔들어 줍니다.
- 각 100 mL 배양액을 실온(RT)에서 5분 동안 3,000 x g에서 2개의 50mL 원원관 과 원심분리기로 옮긴다.
참고: C. 알비칸스는 RT에서 비교적 느리게 전파됩니다. 다른 종에 대 한이 프로토콜을 적응 하는 경우, inocula 지속적인된 성장을 방지 하기 위해 얼음에 보관 해야 할 수 있습니다. - 상급체를 버리고, 배양 50 mL 당 멸균 식염수 20 mL에서 펠릿 세포를 다시 중단하고, 중복 된 재일시 펠릿을 단일 원엽 튜브로 풀. 3,000 x g에서 5 분 동안 원심 분리기.
- 상급을 버리고 멸균 식염수 20 mL에 다시 일시 중단하십시오. 소용돌이는 간단히 제거하고 OD 600 측정을 위해20 μL을 제거합니다. 멸균 정상 식염수로 1:50희석하십시오. 나머지 재중단 된 세포를 3,000 x g에서 5 분 동안 원심 분리합니다.
- 상급제는 버리십시오. 1 x 108 CFU의 접종 크기의 경우, OD600 측정에서 결정된 추정 농도에 따라 멸균 정상 식염수에서 펠릿 세포를 약 5 x 108 CFUs/mL로 다시 일시 중단합니다.
참고: 전형적으로, OD600 의 1은 ~1 x 107 효모 세포/mL에 해당한다. 이 값은 분광광도계에 따라 다를 수 있으므로 확인해야 합니다. 다른 미생물을 가진 감염에 대한 농도의 변화가 바람직한 경우, 동물에 대한 불편을 최소화하기 위해 ≤10 μL/g 마우스의 접종 부피를 계획하십시오. - 혈뇨계로 1:1,000 희석을 계수하여 접종의 농도를 확인합니다. 혈세포계를 이용하여 결정된 농도에 기초하여 치명화될 세포의 부피를 조절한다.
- 동물 먹이바늘(그림 1A)을 사용하여, 주어진 접종물의 계산된 부피를 가진 각 동물을 혈통한다. 위전 절차는 1.13.1-1.13.8 단계를 참조하십시오.
참고 : 위계에 대한 교육은 숙련 된 개업자로부터 얻어야하며, 절차는 사전에 숙달되어야합니다. 단일 동물에 대한 성공적인 절차는 일반적으로 1 분 이상 걸리지 않습니다.- 1mL 주사기에 오토클레이브 동물 먹이 바늘을 부착하고 부정확한 복용량을 피하기 위해 기포를 제거, 하나의 gavage 볼륨으로 주사기를 채웁니다. 멸균 표면에 놓습니다.
- 동물을 위축에 고정하십시오. 지배적 인 손으로 꼬리의 바닥에 동물을 잡고 귀 바로 뒤에 느슨한 피부에 동물의 뒷면을 비 지배적 인 손을 밀어.
- 지배적 인 손의 집게 손가락과 엄지 손가락을 사용하여 느슨한 피부를 단단히 모읍니다. 이것은 "스크러프"입니다. 동물의 목덜미와 같은 (비 지배적 인) 손의 작은 손가락으로 동물을 데리러 손바닥에 동물을 고정시다. 동물의 머리를 부드럽게 확장하여 머리와 몸(따라서 목과 식도)이 직선으로 되도록 합니다.
참고: 동물의 몸이 구부러지거나 뒤틀린 상태에서 위장을 시도하는 것은 식도 천수 및 동물의 죽음과 같은 합병증을 초래할 수 있습니다. - 지배적 인 손으로 주사기를 들고 구부러진 바늘이 아래를 가리키며 동물에게 수직으로 잡습니다(그림 1B). 바늘의 공을 사용하여 입 안쪽 모서리를 부드럽게 연결하고 입의 측면을 따라 목뒤쪽으로 바늘을 부드럽게 전진시키고 마지막으로 바늘을 중앙으로 이동시킵니다.
참고: 측면 경로를 따라 바늘을 도입하면 동물의 치아와 혀의 저항을 피하는 데 도움이됩니다. - 바늘의 공이 목 뒤쪽에 있으면 바늘을 위로 기울여 동물의 몸줄과 평행하게합니다(그림 1C).
참고: 이 시점에서, 동물은 개그 반사를 전시할 것이다. 이것은 바늘이 올바르게 위치하고 있음을 나타내는 좋은 징후이며 재갈 운동은 식도 아래로 바늘을 안내하는 데 도움이됩니다. 개그 반사가 없는 경우에, 바늘은 식도 보다는 오히려 기관에 있을 수 있습니다. 바늘을 부드럽게 철회하고 1.13.1 단계로 돌아갑니다. - 동물이 몇 밀리미터만 볼 때까지 접종을 삼킬 수 있도록하십시오(그림 1D). 바늘을 부드럽게 진행합니다.
참고: 바늘이 진행되지 않으면 식도를 손상시킬 수있는 힘을 사용하지 마십시오. 때로는 마지막 반 센티미터를 진행하면 동물에서 초대형 개그가 필요합니다. 바늘이 붙어있는 것 같으면 천천히 철회하고 1.13.4 단계에서 다시 시도하십시오. - 바늘의 공이 플런저를 부드럽게 진행하여 올바른 위치 (위)에 있는지 테스트하십시오. 저항이 없는 경우 접종을 계속 합니다. 접종이 시행되면 천천히 바늘을 철회하십시오.
- 케이지에 있는 동물을 교체하고 동물을 5-10분 동안 계속 모니터링하여 호흡이나 고통의 징후가 있는지 모니터링하십시오. 동물이 위축 직후 정상적인 활동을 재개했는지 확인합니다.
- 동일한 접종을 다음 동물과 함께 사용하면 알코올 닦음으로 바늘을 닦으하십시오. 1.13.1단계로 되돌아갑니다. 다른 접종을 사용할 경우 새 바늘을 사용하고 1.13.1 단계로 되돌아갑니다.
참고: 위가 진 다음 날 동물을 검사하는 것이 중요합니다. 고민의 징후를 보이는 동물 (예 : 구부러진 자세, 수고 한 호흡)은 식도 파열, 폐 손상 또는 회복가능성이 거의없는 다른 내부 부상을 입었기 때문에 인간적으로 안락사되어야합니다.
- 동물의 위축에 따라, 용량 확인을위한 inocula의 플레이트 희석.
- 10 배 직렬 희석을 준비 1:105. 1:105 희석의 1개의 위자 부피를 사부라우드 덱스트로스 한천의 100 mm 플레이트에 플레이트.
- 30 °C에서 2 일 동안 플레이트를 배양합니다. 접종 용량을 확인하기 위해 CFU를 계산합니다.
2. 조직학을 위한 위장 조직의 준비
참고: 프로토콜의이 섹션은 요한슨과 핸슨 에서 적응16.
- 해부된 동물 2마리당 대형 스크류 캡 플라스틱 용기에 메타칸 용액 500mL(메탄올 60%, 클로로폼 30%, 빙하 아세트산 10%)를 준비합니다.
주의 사항: 메탄올과 클로로포름은 흡입시 유해하며 화학 적 후드에서 조작해야합니다. 빙하 아세트산은 부식성이 있을 수 있으며 적절한 개인 보호 장비로 취급해야 합니다. 메탄올, 클로로포름 및 빙하 아세트산은 유해 폐기물로 폐기되어야 합니다. - 실험 종점에서, 현지 IACUC에 의해 승인된 프로토콜에 따라 동물을 인간적으로 안락사시한다.
참고: 항생제 치료 동물에서, C. albicans 식민지 일반적으로 범위 ~106 CFUs/g 5 일에 ~5 x 107 CFUs/g 하루에 의해 25. - 10% 표백제로 해부 도구를 살균하고 70% 에탄올로 헹구어 주세요.
- 각 동물을 복부 쪽이 위를 향하도록 해부 표면에 고정합니다. 30G 바늘을 사용하여 팔다리를 해부 표면에 고정합니다(그림2A). 70% 에탄올로 동물에게 스프레이하여 모피를 청소하고 공구에 달라붙지 않도록 하십시오.
- 무딘 끝 집게를 사용하여, 비 지배적 인 손으로 복부 피부의 부분을 꼬집어. 지배적 인 손으로 가위를 사용하여 골반 기저 부근의 피부와 근막을 절개하십시오. 복막 강의 각 측면을 따라 늑골 케이지까지 U 모양으로 절개를 확장합니다. 방해에서 피부를 들어 올립니다.
- 연필을 사용하여 GI 세그먼트를 평가하기 위해 예비 라벨 을 붙인 장학 카세트를 사용하십시오. 예를 들어, 각 동물에 대해 별도의 카세트를 "위", "근위 소장", "중간 소장", "원위 소장", "소막함", "대장", "대장"으로 라벨을 붙입니다. 각 카세트의 바닥에 폼 패드를 놓습니다(그림2A).
참고: 그림 2B개요는 카세트에 배치할 섹션을 제안했습니다. - 무딘 끝 집게를 사용하여 복강에서 소막을 부드럽게 추출하십시오. 가위를 사용하여 소양과 소장 및 대장 사이의 연결을 끊습니다.
참고: 세칼 조직은 매우 섬세하고 파열하기 쉽습니다. 조작 할 때주의하십시오. - 전체 묘지를 꼬지 않고 평평하게 놓도록 하는 기록학 카세트에놓습니다(그림 2C). 위에 두 번째 거품 패드를 놓고 카세트를 닫습니다. 메타칸이 들어 있는 나사 캡 용기에 카세트를 넣습니다.
- 카세트보다 길이가 1-2 배설액이 들어있는 대장의 섹션을 절제하십시오.
- 조직 섹션을 카세트에 넣고 조직을 평평하고 꼬지 않은 상태로 유지하십시오. 두 번째 폼 패드로 오버레이하고 카세트를 닫습니다. 카세트를 메타칸에 넣습니다.
- 샘플링할 소장의 각 섹션에 대해 소화 물질이 들어 있는 1-2cm 세그먼트를 절제하십시오.
- 조직을 조직학 카세트에 넣고 조직을 평평하고 꼬지 않은 상태로 유지합니다. 두 번째 폼 패드로 오버레이하고 카세트를 닫습니다. 카세트를 메타칸에 넣습니다.
- 위장의 경우 식도와 소장과의 연결을 끊습니다. 카세트에 놓고 조직을 평평하고 꼬지 않은 상태로 유지하십시오. 두 번째 폼 패드로 오버레이하고 카세트를 닫습니다. 카세트를 메타칸에 넣습니다.
- 카세트를 RT의 메타카른 용액에 적어도 3시간 및 2주 미만 동안 둡니다.
참고: 고정 GI 세그먼트를 상업 적 학 서비스로 전송할 수 있는 몇 가지 지점이 있습니다. 이러한 조직은 발광 내용물의 중단없이 단면도하기 어려울 수 있으며 숙련 된 기술자가 최적의 결과를 얻을 수 있습니다. 상용 서비스가 파라핀에 조직을 포함하기 전에 세탁을 기꺼이 수행하려는 경우, 카세트는 단계 2.16에 대한 지침과 함께이 단계에서 보낼 수 있습니다. - 예열된 70°C 혼성화 오븐에서 대형 비커에 있는 모든 티슈 카세트를 덮을 만큼 충분한 파라핀 왁스를 녹이기 시작합니다.
- 고정 후, 폼 패드를 제거하고 다시 카세트에 각 그대로 조직 섹션을 반환합니다. RT에서 다음과 같은 용액으로 조직을 흔들어 주세요 : 100 % 메탄올에서 35 분 동안 두 번, 100 % 에탄올에서 25 분 동안 두 번, 자일렌에서 20 분 동안 두 번.
주의 사항: 자일렌은 인화성, 독성, 흡입시 손상을 일으킬 수 있습니다. 적절한 보호 기능을 갖춘 화학 후드에 사용하십시오. 유해 폐기물 절차를 통해 자일렌을 폐기하십시오. - 카세트를 종이 타월에 말린 후 혼성화 오븐에서 70°C에서 2시간 동안 미리 녹인 파라핀 왁스를 넣고 닦습니다. 카세트에 파라핀이 채워지고 거품이 남아 있지 않은지 확인하십시오.
참고: 이 단계는 왁스가 GI 분절에 침투하고 조직 및 내용물을 안정화시키는 것을 허용한다. - 왁스에서 카세트를 제거하고, 여분의 왁스가 배수되도록 하고, 왁스 블록에 매립될 때까지 RT에 보관하십시오. 미량의 자일렌이 함유된 왁스를 유해 폐기물로 폐기하십시오.
참고: 노블 랩은 조직의 삽입 및 절편을 위한 상업적조직학 서비스를 사용합니다. C. 알비칸스 효모와 하이픈의 표준 시각화를 위해 4 μm 섹션이 사용됩니다. 일반적으로 여러 평면을 통해 확장되는 하이프 세그먼트의 연결을 평가하기 위해 8 μm 섹션을 사용할 수 있습니다. FISH 프로브가 시편에 침투하는 능력에 따라 더 두꺼운 섹션을 사용할 수 있습니다.
3. 새로 설계된 프로브의 검증
참고: C. 알비칸스 프로브의 유효성을 검사하기 위한 다음 프로토콜은 Swidsinski 외17에서채택되었습니다.
- 줄무늬 C. 알비칸스 SC5314 및 밀접하게 관련된 비교종 (예를 들어, 칸디다 더블린시스, 칸디다 열대)YEPD + 2% 한천 접시. 30°C에서 1-2일 동안 배양합니다.
- 단일 콜로니로 액체 YEPD 배지 5 mL를 접종합니다.
- 부유 세포의 피펫 1 mL을 미세원심지 튜브 및 원심분리기로 3,000 x g에서 5분 동안 폐기한다.
- 인산완식염수(PBS)의 100 μL에서 펠릿을 다시 중단시다.
- 다시 매달린 세포의 피펫 5-10 μL을 유리 슬라이드에 두드린다. 더 큰 원으로 펴서 말리십시오.
참고: 세포가 부착되지 않은 경우 폴리-L-리신 코팅 슬라이드를 사용하십시오. - PAP 펜으로 세포 스팟을 동그라미를 치고 PBS에서 2.5 % 파라 포름 알데히드 (PFA)의 50 μL로 덮습니다. RT에서 10분 동안 배양합니다.
주의 사항: PFA는 가연성이며 흡입하거나 피부에 닿으면 건강 문제를 일으킬 수 있습니다. PFA로 오염된 품목은 유해 폐기물로 폐기해야 합니다. - PBS로 3x 를 씻으소서. 종이 타월에 액체를 누르고 PBS 100 μL로 덮습니다. 두 번 반복합니다. 마지막 세척은 폐기하십시오.
-
수일 간 보관할 수 있도록 슬라이드를 준비합니다. 같은 날 FISH를 수행하는 경우 이 섹션의 단계 없이 3.9단계로 진행합니다.
참고: 혼성화를 즉시 수행하는 것이 바람직하지만, 시간이 짧은 경우 저장하기 전에 3.8 단계를 따르십시오. 슬라이드는 4 °C에서 며칠 동안 보관할 수 있습니다.- 60% 에탄올로 그 자리를 덮습니다. RT에서 3 분 동안 인큐베이션하십시오.
- 80% 에탄올로 그 자리를 덮습니다. RT에서 3 분 동안 인큐베이션하십시오.
- 100% 에탄올로 그 자리를 덮습니다. RT에서 3 분 동안 인큐베이션하십시오. 3.9단계로 진행합니다.
- 미완성 슬라이드를 50°C에서 1시간 동안 혼성화 오븐에 놓습니다. 3.8단계를 따랐을 경우, 슬라이드를 4°C에 보관하였다. 그렇지 않은 경우, 혼성화 프로토콜을 수행하기 위해 4.2 단계로 진행한다.
4. 위장관 조직에서 생선 얼룩
- 디왁스 파라핀 내장 조직학적 섹션.
- 혼성화 오븐에서 자일렌으로 채워진 코플린 항아리를 60°C로 미리 데우자.
- 슬라이드를 자일렌이 채워진 항아리에 넣습니다. 60°C에서 10분 동안 놓아 두십시오. 항아리에 슬라이드를 유지하고 폐기물 용기에 자일렌을 부어.
- 신선한 RT 자일렌을 항아리에 붓고 60 °C에서 10 분 동안 배양하십시오.
- 항아리에 100 % 에탄올을 채우고 RT에서 5 분 동안 배양하십시오.
- 4.2절의 단계에 대해 혼성화 오븐을 50°C로 설정합니다.
- 물고기 프로브와 얼룩 C. 알비칸스.
- 신선한 혼성화 용액 1 mL (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.9 M NaCl, 0.1 % 나트륨 도데실 황산염 [SDS], RNase-free 물에서 1 % 포름 아미드)를 준비하십시오. 샘플 계산은 표 1을 참조하십시오.
- 50 μL의 혼성화 용액을 C. albicans 프로브 1 μL(5' Cy3- ACAGCAGAAGGGGGCC 3'; RNase-free 물에서 50 μg/mL)과 혼합하여 슬라이드당 0.5 μg의 최종 프로브 양을 제공합니다.
참고: 많은 실험실 사육 마우스는 그들의 microbiota 중 어떤 균류를 포함 하지 않습니다. 이 경우, C. 알비칸스뿐만아니라 대부분의 곰팡이 종의 23S rRNA를 인식하는 범곰팡이 프로브(5'Cy3-CTCTCTCTCTTCTTTC 3')를 대체할 수 있다. 저자의 경험에서, 판푼갈 프로브는 C. albicans-특정 프로브보다 더 밝은 염색을 산출합니다. - 용액을 빛으로부터 보호하고 50°C까지 프리웜합니다.
- PAP 펜을 사용하여 섹션 4.1에서 조직 섹션 주위에 원을 그립니다.
- 파이펫 50 μL의 프로브-함유 혼성화 용액을 고정 된 조직에 상고하고 피펫 팁으로 조직 섹션에 부드럽게 퍼질 수 있습니다. 액체를 혼성 커버슬립으로 오버레이하여 거품을 방지합니다.
- 방수 혼성화 챔버에서 슬라이드를 밀봉하고 혼성화 오븐에서 어둠 속에서 50 °C에서 3 시간 동안 섹션을 배양합니다.
- 한편, 50 mL의 FISH 세척 용액 (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, RNase-free 물에서 0.9 M NaCl)을 준비하십시오. 샘플 계산은 표 1을 참조하십시오.
- 세척 용액을 50°C로 옮겨 서두르게 합니다.
- 3 시간 후, 코플린 항아리에 세척 용액을 추가합니다. 그런 다음 집게로 슬라이드에서 덮개 슬립을 조심스럽게 제거하고 슬라이드를 세척 용액에 놓습니다.
- 항아리를 알루미늄 호일로 덮고 50 °C에서 20 분 동안 배양하십시오.
- 이 인큐베이션 동안, 뮤신 핵 염색 용액을 준비 (20 ng/mL 4′, 6-diamidino-2-페니린데어 [DAPI], 1.6 μg/mL 플루오레세인 이소티오시아네이트 [FITC]-렉틴 PBS에서). 샘플 계산은 표 1을 참조하십시오. 위장과 대장의 경우 FITC-Ulex 유로파에우스 아글루티닌 1(UEA-1)을 사용하십시오. 소장과 소골의 경우 FITC-UEA-1과 FITC-밀 배아 아글루티닌(WGA)의 조합을 사용하십시오.
참고: 다른 종에서 렉틴은 뮤신과 같은 당단백질의 다른 설탕 수정을 인식합니다. 여기에 권장된 렉틴 조합은 다른 GI 구획에서 점액의 최적 염색을 위해 경험적으로 결정되었습니다. - FISH 세척 용액을 붓고 RT PBS로 항아리를 다시 채우면 슬라이드를 씻으십시오. 즉시 PBS를 붓고 PBS로 리필하십시오. 총 2번의 세안으로 PBS를 부어 내보입니다.
- 섬세한 작업 와이퍼 조직으로 PBS를 심고 PAP 펜으로 장 조직 섹션을 동그라미하십시오. 불투명 한 플라스틱 용기에 슬라이드를 배치 하 고 조직 섹션에 mucin-핵 염색 솔루션의 50 μL를 추가 합니다. 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일로 용기를 덮습니다. 4°C에서 45분 동안 배양합니다.
- 슬라이드를 코플린 병에 놓고 RT의 PBS에서 두 번 빠르게 씻으십시오.
- 종이 타월에 여분의 PBS를 멀리 누른 다음 티슈로 PBS의 마지막 방울을 심지.
- 각 섹션에 장착 매체 한 방울을 떨어뜨리고 유리 커버슬립으로 오버레이하여 기포를 방지합니다. 마운팅 매체를 전체 커버슬립 아래에 분산시소서. 즉각적인 이미징을 위해 커버슬립을 모서리에 매니큐어로 고정합니다. 장기간 보관할 수 있도록 커버슬립 을 매니큐어로 밀봉하십시오.
- 형광 현미경을 사용하여 슬라이드를 이미지화합니다.
Representative Results
제공된 지침에 따라, 이 기술의 결과는 단면된 GI 조직에서 숙주 상피, 점액 및 C. 알비칸스에서 핵의 형광 라벨링될 것이다. 야생형 칸디다 알비칸스 세포는 둥글고 단세포 효모 세포또는 고도로 길쭉한, 때로는 분지, 다세포 하이픈(세포-세포 분열이 하이픈에서 명백하지 않을 것이다)으로 나타나야 한다. C. albicans의 돌연변이는 추가로 더 작고, 약간 길쭉한 "회색" 효모 또는 더 크고, 약간 길쭉한 "GUT"(위장 유도 전이) 또는 "불투명" 효모로 나타날 수 있습니다.
그림 1은 구강 관저에 사용되는 수유 바늘뿐만 아니라 신체 절차 동안 바늘의 주요 위치를 묘사합니다. 도 2는 마우스의 장기 분절 및 GI 세그먼트의 모양에 사용되는 일반적인 설정을 제공한다.
도 3은 시험관 내 및 마우스 모델 내에서 전파된 후 상이한 C. 알비칸스 세포 유형의 FISH 염색을 표시한다. 도 3A는 체외에서 전파된 고정, 투과, 히파의 형광 및 위상 이미지를 나타낸다. 하이파 형성은 37°C에서 2% N-아세틸루코사민, pH 6.8로 액체 리의배지(18)로 유도하였다. 도 3B는 체외에서 전파된 효모 세포의 고정, 투과, 위상 이미지의 형광 및 위상 이미지를 나타낸다. 도 3C,D는 각각 고정, 투과, 시험관 내 전파 GUT 세포 및 불투명 세포를 나타낸다. GUT 및 불투명 세포 모형은 전자 현미경 검사법을 스캐닝하여 가시화할 때를 제외하고는 형태학적으로 구별할 수 없습니다. 세포가 잘 투과되지 않은 경우 시험관 내 전파 세포의 FISH 염색은 최적이 될 것입니다. 그림 3C에약하고 확산되는 염색의 예가 나와 있습니다. 최상의 결과를 위해, 세포 고정 및 투과 조건은 조사될 각 세포 모형 및 종에 대해 경험적으로 결정되어야 합니다. 다행히도, 절편 된 조직에서 C. albicans를 시각화 하기 위한 권장된 프로토콜 보다 일관 된 투과화를 생산.
도 3E-G는 마우스 대장에서 C.albicans를 묘사하고, C. albicans-특이적프로브(도3E)또는 판곰팡이 프로브(그림3F,G)로염색하였다. C. albicans는 이 심상에서 빨간색으로 나타나고, 숙주 세포 핵은 파랗고, 점액 층은 녹색입니다. 둥근 효모와 고도로 길쭉한 하이픈 (흰색 화살촉)은 대장에서 발생합니다. 판곰팡이 프로브로 염색이 더 밝아두심을 유의하시기 바랍니다. 그림 3G는 동일한 구획에 있는 ume6 돌연변이체를 도시하고, 판곰팡이 프로브로염색한 . Ume6는 시험관 내 조건 하에서 히파 형성에 필요한 전사 인자를 인코딩한다19 . 흥미롭게도, 시험관 내 조건 하에서 이러한 돌연변이체에 의해 표시되는 효모-잠긴 표현형은 장 내에서 재분해되지 않으며, 이는 숙주12내에서 중복 인자가 활성화되어야 함을 시사한다. 도 4는 숙주 점막과 장 내루멘의 더 많은 중앙 영역에 인접한 지역을 포함하는 뮤린 기관의 상이한 세그먼트에서 야생형 C. 알비칸스의 출현을 도시한다.
그림 1: 위봉 시 키 공급 바늘 위치. (A)먹이 바늘. (B)혀 의 측면에 삽입 된 바늘 공을 먹이. (C)식도에 삽입된 바늘을 똑바로 세워 서 먹이. (D)코 위에 몇 밀리미터 를 표시하여 위장에 바늘을 삽입하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 해부 레이아웃 예제입니다. (A)해부 패드 및 도구. (B)절제된 위장관을 빼내. 근위 (식도) 말단에 (항문) 섹션: I. 위. II. 근위 소장. III. 내측 소장. IV. 말단 소장. V. 세쿰. VI. 대장. 분홍색 파선 테두리 상자는 고정할 조직을 나타냅니다. (C)카세트에 배치 된 티슈. 로마 숫자는 패널 B와 동일합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 생선 염색 된 C. albicans의대표적인 이미지. (A) C. albicans hyphae의 물고기 액체 리의 매체에서 성장18% N-아세틸루코사민, pH 6.8. (B) 생선 의 C. 알비칸스 둥근 효 모 세포 YEPD + 2% 한천 접시에 성장. (C)YEPD + 2% 한천 접시에서 자란 C. 알비칸스 장세포(ySN1045)의 생선. (D)YEPD + 2% 한천 접시에서 자란 불투명 세포C. 알비칸스의 생선. (E)야생형 C. 알비칸스(ySN250)를 대장에서, C. 알비칸스-특이적프로브로 염색하였다. (F)야생 형 C. 알비 칸을 대장에서, 판곰 프로브로 염색. (G) Ume6 돌연변이체(ySN1479)는 대장에서, 판곰팡이 프로브로 염색: 빨간색은 C. 알비칸스,청색은 숙주 상피 핵, 녹색은 뮤신이다. 화살촉은 하이픈을 나타냅니다. 화살표는 효모를 나타냅니다. 배율 막대 = 20 μm. 이미지 F와 G는 Witchley 외12에서적응됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 다른 창 자 구획에 물고기 얼룩C. 알비칸의 외관. 야생형 C. 알비칸스는 마우스 위장관의 지시된 세그먼트에 도시된다. 각 구획 내에서, 이미지는 호스트 점막과 창자 루멘의 중앙 지역에 인접한 지역을 묘사합니다. 염색을 판곰팡이 프로브로 수행하였습니다. 스케일 바 = 20 μm. 이미지는 Witchley 외12에서조정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 항생제 주식 (200x) | |||
| 페니실린 G | 181 mg/mL | ||
| 연쇄상 구균 | 400 mg/μL | ||
| 메타칸 주 | |||
| 주식 | 최종 농도 | 볼륨 | 단위 |
| 메탄올 | 60% | 300 | Ml |
| 포 름 | 30% | 150 | Ml |
| 빙하 아세트산 | 10% | 50 | Ml |
| 하이브리드화 솔루션 | |||
| 주식 | 최종 농도 | 볼륨 | 단위 |
| 1 M 트리스-HCl, pH 7.4 | 20 mM | 20 | μL |
| 5 M 나클 | 0.9 M | 180 | μL |
| 10% SDS | 0.10% | 10 | μL |
| 100% 포마미드 | 1.00% | 10 | μL (사용 사이에 -20 °C에서 작은 알리쿼트에 보관) |
| RNase 무료 물 | 780 | μL | |
| 생선 세척 솔루션 | |||
| 1 M 트리스-HCl, pH 7.4 | 20 mM | 1 | Ml |
| 5 M 나클 | 0.9 M | 9 | Ml |
| RNase 무료 물 | 40 | Ml | |
| 뮤신 핵 염색 용액 | |||
| DAPI, 10 μg/mL | 20 ng/mL | 2 | μL |
| 렉틴, 40 μg/mL | 1.6 μg/mL | 40 | μL |
| PBS, pH 7.4 | 958 | μL | |
표 1: 이 프로토콜에 사용되는 솔루션의 일반적인 볼륨 및 농도입니다.
Discussion
여기에 기술된 방법은 어떤 성또는 균주의 공동식민지화된 마우스의 기관에서 C. 알비칸스 효모 및 하이픈의 시각화를 허용한다. FISH 프로브는 곰팡이 세포질 에 걸쳐 분포되는 23S rRNA로 혼성화됩니다. 우리의 방법은 창자 박테리아를 시각화하기 위한 이전에 보고된 프로토콜에서 적응되었습니다20. C. albicans는 호스트 내의 그것의 형태를 바꾸기 때문에, 방법은 진균 세포 모양 뿐만 아니라 현지화를 감시하기 위하여 유용합니다. 예를 들어, 우리는 효모가 소화관 전체에 우세하다는 가설을 반증하고, 특정 "필라멘션-결함" 돌연변이체의 생체내 표현형과 체외 표현형 사이의 불일치를 드러내기 위해 이 방법을 사용하였다12.
C. albicans 공존 식민지에 대 한 여러 마우스 모델 존재. 실험실 마우스와 인간의 microbiota는 구별 하 고, 쥐에서, 항생제 또는 전문된 다이어트의 사용 안정적인 식민지를 설정 하는 데 필요한. 항생제를 가진 처리는 또한 C. albicans 인간을 강화하고 전파한 질병10를위한 중요한 위험 요소입니다. 이 연구에서 사용된 항생제는 상대적으로 저렴하고 세균성 미생물의 신뢰할 수 있는 감소를 산출한다. 항생제는 동물에서 모든 박테리아를 제거 하지, 길 항 성 세균 종의 부담을 줄이기 위해 사용 됩니다. 연구원은 C. albicans-박테리아의부재에 호스트 상호 작용을 공부 하고자 하는 경우 또는 항생제 또는 특별 한 다이어트의 사용을 피하기 위해, 세균 없는 동물 은 전통적으로 사육 동물에 대 한 대체 될 수 있다; 그러나, gnotobiotic 마우스 전시 특정 면역 및 해부학 이상 및 따라서 모든 목적에 적합 하지 않을 수 있습니다.
성공적인 FISH 염색을 위해 몇 가지 단계가 중요합니다: 권장되는 고정 방법은 GI 조직의 구조적 무결성, 특히 점액 층 및 3차원과 같은 장 루멘의 깨지기 쉬운 내용체를 보존하는 데 중요합니다. 곰팡이와 박테리아의 조직16. 물을 포함하는 많은 일반적으로 사용되는 고정 솔루션은 발광 아키텍처에 매우 손상을 입힙니다. 이 프로토콜에서 권장하는 고정식 세차용 고정식 및 솔루션에는 물이 포함되어 있지 않으며, 물에 대한 오염을 피하는 것이 중요합니다. 또 다른 중요한 단계는 혼성화 오븐에서 슬라이드의 배양 동안 혼성화 용액의 증발을 피하는 것이 중요한 혼성화 단계이다. 이 문제를 피하기 위해 슬라이드를 방수 용기에 넣는 것이 좋습니다. 양자택일로, 하나는 마이크로어레이의 혼성화를 위해 원래 사용된 것과 같은 방수 혼성화 챔버를 사용할 수 있습니다.
C. 알비칸스-특정FISH 프로브는 이 프로토콜에 설명되어있다. 그러나, 많은 실험실 사육 마우스 그들의 자연적인 창 자 microbiota의 일환으로 C. albicans 또는 다른 곰 팡이 포함 하지 않기 때문에, panfungal 프로브 는 실험적으로 식민지 동물에서 C. 알비칸스를 구체적으로 얼룩 수 있습니다. 판곰팡이 프로브의 치환은 우수한 혼성화 특성과 더 높은 신호 대 잡음 비 로 인해 바람직할 수 있습니다. panfungal 프로브가 C. albicans에대한 의사 특이적 프로브로 사용되는 경우, 감염되지 않은 동물 (즉, 항생제로 치료하지만 C. albicans)에서염색의 부족을 문서화하는 것이중요합니다. 비식민지화된 대조군 동물의 염색은 또한 FISH 프로브를 식품 미립자까지 준수함으로써 발생할 수 있는 배경 염색을 평가하는 데에도 유용합니다. 전반적으로, FISH 프로브의 사용은 칼코플루어 백색 (키틴, 세포 모형 사이에서 다를 수 있는 세포벽 분대), GMS, 또는 상업적으로 이용가능한 항진균성 항체와 같은 곰팡이염색의 대부분의 다른 방법에 비해 향상된 특이성을 제공한다. 또한, 물고기 염색은 종 특정 rRNAs에 차별화 표지 된 물고기 프로브를 사용하여 여러 유기체의 코스타링을 허용합니다.
이 기술의 한 가지 주의점은 특정 C. albicans 효모 세포 유형이 FISH (예 : 불투명 및 GUT 세포 유형)에 의해 매우 유사하다는 것입니다. 이러한 세포 유형 사이에서 구별하기 위해, 세포 유형 별 곰팡이 mRNA에 혼성화 프로브를 개발하는 것이 유용 할 것이다. 그럼에도 불구하고, 현재의 형태로, FISH 기술은 이미 두 조건 하에서 평가된 C. albicans 돌연변이체의 생체 내 행동과 체외 행동 사이의 놀라운 불일치를밝혀냈으며,이는 기존 시험관 내 검사법에 의해 적절히 모방되지 않은 자연 적인 환경. 추가 야생 유형 및 돌연변이 호스트에 다른 C. albicans 얼룩의 추가 연구 곰 팡이 호스트 상호 작용에 추가 통찰력을 얻을 가능성이. 특히, 인간21에서 C. 알비칸스의 높은 적분과 연관되는 염증성 장 질환의 모델에서 C. albicans를 프로파일화하는 것이 유익할 것이며, 다른 모델인 C. albicans 과성장 및 질병의 다른 모델이다. FISH 기술은 또한 특정 숙주 세포를 얼룩화하기 위하여 면역성화학과 결합될 수 있습니다. 전반적으로, 여기에 제시된 방법은 포유류 기관 내의 C. 알비칸스 국소화 및 형태를 결정하는 합리적으로 빠르고 신뢰할 수 있는 수단을 제공한다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
저자는 FISH 기술 개발에 지도에 대한 캐롤라이나 트로피니, 캐서린 Ng, 저스틴 소넨 버그, KC 황에게 감사드립니다. 테레사 오메라(Teresa O'Meara)는 원고에 대한 유용한 의견을 제공했고, 미리암 레비는 사진 촬영을 도왔다. 이 작품은 NIH 교부금 R01AI108992, R01DK113788, 및 감염증의 병인에서 버로우 환영 상에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | can be substituted from any vendor |
| BHI blood agar | can be substituted from any vendor | ||
| C. albicans FISH probe | IDT DNA Technologies | custom order | |
| Chamber for hybridization incubation | watertight chamber meant to reduce evaporation | ||
| Chloroform | Sigma | C2432 | >=99.5% |
| DAPI | Roche | 10236276001 | can be substituted from any vendor |
| Delicate task wiper tissues | Kimberley-Clark | 34256CT | Kimwipes |
| D-glucose | Sigma | G7021-5KG | can be substituted from any vendor |
| Ethanol | Sigma | E7023 | molecular biology grade |
| Feeding needles | Cadence, Inc. | 7910 | metal; 20 X1-1/2" W/2-1/4; can be autoclaved to sterilize |
| FITC-UEA-1 | Sigma | L9006-1MG | other fluorophores available |
| FITC-WGA | Sigma | L4895-2MG | other fluorophores available |
| Foam pads | Fisher | 22038221 | Order foam pads that will fit within cassettes |
| Formamide | Sigma | 47671 | molecular biology grade |
| Glacial acetic acid | Macron Fine Chemicals | MK881746 | ACS reagent, >=99.5% |
| Glass Coplin jar | Fisher | 08-815 | hold up to 10 slides back to back |
| Histology cassettes | Simport | M512 | Deep cassettes so cecum is not squished |
| Hybridization coverslips | Sigma | GBL712222 | RNase-free |
| Hybridization oven | can be substituted from any vendor | ||
| LB | can be substituted from any vendor | ||
| Lee's media | prepared as described in Lee et al. 1975 | ||
| Methanol | Sigma | 179337 | ACS reagent, >=99.8% |
| Mice | Charles River Laboratories | 028 | adult BALB/c; 18-21 grams (8-10 weeks) |
| Paraformaldehyde | Fisher | 50-980-487 | 16% solution |
| Parrafin wax | Sigma | P3558-1KG | Paraplast for tissue embedding |
| PBS, pH 7.4 | UCSF Cell Culture Facility Media Production Unit | CCFAL003 | calcium, magnesium-free; can be substituted from any vendor |
| Penicillin G | Sigma | PENNA-100MU | |
| Sabouraud dextrose agar | can be substituted from any vendor | ||
| Saline | Baxter | 2F7123 | sterile, can be substituted from any vendor |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S3014 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
| Streptomycin | Sigma | S9137-100G | |
| Super PAP pen | Life Technologies | 8899 | can be substituted from any vendor |
| Tris-HCl | Sigma | T3253 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | does not contain DAPI |
| Xylenes | Sigma | 214736 | reagent grade |
| YEPD | can be substituted from any vendor |
References
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