Summary
Целью этого протокола является визуализация формы клеток Candida Albicans и локализации в желудочно-кишечном тракте млекопитающих.
Abstract
Candida Albicans является грибковым компонентом микрофлоры кишечника у людей и многих других млекопитающих. Хотя C. albicans не вызывает симптомов у большинства колонизированных хостов, комменсальный резервуар действительно служит хранилищем для инфекционных заболеваний, а наличие высоких грибковых титра в кишечнике связано с воспалительным заболеванием кишечника. Здесь мы описываем метод визуализации морфологии клеток C. Albicans и локализации в мышиной модели стабильной колонизации желудочно-кишечного тракта. Колонизация устанавливается с использованием одной дозы C. Albicans у животных, которые были обработаны с пероральными антибиотиками. Сегменты тканей кишечника фиксируются таким образом, что сохраняет архитектуру содержания светила (микроорганизмы и слизь), а также слизистой оболочки хозяина. Наконец, флуоресцентные на месте гибридизации осуществляется с использованием зондов против грибковых rRNA пятно для C. альбиканов и гиф. Ключевым преимуществом этого протокола является то, что он позволяет одновременно наблюдать за морфологией клеток C. albicans и ее пространственной связью со структурами хозяина во время желудочно-кишечной колонизации.
Introduction
Candida Albicans является грибковым commensal, а также оппортунистических человеческих патогенов. Это дрожжи не хватает определенной экологической ниши и вместо этого распространяется в желудочно-кишечного тракта (GI) тракта, кожи и мочеполового тракта человека и других млекопитающих1. В то время как ранние исследования C. albicans сосредоточены в первую очередь на его потенциал вирулентности, несколько последних докладов показывают, что commensally распространения организмов в кишечнике может играть важную роль в нормальном здоровье, в том числе иммунного развития хост2,3,4. Для облегчения исследований C. Albicans commensalism в кишечнике млекопитающих, мы разработали модель мыши стабильной колонизации Г. И. и флуоресценции на месте гибридизации (FISH) метод визуализации грибковых дрожжевых клеток и гифы в кишечный просвет.
За некоторыми исключениями5,лабораторно воспитанных мышей, как правило, проявляют устойчивость к грибковой колонизации пищеварительного тракта. Устойчивость к колонизации, как полагают, опосредовано конкретными бактериальными видами; однако, это может быть преодолено путем лечения животных антибиотиками6,7 или использование химически определенной диеты, которая предположительно изменяет состав бактериальных видов8,9. Аналогичным образом, у людей, использование антибиотиков широкого спектра был связан с C. Albicans разрастание и распространение10. Наша модель колонизации морин использует антибиотики широкого спектра для установления колонизации C. albicans иммунокомпетентных, условно выращенных мышей. Пенициллин и стрептомицин подаются в питьевую воду животных в течение одной недели до gavage с 108 колоний формирования единиц (CFUs) C. Albicans. До тех пор, как антибиотик-настояна вода продолжается, C. albicans будет размножаться через желудочно-кишечного тракта, достигнув фекальные титры 106108 CFUs/g. Несмотря на высокий уровень грибковой колонизации, животные остаются здоровыми и набираются вес с той же скоростью, что и неинфицированные элементы управления. Эта модель была успешно использована для скрининга и характеризуют несколько C. Albicans commensalism факторов11,12.
Как и другие члены грибкового царства, C. albicans способен к огромной морфологической пластичности13. В условиях in vitro было показано, что переход между по крайней мере шестью одноклеточными типами дрожжевых клеток, а также многоклеточными гифами и псевдогифами. Переход от дрожжей к гифе является одним из его наиболее характерных атрибутов вирулентности, и гифы и псевдогифы преобладают в большинстве моделей болезней млекопитающих, а также в инфицированных человеческих тканях. Для определения локализации C. albicans и морфологии клеток в пищеварительном тракте, мы разработали метод FISH для окрашивания дрожжей и гиф в фиксированных гистологических разделах. Зонды состоят из флуоресцентно помеченных олигонуклеотидов ДНК, которые гибридизируются с грибковой 23S рибосомной РНК (rRNA), которая распространяется по всей грибковой цитоплазме. Поскольку ткани хозяина фиксируются таким образом, что сохраняет трехмерную архитектуру кишечника, в том числе слизистую оболочку хозяина, пищеварительный материал, бактериальную микробиоту и слизь в просвете кишечника, эта техника позволяет локализацию грибковых веществ клетки по отношению к этим ориентирам, когда окрашенные. Техника FISH выгодно отличается от традиционных гистологических пятен для грибов, таких как периодическая кислота Шифф (PAS) или метиламин-серебро Гомори (GMS), а также коммерчески доступные противогрибковые антитела, потому что эти реагенты не специфичны для К. Альбиканс. Кроме того, стандартные фиксаторы удалить слизистой слой и нарушить другое содержимое просвета кишечника14,15.
В этой статье мы предоставляем подробные инструкции по установлению полноценной C. Albicans колонизации мыши желудочно-кишечного тракта, для вскрытия пищеварительного тракта от эвтаназии животных, для фиксации тканей таким образом, что сохраняет светило архитектуры, а также для обнаружения C. albicans в тканях хозяина с помощью FISH. В дополнение к дикому типу и мутантным штаммам C. Albicans, метод gavage может быть использован для доставки других микроорганизмов. Техника фиксации была бы полезна для любого исследования, в котором желательно сохранение содержимого кишечника. Процедура FISH может быть завершена в течение дня и может быть использована для локализации нескольких грибковых видов с помощью нескольких, дифференциально обозначенных зондов.
Protocol
Меры, описанные ниже, были одобрены Институциональным комитетом ucSF по уходу за животными и использованию (IACUC).
1. Колонизация желудочно-кишечного тракта мышей с C. Albicans использованием устного гаважа
- Обеспечить жильем для 18-21 г мышей мужского или женского пола (от 8 до 10 недель) в том виде, в каком он одобрен местным IACUC. Используйте автоматические продукты питания и воду, начиная с первого дня.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование стерилизованных клеток, постельных принадлежностей, продуктов питания и воды снижает риск заражения устойчивыми к антибиотикам экологическими бактериями, которые потенциально могут вытеснить C. Albicans из кишечника. Кроме того, в зависимости от экспериментального вопроса, индивидуальное жилье животных должны быть рассмотрены, потому что мыши копрофагии и содержимое кишечника будут разделены между cohoused животных. - На следующий день замените автоклавированную питьевую воду с автоматической водой, содержащей 5% глюкозы, 1500 U/mL пенициллина G и 2 мг/мл стрептомицина.
- Для удобства приготовьте 200x антибиотико-стоковые растворы(таблица 1) заранее, фильтр стерилизовать, и заморозить при -20 градусов по Цельсию.
- Поддерживайте животных антибиотиками в течение одной недели.
- На 3 и 6 дней после того, как антибиотики были начаты, оценить кал каждого животного для загрязнения с устойчивыми к антибиотикам аэробными бактериями. Держа животное одной рукой, поместите необнаруженную микрофугу трубку возле ануса и соберите по крайней мере одну фекальные гранулы.
- Приостановите каждый фекальные гранулы в 1 мл стерильной воды и пластины 100 л на бульоне Лурии (LB), дрожжевом экстракте пептон декстроза (YEPD), или инфузии сердца мозга (BHI) плюс агарные пластины крови. Инкубировать пластины на ночь в стандартном инкубаторе (не анаэробных) при 37 градусах Цельсия и оценить для роста бактерий.
ПРИМЕЧАНИЕ: Плиты должны иметь минимальный рост (0-20 колоний). Если 20 колоний бактерий будут извлечены из животных, обработанных пенициллином и стрептомицином, то маловероятно, что будет установлена колонизация на высоком уровне с помощью C. albicans и эксперимент следует прервать.
- За три дня до gavage, полоса C. Albicans из замороженных запасов глицерола в YEPD - 2% агарпластины и инкубировать при 30 градусах Цельсия в течение 2 дней.
- За день до gavage, привить одну колонию каждого штамма C. albicans для тестирования в 5 мл жидкой YEPD. Инкубировать при 30 градусах Цельсия на ночь с встряхиванием.
- Утро gavage, разбавить насыщенной культуры C. albicans до оптической плотности на 600 нм (OD600) 0,1 в 100 мл YEPD предварительно нагревается до 30 градусов по Цельсию. Встряхните в орбитальной шейкере при 200 об/мин при 30 градусах по Цельсию в течение от 4 ч до 5 ч до тех пор, пока OD600 не достигнет 1 (рост среднего входа).
- Перенесите каждую культуру 100 мл на две конические трубки 50 мл и центрифугу при 3000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре (RT).
ПРИМЕЧАНИЕ: C. albicans распространяется относительно медленно на RT. При адаптации этого протокола для другого вида, прививки, возможно, потребуется сохранить на льду, чтобы предотвратить дальнейший рост. - Откажитесь от супернатанта, resuspend pelleted клеток в 20 мл стерильного сольника на 50 мл культуры, и объединить дубликат повторной гранулы в одной конической трубки. Центрифуга при 3000 х г в течение 5 мин.
- Откажитесь от супернатанта и отбросьте в 20 мл стерильного солья. Vortex кратко и удалить 20 л для измерения OD600. Разбавить 1:50 в стерильном нормальном сольном. Центрифуге оставшиеся повторно ежей на 3000 х г в течение 5 мин.
- Отбросьте супернатант. Для инокулума размер 1 х 108 CFU, resuspend pelleted клеток примерно 5 х 108 CFUs/mL в стерильных нормальных солей на основе предполагаемой концентрации определяется от OD600 измерения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, OD600 из 1 соответствует 1 х 107 дрожжевых клеток / мл. Это значение может варьироваться в зависимости от спектрофотометра и должно быть проверено. Если изменение концентрации желательно для инфекций с другим микроорганизмом, план для инокулум объем ю 10 л / г мыши, чтобы свести к минимуму дискомфорт для животного. - Проверьте концентрацию инокулума, посчитав 1:1,000 разбавления гемоситометром. Отрегулируйте объем клеток, которые будут gavaged на основе концентрации определяется с помощью гемоситометра.
- Используя иглу для кормления животных(рисунок 1А), gavage каждое животное с расчетным объемом данного инокулума. См, которые будут делать сявки 1.13.1-1.13.8 для процедуры gavage.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обучение для gavage должны быть получены от опытного практикующего, и процедура должна быть освоена заранее. Успешная процедура для одного животного обычно занимает не более 1 мин.- Прикрепите автоклавированную иглу для кормления животных к шприцу объемом 1 мл и заполните шприц одним объемом гаважа, удалив любые пузырьки воздуха, чтобы избежать неточной дозы. Место на стерильной поверхности.
- Защищайте животное для gavage. Держите животное у основания хвоста с доминирующей рукой и сдвиньте недоминирующую руку вверх по спине животного к свободной коже прямо за ушами.
- Используя указательный палец и большой палец недоминирующей руки, собрать свободную кожу вместе плотно; это "скрюк". Возьмите животное за потертости и петлю маленький палец той же (недоминирующей) стороны вокруг хвоста, чтобы обездвижить животное против ладони. Аккуратно вытяните голову животного так, чтобы его голова и тело (и, следовательно, шея и пищевод) были в прямой линии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Попытка gavage в то время как тело животного согнуты или скручены может привести к осложнениям, таким как перфорация пищевода и смерть животного. - Возьмите шприц с доминирующей рукой и держать перпендикулярно животному, с изогнутой иглой, указывая вниз (Рисунок 1B). Используя шарик иглы, аккуратно зацепите внутренний угол рта, аккуратно продвигайте иглу вдоль стороны рта к задней части горла и, наконец, переместите иглу в центр.
ПРИМЕЧАНИЕ: Введение иглы вдоль бокового пути помогает избежать сопротивления со стороны зубов и языка животного. - После того, как мяч иглы находится в задней части горла, наклонить иглу так, что она параллельно линии тела животного(Рисунок 1C).
ПРИМЕЧАНИЕ: В этот момент, животное будет проявлять рвотный рефлекс. Это хороший знак, который указывает на то, что игла расположена правильно, и кляпом во рту движение помогает направлять иглу вниз пищевода. Если нет рвотного рефлекса, игла может быть в трахее, а не пищевода. Аккуратно снимите иглу и вернитесь к шагу 1.13.1. - Разрешить животному проглотить инокулум до тех пор, пока только несколько миллиметров остаются видимыми(Рисунок 1D). Предварительно игла плавно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если игла не продвигается вперед, избегайте применения силы, которая может повредить пищевод. Иногда продвижение последнего полусантиметра потребует от животного сверхбольшого кляпа. Если игла, кажется, застряла, медленно снять его и попробуйте еще раз от шага 1.13.4. - Проверьте, что шар иглы находится в правильном месте (желудок) по мягко продвижения поршень. Если нет сопротивления, продолжайте доставлять инокулум. После того, как инокулум был введен, медленно снять иглу.
- Замените животное в клетке и продолжайте следить за животным в течение 5–10 мин на наличие признаков затрудненного дыхания или бедствия. Убедитесь, что животное возобновляет нормальную деятельность вскоре после gavage.
- Если тот же инокулум будет использоваться со следующим животным, очистите иглу спиртом. Вернитесь к шагу 1.13.1. Если будет использован другой инокулум, используйте новую иглу и вернитесь к шагу 1.13.1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно осматривать животных на следующий день после гаважа. У животных, проявляющих признаки дистресса (например, сгорбленные осанки, затрудненное дыхание) следует гуманно усыплять, так как они, скорее всего, пострадали от разрыва пищевода, повреждения легких или другой внутренней травмы, от которой восстановление маловероятно.
- После gavage животных, пластины разбавления инокула для проверки дозы.
- Подготовка 10-раз серийных разбавлений до 1:105. Плита один gavage объем 1:105 разбавления на 100 мм пластины Sabouraud dextrose агар.
- Инкубировать тарелку в течение 2 дней при 30 градусах Цельсия. Подсчитайте CFUs для подтверждения дозы инокулума.
2. Подготовка желудочно-кишечных тканей для гистологии
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раздел протокола адаптирован от Johansson и Hansson16.
- Приготовьте 500 мл раствора метакарна (60% метанола, 30% хлороформа, 10% ледниковой уксусной кислоты) в большой пластиковой банке винтовой крышки на каждые 2 рассеченных животных.
ПРЕДЕКТО: Метанол и хлороформ вредны при вдыхании и должны быть обработаны в химическом капоте. Ледниковая уксусная кислота может быть коррозионной и должна быть обработана с надлежащей индивидуальной защиты оборудования. Метанол, хлороформ и ледниковая уксусная кислота должны быть отброшены в качестве опасных отходов. - На экспериментальной конечную точку, эвтаназии животных гуманно в соответствии с протоколом, утвержденным местным IACUC.
ПРИМЕЧАНИЕ: В обработанных антибиотиками животных, C. albicans колонизации обычно колеблется от 106 CFUs/g на день 5 до 5 х 107 CFUs/g на день 25. - Стерилизовать инструменты вскрытия с 10% отбеливателя и промыть 70% этанола.
- Защитите каждое животное на поверхности вскрытия, с брюшной стороной вверх. Используйте 30 G иглы для обеспечения конечностей на поверхность вскрытия(Рисунок 2A). Спрей животное с 70% этанола для очистки меха и свести к минимуму прилипание к инструментам.
- Используя тупые щипчут, щипать участок брюшной кожи недоминирующей рукой. Используя ножницы с доминирующей рукой, разрезать кожу и лежащие в основе фасции вблизи основания таза. Расширьте разрез в форме U вдоль каждой стороны перитонеальной полости и до грудной клетки. Поднимите кожу в сторону.
- Используя карандаш, предварительно этикетки гистологии кассеты для СЕГМЕНТов GI для оценки. Например, для каждого животного, этикетки отдельных кассет, как "желудок", "проксимальный тонкий кишечник", "средний тонкий кишечник", "дистальный тонкий кишечник", "cecum", и "большой кишечник". Поместите пенную подушечку на дно каждой кассеты(рисунок 2А).
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2B очертания предложены разделы для размещения в кассетах. - Используя тупые щипчинки, аккуратно извлеките цекум из перитонеальной полости. Используйте ножницы, чтобы разорвать связи между cecum и тонкой и толстой кишки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Цекал ткани очень деликатный и легко разорвать. Будьте осторожны при манипулировании. - Поместите весь cecum в гистологию кассеты так, чтобы он раскручивается и лежит плоским(рисунок 2C). Поместите вторую пенную подушечку сверху и закройте кассету. Поместите кассету в банку винтовой крышки, содержащую метакарн.
- Акциз раздел толстой кишки, который содержит 1'2 фекальные гранулы, с длиной меньше, чем у кассеты.
- Поместите секцию ткани в кассету, сохраняя ткань плоской и раскрученой. Наложить на вторую пенную площадку и закройте кассету. Поместите кассету в метакарн.
- Для каждого участка тонкого кишечника, который будет отобран, акциз 1'2 см сегмент, который содержит некоторые пищеварительный материал.
- Поместите сегмент в гистологию кассеты, сохраняя ткани плоскими и раскручены. Наложить на вторую пенную площадку и закройте кассету. Поместите кассету в метакарн.
- Для желудка, разорвать соединения с пищеводом и тонкого кишечника. Поместите в кассету, сохраняя ткань плоской и раскрученой. Наложить на вторую пенную площадку и закройте кассету. Поместите кассету в метакарн.
- Оставьте кассеты в растворе метакарна на RT не менее 3 ч и менее 2 недель.
ПРИМЕЧАНИЕ: Есть несколько моментов, в течение которых фиксированные сегменты ГИ могут быть переданы в коммерческую гистологию службы. Эти ткани могут быть трудно раздел без нарушения содержания светила, и оптимальные результаты будут получены опытным техником. Если коммерческая служба готова выполнять стирок до встраивания тканей в парафин, кассеты могут быть отправлены на данном этапе вместе с инструкциями для шага 2.16. - Начните таять достаточно парафина воска, чтобы покрыть все ткани кассеты в большой стакан в предварительно разогретой 70 градусов по Цельсию гибридизации печи.
- После фиксации, удалить пены колодки и вернуть каждый нетронутой ткани разделе обратно в кассету. Вымойте ткани со следующими растворами на RT с встряхиванием: дважды за 35 мин в 100% метанола, дважды за 25 мин в 100% этанола, дважды на 20 мин в ксилене.
ПРЕДЕКТО: Ксилен является легковоспламеняющимся, токсичным, и может привести к повреждению при вдыхании. Используйте в химическом капюшоне с надлежащей защитой. Утилизация ксилена с помощью опасных отходов процедур. - Пэт кассеты сухие на бумажное полотенце и место в предварительно расплавленный парафин воск на 2 ч при температуре 70 градусов по Цельсию в духовке гибридизации. Убедитесь, что кассеты заполнены парафином и не остаются пузырьки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг позволяет воск проникнуть в сегмент GI и стабилизировать ткани и содержимое. - Удалите кассеты из воска, позволяют избыток воска для слива, и хранить на RT, пока они не встроены в восковые блоки. Откажитесь от воска, содержащего следовые количества ксиленов в качестве опасных отходов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Благородная лаборатория использует коммерческую гистологию для встраивания и секции тканей. Для стандартной визуализации дрожжей C. Albicans и гиф, 4 мкм разделы используются. Для оценки подключения гифальных сегментов, которые обычно распространяются через несколько плоскостей, можно использовать 8 мкм секций. В зависимости от способности зондов FISH проникать в образец, можно использовать еще более толстые секции.
3. Проверка новых зондов
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол для проверки зондов C. Albicans был адаптирован из Swidsinski et al.17.
- Streak C. albicans SC5314 и тесно связанные виды компараторов (например, Candida dubliniensis, Candida tropicalis) до YEPD - 2% агарные тарелки. Инкубировать в течение 1-2 дней при 30 градусах Цельсия.
- Прививать 5 мл жидкой среды YEPD с одной колонией.
- Пипетка 1 мл взвешенных клеток в микроцентрифугую трубку и центрифугу при 3000 х г в течение 5 мин. Отбросьте супернатант.
- Повторное увеличение гранул в 100 л фосфатно-буферного солира (PBS).
- Пипетка 5-10 л из переистевых ячеек и пятно на стеклянной горке. Распространение в больший круг и дайте высохнуть.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если клетки не являются приверженцами, используйте поли-L-лизин с покрытием слайдов. - Обведите клеточное пятно ручкой PAP и накройте 50 зл параформальдегида (PFA) в PBS. Инкубировать на RT в течение 10 мин.
ПРЕДЕКТО: ПФА легковоспламеняется и может вызвать проблемы со здоровьем при вдыхании или в контакте с кожей. Предметы, загрязненные ПФА, следует выбрасывать в качестве опасных отходов. - Вымойте 3x с PBS. Нажмите жидкость на бумажное полотенце и накройте 100 ЗлЛ PBS. Повторите дважды. Откажитесь от окончательной стирки.
-
Подготовьте слайды для многодневного хранения. При выполнении FISH в тот же день, перейдите к шагу 3.9 без шагов в этом разделе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительно выполнить гибридизацию немедленно, но если не долго следовать шаг 3.8 перед хранением. Слайды можно хранить в течение нескольких дней при 4 градусах Цельсия.- Обложка месте с 60% этанола. Инкубировать на RT в течение 3 мин. Отбросьте раствор.
- Обложка месте с 80% этанола. Инкубировать на RT в течение 3 мин. Отбросьте раствор.
- Обложка месте с 100% этанола. Инкубировать на RT в течение 3 мин. Отбросьте раствор. Приступай к шагу 3.9.
- Поместите горки, обнаруженные в духовке гибридизации при температуре 50 градусов по Цельсию на 1 ч. Если шаг 3.8 был последовать, храните слайды при 4 градусах Цельсия. Если нет, то приступайте к шагу 4.2 для выполнения протокола гибридизации.
4. FISH Sstaining в Тканях ЖЕЛУДОЧНО-кишечного тракта
- Dewax парафин встроенных гистологических разделов.
- В духовке гибридизации, prewarm коплин банку заполнены ксилена до 60 градусов по Цельсию.
- Вставьте слайды в заполненную ксиленом банку. Поместите при 60 градусах по Цельсию в течение 10 мин. Отбросьте ксиленовый стирку. Держите слайды в банке и слить ксилена в контейнер для отходов.
- Налейте свежий RT ксилена в банку и инкубировать при 60 градусах по Цельсию в течение 10 мин. Отбросьте вторую ксиленовую стирку.
- Заполните банку 100% этанолом и инкубировать на RT в течение 5 мин. Удалить слайды из банки и воздух сухой.
- Установите духовку гибридизации до 50 градусов по Цельсию для шагов в разделе 4.2.
- Пятно C. Альбиканс с зондом FISH.
- Приготовьте 1 мл свежего раствора гибридизации (20 мм Tris-HCl, pH 7.4, 0.9 M NaCl, 0,1% сульфат атрия dodecyl (SDS), 1% формамидавида в безрычании RNase). См таблица 1 для расчетов выборки.
- Смешайте 50 злиц раствор амплизации с 1 л зонда C. albicans (5' Cy3- ACAGGAAGCCGTCCC 3'; 50 мкг/мл в свободной от RNase воде) для окончательного количества зонда 0,5 мкг на слайд.
ПРИМЕЧАНИЕ: Многие лабораторно воспитанные мыши не содержат грибов среди их микробиоты. В этом случае можно заменить пангрибаковый зонд (5' Cy3-CTCTGGTCACCCTTTC 3'), который распознает 23S rRNA большинства грибковых видов, а не только C. albicans. По опыту авторов, panfungal зонд дает ярче окрашивания, чем C. Albicans-специфическийзонд. - Защитите раствор от света и претеплый до 50 градусов по Цельсию.
- Используя ручку PAP, нарисуйте круг вокруг раздела ткани из раздела 4.1.
- Пипетка 50 злител зонд-содержащего раствор гибридизации на фиксированной ткани и аккуратно распространяется по ткани разделе с кончиком пипетки. Накладывай жидкость с гибридизацией coverslip убедившись, чтобы предотвратить пузырьки.
- Уплотнение скользит в водонепроницаемой камере гибридизации и инкубирует секции на 3 ч при температуре 50 градусов в темноте в духовке гибридизации.
- Между тем, подготовить 50 мл FISH стиральный раствор (20 мм Tris-HCl, рН 7,4, 0,9 м NaCl в RNase свободной воды). См таблица 1 для расчетов выборки.
- Переместите стиральный раствор до 50 градусов по Цельсию, чтобы предварительно разогреть.
- После 3 ч добавьте стиральный раствор в банку Coplin. Затем осторожно снимите крышку с горки с помощью щипков и поместите слайд в стиральный раствор.
- Накройте банку алюминиевой фольгой и инкубируйте при 50 градусах по Цельсию в течение 20 мин.
- Во время этой инкубации, подготовить муцин-ядерный окрашивающий раствор (20 нг/мл 4 ",6-диамидино-2-фенилинол "DAPI", 1,6 мкг/мФл флюоресцеин изотиоцианат (FITC)-лектин в PBS). См таблица 1 для расчетов выборки. Для желудка и толстого кишечника используйте FITC-Ulex europaeus agglutinin 1 (UEA-1). Для тонкого кишечника и cecum, используйте комбинацию FITC-UEA-1 и FITC-пшеница зародышевой агглютинин (WGA).
ПРИМЕЧАНИЕ: Лектины из разных видов признают различные изменения сахара гликопротеинов, таких как муцин. Рекомендуемые здесь комбинации лектина были определены эмпирически для оптимального окрашивания слизи в различных отсеках GI. - Вымойте слайды, выливая раствор FISH для мытья и пополнив банку с помощью RT PBS. Налейте PBS немедленно и пополнить с PBS. Налейте PBS в общей сложности 2 стир.
- Wick прочь PBS с деликатной тканью стеклоочистителя задачи и обведи тетру кишечной ткани с ручкой PAP. Поместите слайды в непрозрачный пластиковый контейнер и добавьте 50 зл муцинов-ядеросного раствора в секцию тканей. Обложка контейнера с алюминиевой фольгой для защиты от света. Инкубировать при 4 градусах по Цельсию в течение 45 мин.
- Поместите слайды в банку Коплин и быстро мыть дважды в PBS на RT.
- Нажмите прочь избыток PBS на бумажное полотенце, а затем фитиль от окончательных капель PBS с тканью.
- Поместите одну каплю монтажной среды на каждую секцию и налейте стеклянным покрытием, предотвращая пузыри. Пусть монтаж наяпадная среда распространяется под всем покрытием. Для немедленного изображения, якорь coverslip на месте с лаком для ногтей по углам. Для длительного хранения, печать вокруг крышки с лаком для ногтей.
- Изображение слайдов с помощью флуоресцентного микроскопа.
Representative Results
В соответствии с инструкциями, результатом этой техники будет флуоресцентная маркировка ядер в эпителии хозяина, слизи и C. albicans в секционированных тканях Г. Дикий тип Candida Albicans клетки должны появиться как круглые, одноклеточные дрожжевые клетки или очень удлиненные, иногда ветвления, многоклеточные гифы (клеточные деления не будут очевидны в гифае). Мутанты C. albicans могут дополнительно казаться более мелкими, слегка удлиненных «серыми» дрожжами или более крупными, слегка удлиненным «ГУТ» (желудочно-кишечный переход) или «непрозрачными» дрожжами.
На рисунке 1 изображена кормящую игла, используемая для перорального гаважа, а также ключевые положения иглы во время процедуры гаважа. Рисунок 2 обеспечивает типичную установку, используемую для вскрытия органов и появления сегментов GI мыши.
Рисунок 3 отображает FISH окрашивание различных типов клеток C. albicans после распространения в пробирке и в модели мыши. На рисунке 3А показана флуоресценция и фазовые изображения фиксированных, пермяковых, в ипроколовых гифах. Гифа образование было индуцировано с жидкостью Ли в среднем18 с 2% N-ацетилглукосамин, рН 6,8 при 37 градусов по Цельсию. На рисунке 3B показаны флуоресценция и фазовые изображения фиксированных, пермяковых, в пробирковых дрожжевых клеток. Рисунок 3C, D показывает фиксированные, permeabilized, в пробирке-распространяемых клеток GUT и непрозрачных клеток, соответственно. GUT и непрозрачные типы клеток морфологически неразличимы, за исключением случаев, когда визуализированы путем сканирования электронной микроскопии. Пожалуйста, обратите внимание, что FISH окрашивания в пробирке-распространяемых клеток будет неоптимальным, если клетки не хорошо пронизаны. Пример слабого и рассеянного окрашивания показан на рисунке 3C. Для достижения наилучших результатов, клеточная фиксация и условия промеялизации должны быть определены эмпирически для каждого типа клеток и видов, которые будут исследованы. К счастью, рекомендуемый протокол визуализации C. albicans в секционированных тканях производит более последовательную пермяковую.
Рисунок 3E-G изображают C. albicans в мышитолстой толстой кишки, окрашенные C. Albicans-специфическийзонд(Рисунок 3E) или panfungal зонд(Рисунок 3F,G). C. Albicans появляется красным на этих изображениях, ядра клетки-хозяина синие, а слой слизи зеленый. Как круглые дрожжи, так и высокоудлинные гифы (белые наконечники стрел) встречаются в толстом кишечнике. Обратите внимание, что окрашивание ярче с panfungal зонда. Рисунок 3G изображает ume6 мутант в том же отсеке, окрашенные panfungal зонд. Ume6 кодирует транскрипции фактор, который необходим для формирования гифы в условиях in vitro19 . Интересно, что дрожжи заблокирован фенотип отображается этот мутант в условиях пробирки не recapitulated в кишечнике, предполагая, что избыточный фактор должен быть активирован в принимающей12. На рисунке 4 изображено появление дикого типа C. albicans в различных сегментах гутерришного желудочно-кишечного тракта, включая регионы, непосредственно прилегающие к слизистой оболочке хозяина, и более центральные участки промывки кишечника.
Рисунок 1: Ключевые положения иглы кормления во время gavage. (A) Кормление иглы. (B) Кормление иглы мяч вставляется в сторону языка. (C) Кормление иглы в вертикальном положении с вставкой в пищеводе. (D) Кормление иглы вставляется в желудок с несколькими миллиметрами видимых над носом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Макет вскрытия примера. (A) Рассеиваните площадку и инструменты. (B) Вырезанный желудочно-кишечный тракт. Проксимальные (эзофаг) до дистальных (анус) разделов: I. Stomach. II. Проксимальный тонкий кишечник. III. Средний тонкий кишечник. IV. Дисталь тонкого кишечника. В. Чекум. VI. Толстая кишка. Розовые разбитые пограничные ящики указывают на то, что ткани должны быть исправлены. (C)Ткани, расположенные в кассетах. Римские цифры такие же, как в панели B. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Репрезентативные изображения FISH-окрашенных C. Albicans. ( A) FISH C. Albicans гифы, выращенные в средствах массовой информации жидкости Ли18 с 2% N-ацетилглукосамин, рН 6.8. (B) FISH C. Albicans круглые дрожжевые клетки, выращенные на YEPD и 2% агарпластин. (C)FISH Из C. albicans GUT-клеток (ySN1045), выращенных на ЕМПД и 2% агарных пластинах. (D) FISH Из C. Albicans непрозрачные клетки, выращенные на YEPD и 2% агар пластин. (E) Дикий тип C. albicans (ySN250) в толстой кишке, окрашенных C. Albicans-специфическийзонд. (F) Дикий тип C. Альбиканы в толстой кишке, окрашенные панфунгальным зондом. (G) Ume6 мутант (ySN1479) в толстой кишке, окрашенные panfungal зонд: красный C. Albicans, синий является хозяином эпителиальных ядер, и зеленый муцин. Стрелы указывают на гифы. Стрелки указывают на дрожжи. Шкала баров No 20 мкм. Изображения F и G адаптированы из Witchley et al.12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Появление окрашенных РЫБами C. Albicans в различных кишечных отсеках. Дикий тип C. Albicans показан в указанных сегментах тракта GI мыши. В каждом отсеке изображения изображают область, прилегающую к слизистой оболочке хозяина, и центральную область просвета кишечника. Окрашивание было выполнено с панфунгевого зонда. Шкала бар 20 мкм. Изображения адаптированы из Witchley et al.12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Запасы антибиотиков (200x) | |||
| Пенициллин G | 181 мг/мл | ||
| Стрептомицина | 400 мг/л | ||
| Метакарн | |||
| Фондовая | Окончательная концентрация | Объем | Единиц |
| Метанола | 60% | 300 | Мл |
| Хлороформе | 30% | 150 | Мл |
| Ледниковая уксусная кислота | 10% | 50 | Мл |
| Решение гибридизации | |||
| Фондовая | Окончательная концентрация | Объем | Единиц |
| 1 M Tris-HCl, рН 7.4 | 20 мМ | 20 | Мкл |
| 5 M NaCl | 0,9 м | 180 | Мкл |
| 10% SDS | 0.10% | 10 | Мкл |
| 100% формамид | 1.00% | 10 | QL (сохраняется в небольших аликвотах при -20 градусов по Цельсию между использованием) |
| Безrза | 780 | Мкл | |
| Решение для мытья FISH | |||
| 1 M Tris-HCl, рН 7.4 | 20 мМ | 1 | Мл |
| 5 M NaCl | 0,9 м | 9 | Мл |
| Безrза | 40 | Мл | |
| Муцин-ядерный окрашивающий раствор | |||
| DAPI, 10 мкг/мл | 20 нг/мл | 2 | Мкл |
| лектин, 40 мкг/мл | 1,6 мкг/мл | 40 | Мкл |
| PBS, рН 7.4 | 958 | Мкл | |
Таблица 1: Типичные объемы и концентрации решений, используемых в этом протоколе.
Discussion
Описанный здесь метод позволяет визуализировать дрожжи C. albicans и гифы в желудочно-кишечных трактах комменсически колонизированных мышей любого пола или штамма. Зонд FISH гибридизируется до 23S rRNA, который распространяется по всей грибковой цитоплазме. Наш метод был адаптирован из ранее сообщалось протокол для визуализации кишечных бактерий20. Поскольку C. albicans изменяет свою морфологию внутри хоста, метод полезен для мониторинга формы грибковых клеток, а также локализации. Например, мы использовали этот метод, чтобы опровергнуть гипотезу о том, что дрожжи преобладают во всем пищеварительном тракте, и разоблачить расхождения между in vivo и in vitro фенотипов некоторых "филатант-дефектных" мутантов12.
Несколько моделей мыши существуют для C. albicans commensal колонизации. Микробиота лабораторных мышей и людей отличается и, у мышей, использование антибиотиков или специализированной диеты требуется для установления стабильной колонизации. Лечение антибиотиками также усиливает колонизацию человека C. Albicans и является основным фактором риска распространения заболевания10. Антибиотики, используемые в этом исследовании являются относительно недорогими и дают надежное снижение бактериальной микробиоты. Обратите внимание, что антибиотики используются для уменьшения бремени антагонистических бактериальных видов, а не для устранения всех бактерий из животных. Если исследователи хотят изучить C. albicans-хоствзаимодействий в отсутствие бактерий или, чтобы избежать использования антибиотиков или специальной диеты, микробов животных могут быть заменены на условно выращенных животных; однако, гнотобиотические мыши проявляют определенные иммунные и анатомические аномалии и, следовательно, не могут быть пригодны для всех целей.
Несколько шагов важны для успешного окрашивания FISH: Рекомендуемый метод фиксации имеет решающее значение для сохранения структурной целостности тканей GI, особенно хрупкого содержимого просвета кишечника, таких как слизистая оболочка и трехмерный организации грибов и бактерий16. Обратите внимание, что многие широко используемые решения для фиксации, содержащие воду, наносят большой ущерб светящейся архитектуре. Фиксаторы и растворы для постфиксации, рекомендованные в этом протоколе, не содержат воды, и важно избегать загрязнения водой. Другим важным шагом является этап гибридизации, где важно избегать испарения раствора гибридизации при инкубации слайдов в печи гибридизации. Мы предлагаем поместить горки в водонепроницаемый контейнер, чтобы избежать этой проблемы. Кроме того, можно использовать водонепроницаемые камеры гибридизации, такие как те, которые первоначально использовались для гибридизации микроаррей.
C. Albicans-специфическийзонд FISH описан в этомпротоколе. Однако, поскольку многие лабораторно воспитанные мыши не содержат C. albicans или других грибов как часть их естественной кишечной микробиоты, panfungal зонд может специально пятно C. Albicans в экспериментально колонизированных животных. Замена панфунгелей зонда может быть желательно из-за его превосходных характеристик гибридизации и более высокого соотношения сигнала к шуму. Если panfungal зонд используется в качестве псевдоспецифического зонда для C. albicans, важно документировать отсутствие окрашивания у неинфицированных животных (т.е. лечение антибиотиками, но не C. Albicans). Окрашивание неколонизованных контрольных животных также полезно для оценки фоновых окрашивания, которые могут возникнуть в результате присоединения зондов FISH к пищевым твердым частицам. В целом, использование fish зонды предлагает повышенную специфичность по сравнению с большинством других методов окрашивания грибов, таких как Calcofluor белый (который пятна хитин, компонент клеточной стенки, которые могут варьироваться между типами клеток), GMS, или коммерчески доступныантичных антител. Кроме того, fish окрашивания позволяет для костей нескольких организмов с использованием дифференимационно помечены FISH зондов для видов конкретных rRNAs.
Одним из предостережений этого метода является то, что некоторые типы дрожжевых клеток C. albicans очень похожи на FISH (например, непрозрачные и типы клеток ГУТ). Чтобы различать эти типы клеток, было бы полезно разработать гибридизации зондов для клеточного типа конкретных грибковых мРНК. Тем не менее, в своей нынешней форме, метод FISH уже выявил удивительные расхождения между in vivo и in vitro поведения C. albicans мутантов оценивается в обоих условиях12, что свидетельствует о сложных взаимодействий в естественной соштатной среды, которые не адекватно передразнил существующих in vitro анализы. Дальнейшие исследования различных пятен C. albicans в дополнительных диких типа хостах и мутантов, вероятно, дадут дополнительную информацию о взаимодействиях грибковых хост. В частности, будет поучительно профилировать C. albicans в моделях воспалительных заболеваний кишечника, что связано с высокими титрами C. Albicans у людей21,и другими моделями C. albicans разрастания и болезни. Техника FISH также может сочетаться с иммуногистохимией, чтобы запятнать конкретные клетки-хозяина. В целом, представленный здесь метод обеспечивает достаточно быстрое и надежное средство для определения локализации И. Альбиканов и морфологии в желудочно-кишечном тракте млекопитающих.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Каролину Тропини, Кэтрин Нг, Джастина Зонненга и KC Huang за рекомендации по разработке методики FISH. Тереза О'Мира предоставила полезные комментарии по рукописи, а Мириам Леви помогала с фотографией. Эта работа была поддержана NIH гранты R01AI108992, R01DK113788, и Берроуз Добро пожаловать премии в патогенеза инфекционных заболеваний.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | can be substituted from any vendor |
| BHI blood agar | can be substituted from any vendor | ||
| C. albicans FISH probe | IDT DNA Technologies | custom order | |
| Chamber for hybridization incubation | watertight chamber meant to reduce evaporation | ||
| Chloroform | Sigma | C2432 | >=99.5% |
| DAPI | Roche | 10236276001 | can be substituted from any vendor |
| Delicate task wiper tissues | Kimberley-Clark | 34256CT | Kimwipes |
| D-glucose | Sigma | G7021-5KG | can be substituted from any vendor |
| Ethanol | Sigma | E7023 | molecular biology grade |
| Feeding needles | Cadence, Inc. | 7910 | metal; 20 X1-1/2" W/2-1/4; can be autoclaved to sterilize |
| FITC-UEA-1 | Sigma | L9006-1MG | other fluorophores available |
| FITC-WGA | Sigma | L4895-2MG | other fluorophores available |
| Foam pads | Fisher | 22038221 | Order foam pads that will fit within cassettes |
| Formamide | Sigma | 47671 | molecular biology grade |
| Glacial acetic acid | Macron Fine Chemicals | MK881746 | ACS reagent, >=99.5% |
| Glass Coplin jar | Fisher | 08-815 | hold up to 10 slides back to back |
| Histology cassettes | Simport | M512 | Deep cassettes so cecum is not squished |
| Hybridization coverslips | Sigma | GBL712222 | RNase-free |
| Hybridization oven | can be substituted from any vendor | ||
| LB | can be substituted from any vendor | ||
| Lee's media | prepared as described in Lee et al. 1975 | ||
| Methanol | Sigma | 179337 | ACS reagent, >=99.8% |
| Mice | Charles River Laboratories | 028 | adult BALB/c; 18-21 grams (8-10 weeks) |
| Paraformaldehyde | Fisher | 50-980-487 | 16% solution |
| Parrafin wax | Sigma | P3558-1KG | Paraplast for tissue embedding |
| PBS, pH 7.4 | UCSF Cell Culture Facility Media Production Unit | CCFAL003 | calcium, magnesium-free; can be substituted from any vendor |
| Penicillin G | Sigma | PENNA-100MU | |
| Sabouraud dextrose agar | can be substituted from any vendor | ||
| Saline | Baxter | 2F7123 | sterile, can be substituted from any vendor |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S3014 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
| Streptomycin | Sigma | S9137-100G | |
| Super PAP pen | Life Technologies | 8899 | can be substituted from any vendor |
| Tris-HCl | Sigma | T3253 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | does not contain DAPI |
| Xylenes | Sigma | 214736 | reagent grade |
| YEPD | can be substituted from any vendor |
References
- Noble, S. M., Gianetti, B. A., Witchley, J. N. Candida Albicans Cell-Type Switching and Functional Plasticity in the Mammalian Host. Nature Reviews in Microbiology. 15 (2), 96-108 (2017).
- Bacher, P., et al. Human Anti-fungal Th17 Immunity and Pathology Rely on Cross-Reactivity against Candida albicans. Cell. 176 (6), 1340-1355 (2019).
- Shao, T. Y., et al. Commensal Candida albicans Positively Calibrates Systemic Th17 Immunological Responses. Cell Host and Microbe. 25 (3), 404-417 (2019).
- Jiang, T. T., et al. Commensal Fungi Recapitulate the Protective Benefits of Intestinal Bacteria. Cell Host and Microbe. 22 (6), 809-816 (2017).
- Iliev, I. D., et al. Interactions Between Commensal Fungi and the C-Type Lectin Receptor Dectin-1 Influence Colitis. Science. 336 (6086), 1314-1317 (2012).
- Fan, D., et al. Activation of HIF-1 alpha and LL-37 by Commensal Bacteria Inhibits Candida Albicans Colonization. Nature Medicine. 21 (7), 808-814 (2015).
- Koh, A. Y., Kohler, J. R., Coggshall, K. T., Van Rooijen, N., Pier, G. B. Mucosal Damage and Neutropenia Are Required for Candida Albicans Dissemination. PLoS Pathogens. 4 (2), e35 (2008).
- Yamaguchi, N., et al. Gastric Colonization of Candida Albicans Differs in Mice Fed Commercial and Purified Diets. Journal of Nutrition. 135 (1), 109-115 (2005).
- Kadosh, D., et al. Effect of Antifungal Treatment in a Diet-Based Murine Model of Disseminated Candidiasis Acquired via the Gastrointestinal Tract. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (11), 6703-6708 (2016).
- Perlroth, J., Choi, B., Spellberg, B. Nosocomial Fungal Infections: Epidemiology, Diagnosis, and Treatment. Medical Mycology. 45 (4), 321-346 (2007).
- Pande, K., Chen, C., Noble, S. M. Passage Through the Mammalian Gut Triggers a Phenotypic Switch That Promotes Candida Albicans Commensalism. Nature Genetics. 45 (9), 1088-1091 (2013).
- Witchley, J. N., et al. Candida Albicans Morphogenesis Programs Control the Balance between Gut Commensalism and Invasive Infection. Cell Host and Microbe. 25 (3), 432-443 (2019).
- Noble, S. M., Gianetti, B. A., Witchley, J. N. Candida Albicans Cell-Type Switching and Functional Plasticity in the Mammalian Host. Nature Reviews in Microbiology. 15 (2), 96-108 (2017).
- Balish, E., Filutowicz, H., Oberley, T. D. Correlates of Cell-Mediated Immunity in Candida Albicans-Colonized Gnotobiotic Mice. Infection and Immunity. 58 (1), 107-113 (1990).
- Guarner, J., Brandt, M. E. Histopathologic Diagnosis of Fungal Infections in the 21st Century. Clinical Microbiology Reviews. 24 (2), (2011).
- Johansson, M. E., Hansson, G. C. Preservation of Mucus in Histological Sections, Immunostaining of Mucins in Fixed Tissue, and Localization of Bacteria with FISH. Methods in Molecular Biology. 842, 229-235 (2012).
- Swidsinski, A., Weber, J., Loening-Baucke, V., Hale, L. P., Lochs, H. Spatial Organization and Composition of the Mucosal Flora in Patients with Inflammatory Bowel Disease. Journal of Clinical Microbiology. 43 (7), 3380-3389 (2005).
- Lee, K. L., Buckley, H. R., Campbell, C. C. An Amino Acid Liquid Synthetic Medium for the Development of Mycelial and Yeast Forms of Candida Albicans. Sabouraudia. 13 (2), 148-153 (1975).
- Banerjee, M., et al. UME6, a Novel Filament-Specific Regulator of Candida Albicans Hyphal Extension and Virulence. Molecular Biology of the Cell. 19 (4), 1354-1365 (2008).
- Earle, K. A., et al. Quantitative Imaging of Gut Microbiota Spatial Organization. Cell Host and Microbe. 18 (4), 478-488 (2015).
- Sokol, H., et al.
