Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

ויזואליזציה של קנדידה אלביקנס במערכת העיכול מוריין באמצעות פלורסנט היברידיזציה באתרו

Published: November 5, 2019 doi: 10.3791/60283
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Microbiology and Immunology, University of California, San Francisco, 2Department of Medicine, Division of Infectious Disease, University of California, San Francisco

Summary

מטרת פרוטוקול זה היא להמחיש את הצורה של קנדידה אלביקנס תא ולוקליזציה במערכת העיכול היונקים.

Abstract

קנדידה אלביקנס היא מרכיב פטרייתי של המעיים microbiota בבני אדם ויונקים רבים אחרים. למרות ג ' אלביקנס לא לגרום לסימפטומים ברוב מארחי הקולוניה, מאגר הקומנדאנס משמש מאגר למחלות זיהומיות, ואת הנוכחות של מגדל פטרייתי גבוה בבטן הוא קשור למחלות מעיים דלקתיות. כאן, אנו מתארים שיטה להמחיש C. אלביקנס מורפולוגיה התא ולוקליזציה במודל העכבר של מושבת מערכת העיכול יציבה. הקולוניזציה הוקמה באמצעות מנה אחת של C. אלביקנס בבעלי חיים שטופלו באנטיביוטיקה דרך הפה. מקטעים של רקמת הבטן קבועים באופן השומר על הארכיטקטורה של תוכן הלומיאלי (מיקרואורגניזמים וריר) כמו גם רירית המארח. לבסוף, פלורסנט באתרו היברידיזציה מבוצעת באמצעות מגששים נגד פטריות rrna לכתם עבור C. אלביקנס ו hyphae. יתרון מרכזי של פרוטוקול זה הוא שהוא מאפשר להתבונן בו זמנית של מורפולוגיה תא של C. אלביקנס ואת הקשר המרחבי שלה עם מבנים מארחים במהלך התיישבות מערכת העיכול.

Introduction

קנדידה אלביקנס היא המסרק פטרייתי, כמו גם פתוגן אנושי אופורטוניסטי. שמרים זו חסרה נישה סביבתית מוגדרת, במקום זאת מפיץ בתוך מערכת העיכול (GI) בדרכי העור, ומערכת מין השתן של בני אדם ויונקים אחרים1. בעוד מחקר מוקדם על C. אלביקנס התמקדו בעיקר בפוטנציאל התקפה שלה, מספר דוחות האחרונות מצביעים על כך הפצת אורגניזמים בתוך הבטן עשוי לשחק תפקידים חשובים בבריאות נורמלית, כולל הפיתוח החיסונית של ה . מארח2,3,4 כדי להקל על חקירות של C. אלביקנס בתוך הבטן היונקים, פיתחנו מודל העכבר של מושבת GI יציבה ו פלואורסצנטית באתרו היברידיזציה (דג) מבוססי שיטה להמחיש בתאי שמרים פטרייתיים ו לקורבן בתוך ה מעיים לומן.

עם כמה חריגים5, עכברים שנולדו מעבדה בדרך כלל מציגים התנגדות פטרייתי הקולוניזציה של מערכת העיכול. ההתנגדות הקולוניזציה נחשבת לתיווך על ידי מין חיידקי מסוים; עם זאת, זה יכול להיות להתגבר על ידי טיפול בעלי חיים עם אנטיביוטיקה6,7 או שימוש של תזונה כימית מוגדרת, כי כנראה משנה את הרכב מין חיידקי8,9. באופן דומה, אצל בני אדם, השימוש באנטיביוטיקה רחבה הספקטרום נקשר עם C. אלביקנס יתר והפצת10. מודל הקולוניזציה שלנו משתמש באנטיביוטיקה רחבת טווח כדי לבסס את מושבת האנטי - משתמשים החיסונית של העכברים. פניצילין וסטרפטומיצין מסופקים במים השתייה של בעלי החיים למשך שבוע לפני gavage עם 108 המושבה להרכיב יחידות (בדפוס) של C. albicans. כל עוד המים הזורמים לאנטיביוטיקה ממשיכים, הג. אלביק יפיץ דרך מערכת העיכול, ויגיע לטיטרים בצואה של 106עד 108 ק ג/g. למרות הרמה הגבוהה של הקולוניזציה פטרייתי, בעלי חיים להישאר בריאים לעלות במשקל באותו קצב כמו שולטת נגוע. מודל זה שימש בהצלחה למסך עבור ולאפיין מספר מרובי C. אלביקנס מרובים11,12.

כמו שאר חברי הממלכה הפטרייתיים, מסוגל הג להפלבינים לפלסטיות מורפולוגית ענקית13. תחת בתנאים מחוץ למבחנה, זה הוכח למעבר בין לפחות שישה סוגי תאים שמרים חד-תאיים, כמו גם מיקוף רב-תאיים ופסבדו. המעבר שמרים-to-hypha הוא אחד המאפיינים הטובים ביותר של התקפה אלימה, ו לקורבן ו מודאמהה לשלוט ברוב מודלים מחלת היונקים, כמו גם ברקמות האדם הנגוע. כדי לקבוע C. אלביקנס לוקליזציה ומורפולוגיה התא בתוך מערכת העיכול murine, פיתחנו שיטת דגים עבור כתמים ומיקוף בסעיפים היסטולוגית קבוע. הבדיקות מורכבות fluorescently תווית ה-DNA olig, הhybridize לתוך פטריות מודחלת RNA (rRNA), אשר מופץ ברחבי הציטופלסמה הפטריות. מכיוון שרקמות מארחים קבועות באופן השומר על הארכיטקטורה התלת-ממדית של המעיים, כולל רירית המארח, חומר העיכול, המיקרוביוטה החיידקית והריר בתוך לומן הבטן, טכניקה זו מאפשרת לוקליזציה של פטרייתי תאים ביחס לנקודות ציון אלה כאשר הם מוכתמים. טכניקת הדג משווה בחיוב לכתמים היסטלוגיים המסורתיים לפטריות, כגון חומצה מחזורית שיף (PAS) או מתיונין-כסף של גומורי (GMS), כמו גם נוגדנים מסחרית הזמינים נגד פטריות, כי ריאגנטים אלה אינם ספציפיים ג. אלביאנים. יתר על כן, תיקונים סטנדרטיים להסיר את שכבת הריר ולשבש את התוכן האחר של הבטן לומן14,15.

במאמר זה, אנו מספקים הנחיות מפורטות להקמת בדרגה גבוהה C. אלביקנס מושבת מערכת GI של העכבר, עבור ניתוח של מערכת העיכול מפני בעלי חיים מורדמים, לקיבוע רקמות באופן השומר על הלומיאל אדריכלות, ולזיהוי של הג. אלביקנס בתוך רקמות מארחים באמצעות דגים. בנוסף סוג פראי וזנים מוטציה של C. albicans, הטכניקה gavage יכול לשמש כדי לספק מיקרואורגניזמים אחרים. טכניקת הקיבעון תהיה שימושית לכל מחקר שבו רצוי לשמור על תכולת הבטן. ניתן להשלים את תהליך הדגים בתוך יום וניתן להשתמש בו כדי להתאים מינים פטרייתיים מרובים באמצעות מספר רב של בדיקה בעלת תוויות מרובות.

Protocol

השלבים המתוארים להלן אושרו על-ידי שימוש בבעלי חיים מוסדיים וועדת השימוש (IACUC).

1. מושבת העיכול של עכברים עם C. אלביקנס באמצעות אוראלי Gavage

  1. לספק דיור עבור 18 עד 21 העכברים זכר או נקבה (8-10 שבועות בן) כפי שאושרו על ידי IACUC המקומי. השתמש במזון אוטוקלע ובמים החל מהיום הראשון.
    הערה: השימוש של כלובים מעוקר, מצעים, מזון, ומים מפחית את הסיכון של זיהום עם חיידקים סביבתיים עמידים בפני אנטיביוטיקה שעלולים לתפוס את C. אלביקנס מהבטן. יתר על כן, בהתאם לשאלה הניסיונית, הדיור הפרטני של בעלי חיים צריך להיחשב כי עכברים הם coprophagic והבטן התוכן יהיה משותף בין בעלי חיים שוכנו.
  2. למחרת, החליפו את מי השתייה האוטוקלבים עם מים אוטוקלתיים המכילים 5% גלוקוז, 1,500 U/mL פניצילין G, ו 2 מ"ג/mL סטרפטומיצין.
  3. לנוחיות, להכין מניות 200x אנטיביוטי פתרונות (שולחן 1) מראש, לסנן לעקר, ו להקפיא ב-20 ° c.
  4. לשמור על בעלי חיים. על אנטיביוטיקה לשבוע אחד
    1. בימים 3 ו 6 לאחר אנטיביוטיקה כבר החלו, להעריך את הצואה של כל חיה לזיהום עם חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה האירובי. מחזיק בעל חיים ביד אחת, במקום צינור microfuge uncapped כתיר ליד פי הטבעת ולאסוף לפחות גלולה אחת צואה.
    2. השהה מחדש את כל הצואה בתוך 1 מ ל של מים סטריליים וצלחת 100 μL על ציר לוריא (LB), תמצית שמרים peptone דקסטרוז (YEPD), או עירוי לב המוח (BHI) בתוספת לוחות דם אגר. דגירה את הצלחות לילה בחממה סטנדרטית (לא אנאירובית) ב 37 ° צ' ולהעריך את הצמיחה חיידקים.
      הערה: הצלחות אמורות להפגין צמיחה מינימלית (0-20 מושבות). אם > 20 מושבות של חיידקים הם התאושש בעלי חיים מטופלים עם פניצילין ו סטרפטומיצין, אז זה לא סביר כי מושבת ברמה גבוהה עם C. אלביקנס יהיה להקים את הניסוי צריך להיות מבוטלת.
  5. שלושה ימים לפני gavage, פס C. אלביקנס ממניות הגליצרול קפואים כדי yepd + 2% אגר צלחות ו דגירה ב 30 ° c עבור 2 ימים.
  6. יום אחד לפני gavage, איחסן מושבה אחת של כל C. אלביקנס מאמץ להיבדק 5 מ ל של נוזל yepd. מודטה ב -30 ° c לילה עם טלטול.
  7. בבוקר של gavage, לדלל את התרבות רווי של C. אלביקנס לצפיפות אופטית ב 600 ננומטר (OD600) של 0.1 ב 100 mL של yepd prewarmed ל 30 ° c. לנער את שייקר מסלולית ב 200 rpm ב 30 ° צ' עבור בין 4 h ו 5 עד OD600 מגיע 1 (באמצע יומן הצמיחה).
  8. העברת כל תרבות 100 mL ל 2 50 מ"ל צינורות חרוטי ו צנטריפוגה ב 3,000 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    הערה: C. אלביקנס מפיץ לאט יחסית ב-RT. אם התאמת פרוטוקול זה למין אחר, ייתכן שיהיה צורך לשמור על הקרח על מנת למנוע את המשך הגידול.
  9. להיפטר supernatant, להשהות מחדש את התאים בתוך 20 מ ל של תמיסת מלח סטרילי לכל 50 mL של התרבות, ובריכת כדורי מחדש הושעה לצינורות חרוט יחיד. צנטריפוגה ב 3,000 x g עבור 5 דקות.
  10. השמט את הסופרנטאנט והשהה מחדש 20 מ ל של תמיסת מלח סטרילית. מערבולת בקצרה ולהסיר 20 μL עבור OD600 מדידה. . לדלל 1:50 בתמיסת מלח רגילה וסטרילית צנטריפוגה את התאים שנותרו resuspended ב 3,000 x g עבור 5 דקות.
  11. . מחק את הסופרנטאנט בגודל של התאותיות של 1 x 108 cfu, להשעות את התאים מחדש כ 5 x 108 cfu/mL ב מלוחים רגיל סטרילי מבוסס על הריכוז המשוער שנקבע מ OD600 מדידה.
    הערה: בדרך כלל, OD600 של 1 מתאים ~ 1 x 107 שמרים תאים/mL. ערך זה עשוי להשתנות באמצעות ספקטרוסקופיה ויש לאמת אותו. אם שינוי בריכוז רצוי עבור זיהומים עם מיקרואורגניזם שונים, תוכנית כמות האינואותיות של ≤ 10 μL/g העכבר כדי למזער אי נוחות לחיה.
  12. בדוק את הריכוז של האינוונה על ידי ספירת 1-1000 דילול עם הומוציטומטר. להתאים את עוצמת הקול של התאים כדי להיות גבבת בהתבסס על הריכוז שנקבע באמצעות הומוציטומטר.
  13. באמצעות מחט האכלה בעלי חיים (איור 1א), הgavage כל חיה בעלת הנפח המחושב של מימוש נתון. ראה שלבים 1.13.1-1.13.8 עבור הליך הgavage.
    הערה:     יש להשיג הכשרה לgavage מתוך מתרגל מנוסה, וההליך צריך להיות שולט מראש. הליך מוצלח עבור בעל חיים יחיד לוקח בדרך כלל לא יותר מ-1 דקות.
    1. הצמד בעלי חיים אוטוקלבית האכלה מחט ל 1 מזרק mL ולמלא את המזרק עם אחד gavage volume, הסרת כל בועות אוויר כדי למנוע מינון לא מדויק. מניחים על משטח סטרילי.
    2. . אבטחו את החיה לgavage החזיקו את החיה בבסיס הזנב עם היד הדומיננטית, והחליקו את היד הלא-דומיננטית במעלה החיה אל העור הרופף, ממש מאחורי האוזניים.
    3. באמצעות האצבע והאגודל של היד הלא-דומיננטית, אסוף את העור הרופף בחוזקה; זהו "הסקרף". להרים את החיה על ידי הראש שלה ואת האצבע הקטנה לולאה של יד זהה (לא דומיננטי) ליד הזנב כדי לשתק את החיה על כף היד. הארך בעדינות את ראשו של בעל החיים כך שהראש והגוף שלו (ולכן הצוואר והוושט) יהיו בקו ישר.
      הערה: ניסיון לgavage בזמן שהגוף של בעל החיים כפוף או מעוות עלול לגרום לסיבוכים כגון ניקוב הוושט ומותו של בעל החיים.
    4. הרם את המזרק בידו הדומיננטית והחזק את הבעל הניצב לבעל החיים, כאשר המחט המעומנת מכוונת למטה (איור 1ב). באמצעות כדור המחט, להוק בעדינות בפינה הפנימית של הפה, לקדם בעדינות את המחט לאורך הצד של הפה אל החלק האחורי של הגרון, ולבסוף להעביר את המחט למרכז.
      הערה: מציגים את המחט לאורך נתיב לרוחב מסייעת למנוע התנגדות של השיניים והלשון של בעל החיים.
    5. לאחר כדור המחט הוא בחלק האחורי של הגרון, להטות את המחט למעלה כך שהוא מקביל עם קו הגוף של החיה (איור 1ג).
      הערה: בשלב זה, בעל החיים. יציג רפלקס מחסום זהו סימן טוב המציין כי המחט ממוקם כראוי, ואת התנועה מסייעת להנחות את המחט למטה הוושט. אם אין רפלקס ההקאה, המחט עשויה להיות בקנה הנשימה ולא בוושט. בעדינות למשוך את המחט ולהמשיך לשלב 1.13.1.
    6. הניחו לבעל החיים לבלוע את האינותיות עד שנותרו רק כמה מילימטרים גלויים (איור 1ד). הקדם את המחט בצורה חלקה.
      הערה: אם המחט לא מתקדמת, להימנע משימוש בכוח, אשר יכול לפגוע הוושט. לפעמים לקדם את החצי סנטימטר האחרון ידרוש מחסום גדול במיוחד מהחיה. אם המחט נראה תקוע, לאט לסגת אותו ונסה שוב משלב 1.13.4.
    7. מבחן כי כדור המחט הוא במיקום הנכון (בטן) על ידי לקדם בעדינות את הבוכנה. אם אין התנגדות, המשך להעביר את האינוות. , ברגע שהאינונה מנוהלת. הורידו לאט את המחט
    8. החליפו את החיה בכלוב והמשיכו לעקוב אחר החיה במשך 5 עד 10 דקות לסימני נשימה או מצוקה מאומצת. ודאו שהחיה מחדשת את הפעילות הרגילה מיד לאחר gavage.
    9. אם החיים הבאים ישמשו עם החיה הבאה, נקה את המחט באמצעות מחיקת אלכוהול. . המשך לחזור לשלב 1.13.1 אם נעשה שימוש בשונות שונה, השתמש במחט חדשה והמשך לחזור לשלב 1.13.1.
      הערה: חשוב לבחון בעלי חיים ביום שלאחר gavage. בעלי חיים המציגות סימני מצוקה (למשל, תנוחה מצוטת, נשימה מאומצת) צריכים להיות מורדמים באורח אנושי, כנראה שהם סבלו מקרע בוושט, פוגעים בריאות, או פציעה פנימית אחרת שממנה ההחלמה אינה סבירה.
  14. בעקבות הgavage של בעלי החיים, מדלל צלחות של האינוולה לאימות מינון.
    1. הכינו דילול סדרתי של 10 מקפלים עד 1:105. צלחת אחד gavage נפח של 1:105 דילול על צלחת 100 מ"מ של Sabouraud דקסטרוז אגר.
    2. מודקת את הצלחת במשך יומיים ב 30 ° c. . הרוזן בשביל לאשר מינון

2. הכנת רקמות מערכת העיכול עבור היסטולוגיה

הערה: חלק זה של הפרוטוקול מותאם מיוהנסון והנסון16.

  1. הכינו 500 mL של הפתרון methacarn (60% מתנול, 30% כלורופורם, 10% חומצה אצטית סינתטית) בצנצנת פלסטיק גדולה בורג ברגים עבור כל 2 בעלי חיים.
    זהירות: מתנול ו כלורופורם מזיקים אם נשאף ויש לתמרן במכסה כימי. חומצה אצטית קרחוני יכול להיות מאכל וצריך להיות מטופל עם ציוד הגנה אישית נאותה. יש להיפטר ממתנול, כלורופורם ומחומצה אצטית קרחוני כפסולת מסוכנת.
  2. בנקודת הקצה הניסיונית, המתת החסד בעלי חיים הומאנית בהתאם לפרוטוקול שאושר על ידי IACUC המקומי.
    הערה: בבעלי חיים שטופלו אנטיביוטי, C. אלביקנס מושבת בדרך כלל נע בין ~ 106 cfus/g ביום 5 עד ~ 5 x 107 cfus/g ביום 25.
  3. לחטא כלים לחיתוך עם אקונומיקה 10% ולשטוף עם 70% אתנול.
  4. , אבטחו את כל החיות לפני הניתוח. והצד הגחוני פונה כלפי מעלה השתמש 30 גרם מחטים כדי לאבטח את הגפיים למשטח הניתוח (איור 2א). רסס את בעל החיים עם 70% אתנול כדי לנקות את הפרווה ולמזער נדבקת הכלים.
  5. באמצעות מלקחיים קהה הסתיים, לצבוט קטע של עור הבטן עם יד לא דומיננטי. באמצעות מספריים עם יד דומיננטית, לשלב את העור ואת fascia הבסיסית ליד בסיס האגן. מתחו את החתך בצורת U לאורך כל צד של חלל הצפק עד כלוב הצלעות. . הרם את העור מהדרך
  6. באמצעות עיפרון, טרום תווית היסטולוגיה קלטות עבור פלחי GI להעריך. לדוגמה, עבור כל בעל חיים, יש לתייג את הקלטות הנפרדות כ"בטן", "המעיים הקטנים ביותר", "המעיים הקטנים", "המעיים הקטנים," המעי הקטן, "cecum" ו-"מעיים גדולים". הצב משטח קצף בתחתית כל קלטת (איור 2א).
    הערה: איור 2ב קווי המתאר המוצעים מקטעים למקום בקלטות.
  7. בעדינות להוציא את המעי. הקהה מחלל הצפק השתמש במספריים לנתק חיבורים בין המעי הקטן למעיים הקטנים והגדולים.
    הערה: רקמת cecal היא עדינה מאוד וקל לקרוע. . שמור על עצמך כשאתה מתפעל
  8. מניחים את כל מעי לתוך קלטת היסטולוגיה, כך שהוא לא מעוות ומניח שטוח (איור 2ג). הניחו משטח מוקצף נוסף למעלה וסגרו את הקלטת. הצב את הקלטת לצנצנת של כובע בורג המכילה את מתיונין.
  9. בלו קטע מהמעי הגדול המכיל 1-2 כדורי צואה, עם אורך פחות מזה של הקסטה.
  10. הניחו את הרקמה בתוך הקסטה, ושמרו על הרקמה השטוחה והבלתי מעוותת. שכבת עם משטח קצף שני וסגור את הקלטת. . מניחים את הקלטת לתוך מתיונין
  11. על כל קטע של המעי הקטן שניתן לדגום, הבלו מקטע של 1-2 ס מ המכיל חומר העיכול.
  12. מניחים את הקטע לתוך קלטת היסטולוגיה, שמירה על הרקמה שטוחה ולא מעוותת. שכבת עם משטח קצף שני וסגור את הקלטת. . מניחים את הקלטת לתוך מתיונין
  13. לבטן, לנתק את החיבורים לוושט ומעיים קטנים. מניחים בקסטה, שומרים על. הרקמה השטוחה והבלתי מעוותת שכבת עם משטח קצף שני וסגור את הקלטת. . מניחים את הקלטת לתוך מתיונין
  14. השאירו את הקלטות בתמיסה של מתיונין ב-RT לפחות 3 שעות ופחות משבועיים.
    הערה: קיימות מספר נקודות שבהן ניתן להעביר את פלחי ה-GI הקבועים לשירות היסטולוגיה מסחרי. רקמות אלה עשויות להיות קשות לסעיף ללא הפרעה של תכני הלומיאל, והתוצאות האופטימליות יתקבלו על ידי טכנאי מנוסה. אם השירות המסחרי מוכן לבצע שוטף לפני הטבעה של רקמות בפרפין, ניתן לשלוח את הקלטות בשלב זה יחד עם הוראות לשלב 2.16.
  15. התחילו להמיס מספיק פרפין שעווה כדי לכסות את כל הקלטות הרקמה בגביע גדול בתנור הכלאה 70 מעלות צלזיוס.
  16. בעקבות קיבעון, להסיר את רפידות קצף ולהחזיר כל מקטע רקמות שלמות בחזרה לתוך הקלטת שלה. שטוף את הרקמות עם הפתרונות הבאים ב-RT עם טלטול: פעמיים עבור 35 דקות ב 100% מתנול, פעמיים עבור 25 דקות ב 100% אתנול, פעמיים עבור 20 דקות ב-xylene.
    זהירות: קסילן הוא דליק, רעיל, והוא יכול לגרום נזק אם שאפה. השתמשו במכסה כימי. עם הגנה ראויה היפטר מקסילן באמצעות תהליכי פסולת מסוכנים.
  17. טפיחה על הקלטות להתייבש על מגבת נייר ומניחים שעווה מלאה בשעווה עבור 2 h ב 70 ° c בתנור הכלאה. ודא שהקלטות מלאות בפרפין ולא נשארות בועות.
    הערה: שלב זה מאפשר שעווה לחדור קטע GI ולייצב את הרקמה ואת התוכן.
  18. הסר את הקלטות משעווה, לאפשר את עודפי שעווה לנקז, ולאחסן ב RT עד שהם מוטבעים בלוקים שעווה. התעלם מהשעווה המכילה כמויות זעירות של מעקב כפסולת מסוכנת.
    הערה: המעבדה האצילה משתמשת בשירות היסטולוגיה מסחרי להטבעה והסרת רקמות. עבור הדמיה סטנדרטית של אס . אל. אלביק ומיקוף, 4 מקטעים יקרומטר משמשים. כדי להעריך את הקישוריות של מקטעי hyphal, הנמתחים בדרך כלל דרך מישורים מרובים, ניתן להשתמש במקטעים של 8 יקרומטר. בהתאם ליכולת של בדיקה דגים לחדור לתוך הדגימה, זה יכול להיות אפשרי להשתמש במקטעים אפילו עבה יותר.

3. ואלידציה של רגשים שעוצבו לאחרונה

הערה: הפרוטוקול הבא לאימות C. אלביקנס הבדיקות הותאם מ swidsinski ואח '17.

  1. פס C. אלביקנס SC5314 והקשר הדוק מינים המשווה (למשל, קנדידה dubliniensis, קנדידהבשנת) כדי yepd + 2% אגר צלחות. המשך 1-2 ימים ב -30 ° c.
  2. החזר 5 מ ל של בינוני נוזלי YEPD עם מושבה אחת.
  3. פיפטה 1 מ ל של תאים מושעה לצינור מיקרוצנטריפוגה ו צנטריפוגה ב 3,000 x g עבור 5 דקות. להיפטר supernatant.
  4. השהה מחדש את הגלולה ב-100 μL של תמיסת מלח מוזרמת פוספט (PBS).
  5. פיפטה 5/10 μL של תאים מושעים מחדש וספוט על שקופית זכוכית. מורחים למעגל גדול יותר ומאפשרים להתייבש.
    הערה: אם תאים אינם מחסיד, השתמש בשקופיות מצופות פולי-ליזין.
  6. מעגל את מקום התא עם עט פאפ ולכסות עם 50 μL של 2.5% פאראפורמלדהיד (בתחתית) ב-PBS. דגירה ב RT עבור 10 דקות.
    זהירות: בכיוון ההוא דליק, והוא עלול לגרום לבעיות בריאותיות, אם נשאף או במגע עם העור. יש להיפטר מפריטים שנגועים באמצעות היחידה הזאת כפסולת מסוכנת.
  7. . שטוף את 3x עם הערוץ הקש על הנוזל על מגבת נייר ולכסות עם 100 μL של PBS. . אני חוזר פעמיים התעלם משטיפה סופית.
  8. הכן שקופיות עבור אחסון מרובה ימים. אם ביצוע דגים באותו יום, המשך לשלב 3.9 ללא השלבים בסעיף זה.
    הערה:     עדיף לבצע את היברידיזציה מיד אבל אם קצר בזמן לאחר שלב 3.8 לפני האחסון. ניתן לאחסן שקופיות במשך מספר ימים ב-4 ° c.
    1. מכסים את המקום עם 60% אתנול. דגירה ב RT עבור 3 דקות. לבטל את הפתרון.
    2. מכסים את המקום עם 80% אתנול. דגירה ב RT עבור 3 דקות. לבטל את הפתרון.
    3. מכסים את המקום עם 100% אתנול. דגירה ב RT עבור 3 דקות. לבטל את הפתרון. . המשך לשלב 3.9
  9. הניחו את השקפים בתנור הכלאה ב-50 ° c בשביל 1 h. אם מעקב אחר שלב 3.8, אחסן את השקופיות ב-4 ° c. אם לא, המשך לשלב 4.2 כדי לבצע את פרוטוקול הכלאה.

4. דגים מכתים ברקמות העיכול

  1. שעווה dewax-סעיפים היסטולוגית מוטבע.
    1. בתנור הכלאה, חמם את צנצנת הקופלין מלאה בקסילן עד 60 ° c.
    2. הכנס את השקופיות לצנצנת המלאה. מקום ב 60 ° c עבור 10 דקות. לבטל את שטיפת הקסילין. שמרו את השקפים בצנצנת ושופכים את הקסילן למיכל פסולת.
    3. יוצקים מחדש RT קסילן לתוך הצנצנת הדגירה ב 60 ° c עבור 10 דקות. להיפטר שטיפת קסילן השני.
    4. למלא את הצנצנת עם 100% אתנול ו-דגירה ב-RT עבור 5 דקות. הסר את השקופיות מהכד והאוויר יבש.
    5. הגדר את התנור הכלאה ל 50 ° c עבור שלבים בסעיף 4.2.
  2. כתם ג. אלביקנס עם הבדיקה דג.
    1. הכינו 1 מ ל של פתרון היברידיזציה טרי (20 mM טריס-HCl, pH 7.4, 0.9 M הנאל, 0.1% נתרן dodecyl סולפט [SDS], 1% הטופסבמים בחינם RNase. ראה טבלה 1 לחישובי דוגמה.
    2. מערבבים יחד 50 μl של פתרון הכלאה עם 1 μl של C. אלביקנס בדיקה (5 ' Cy3-ACAGCAGAAGCCGTGCC 3 '; 50 μg/mL ב rnase-מים חינם) עבור כמות הבדיקה הסופית של 0.5 μg לכל שקופית.
      הערה: עכברים רבים שנולדו במעבדה אינם מכילים שום פטריות בקרב microbiota שלהם. במקרה זה, ניתן להחליף בדיקה פאן פטרייתי (5 ' Cy3-ctctggcttcacccc 3 ') המכיר את ה-23s rrna של המינים הפטרייתיים ביותר, לא רק C. אלביקנס. בניסיון המחברים, בדיקה panפטרייתיים מניב בהיר יותר מאשר C. albicansלווין ספציפי.
    3. להגן על הפתרון מפני אור ולהתחמם עד 50 ° c.
    4. באמצעות עט פאפ, צייר עיגול סביב מקטע הרקמה מסעיף 4.1.
    5. פיפטה 50 μL של בדיקה-המכיל פתרון היברידיזציה על הרקמה הקבועה להתפשט בעדינות על מקטע הרקמה עם טיפ פיפטה. שכבת עם הנוזל עם שמיכות היברידיזציה מוודאים למנוע בועות.
    6. החותם שקופיות בתא היברידיזציה בחלל ומודעות את הסעיפים עבור 3 h ב 50 ° c בחשיכה בתנור הכלאה.
    7. בינתיים, להכין 50 mL של פתרון כביסה דגים (20 מ"מ טריס-HCl, pH 7.4, 0.9 M הנאל ב RNase-מים ללא תשלום). ראה טבלה 1 לחישובי דוגמה.
    8. הזיזו את פתרון הכביסה עד 50 מעלות צלזיוס לחימום מקדים.
    9. לאחר 3 שעות, מוסיפים את פתרון הכביסה לצנצנת של קופלין. אז, בזהירות להסיר את הכיסויים מהשקופית עם מלקחיים ולמקם את השקופית בפתרון כביסה.
    10. לכסות את הצנצנת עם רדיד אלומיניום ו דגירה ב 50 ° c עבור 20 דקות.
    11. במהלך הדגירה הזו, להכין mucin-גרעינים מכתים פתרון (20 ng/mL 4 ′, 6-diamidino-2-פניינילידול [DAPI], 1.6 μg/mL fluorescocyanate [FITC]-לקטין ב PBS). ראה טבלה 1 לחישובי דוגמה. לבטן ולמעיים גדולים, השתמש ב-FITC-Ulex europaeus 1 (ULEX-1). עבור המעי הקטן, cecum, להשתמש בשילוב של הנבט של FITC-UEA-1 ו-FITC-חיטה (WGA).
      הערה: לטינס ממינים שונים מזהים שינויים בסוכר שונים של גליקורופנס כגון mucin. שילובי הקטין המומלצים כאן נקבעו בצורה מדעית לצביעת מיטבי של ריר בתאי GI שונים.
    12. לשטוף את השקופיות על ידי שפיכת הפתרון כביסה דגים מילוי הצנצנת עם RT PBS. שופכים את ה-PBS מיד וממלאים עם PBS. שופכים את ה-PBS עבור סך של 2 שוטף.
    13. Wick הרחק PBS עם רקמת משימה עדינה מגב מעגל את מקטע רקמת המעי עם עט פאפ. מניחים את השקופיות במיכל פלסטיק אטום ומוסיפים 50 μL של התמיסה של מודצין-גרעינים לחלק הרקמה. כסו את המיכל ברדיד אלומיניום כדי להגן מפני אור. דגירה ב 4 ° צ' עבור 45 דקות.
    14. מקם את השקופיות בצנצנת Coplin ושטוף במהירות פעמיים ב-PBS ב-RT.
    15. ולאחר מכן הפתיל החוצה את הטיפות האחרונות של PBS עם רקמה.
    16. מניחים טיפה אחת של בינוני ההרכבה על כל קטע ושכבת-על עם שמיכות זכוכית, מניעת בועות. הנח לאמצעי ההרכבה להתפשט. תחת כל הכיסויים להדמיה מיידית, עוגן את הכיסויים במקום עם לק ציפורניים בפינות. לאחסון לטווח ארוך, לאטום סביב שמיכות עם לק ציפורניים.
    17. צלמו את השקופיות בעזרת מיקרוסקופ פלורסנט.

Representative Results

בעקבות ההוראות שסופקו, התוצאה של טכניקה זו תהיה התוויות פלורסנט של גרעינים ב האפיתל המארח, ריר, ו -C. אלביקנס ברקמות GI מנות. מסוג פראי קנדידה אלביקנס תאים צריך להופיע כמו גם עגול, תאים שמרים חד-תאיים או מוארך מאוד, לפעמים הסתעפות, מיקוף משני תאי (תא התא חטיבות לא יהיה ברור בתוך הלקורבן. מוטציות של C. אלביקנס יכול בנוסף להופיע כמו קטן, מעט מוארך "אפור" או יותר גדול, מעט מוארך "בטן" (המעבר המושרה במערכת העיכול) או "אטום" היעדים.

איור 1 מתאר את המחט האכלה המשמש gavage אוראלי, כמו גם עמדות מפתח של המחט במהלך ההליך gavage. איור 2 מספק התקנה טיפוסית המשמש לניתוח איברים ואת המראה של פלחי GI של העכבר.

איור 3 מציג מכתים דגים של סוגי תאים שונים של C. אלביקנס לאחר התפשטות בתחום החוץ בתוך מודל העכבר. איור 3A מראה את התמונות הפלואורסצנטית והפאזה של קבוע, מחלחל, בתוך הפריה חוץ גופית. היווצרות Hypha המושרה עם נוזל בינוני של לי18 עם 2% N-Acetylglucosamine, pH 6.8 ב 37 ° c. איור 3ב מראה את התמונות הפלואורסצנטית והפאזה של קבוע, מחלחל, בתאי שמרים המופצות באמצעות מבחנה. איור 3ג, ד מראה קבוע, מחלחל, בתאי בטן מחולקים מחוץ לגופית ותאים אטומים, בהתאמה. המעיים וסוגי התאים האטומים הם בעלי הבנה מורפולוגית, למעט כאשר דמיינו על ידי סריקת מיקרוסקופ אלקטרוני. אנא שימו לב כי כתמים של דגים בתאים שעברו הפריה חוץ גופית יהיו מיטביים אם התאים אינם מחלחלים היטב. דוגמה של כתמים חלשים ומפוזר מוצג באיור 3ג. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, יש לקבוע את מצבי הקיבוע התא ואת התנאים הפרביטיזציה עבור כל סוג תא ומינים שיש לחקור. למרבה המזל, הפרוטוקול המומלץ ליצירת המחשה של הרקמות הממנות ברקמה הסיתית מייצר חדירות עקביות יותר.

איור 3E-G מתארים ג. אלביקנס במעי גדול של העכבר, מוכתם עם c. אלביקנס-בדיקה ספציפית (איור 3E) או בדיקה panfungal (איור 3F, G). C. אלביקנס נראה אדום בתמונות אלה, גרעיני תא מארח הם כחולים, ושכבת הריר הוא ירוק. שני היעדים העגולים והמהפהה מאורכים מאוד (ראשי חץ לבנים) מתרחשים במעי הגדול. הינכם מתבקשים לשים לב כי הצביעת בהיר יותר עם המקדח הפטרייתי. איור 3G מתאר מוטציה ume6 באותו תא, מוכתם במחקר panfungal. ume6 מקודד מקדם שעתוק הנדרש עבור hypha היווצרות בתנאים מחוץ למבחנה19 . מעניין, הפנוטיפים הנועלים שמרים המוצגים על ידי המוטציה הזאת תחת התנאים של מבחנה אינו מסכם בתוך הבטן, ורומז שיש להפעיל את הגורם המיותר בתוך המחשב המארח12. איור 4 מתאר את המראה פראי מסוג C. אלביקנס בחלקים שונים של מערכת העיכול מורלין, כולל האזורים הסמוכים מיד לרירית המארח ואזורים מרכזיים יותר של הבטן לומן.

Figure 1
איור 1: האכלה מפתח בתנוחות המחט במהלך gavage. (א) האכלהמחט. (ב) האכלה כדור מחט מוכנס לצד הלשון. (ג) האכלה מחט בתנוחה זקופה עם החדרת הוושט. (ד) האכלה מחט מוכנס לתוך הבטן עם כמה מילימטרים גלויים מעל האף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: פריסת החיתוך לדוגמה. (א) משטח לחיתוך וכלים. (ב) במערכת העיכול. האבויה (הוושט) סעיפים המרוחק (פי הטבעת): אני. בטן. ב. המעיים הקטנים של האבויה. III. המעי הקטן המדיאלי. 4. המעיים הקטנים. . נ. Cecum VI. המעי הגס. תיבות הגבול הוורוד המקווקו מציינות שניתן לתקן את הרקמות. (ג) רקמות הממוקמות בקלטות. ספרות רומיות זהה ללוח B. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: דמויות מייצגות של מוכתם דגים c. אלביקנס. (א) דג של C. אלביקנס צמח במדיה נוזלית של לי18 עם 2% N-acetylglucosamine, pH 6.8. (ב) דג של C. אלביקנס בתאי שמרים הגדלים על yepd + 2% אגר צלחות. (ג) דג של C. אלביקנס בתאי בטן (ySN1045) גדל על yepd + 2% לוחות אגר. (ד) דג של C. אלביקנס תאים שגדלו על yepd + 2% אגר צלחות. (ה) פראי סוג c. אלביקנס (ySN250) במעי גדול, מוכתם עם C. אלביקנסלווין ספציפי. (ו) פראי מסוג C. אלביקנס במעיים גדולים, מוכתם במחקר panfungal. (G) Ume6 החשבונאי (ySN1479) במעי גדול, מוכתם במחקר panfungal: אדום הוא C. אלביקנס, כחול הוא מארח גרעינים אפיתל, וירוק הוא mucin. ראשי חץ מצביעים על מיקוף. חיצים מציינים שמרים. קנה מידה של סרגלים = 20 μm. תמונות F ו-G מותאמים ממכשפות ואח'. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: מראה של מוכתם דגים C. אלביקנס בתאי בטן שונים. פראי מסוג C. אלביקנס מוצג בקטעים המצוינים של מערכת העכבר GI. בתוך כל תא, התמונות מתארות את האזור הסמוך לרירית המארחת ולאזור המרכזי של לומן הבטן. . כתמים בוצע עם המקדח הפטרייתי סרגל קנה מידה = 20 μm. תמונות מותאמים ממכשפות ואח '. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

מניות לאנטיביוטיקה (200x)
פניצילין G 181 מ"ג/mL
סטרפטומיצין 400 מ"ג/μL
מתיאכארן
לאי ריכוז סופי אמצעי אחסון יחידות
מתנול 60% 300 מ ל
כלורופורם 30 150 מ ל
חומצה אצטית קרחוני 10 50 מ ל
פתרון היברידיזציה
לאי ריכוז סופי אמצעי אחסון יחידות
1 M טריס-HCl, pH 7.4 20 ממ ' 20 . אני מבין
5 ליטר 0.9 מ ' 180 . אני מבין
10% SDS 0.10% 10 . אני מבין
100% טופסאחר 1.00% 10 μL (שמרו על שימוש קטן ב-20 ° צ' בין שימושים)
מים בחינם 780 . אני מבין
תמיסת כביסה לדגים
1 M טריס-HCl, pH 7.4 20 ממ ' 1 מ ל
5 ליטר 0.9 מ ' 9 מ ל
מים בחינם 40 מ ל
מוצין-גרעיני מכתים פתרון
DAPI, 10 μg/mL 20 ng/mL 2 . אני מבין
לקטין, 40 μg/mL 1.6 μg/mL 40 . אני מבין
מ7.4 958 . אני מבין

טבלה 1: אמצעי אחסון טיפוסיים וריכוזי פתרונות המשמשים בפרוטוקול זה.

Discussion

השיטה המתוארת כאן מאפשרת ויזואליזציה של ס. אלביקנס לאס ו לקורבן ב-GI המוני של הקולוניה של מדינת המלך כל מין או זן. Hybridizes לבדוק את הדגים כדי לשנות את ה-23S rRNA, אשר מופץ ברחבי הציטופלסמה פטרייתי. השיטה שלנו הותאמה מפרוטוקול שדווח בעבר להמחיש חיידק המעיים20. מכיוון ש -C. אלביקנס משנה את מורפולוגיה בתוך המחשב המארח, השיטה שימושית לניטור צורה של תא פטרייתי כמו גם לוקליזציה. לדוגמה, השתמשנו בשיטה זו כדי להפריך את ההשערה כי לפני כן שולטים לאורך מערכת העיכול, וכיצד לחשוף אי-התאמות בין הvivo ובפנוטיפים מתוך הפריה חוץ גופית של מוטציות "filamentation-פגומים" מסוימים12.

מספר דגמי עכבר קיימים עבור מושבת המושבות. Microbiota של עכברי מעבדה ובני אדם הם ברורים, בעכברים, השימוש באנטיביוטיקה או דיאטה מיוחדת נדרש כדי להקים מושבת יציב. הטיפול עם אנטיביוטיקה גם מגביר C. אלביקנס מושבת בני אדם והוא גורם סיכון משמעותי עבור מחלה שמופץ10. האנטיביוטיקה המשמשת במחקר זה הם זולים יחסית תשואה אמין הקטנת microbiota חיידקי. שים לב כי אנטיביוטיקה משמשים כדי להקטין את הנטל של מינים בקטריאליים עוינת, לא לחסל את כל החיידקים מן החיות. אם החוקרים רוצים ללמוד את האינטראקציות של C. albicans-מארחים בהעדר חיידקים או כדי למנוע שימוש באנטיביוטיקה או תזונה מיוחדת, בעלי חיים ללא חיידקים יכולים להיות מוחלף לבעלי חיים מיוחדים; עם זאת, עכברים גנוטוביוטיים מציגים מומים חיסוניים ואנטומיים מסוימים, ולכן ייתכן שאינם מתאימים לכל המטרות.

מספר שלבים חשובים לצביעת מוצלח של דגים: שיטת הקיבוע המומלצת היא קריטית לשימור השלמות המבנית של רקמות ה-GI, במיוחד התוכן השברירי של לומן הבטן, כגון שכבת הריר והתלת-מימדי ארגון של פטריות וחיידקים16. הינכם מתבקשים לשים לב כי פתרונות הקיבעון הנפוצים רבים המכילים מים מזיקים מאוד לארכיטקטורת הלומיאל. התיקונים והפתרונות עבור שוטף לאחר הקיבעון המומלצים בפרוטוקול זה אינם מכילים מים, וחשוב להימנע מזיהום במים. צעד קריטי נוסף הוא שלב הכלאה, שבו חשוב להימנע מאידוי של פתרון הכלאה במהלך דגירה של שקופיות בתנור הכלאה. אנחנו מציעים להציב את השקופיות במיכל. האטום כדי למנוע בעיה זו לחילופין, אפשר להשתמש בתאי הכלאה היברידיים, כגון אלה ששימשו במקור להכלאה של מיקרו-מערכים.

בדיקת הדגים הספציפית של C. אלביקנסמתוארת בפרוטוקול זה. עם זאת, בגלל הרבה עכברים מגדל מעבדה לא מכילים C. אלביקנס או פטריות אחרות כחלק של הבטן הטבעית שלהם microbiota, בדיקה panfungal עשוי במפורש כתם C. אלביקנס בעלי חיים כנסתיים. החלפת בדיקה פטרייתי עשוי להיות רצוי בגלל המאפיינים היברידיזציה מעולה ויחס האות לרעש גבוה יותר. אם בדיקה panפטרייתיים משמש בדיקה מדומה המדומה עבור C. אלביקנס, חשוב לתעד חוסר בצביעת בעלי חיים לא נגוע (כלומר, מטופלים עם אנטיביוטיקה אבל לא C. אלביקנס). כתמים של בעל חיים שליטה ללא הקולוניה הוא שימושי גם כדי להעריך את צביעת הרקע שעשוי לנבוע מדבקות דגים לחלקיקי מזון. בסך הכל, השימוש בבדיקות דגים מציע ספציפיות משופרת על פני רוב השיטות האחרות של פטריות מכתים, כגון Calcofluor לבן (אשר כתמי כתמים, רכיב קיר תא שעשוי להשתנות בין סוגי תאים), GMS, או נוגדנים מסחרית שזמין נגד פטריות. יתר על כן, הצביעת הדגים מאפשרת כתמים של אורגניזמים מרובים באמצעות שימוש מרובה בבדיקות דגים למין rRNAs ספציפיים.

אזהרה אחת של טכניקה זו היא כי מסוימים C. אלביקנס שמרים סוגי תאים מופיעים דומה מאוד על ידי דגים (למשל, את האטום ואת סוגי תא בטן). כדי להבחין בין סוגי תאים אלה, זה יהיה שימושי לפתח בדיקה היברידיזציה לסוג של תא מסוים של פטריות. עם זאת, בצורתו הנוכחית, טכניקת הדג כבר חשפה סתירות מפתיעות בין הvivo לבין התנהגויות מבחנה של C. אלביקנס מוטציות העריכו בשני התנאים12, המציין אינטראקציות מורכבות ב סביבת ה, שאינה מחקה כראוי את הקיים במרחב החוץ. מחקרים נוספים של כתמי C. אלביקנס שונים בסוג פראי נוסף ומארחי מוטציה צפויים להניב תובנות נוספות לאינטראקציות של מארחים פטרייתי. בפרט, זה יהיה לאלף פרופיל C. אלביקנס במודלים של מחלת המעי הגס, אשר קשורה מגדל גבוה של c. אלביקנס בבני אדם21, ודגמים אחרים של c. אלביקנס יתר ומחלות. טכניקת הדג עשויה גם להיות משולבת עם אימונוהיסטוכימיה כדי להכתים תאים מארחים מסוימים. באופן כללי, השיטה המוצגת כאן מספקת אמצעים מהירים ואמינים לקביעת הלוקליזציה והמבנה של C. אלביקנס בתוך מערכת ה-GI של היונקים.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

המחברים רוצים להודות לקרולינה טרופיני, קתרין נג, ג'סטין סוננבורג ו-KC Huang להדרכה בפיתוח טכניקת הדג. תרזה או'מארה סיפקה הערות מועילות על כתב היד, ומרים לוי סייעה בצילום. עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקים R01AI108992, R01DK113788, ו בורוז ברוך הבא פרס בפתוגנזה של מחלות זיהומיות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe BD 309659 can be substituted from any vendor
BHI blood agar can be substituted from any vendor
C. albicans FISH probe IDT DNA Technologies custom order
Chamber for hybridization incubation watertight chamber meant to reduce evaporation
Chloroform Sigma C2432 >=99.5%
DAPI Roche 10236276001 can be substituted from any vendor
Delicate task wiper tissues Kimberley-Clark 34256CT Kimwipes
D-glucose Sigma G7021-5KG can be substituted from any vendor
Ethanol Sigma E7023 molecular biology grade
Feeding needles Cadence, Inc. 7910 metal; 20 X1-1/2" W/2-1/4; can be autoclaved to sterilize
FITC-UEA-1 Sigma L9006-1MG other fluorophores available
FITC-WGA Sigma L4895-2MG other fluorophores available
Foam pads Fisher 22038221 Order foam pads that will fit within cassettes
Formamide Sigma 47671 molecular biology grade
Glacial acetic acid Macron Fine Chemicals MK881746 ACS reagent, >=99.5%
Glass Coplin jar Fisher 08-815 hold up to 10 slides back to back
Histology cassettes Simport M512 Deep cassettes so cecum is not squished
Hybridization coverslips Sigma GBL712222 RNase-free
Hybridization oven can be substituted from any vendor
LB can be substituted from any vendor
Lee's media prepared as described in Lee et al. 1975
Methanol Sigma 179337 ACS reagent, >=99.8%
Mice Charles River Laboratories 028 adult BALB/c; 18-21 grams (8-10 weeks)
Paraformaldehyde Fisher 50-980-487 16% solution
Parrafin wax Sigma P3558-1KG Paraplast for tissue embedding
PBS, pH 7.4 UCSF Cell Culture Facility Media Production Unit CCFAL003 calcium, magnesium-free; can be substituted from any vendor
Penicillin G Sigma PENNA-100MU
Sabouraud dextrose agar can be substituted from any vendor
Saline Baxter 2F7123 sterile, can be substituted from any vendor
Sodium chloride (NaCl) Sigma S3014 can be substituted from any vendor; maintain RNase-free
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma L3771 can be substituted from any vendor; maintain RNase-free
Streptomycin Sigma S9137-100G
Super PAP pen Life Technologies 8899 can be substituted from any vendor
Tris-HCl Sigma T3253 can be substituted from any vendor; maintain RNase-free
Vectashield Vector Laboratories H-1000 does not contain DAPI
Xylenes Sigma 214736 reagent grade
YEPD can be substituted from any vendor

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Noble, S. M., Gianetti, B. A., Witchley, J. N. Candida Albicans Cell-Type Switching and Functional Plasticity in the Mammalian Host. Nature Reviews in Microbiology. 15 (2), 96-108 (2017).
  2. Bacher, P., et al. Human Anti-fungal Th17 Immunity and Pathology Rely on Cross-Reactivity against Candida albicans. Cell. 176 (6), 1340-1355 (2019).
  3. Shao, T. Y., et al. Commensal Candida albicans Positively Calibrates Systemic Th17 Immunological Responses. Cell Host and Microbe. 25 (3), 404-417 (2019).
  4. Jiang, T. T., et al. Commensal Fungi Recapitulate the Protective Benefits of Intestinal Bacteria. Cell Host and Microbe. 22 (6), 809-816 (2017).
  5. Iliev, I. D., et al. Interactions Between Commensal Fungi and the C-Type Lectin Receptor Dectin-1 Influence Colitis. Science. 336 (6086), 1314-1317 (2012).
  6. Fan, D., et al. Activation of HIF-1 alpha and LL-37 by Commensal Bacteria Inhibits Candida Albicans Colonization. Nature Medicine. 21 (7), 808-814 (2015).
  7. Koh, A. Y., Kohler, J. R., Coggshall, K. T., Van Rooijen, N., Pier, G. B. Mucosal Damage and Neutropenia Are Required for Candida Albicans Dissemination. PLoS Pathogens. 4 (2), e35 (2008).
  8. Yamaguchi, N., et al. Gastric Colonization of Candida Albicans Differs in Mice Fed Commercial and Purified Diets. Journal of Nutrition. 135 (1), 109-115 (2005).
  9. Kadosh, D., et al. Effect of Antifungal Treatment in a Diet-Based Murine Model of Disseminated Candidiasis Acquired via the Gastrointestinal Tract. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (11), 6703-6708 (2016).
  10. Perlroth, J., Choi, B., Spellberg, B. Nosocomial Fungal Infections: Epidemiology, Diagnosis, and Treatment. Medical Mycology. 45 (4), 321-346 (2007).
  11. Pande, K., Chen, C., Noble, S. M. Passage Through the Mammalian Gut Triggers a Phenotypic Switch That Promotes Candida Albicans Commensalism. Nature Genetics. 45 (9), 1088-1091 (2013).
  12. Witchley, J. N., et al. Candida Albicans Morphogenesis Programs Control the Balance between Gut Commensalism and Invasive Infection. Cell Host and Microbe. 25 (3), 432-443 (2019).
  13. Noble, S. M., Gianetti, B. A., Witchley, J. N. Candida Albicans Cell-Type Switching and Functional Plasticity in the Mammalian Host. Nature Reviews in Microbiology. 15 (2), 96-108 (2017).
  14. Balish, E., Filutowicz, H., Oberley, T. D. Correlates of Cell-Mediated Immunity in Candida Albicans-Colonized Gnotobiotic Mice. Infection and Immunity. 58 (1), 107-113 (1990).
  15. Guarner, J., Brandt, M. E. Histopathologic Diagnosis of Fungal Infections in the 21st Century. Clinical Microbiology Reviews. 24 (2), (2011).
  16. Johansson, M. E., Hansson, G. C. Preservation of Mucus in Histological Sections, Immunostaining of Mucins in Fixed Tissue, and Localization of Bacteria with FISH. Methods in Molecular Biology. 842, 229-235 (2012).
  17. Swidsinski, A., Weber, J., Loening-Baucke, V., Hale, L. P., Lochs, H. Spatial Organization and Composition of the Mucosal Flora in Patients with Inflammatory Bowel Disease. Journal of Clinical Microbiology. 43 (7), 3380-3389 (2005).
  18. Lee, K. L., Buckley, H. R., Campbell, C. C. An Amino Acid Liquid Synthetic Medium for the Development of Mycelial and Yeast Forms of Candida Albicans. Sabouraudia. 13 (2), 148-153 (1975).
  19. Banerjee, M., et al. UME6, a Novel Filament-Specific Regulator of Candida Albicans Hyphal Extension and Virulence. Molecular Biology of the Cell. 19 (4), 1354-1365 (2008).
  20. Earle, K. A., et al. Quantitative Imaging of Gut Microbiota Spatial Organization. Cell Host and Microbe. 18 (4), 478-488 (2015).
  21. Sokol, H., et al. Fungal Microbiota Dysbiosis in IBD. Gut. 66 (6), 1039-1048 (2017).

Tags

אימונולוגיה וזיהום סוגיה 153 קנדידה אלביקנס מעיים בטן פלורסנט באתרו היברידיזציה (דג) רירית לוקליזציה מורפולוגיה
ויזואליזציה של <em>קנדידה אלביקנס</em> במערכת העיכול מוריין באמצעות פלורסנט היברידיזציה באתרו
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Witchley, J. N., Penumetcha, P. M.,… More

Witchley, J. N., Penumetcha, P. M., Noble, S. M. Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (153), e60283, doi:10.3791/60283 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter